JP7261222B2 - ３－ヒドロキシプロピオン酸を生産する遺伝子組換え菌、その製造方法、及びその応用 - Google Patents

３－ヒドロキシプロピオン酸を生産する遺伝子組換え菌、その製造方法、及びその応用 Download PDF

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Description

本発明は、バイオテクノロジー分野における、３－ヒドロキシプロピオン酸を生産する遺伝子組換え菌、その製造方法、及びその応用に関する。
化石資源の利用を基礎とした化学品の製造は、資源の枯渇や環境汚染などが益々深刻化している問題に直面している。そこで、生合成経路で従来の化学品の低コスト製造を達成することは将来性のある代替的手段となる。工業用微生物菌株に対する遺伝子操作を行うことで、微生物細胞による原料の利用を改善し、製品の変換率を向上させることができ、それにより製造コストを削減する。
３－ヒドロキシプロピオン酸は、重要な化学中間体として、市場における将来性の高いプラットフォーム化合物であり、２００４年に米国エネルギー省により挙げられた現在世界での１２種の最も開発可能性のあるバイオ基化学製品の１つでもある。３－ヒドロキシプロピオン酸は、それ自体が食品又は飼料の添加剤と防腐剤とすることができるのみならず、酸化、脱水、還元、エステル化、重合などの反応によって複数の重要な化学物質、例えば、アクリル酸、マロン酸、１，３プロピレングリコール、アクリルアミド、ポリ３－ヒドロキシプロピオン酸などを合成することができる。
現在３－ヒドロキシプロピオン酸の製造方法は主に化学合成法及び生合成法を含む。３－ヒドロキシプロピオン酸を製造する化学合成法としては、３－ヒドロキシニトリル加水分解法、アクリル酸水和法、３－ヒドロキシプロピオンアルデヒド酸化法、アリルアルコール酸化法などが挙げられる。３－ヒドロキシプロピオン酸の生合成法としては、主に微生物発酵によって原料を３－ヒドロキシプロピオン酸に変換するか、あるいは関連酵素を抽出した後、無細胞系において３－ヒドロキシプロピオン酸を生産するものである。微生物による３－ヒドロキシプロピオン酸の合成についての研究は主に、（１）３－ヒドロキシプロピオン酸を自然に合成する微生物菌株をスクリーニングし、変異誘発すること、（２）遺伝子組換え微生物の遺伝子操作株を構築し、グルコースによって３－ヒドロキシプロピオン酸を生産すること、（３）微生物の遺伝子操作株を構築し、グリセリンによって３－ヒドロキシプロピオン酸を生産すること、という三つの方面を含む。
３－ヒドロキシプロピオン酸を自然に合成する微生物に対するスクリーニングや変異誘発は、主にカンジダ酵母を用いるが、カンジダ酵母によって３－ヒドロキシプロピオン酸を合成するために、一般的にプロピオン酸を炭素源とする必要があるので、経済的妥当性は低い。
グルコースを基質として３－ヒドロキシプロピオン酸を合成する遺伝子組換え微生物の遺伝子操作株の構築は、主に大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミカムなどを用いる。遺伝子操作株によって３－ヒドロキシプロピオン酸を合成する場合、主に（１）３－ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ経由の合成経路と、（２）マロニルＣｏＡ経由の合成経路とを含む２種類の合成経路を利用している。米国Ｃａｒｇｉｌｌ会社は３－ヒドロキシプロピオニルＣｏＡ経由の経路を基礎とし、大腸菌などの遺伝子操作株によってグルコースを乳酸に変換し、その後プロピオニルＣｏＡトランスフェラーゼ、乳酸ＣｏＡデヒドラターゼと３－ヒドロキシプロピオニルヒドロラーゼによる触媒作用などの三段階の反応を経て３－ヒドロキシプロピオン酸を生成する。米国ＯＰＸＢｉｏ社はマロニルＣｏＡ経由の経路を利用し、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼとマロニルＣｏＡレダクターゼによる触媒作用で基質を３－ヒドロキシプロピオン酸に変換する。
グリセリンを基質として３－ヒドロキシプロピオン酸を合成する遺伝子組換え微生物の遺伝子操作株の構築は主に肺炎桿菌又は大腸菌にアルデヒドオキシダーゼを導入して３－ヒドロキシプロピオンアルデヒドを３－ヒドロキシプロピオン酸に酸化する。
現在、生合成法での３－ヒドロキシプロピオン酸の合成における主な技術的制約は原料価格が比較的高く、使用経路の理論上の変換率が低いということであり、新規で低コストの原料経路の開発が望ましい。脂肪酸は高度な還元状態を持つ物質であり、微生物発酵、生物学的変換に用いられる脂肪酸原料は石油製品の粗加工の生成物、下水油などの供給源から安価な価額で入手することができる。
本発明が解決しようとする技術的課題は、如何にして３－ヒドロキシプロピオン酸を生産することである。
上記技術課題を解決するために、本発明は、まず遺伝子組換え菌の構築方法を提供する。
本発明により提供される遺伝子組換え菌の構築方法において、受容菌に対する「イ」又は「ロ」の遺伝子操作を行って前記遺伝子組換え菌を得ることを含み、前記「イ」はＡ６であり、前記「ロ」はＡ６、及びＡ１、Ａ２、Ａ３、Ａ４、Ａ５、Ａ７、及びＡ８の７つのうちの全て又は一部であり、
Ａ１は、前記受容菌の脂肪酸分解に関わる転写因子遺伝子、即ちｆａｄＲ遺伝子をノックアウトし、又は前記ｆａｄＲ遺伝子の発現を抑制し、又は前記ｆａｄＲ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を抑制することであり、
Ａ２は、前記受容菌のβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼＩＩ遺伝子、即ちｆａｂＦ遺伝子をノックアウトし、又は前記ｆａｂＦ遺伝子の発現を抑制し、又は前記ｆａｂＦ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を抑制することであり、
Ａ３は、前記受容菌のβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼＩＩＩ遺伝子、即ちｆａｂＨ遺伝子をノックアウトし、又は前記ｆａｂＨ遺伝子の発現を抑制し、又は前記ｆａｂＨ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を抑制することであり、
Ａ４は、前記受容菌におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子、即ちａｃｃ遺伝子又は遺伝子クラスターによってコードされるタンパク質の含有量を増加させ、又は／及び前記ａｃｃ遺伝子又は遺伝子クラスターによってコードされるタンパク質の活性を増強することであり、
Ａ５は、前記受容菌における外因性アルカン取り込み外膜タンパク質遺伝子、即ちａｌｋＬ遺伝子によってコードされるタンパク質の含有量を増加させ、又は／及び前記ａｌｋＬ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を増強することであり、
Ａ６は、前記受容菌におけるマロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子、即ちｍｃｒ遺伝子によってコードされるタンパク質の含有量を増加させ、又は／及び前記ｍｃｒ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を増強することであり、
前記受容菌は前記ｆａｄＲ遺伝子、前記ｆａｂＦ遺伝子、及び前記ｆａｂＨ遺伝子を含む細菌又は真菌である。
上記方法において、前記受容菌は、
１）大腸菌、又は
２）大腸菌ＢＷ２５１１３であってもよい。
上記方法において、前記ａｃｃ遺伝子又は遺伝子クラスターはコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）又は／及びロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ）から由来してもよい。
前記ａｌｋＬ遺伝子はマリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）又は／及びシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）から由来してもよい。
前記ｍｃｒ遺伝子はクロロフレクサス・オーランティアカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）から由来してもよい。
上記方法において、前記ｆａｄＲ遺伝子は、
ａ１）配列表中の配列番号２に示されるタンパク質、又は
ａ２）配列表中の配列番号２のアミノ酸配列において１つ又は複数個のアミノ酸残基が置換され、及び／又は欠失され、及び／又は付加された、配列番号２のアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有し前記アミノ配列と同じ機能を有するタンパク質、をコードすることができる。
前記ｆａｂＦ遺伝子は、
ａ３）配列表中の配列番号１４に示されるタンパク質、又は
ａ４）配列表中の配列番号１４のアミノ酸配列において１つ又は複数個のアミノ酸残基が置換され、及び／又は欠失され、及び／又は付加された、配列番号１４のアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有し前記アミノ配列と同じ機能を有するタンパク質、をコードすることができる。
前記ｆａｂＨ遺伝子は、
ａ５）配列表中の配列番号１６に示されるタンパク質、又は
ａ６）配列表中の配列番号１６のアミノ酸配列において１つ又は複数個のアミノ酸残基が置換され、及び／又は欠失され、及び／又は付加された、配列番号１６のアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有し前記アミノ配列と同じ機能を有するタンパク質、をコードすることができる。
前記ａｃｃ遺伝子又は遺伝子クラスターは、
ａ７１）配列表中の配列番号２６に示されるタンパク質、又は
ａ７２）配列表中の配列番号２６のアミノ酸配列において１つ又は複数個のアミノ酸残基が置換され、及び／又は欠失され、及び／又は付加された、配列番号２６のアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有し前記アミノ配列と同じ機能を有するタンパク質であるａ７）のタンパク質、及び
ａ８１）配列表中の配列番号２７に示されるタンパク質、又は
ａ８２）配列表中の配列番号２７のアミノ酸配列において１つ又は複数個のアミノ酸残基が置換され、及び／又は欠失され、及び／又は付加された、配列番号２７のアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有しかつ前記アミノ配列と同じ機能を有するタンパク質であるａ８）のタンパク質、をコードすることができる。
前記ａｌｋＬ遺伝子は、
ａ９）配列表中の配列番号２９に示されるタンパク質、又は
ａ１０）配列表中の配列番号２９のアミノ酸配列において１つ又は複数個のアミノ酸残基が置換され、及び／又は欠失され、及び／又は付加された、配列番号２９のアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有しかつ前記アミノ配列と同じ機能を有するタンパク質、をコードすることができる。
前記ｍｃｒ遺伝子は、
ａ１１）配列表中の配列番号３７に示されるタンパク質、又は
ａ１２）配列表中の配列番号３７のアミノ酸配列において１つ又は複数個のアミノ酸残基が置換され、及び／又は欠失され、及び／又は付加された、配列番号３７のアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有しかつ前記アミノ配列と同じ機能を有するタンパク質、をコードすることができる。
上記方法において、Ａ４は前記受容菌に前記ａｃｃ遺伝子又は遺伝子クラスターを導入することによって達成されてもよい。
Ａ５は前記受容菌に前記ａｌｋＬ遺伝子を導入することによって達成されてもよい。
Ａ６は前記受容菌に前記ｍｃｒ遺伝子を導入することによって達成されてもよい。
上記方法において、前述の前記受容菌に前記ａｃｃ遺伝子又は遺伝子クラスターを導入することは具体的には、前記ａｃｃ遺伝子又は遺伝子クラスターを含む発現ベクター（即ち、ａｃｃ遺伝子又は遺伝子クラスター発現ベクターである）を前記受容菌に導入することであってもよい。
前述の前記受容菌に前記ａｌｋＬ遺伝子を導入することは具体的には、前記ａｌｋＬ遺伝子を含む発現ベクター（即ち、ａｌｋＬ遺伝子発現ベクターである）を前記受容菌に導入することであってもよい。
前述の前記受容菌に前記ｍｃｒ遺伝子を導入することは具体的には、前記ｍｃｒ遺伝子を含む発現ベクター（即ち、ｍｃｒ遺伝子発現ベクターである）を前記受容菌に導入することであってもよい。
前記発現ベクターはいずれもプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、又はウイルスベクターであってもよい。前記プラスミドは具体的には、ｐＳＢ１ｓ又はｐＸＢ１ｋであってもよく、前記ｐＳＢ１ｓの配列は配列表中の配列番号３０であり、前記ｐＸＢ１ｋの配列は配列表中の配列番号３５である。
前記受容菌に、前記ａｃｃ遺伝子又は遺伝子クラスター、前記ａｌｋＬ遺伝子、及び／又は前記ｍｃｒ遺伝子を導入する時、別個の発現ベクターを導入することによって達成されてもよく、共発現ベクターを導入することによって達成されてもよく、前記別個の発現ベクターは、前記ａｃｃ遺伝子又は遺伝子クラスター、前記ａｌｋＬ遺伝子、及び前記ｍｃｒ遺伝子のうちの１つのみを含み、前記共発現ベクターは、前記ａｃｃ遺伝子又は遺伝子クラスター、前記ａｌｋＬ遺伝子、及び前記ｍｃｒ遺伝子のうちの少なくとも２つを含む。
本発明の一実施例において、前記受容菌に前記ａｃｃ遺伝子又は遺伝子クラスターと前記ａｌｋＬ遺伝子とを導入する時、この２つの遺伝子又は遺伝子クラスターを含む共発現ベクター（即ち、ａｃｃ－ａｌｋＬ共発現ベクターである）を前記受容菌に導入することによって達成されてもよく、前記受容菌に前記ｍｃｒ遺伝子を導入する時、この遺伝子を含む別個の発現ベクター（即ち、ｍｃｒ発現ベクターである）を前記受容菌に導入することによって達成されてもよい。前記ａｃｃ－ａｌｋＬ共発現ベクターは具体的には、前記ａｃｃ遺伝子又は遺伝子クラスターと前記ａｌｋＬ遺伝子とを前記ｐＳＢ１ｓに導入して得られた遺伝子組換えベクターｐＳＢ１ｓ－ａｃｃ－ａｌｋＬであってもよい。前記ｐＳＢ１ｓ－ａｃｃ－ａｌｋＬは、配列番号２６に示されるａｃｃＢＣタンパク質、配列番号２７に示されるａｃｃＤＡタンパク質、及び配列番号２９に示されるａｌｋＬタンパク質を発現することができる。前記ｍｃｒ発現ベクターは具体的には、前記ｍｃｒ遺伝子を前記ｐＸＢ１ｋに導入して得られた遺伝子組換えベクターｐＸＢ１ｋ－ｍｃｒであってもよい。前記ｐＸＢ１ｋ－ｍｃｒは配列番号３７に示されるｍｃｒタンパク質を発現することができる。
上記方法において、前記ｆａｄＲ遺伝子は、ｂ１）又はｂ２）であってもよく、
ｂ１）は配列表中の配列番号１に示されるｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子であり、
ｂ２）はｂ１）に限定されるヌクレオチド配列と７５％以上の同一性を有し、かつ同じ機能を有するｃＤＮＡ分子又はゲノムＤＮＡ分子である。
前記ｆａｂＦ遺伝子は、ｂ３）又はｂ４）であってもよく、
ｂ３）は配列表中の配列番号１３に示されるｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子であり、
ｂ４）はｂ３）に限定されるヌクレオチド配列と７５％以上の同一性を有し、かつ同じ機能を有するｃＤＮＡ分子又はゲノムＤＮＡ分子である。
前記ｆａｂＨ遺伝子は、ｂ５）又はｂ６）であってもよく、
ｂ５）は配列表中の配列番号１５に示されるｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子であり、
ｂ６）はｂ５）に限定されるヌクレオチド配列と７５％以上の同一性を有し、かつ同じ機能を有するｃＤＮＡ分子又はゲノムＤＮＡ分子である。
前記ａｃｃ遺伝子又は遺伝子クラスターは、ｂ７）又はｂ８）であってもよく、
ｂ７）は配列表中の配列番号２５の第１５～３２５９位に示されるｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子であり、
ｂ８）はｂ７）に限定されるヌクレオチド配列と７５％以上の同一性を有し、かつ同じ機能を有するｃＤＮＡ分子又はゲノムＤＮＡ分子である。
前記ａｌｋＬ遺伝子は、ｂ９）又はｂ１０）であってもよく、
ｂ９）配列表中の配列番号２８に示されるｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子であり、
ｂ１０）ｂ９）に限定されるヌクレオチド配列と７５％以上の同一性を有し、かつ同じ機能を有するｃＤＮＡ分子又はゲノムＤＮＡ分子である。
前記ｍｃｒ遺伝子は、ｂ１１）又はｂ１２）であってもよく、
ｂ１１）は配列表中の配列番号３６に示されるｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子であり、
ｂ１２）はｂ１１）に限定されるヌクレオチド配列と７５％以上の同一性を有し、かつ同じ機能を有するｃＤＮＡ分子又はゲノムＤＮＡ分子である。
上記方法において、Ａ１における前述の前記受容菌の脂肪酸分解に関わる転写因子遺伝子、即ちｆａｄＲ遺伝子をノックアウトすることは、相同組換えによって行うことができ、具体的には、前記ｆａｄＲ遺伝子ノックアウト形質を有する大腸菌の菌株ＪＷ１１７６を利用することによって達成されてもよい。
Ａ２における前述の前記受容菌のβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼＩＩ遺伝子、即ちｆａｂＦ遺伝子をノックアウトすることは、相同組換えによって行うことができ、具体的には、前記ｆａｂＦ遺伝子ノックアウト形質を有する大腸菌の菌株ＪＷ１０８１を利用することによって達成されてもよい。
Ａ３における前述の前記受容菌のβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼＩＩＩ遺伝子、即ちｆａｂＨ遺伝子をノックアウトすることは、相同組換えによって行うことができ、具体的には、前記ｆａｂＨ遺伝子ノックアウト形質を有する大腸菌の菌株ＪＷ１０７７を利用することによって達成されてもよい。
上記方法は更に、下記のＢ１～Ｂ４のうちの４つ、いずれか３つ、いずれか２つ、又はいずれか１つを含んでもよい。
Ｂ１は、前記受容菌におけるｆａｄＬ遺伝子によってコードされるタンパク質の含有量を増加させ、又は／及び前記ｆａｄＬ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を増強することであり、
Ｂ２は、前記受容菌における脂肪酸β酸化経路における遺伝子によってコードされるタンパク質の含有量を増加させ、又は／及び前記脂肪酸β酸化経路における遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を増強することであり、
前記脂肪酸β酸化経路における遺伝子は、アシルＣｏＡシンセターゼをコードするｆａｄＤ遺伝子、アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードするｆａｄＥ遺伝子、３－ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードするｆａｄＢ遺伝子、３－ケトアシルＣｏＡチオラーゼをコードするｆａｄＡ遺伝子、３－ケトアシルＣｏＡチオラーゼをコードするｆａｄＩ遺伝子、３－ヒドロキシアシルＣｏＡデヒドロゲナーゼをコードするｆａｄＪ遺伝子、及び短鎖アシルＣｏＡシンセターゼをコードするｆａｄＫ遺伝子からなる群から選択される１つ又は複数の遺伝子であり、
Ｂ３は、前記受容菌におけるｓｔｈＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の含有量を増加させ、又は／及び前記ｓｔｈＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を増強することであり、
Ｂ４は、前記受容菌における短鎖脂肪酸分解経路における遺伝子によってコードされるタンパク質の含有量を増加させ、又は／及び前記短鎖脂肪酸分解経路における遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を増強することであり、
前記短鎖脂肪酸分解経路における遺伝子は、Ｂ４ａ又はＢ４ｂであり、
Ｂ４ａは短鎖脂肪酸分解を制御する遺伝子クラスター、即ちａｔｏＳＣ遺伝子クラスターにおける遺伝子であり、
Ｂ４ｂは短鎖脂肪酸分解遺伝子クラスター、即ちａｔｏＤＡＥＢ遺伝子クラスターにおける遺伝子である。
上記方法において、前記受容菌は、前記ｆａｄＬ遺伝子、前記脂肪酸β酸化経路における遺伝子、前記ｓｔｈＡ遺伝子及び／又は前記短鎖脂肪酸分解経路における遺伝子を更に含んでもよい。
上記方法において、前記短鎖脂肪酸分解を制御する遺伝子クラスター、即ちａｔｏＳＣ遺伝子クラスターにおける遺伝子は、ａｔｏＣ転写活性化因子をコードする遺伝子ａｔｏＣ遺伝子及び／又はａｔｏＳセンシングヒスチジンキナーゼをコードする遺伝子ａｔｏＳ遺伝子であってもよい。
前記短鎖脂肪酸分解遺伝子クラスター、即ちａｔｏＤＡＥＢ遺伝子クラスターにおける遺伝子は、アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼαサブユニットをコードする遺伝子、即ちａｔｏＡ遺伝子、アセトアセチルＣｏＡトランスフェラーゼβサブユニットをコードする遺伝子、即ちａｔｏＤ遺伝子、アセト酢酸輸送タンパク質をコードする遺伝子、即ちａｔｏＥ遺伝子、及び／又はアセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子、即ちａｔｏＢ遺伝子であってもよい。
上記方法において、前記ｆａｄＬ遺伝子は、
ａ１７）配列表中の配列番号６に示されるタンパク質、又は
ａ１８）配列表中の配列番号６のアミノ酸配列において１つ又は複数個のアミノ酸残基が置換され、及び／又は欠失され、及び／又は付加された、配列番号６のアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有し前記アミノ配列と同じ機能を有するタンパク質、をコードすることができる。
前記ｆａｄＤ遺伝子は、
ａ１９）配列表中の配列番号９に示されるタンパク質、又は
ａ２０）配列表中の配列番号９のアミノ酸配列において１つ又は複数個のアミノ酸残基が置換され、及び／又は欠失され、及び／又は付加された、配列番号９のアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有し前記アミノ配列と同じ機能を有するタンパク質、をコードすることができる。
前記ｓｔｈＡ遺伝子は、
ａ２１）配列表中の配列番号１２に示されるタンパク質、又は
ａ２２）配列表中の配列番号１２のアミノ酸配列において１つ又は複数個のアミノ酸残基が置換され、及び／又は欠失され、及び／又は付加された、配列番号１２のアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有し前記アミノ配列と同じ機能を有するタンパク質、をコードすることができる。
前記ａｔｏＳＣ遺伝子クラスターは、
ａ２３１）配列表中の配列番号１９に示されるタンパク質、又は
ａ２３２）配列表中の配列番号１９のアミノ酸配列において１つ又は複数個のアミノ酸残基が置換され、及び／又は欠失され、及び／又は付加された、配列番号１９のアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有し前記アミノ配列と同じ機能を有するタンパク質であるａ２３）のタンパク質、及び
ａ２４１）配列表中の配列番号２１に示されるタンパク質、又は
ａ２４２）配列表中の配列番号２１のアミノ酸配列において１つ又は複数個のアミノ酸残基が置換され、及び／又は欠失され、及び／又は付加された、配列番号２１のアミノ酸配列と７５％以上の同一性を有し前記アミノ配列と同じ機能を有するタンパク質であるａ２４）のタンパク質、をコードすることができる。
上記方法において、Ｂ１は、前記ｆａｄＬ遺伝子のプロモーターをプロモーターＰＣＰＡ１に置換することによって達成されてもよい。
Ｂ２は、前記脂肪酸β酸化経路における遺伝子のプロモーターを前記プロモーターＰＣＰＡ１に置換することによって達成されてもよい。
Ｂ３は、前記ｓｔｈＡ遺伝子のプロモーターを前記プロモーターＰＣＰＡ１に置換することによって達成されてもよい。
Ｂ４は、前記短鎖脂肪酸分解経路における遺伝子のプロモーターを前記プロモーターＰＣＰＡ１に置換することによって達成されてもよい。
上記方法において、前記短鎖脂肪酸分解経路における遺伝子のプロモーターは前記短鎖脂肪酸分解を制御する遺伝子クラスター、即ちａｔｏＳＣ遺伝子クラスターのプロモーター又は前記短鎖脂肪酸分解遺伝子クラスター、即ちａｔｏＤＡＥＢ遺伝子クラスターのプロモーターであってもよい。
上記方法において、前記プロモーターＰＣＰＡ１は、
１）コード配列が配列表中の配列番号３の第１４４３～１６２２位であるＤＮＡ分子、又は
２）１）に限定されるヌクレオチド配列と７５％以上の同一性を有し、かつ同じ機能を有するＤＮＡ分子、又は
３）ストリンジェントな条件下で１）に限定されるヌクレオチド配列とハイブリダイズし、同じ機能を有するＤＮＡ分子、のような核酸分子であってもよい。
上記方法において、前記ｆａｄＬ遺伝子のプロモーターをプロモーターＰＣＰＡ１に置換することは配列表中の配列番号４に示されるＤＮＡ断片によって達成されてもよい。
前記脂肪酸β酸化経路における遺伝子のプロモーターを前記プロモーターＰＣＰＡ１に置換することは配列表中の配列番号７に示されるＤＮＡ断片によって達成されてもよい。
前記ｓｔｈＡ遺伝子のプロモーターを前記プロモーターＰＣＰＡ１に置換することは配列表中の配列番号１０に示されるＤＮＡ断片によって達成されてもよい。
前記短鎖脂肪酸分解経路における遺伝子のプロモーターを前記プロモーターＰＣＰＡ１に置換することは配列表中の配列番号１７に示されるＤＮＡ断片によって達成されてもよい。
上記方法において、前記７５％以上の同一性は、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％以上の同一性であってもよい。
上記技術課題を解決するために、本発明は、３－ヒドロキシプロピオン酸の製造方法を更に提供する。
本発明により提供される３－ヒドロキシプロピオン酸の製造方法は、脂肪酸を基質とし、前記遺伝子組換え菌の製造方法で製造した前記遺伝子組換え菌で生物学的変換を行い、３－ヒドロキシプロピオン酸を製造することを含む。
上記３－ヒドロキシプロピオン酸の製造方法において、前記脂肪酸は、パルミチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、カプリン酸、カプリル酸、及び／又はカプロン酸であってもよい。
上記３－ヒドロキシプロピオン酸の製造方法は更に、前記生物学的変換を行う前にアラビノースを利用して前記遺伝子組換え菌に対する誘導を行うことを含んでも良い。
上記３－ヒドロキシプロピオン酸の製造方法は具体的には、前記遺伝子組換え菌を利用して前記脂肪酸に対する全細胞触媒を行って３－ヒドロキシプロピオン酸を製造することであってもよい。
上記技術課題を解決するために、本発明は、Ｚ１～Ｚ４のいずれか一つの製品を更に提供する。
Ｚ１は、前記遺伝子組換え菌の製造方法により製造される遺伝子組換え菌Ｚ１であり、
Ｚ２は、
前記ｍｃｒ遺伝子によってコードされるタンパク質であるＭ１ａ、並びに、前記ａｃｃ遺伝子又は遺伝子クラスターによってコードされるタンパク質、及び前記ａｌｋＬ遺伝子によってコードされるタンパク質のうちの全て又は一部であるＭ１ｂを含むＭ１、又は
前記Ｍ１、並びに、前記ｆａｄＬ遺伝子によってコードされるタンパク質、前記ｆａｄＤ遺伝子によってコードされるタンパク質、前記ｓｔｈＡ遺伝子によってコードされるタンパク質、及び前記ａｔｏＳＣ遺伝子クラスターによってコードされるタンパク質のうちの全て又は一部であるＭ２ａを含むＭ２、
であるタンパク質又はタンパク質セットであり、
Ｚ３は、
前記ｍｃｒ遺伝子Ｎ１ａ、並びに、前記ａｃｃ遺伝子又は遺伝子クラスター、及び前記ａｌｋＬ遺伝子のうちの全て又は一部であるＮ１ｂを含むＮ１、又は
前記Ｎ１、並びに、前記ｆａｄＬ遺伝子、前記ｆａｄＤ遺伝子、前記ｓｔｈＡ遺伝子、及び前記ａｔｏＳＣ遺伝子クラスターのうちの全て又は一部であるＮ２ａを含むＮ２、
である遺伝子又は遺伝子セットであり、
Ｚ４は、前記プロモーターＰＣＰＡ１と前記遺伝子又は遺伝子セットからなる試薬セットである。
上記技術課題を解決するために、本発明は、前記製品の、
３－ヒドロキシプロピオン酸の製造であるＸ１、
３－ヒドロキシプロピオン酸を生産する製品の製造であるＸ２、
脂肪酸の分解であるＸ３、
脂肪酸を分解する製品の製造であるＸ４、のいずれか一つの応用を更に提供する。
ＦＭ０８を利用してβ－アラニンを製造することを示す。 ＦＩ０８を利用して３－ヒドロキシプロピオン酸を生産することを示す。 ＦＡ１１を利用してβ－アラニンを製造することを示す。
以下、実施形態に合わせて本発明を更に詳細に説明し、提供される実施例は、本発明を説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲を制限するためのものではない。下記実施例の実験方法について、特に説明しない限り、いずれも通常方法である。下記実施例に用いられる材料、試薬、計器などは、特に説明しない限り、いずれも市販により入手できるものである。以下の実施例における定量的な実験について、いずれも３回の繰り返し実験とし、結果を平均化する。
下記実施例の野生型Ｐ１バクテリオファージ（Ｔｈｏｍａｓｏｎ ＬＣ、Ｃｏｓｔａｎｔｉｎｏ Ｎ．２００７．Ｅ．ｃｏｌｉ ｇｅｎｏｍｅ ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ Ｐ１ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：１．１７．１－８）について、一般人は中国科学院微生物研究所から入手でき、該生体材料は本発明の関連する実験を繰り返すためにのみ用いられ、その他の用途に使用してはいけない。
下記実施例において、大腸菌ＢＷ２５１１３（Ｄａｔｓｅｎｋｏ ＫＡ、Ｗａｎｎｅｒ ＢＬ．Ｏｎｅ－ｓｔｅｐ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０００；９７（１２）：６６４０－６６４５．）は非病原性細菌であり、遺伝的背景が明確で、世代時間が短く、培養しやすく且つ培地原料が安価である。大腸菌ＢＷ２５１１３について、一般人は中国科学院微生物研究所から入手でき、該生体材料は本発明の関連する実験を繰り返すためにのみ用いられ、その他の用途に使用してはいけない。
実施例１：遺伝子組換え大腸菌の遺伝子操作株ＦＭ０７の構築
本実施例は、β－アラニンと３－ヒドロキシプロピオン酸とを生産する菌株を製造するために用いられる基本菌株ＦＭ０７を製造し、該菌株の製造方法は以下に示すとおりであり、使用されるプライマーは表１に示す。
（１）脂肪酸分解に関わる転写因子遺伝子、即ちｆａｄＲ遺伝子をノックアウトする。
大腸菌ＢＷ２５１１３から、大腸菌ＢＷ２５１１３のｆａｄＲ遺伝子をノックアウトし、大腸菌ＢＷ２５１１３の突然変異体ＦＭ０１を得て、具体的には、
ｆａｄＲノックアウト形質を有する大腸菌の遺伝子断片を含むＰ１バクテリオファージを製造するというステップ（１－ａ）であって、
ｆａｄＲノックアウト形質を有する大腸菌の遺伝子断片は大腸菌の菌株ＪＷ１１７６からのものであり、該菌株はｆａｄＲノックアウト形質を有するＷ３１１０シリーズ菌株であり、ＪＷ１１７６は日本国立遺伝学研究所（ＮＩＧ、Ｊａｐａｎ）の製品であり、その中の脂肪酸分解に関わる転写因子をコードする遺伝子ｆａｄＲは両端にＦＲＴ部位を持つカナマイシン耐性遺伝子（約１３００ｂｐ）に置換され、それによりｆａｄＲ遺伝子をノックアウトし（Ｂａｂａ Ｔ、Ａｒａ Ｔ、ｅｔ ａｌ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ－１２ ｉｎ－ｆｒａｍｅ、ｓｉｎｇｌｅ－ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｕｔａｎｔｓ：ｔｈｅ Ｋｅｉｏ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．２００６；２：２００６．０００８．）、Ｐ１バクテリオファージの製造過程は、ＪＷ１１７６菌株を３７℃で一晩培養した後、５ｍｍｏｌ／ＬのＣａＣｌ２と０．１％のグルコースとを含むＬＢ培地に移し、３７℃で１時間培養し、その後野生型Ｐ１バクテリオファージを添加して１～３時間培養し続け、数滴のクロロホルムを加えて更に数分間培養し、遠心分離して上澄みを取り、ｆａｄＲノックアウト形質を有する大腸菌の遺伝子断片を含有するバクテリオファージＰ１ｖｉｒ ｆａｄＲを得るものと、
Ｐ１バクテリオファージの形質導入技術によって大腸菌の菌株ＦＭ０１－Ｋａｎを構築するというステップ（１－ｂ）であって、
一晩培養した大腸菌ＢＷ２５１１３（受容菌）について、１．５ｍＬの菌液を２分間で１００００ｇで遠心分離した後、０．７５ｍＬのＰ１塩溶液（溶媒は水であり、溶質は１０ｍＭのＣａＣｌ２と５ｍＭのＭｇＳＯ４である）でＢＷ２５１１３菌体細胞を再懸濁し、１００μＬのバクテリオファージＰ１ｖｉｒ ｆａｄＲを１００μＬのＢＷ２５１１３細胞懸濁液と混合し、３７℃で３０分間インキュベートし、その後１ｍＬのＬＢ培地と１ｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウム２００μＬとを添加し、３７℃で１時間培養し続け、遠心分離して菌体を収集し、１００μＬのＬＢ培地で再懸濁した後、カナマイシンを含むＬＢプレート（カナマイシンの濃度が５０μｇ／ｍｌである）に塗布し、３７℃で一晩培養した後、クローンを選択し、ｆａｄＲ－ＩＦ／ｆａｄＲ－ＩＲプライマーでＰＣＲによって増幅と同定を行い（陽性である１７００ｂｐの目的バンドが増幅される）、陽性クローンを選択してＦＭ０１－Ｋａｎと名付けるものと、
耐性を除去するというステップ（１－ｃ）であって、
ｐＣＰ２０プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を塩化カルシウム形質転換法によってＦＭ０１－Ｋａｎに形質転換し、アンピシリンを含むＬＢプレートにおいて３０℃で一晩培養した後、クローンを選択し、プラスミドｐＣＰ２０を含む遺伝子組換え大腸菌ＦＭ０１－Ｋａｎ／ｐＣＰ２０を得て、アンピシリン耐性を有するＬＢ培地において３０℃で培養した後、耐性のないＬＢプレートに塗布し、４３℃で一晩培養し、クローンを選択し、ｆａｄＲ－ＩＦ／ｆａｄＲ－ＩＲプライマーでＰＣＲによって増幅と同定を行い（陽性である４００ｂｐの目的バンドが増幅される）、陽性クローンを選択してＦＭ０１と名付け、
ここで、ＦＭ０１は大腸菌ＢＷ２５１１３の脂肪酸分解に関わる転写因子遺伝子、即ちｆａｄＲ遺伝子をノックアウトした菌株であり、大腸菌ＢＷ２５１１３において、ｆａｄＲ遺伝子は配列番号２に示されるタンパク質をコードし、ｆａｄＲ遺伝子のコード配列は配列番号１に示すとおりであり、ｆａｄＲ－ＩＦ／ｆａｄＲ－ＩＲはＦＭ０１のゲノムＤＮＡから１つの約４００ｂｐの断片が増幅され、大腸菌ＢＷ２５１１３のゲノムＤＮＡから１つの約１１００ｂｐの断片が増幅され、ここで、ｆａｄＲ－ＩＦとｆａｄＲ－ＩＲプライマーとの結合位置は、それぞれ大腸菌ＢＷ２５１１３のｆａｄＲ遺伝子の上流領域と下流領域であり、配列解析結果からＦＭ０１のゲノムにｆａｄＲ遺伝子がないことを示し、ＦＭ０１は大腸菌ＢＷ２５１１３のｆａｄＲ遺伝子をノックアウトして得られた大腸菌ＢＷ２５１１３の突然変異体であるものと、を含む。
（２）プロモーター置換によってｆａｄＬ遺伝子の発現を増強する。
遺伝子組換え菌ＦＭ０１から、該菌株におけるｆａｄＬ遺伝子のプロモーターを大腸菌構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換し、遺伝子組換え大腸菌ＦＭ０２を得て、具体的には、
ｐＫＤ４６プラスミドを含む宿主菌株を製造するというステップ（２－ａ）であって、
ｐＫＤ４６プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を塩化カルシウム形質転換法によって前のステップで得られたＦＭ０１菌株に形質転換し、アンピシリンを含むＬＢプレートにおいて３０℃で一晩培養した後、クローンを選択し、プラスミドｐＫＤ４６を含む遺伝子組換え大腸菌ＦＭ０１／ｐＫＤ４６を得て、遺伝子組換え大腸菌ＦＭ０１／ｐＫＤ４６をアラビノースによって誘導した後、λバクテリオファージの３つの遺伝子組換えタンパク質を発現し、よって宿主菌株は相同組換えの機能を有し、その後１０％のグリセリンで洗浄してＦＭ０１／ｐＫＤ４６コンピテント細胞を製造するものと、
置換プロモーター標的遺伝子断片を増幅させるのに用いられるプラスミドを製造するというステップ（２－ｂ）であって、
ＣＰＡ１－Ｌｏｘ６６－Ｋａｎ－Ｌｏｘ７１断片のヌクレオチド配列は、配列番号３に示すとおりであり、ＣＰＡ１－Ｌｏｘ６６－Ｋａｎ－Ｌｏｘ７１は、ヌクレオチド配列が配列番号３の第１４４３～１６２２位である構成的プロモーターＰＣＰＡ１配列Ａと、ヌクレオチド配列が配列番号３の第２１～１４３３位であるＬＯＸＰサイトを持つカナマイシン耐性遺伝子（ＬＯＸＰ－ｋａｎ－ＬＯＸＰ）Ｂとを含み、ＣＰＡ１－Ｌｏｘ６６－Ｋａｎ－Ｌｏｘ７１配列は全遺伝子合成（南京金士瑞生物科技有限会社）により、ｐＵＣ５７ベクターに結合され、遺伝子組換えベクターｐＵＣ５７－９Ｋを得るものと、
ターゲティング断片ｆａｄＬｕｐ－ｋａｎ－ＰＣＰＡ１－ｆａｄＬｄｏｗｎを製造するというステップ（２－ｃ）であって、
ｐＵＣ５７－９Ｋをテンプレートとし、プライマーｆａｄＬ－ＰＦ／ｆａｄＬ－ＰＲを用いてｆａｄＬｕｐ－ｋａｎ－ＰＣＰＡ１－ｆａｄＬｄｏｗｎ断片を増幅し、ｆａｄＬｕｐ－ｋａｎ－ＰＣＰＡ１－ｆａｄＬｄｏｗｎ断片の配列は配列表中の配列番号４であり、該断片は、
ヌクレオチド配列が配列番号４の第１～５１位であるｆａｄＬ遺伝子のプロモーターの上流相同性アームｆａｄＬｕｐ（ａ）、ヌクレオチド配列が配列番号４の第５２～１４９２位であるＬＯＸＰサイトを持つカナマイシン耐性遺伝子（ＬＯＸＰ－ｋａｎ－ＬＯＸＰ）（ｂ）、ヌクレオチド配列が配列番号４の第１４９３～１６７０位である大腸菌構成的プロモーターＰＣＰＡ１（ｃ）、ヌクレオチド配列が配列番号４の第１６７１～１７２２位であるｆａｄＬ遺伝子のプロモーターの下流相同性アームｆａｄＬｄｏｗｎ（ｄ）を含むものと、
相同組換えを行うというステップ（２－ｄ）であって、
上記ｆａｄＬｕｐ－ｋａｎ－ＰＣＰＡ１－ｆａｄＬｄｏｗｎ断片を電気穿孔法によって（２－ａ）で製造したＦＭ０１／ｐＫＤ４６コンピテント細胞に導入し、カナマイシン（濃度が５０μｇ／ｍｌである）を含むＬＢプレートにおいて３７℃で一晩培養し、クローンを選択し、ｆａｄＬ－ＰＩＦ／ｆａｄＬ－ＰＩＲプライマーでＰＣＲによって増幅と同定を行い（陽性である約２０００ｂｐの目的バンドが増幅され、陰性である約４００ｂｐの目的バンドが増幅される）、陽性クローンを選択してＦＭ０２－ｋａｎと名付ける。ここで、プライマーの結合位置はそれぞれ大腸菌ＢＷ２５１１３のｆａｄＬ遺伝子のプロモーターの上流領域と下流領域であり、配列解析結果からＦＭ０２－ｋａｎのゲノムにステップ（２－ｃ）のｆａｄＬｕｐ－ｋａｎ－ＰＣＰＡ１－ｆａｄＬｄｏｗｎ断片を含むことを示すものと、
耐性を除去するというステップ（２－ｅ）であって、
ｐＣＰ２０プラスミド（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製）を塩化カルシウム形質転換法によってＦＭ０２－Ｋａｎに形質転換し、アンピシリンを含むＬＢプレートにおいて３０℃で一晩培養した後、クローンを選択し、プラスミドｐＣＰ２０を含む遺伝子組換え大腸菌ＦＭ０２－Ｋａｎ／ｐＣＰ２０を得て、アンピシリン耐性を有するＬＢ培地において３０℃で培養した後、耐性のないＬＢプレートに塗布し、４３℃で一晩培養し、クローンを選択し、ｆａｄＬ－ＰＩＦ／ｆａｄＬ－ＰＩＲプライマーでＰＣＲによって増幅と同定を行い（陽性である約６００ｂｐの目的バンドが増幅され、陰性である約２０００ｂｐ又は４００ｂｐの目的バンドが増幅される）、陽性クローンを選択してＦＭ０２と名付け、
ここで、ＦＭ０２はＦＭ０１のｆａｄＬ遺伝子のプロモーターを構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換した菌株であり、ＦＭ０１において、ｆａｄＬ遺伝子は配列番号６に示されるタンパク質をコードし、ｆａｄＬ遺伝子のコード配列は配列番号５に示すとおりであり、配列解析結果からＦＭ０２のゲノムにおけるｆａｄＬ遺伝子のプロモーターが構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換されたことを示し、ｆａｄＬ遺伝子の発現はＰＣＰＡ１により開始されるものと、を含む。
（３）プロモーター置換によってｆａｄＤ遺伝子の発現を増強する。
遺伝子組換え菌ＦＭ０２から、該菌株におけるアシルＣｏＡシンセターゼ遺伝子、即ちｆａｄＤ遺伝子のプロモーターを大腸菌構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換し、遺伝子組換え大腸菌ＦＭ０３を得て、具体的には、
ｐＫＤ４６プラスミドを含む宿主菌株を製造するというステップ（３－ａ）であって、
ステップ（２）の方法に応じて、ｐＫＤ４６プラスミドを前のステップで得られたＦＭ０２菌株に形質転換し、プラスミドｐＫＤ４６を含む遺伝子組換え大腸菌ＦＭ０２／ｐＫＤ４６を得て、その後ＦＭ０２／ｐＫＤ４６コンピテント細胞を製造するものと、
ターゲティング断片ｆａｄＤｕｐ－ｋａｎ－ＰＣＰＡ１－ｆａｄＤｄｏｗｎを製造するというステップ（３－ｂ）であって、
ステップ（２）のｐＵＣ５７－９Ｋをテンプレートとし、プライマーｆａｄＤ－ＰＦ／ｆａｄＤ－ＰＲを用いてｆａｄＤｕｐ－ｋａｎ－ＰＣＰＡ１－ｆａｄＤｄｏｗｎ断片を増幅され、ｆａｄＤｕｐ－ｋａｎ－ＰＣＰＡ１－ｆａｄＤｄｏｗｎ断片の配列は配列表中の配列番号７であり、該断片は、
ヌクレオチド配列が配列番号７の第１～５１位であるｆａｄＤ遺伝子のプロモーターの上流相同性アームｆａｄＤｕｐ（ａ）、ヌクレオチド配列が配列番号７の第５２～１４９２位であるＬＯＸＰサイトを持つカナマイシン耐性遺伝子（ＬＯＸＰ－ｋａｎ－ＬＯＸＰ）（ｂ）、ヌクレオチド配列が配列番号７の第１４９３～１６７０位である大腸菌構成的プロモーターＰＣＰＡ１（ｃ）、ヌクレオチド配列が配列番号７の第１６７１～１７２２位であるｆａｄＤ遺伝子のプロモーターの下流相同性アームｆａｄＤｄｏｗｎ（ｄ）を含むものと、
相同組換えを行うというステップ（３－ｃ）であって、
上記ｆａｄＤｕｐ－ｋａｎ－ＰＣＰＡ１－ｆａｄＤｄｏｗｎ断片を電気穿孔法によって（３－ａ）で製造したＦＭ０２／ｐＫＤ４６コンピテント細胞に導入し、カナマイシン（濃度が５０μｇ／ｍｌである）を含むＬＢプレートにおいて３７℃で一晩培養し、クローンを選択し、ｆａｄＤ－ＰＩＦ／ｆａｄＤ－ＰＩＲプライマーでＰＣＲによって増幅と同定を行い（陽性である２０００ｂｐの目的バンドが増幅され、陰性である約４００ｂｐの目的バンドが増幅される）、陽性クローンを選択してＦＭ０３－ｋａｎと名付け、ここで、プライマーの結合位置はそれぞれ大腸菌ＢＷ２５１１３のｆａｄＤ遺伝子のプロモーターの上流領域と下流領域であり、配列解析結果からＦＭ０３－ｋａｎのゲノムにステップ（３－ｂ）のｆａｄＤｕｐ－ｋａｎ－ＰＣＰＡ１－ｆａｄＤｄｏｗｎ断片を含むことを示すものと、
耐性を除去するというステップ（３－ｄ）であって、
ステップ（２）の方法に応じてｐＣＰ２０プラスミドを利用してＦＭ０３－ｋａｎのカナマイシン耐性を除去し、ｆａｄＤ－ＰＩＦ／ｆａｄＤ－ＰＩＲプライマーでＰＣＲによって増幅と同定を行い（陽性である約６００ｂｐの目的バンドが増幅され、陰性である約２０００ｂｐ又は４００ｂｐの目的バンドが増幅される）、陽性クローンを選択してＦＭ０３と名付け、
ここで、ＦＭ０３はＦＭ０２のｆａｄＤ遺伝子のプロモーターを構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換した菌株であり、ＦＭ０２において、ｆａｄＤ遺伝子は配列番号９に示されるタンパク質をコードし、ｆａｄＤ遺伝子のコード配列は配列番号８に示すとおりであり、配列解析結果からＦＭ０３のゲノムにおけるｆａｄＤ遺伝子のプロモーターが構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換されたことを示し、ｆａｄＤ遺伝子の発現はＰＣＰＡ１により開始されるものと、を含む。
（４）プロモーター置換によってｓｔｈＡ遺伝子の発現を増強する。
遺伝子組換え菌ＦＭ０３から、該菌株におけるアシルＣｏＡシンセターゼ遺伝子、即ちｓｔｈＡ遺伝子のプロモーターを大腸菌構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換し、遺伝子組換え大腸菌ＦＭ０４を得て、具体的には、
ｐＫＤ４６プラスミドを含む宿主菌株を製造するというステップ（４－ａ）であって、
ステップ（２）の方法に応じて、ｐＫＤ４６プラスミドを前のステップで得られたＦＭ０３菌株に形質転換し、プラスミドｐＫＤ４６を含む遺伝子組換え大腸菌ＦＭ０３／ｐＫＤ４６を得て、その後ＦＭ０３／ｐＫＤ４６コンピテント細胞を製造するものと、
ターゲティング断片ｓｔｈＡｕｐ－ｋａｎ－ＰＣＰＡ１－ｓｔｈＡｄｏｗｎを製造するというステップ（４－ｂ）であって、
ステップ（２）のｐＵＣ５７－９Ｋをテンプレートとし、プライマーｓｔｈＡ－ＰＦ／ｓｔｈＡ－ＰＲを用いてｓｔｈＡｕｐ－ｋａｎ－ＰＣＰＡ１－ｓｔｈＡｄｏｗｎ断片が増幅され、ｓｔｈＡｕｐ－ｋａｎ－ＰＣＰＡ１－ｓｔｈＡｄｏｗｎ断片の配列は配列表中の配列番号１０であり、該断片は、
ヌクレオチド配列が配列番号１０の第１～５１位であるｓｔｈＡ遺伝子のプロモーターの上流相同性アームｆａｄＤｕｐ（ａ）、ヌクレオチド配列が配列番号１０の第５２～１４９２位であるＬＯＸＰサイトを持つカナマイシン耐性遺伝子（ＬＯＸＰ－ｋａｎ－ＬＯＸＰ）（ｂ）、ヌクレオチド配列が配列番号１０の第１４９３～１６７０位である大腸菌構成的プロモーターＰＣＰＡ１（ｃ）、ヌクレオチド配列が配列番号１０の第１６７１～１７２２位であるｓｔｈＡ遺伝子のプロモーターの下流相同性アームｆａｄＤｄｏｗｎ（ｄ）を含むものと、
相同組換えを行うというステップ（４－ｃ）であって、
上記ｓｔｈＡｕｐ－ｋａｎ－ＰＣＰＡ１－ｓｔｈＡｄｏｗｎ断片を電気穿孔法によって（４－ａ）で製造したＦＭ０３／ｐＫＤ４６コンピテント細胞に導入し、カナマイシン（濃度が５０μｇ／ｍｌである）を含むＬＢプレートにおいて３７℃で一晩培養し、クローンを選択し、ｓｔｈＡ－ＰＩＦ／ｓｔｈＡ－ＰＩＲプライマーでＰＣＲによって増幅と同定を行い（陽性である約２０００ｂｐの目的バンドが増幅され、陰性である約４００ｂｐの目的バンドが増幅される）、陽性クローンを選択してＦＭ０４－ｋａｎと名付け、ここで、プライマーの結合位置はそれぞれ大腸菌ＢＷ２５１１３のｓｔｈＡ遺伝子のプロモーターの上流領域と下流領域であり、配列解析結果からＦＭ０４－ｋａｎのゲノムにステップ（４－ｂ）のｓｔｈＡｕｐ－ｋａｎ－ＰＣＰＡ１－ｓｔｈＡｄｏｗｎ断片を含むことを示すものと、
耐性を除去するというステップ（４－ｄ）であって、
ステップ（２）の方法に応じてｐＣＰ２０プラスミドを利用してＦＭ０４－ｋａｎのカナマイシン耐性を除去し、ｓｔｈＡ－ＰＩＦ／ｓｔｈＡ－ＰＩＲプライマーでＰＣＲによって増幅と同定を行い（陽性である約６００ｂｐの目的バンドが増幅され、陰性である約２０００ｂｐ又は４００ｂｐの目的バンドが増幅される）、陽性クローンを選択してＦＭ０４と名付け、
ここで、ＦＭ０４はＦＭ０３のｓｔｈＡ遺伝子のプロモーターを構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換した菌株であり、ＦＭ０３において、ｓｔｈＡ遺伝子は配列番号１２に示されるタンパク質をコードし、ｓｔｈＡ遺伝子のコード配列は配列番号１１に示すとおりであり、配列解析結果からＦＭ０４のゲノムにおけるｓｔｈＡ遺伝子のプロモーターが構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換されたことを示し、ｓｔｈＡ遺伝子の発現はＰＣＰＡ１により開始されるものと、を含む。
（５）β－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼＩＩ遺伝子ｆａｂＦをノックアウトする。
遺伝子組換え菌ＦＭ０４から、ＦＭ０４のｆａｂＦ遺伝子をノックアウトし、ＦＭ０５を得て、具体的には、
ｆａｂＦノックアウト形質を有する大腸菌の遺伝子断片を含むＰ１バクテリオファージを製造するというステップ（５－ａ）であって、
ｆａｂＦノックアウト形質を有する大腸菌の遺伝子断片は大腸菌の菌株ＪＷ１０８１からのものであり、ＪＷ１０８１は日本国立遺伝学研究所（ＮＩＧ、Ｊａｐａｎ）の製品であり、ステップ（１）のＰ１バクテリオファージの製造方法に応じて、ＪＷ１１７６菌株を菌株ＪＷ１０８１に置換し、ｆａｂＦノックアウト形質を有する大腸菌の遺伝子断片を含有するバクテリオファージＰ１ｖｉｒ ｆａｂＦを得るものと、
Ｐ１バクテリオファージの形質導入技術による大腸菌の菌株ＦＭ０５－Ｋａｎを構築するというステップ（５－ｂ）であって、
ステップ（１）の方法に応じて、大腸菌ＢＷ２５１１３をステップ（４）のＦＭ０４に置換し、ｆａｂＦ－ＩＦ／ｆａｂＦ－ＩＲプライマーでＰＣＲによって増幅と同定を行い（陽性である約１７００ｂｐの目的バンドが増幅される）、陽性クローンを選択してＦＭ０５－Ｋａｎと名付けるものと、
耐性を除去するというステップ（５－ｃ）であって、
ステップ（１）の方法に応じて、ＦＭ０１－ＫａｎをＦＭ０５－Ｋａｎに置換し、菌株のカナマイシン耐性を除去し、ｆａｂＦ－ＩＦ／ｆａｂＦ－ＩＲプライマーでＰＣＲによって増幅と同定を行い（陽性である４００ｂｐの目的バンドが増幅される）、陽性クローンを選択してＦＭ０５と名付け、
ここで、ＦＭ０５はＦＭ０４のｆａｂＦ遺伝子をノックアウトした菌株であり、ＦＭ０４において、ｆａｂＦ遺伝子は配列番号１４に示されるタンパク質をコードし、ｆａｂＦ遺伝子のコード配列は配列番号１３に示すとおりであり、ｆａｂＦ－ＩＦ／ｆａｂＦ－ＩＲはＦＭ０５のゲノムＤＮＡから１つの約４００ｂｐの断片が増幅され、ＦＭ０４のゲノムＤＮＡから１つの約１６００ｂｐの断片が増幅され、ここで、ｆａｂＦ－ＩＦとｆａｂＦ－ＩＲプライマーとの結合位置はそれぞれ大腸菌ＢＷ２５１１３のｆａｂＦ遺伝子の上流領域と下流領域であり、配列解析結果はＦＭ０５のゲノムにｆａｂＦ遺伝子がないことを示し、ＦＭ０５はＦＭ０４のｆａｂＦ遺伝子をノックアウトして得られた菌株であるものと、を含む。
（６）β－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼＩＩＩ遺伝子、即ちｆａｂＨ遺伝子をノックアウトする。
遺伝子組換え菌ＦＭ０５から、ＦＭ０５のｆａｂＨ遺伝子をノックアウトし、ＦＭ０６を得て、具体的には、
ｆａｂＨノックアウト形質を有する大腸菌の遺伝子断片を含むＰ１バクテリオファージを製造するというステップ（６－ａ）であって、
ｆａｂＨノックアウト形質を有する大腸菌の遺伝子断片は大腸菌の菌株ＪＷ１０７７からのものであり、ＪＷ１０７７は日本国立遺伝学研究所（ＮＩＧ、Ｊａｐａｎ）の製品であり、ステップ（１）のＰ１バクテリオファージの製造方法に応じて、ＪＷ１１７６菌株を菌株ＪＷ１０７７に置換し、ｆａｂＨノックアウト形質を有する大腸菌の遺伝子断片を含有するバクテリオファージＰ１ｖｉｒ ｆａｂＨを得るものと、
Ｐ１バクテリオファージの形質導入技術によって大腸菌の菌株ＦＭ０６－Ｋａｎを構築するというステップ（６－ｂ）であって、
ステップ（１）の方法に応じて、大腸菌ＢＷ２５１１３をステップ（４）のＦＭ０５に置換し、ｆａｂＨ－ＩＦ／ｆａｂＨ－ＩＲプライマーでＰＣＲによって増幅と同定を行い（陽性である１７００ｂｐの目的バンドが増幅される）、陽性クローンを選択してＦＭ０６－Ｋａｎと名付けるものと、
耐性を除去するというステップ（６－ｃ）であって、
ステップ（１）の方法に応じて、ＦＭ０１－ＫａｎをＦＭ０６－Ｋａｎに置換し、菌株のカナマイシン耐性を除去し、ｆａｂＨ－ＩＦ／ｆａｂＨ－ＩＲプライマーでＰＣＲによって増幅と同定を行い（陽性である４００ｂｐの目的バンドが増幅される）、陽性クローンを選択してＦＭ０６と名付け、
ここで、ＦＭ０６はＦＭ０５のｆａｂＨ遺伝子をノックアウトした菌株であり、ＦＭ０５において、ｆａｂＨ遺伝子は配列番号１６に示されるタンパク質をコードし、ｆａｂＨ遺伝子のコード配列は配列番号１５に示すとおりであり、ｆａｂＨ－ＩＦ／ｆａｂＨ－ＩＲはＦＭ０６のゲノムＤＮＡから１つの約４００ｂｐの断片が増幅され、ＦＭ０５のゲノムＤＮＡから１つの約１４００ｂｐの断片が増幅され、ここで、ｆａｂＨ－ＩＦとｆａｂＨ－ＩＲプライマーとの結合位置はそれぞれ大腸菌ＢＷ２５１１３のｆａｂＨ遺伝子の上流領域と下流領域であり、配列解析結果からＦＭ０６のゲノムにｆａｂＨ遺伝子がないことを示し、ＦＭ０６はＦＭ０５のｆａｂＨ遺伝子をノックアウトして得られた菌株であるものと、を含む。
（７）プロモーター置換によってａｔｏＳ遺伝子とａｔｏＣ遺伝子との発現を増強する。
遺伝子組換え菌ＦＭ０６から、該菌株における短鎖脂肪酸分解を制御する遺伝子クラスターａｔｏＳＣ（該遺伝子クラスターはａｔｏＳ遺伝子とａｔｏＣ遺伝子とを含む）のプロモーターを大腸菌構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換し、遺伝子組換え大腸菌ＦＭ０７を得て、具体的には、
ｐＫＤ４６プラスミドを含む宿主菌株を製造するというステップ（７－ａ）であって、
ステップ（２）の方法に応じて、ｐＫＤ４６プラスミドを前のステップで得られたＦＭ０６菌株に形質転換し、プラスミドｐＫＤ４６を含む遺伝子組換え大腸菌ＦＭ０６／ｐＫＤ４６を得て、その後ＦＭ０６／ｐＫＤ４６コンピテント細胞を製造するものと、
ターゲティング断片ａｔｏＳＣｕｐ－ｋａｎ－ＰＣＰＡ１－ａｔｏＳＣｄｏｗｎを製造するというステップ（７－ｂ）であって、
ステップ（２）のｐＵＣ５７－９Ｋをテンプレートとし、プライマーａｔｏＳＣ－ＰＦ／ａｔｏＳＣ－ＰＲを用いてａｔｏＳＣｕｐ－ｋａｎ－ＰＣＰＡ１－ａｔｏＳＣｄｏｗｎ断片が増幅され、ａｔｏＳＣｕｐ－ｋａｎ－ＰＣＰＡ１－ａｔｏＳＣｄｏｗｎ断片の配列は配列表中の配列番号１７であり、該断片は、
ヌクレオチド配列が配列番号１７の第１～５１位であるａｔｏＳＣ遺伝子クラスターのプロモーターの上流相同性アームａｔｏＳＣｕｐ（ａ）、ヌクレオチド配列が配列番号１７の第５２～１４９２位であるＬＯＸＰサイトを持つカナマイシン耐性遺伝子（ＬＯＸＰ－ｋａｎ－ＬＯＸＰ）（ｂ）、ヌクレオチド配列が配列番号１７の第１４９３～１６７０位である大腸菌構成的プロモーターＰＣＰＡ１（ｃ）、ヌクレオチド配列が配列番号１７の第１６７１～１７２２位であるａｔｏＳＣ遺伝子クラスターのプロモーターの下流相同性アームａｔｏＳＣｄｏｗｎ（ｄ）を含むものと、
相同組換えを行うというステップ（７－ｃ）であって、
上記ａｔｏＳＣｕｐ－ｋａｎ－ＰＣＰＡ１－ａｔｏＳＣｄｏｗｎ断片を電気穿孔法によって（７－ａ）で製造したＦＭ０６／ｐＫＤ４６コンピテント細胞に導入し、カナマイシン（濃度が５０μｇ／ｍｌである）を含むＬＢプレートにおいて３７℃で一晩培養し、クローンを選択し、ａｔｏＳＣ－ＰＩＦ／ａｔｏＳＣ－ＰＩＲプライマーでＰＣＲによって増幅と同定を行い（陽性である２０００ｂｐの目的バンドが増幅され、陰性である４００ｂｐの目的バンドが増幅される）、陽性クローンを選択してＦＭ０７－ｋａｎと名付け、ここで、プライマーの結合位置はそれぞれ大腸菌ＢＷ２５１１３のａｔｏＳＣ遺伝子クラスターのプロモーターの上流領域と下流領域であり、配列解析結果からＦＭ０７－ｋａｎのゲノムにステップ（７－ｂ）のａｔｏＳＣｕｐ－ｋａｎ－ＰＣＰＡ１－ａｔｏＳＣｄｏｗｎ断片を含むことを示すものと、
耐性を除去するというステップ（７－ｄ）であって、
ステップ（２）の方法に応じてｐＣＰ２０プラスミドを利用してＦＭ０７－ｋａｎのカナマイシン耐性を除去し、ａｔｏＳＣ－ＰＩＦ／ａｔｏＳＣ－ＰＩＲプライマーでＰＣＲによって増幅と同定を行い（陽性である約６００ｂｐの目的バンドが増幅され、陰性である約２０００ｂｐ又は４００ｂｐｂｐの目的バンドが増幅される）、陽性クローンを選択してＦＭ０７と名付け、
ここで、ＦＭ０７はＦＭ０６のａｔｏＳＣ遺伝子クラスターのプロモーターを構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換した菌株であり、ＦＭ０６において、ａｔｏＳＣ遺伝子クラスターにおけるａｔｏＳ遺伝子は配列番号１９に示されるタンパク質をコードし、ａｔｏＳ遺伝子のコード配列は配列番号１８に示すとおりであり、ａｔｏＣ遺伝子は配列番号２１に示されるタンパク質をコードし、ａｔｏＣ遺伝子のコード配列は配列番号２０に示すとおりであり、配列解析結果からＦＭ０７のゲノムにおけるａｔｏＳＣ遺伝子クラスターのプロモーターが構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換されたことを示し、ａｔｏＳＣ遺伝子クラスターにおけるａｔｏＳ遺伝子とａｔｏＣ遺伝子との発現はＰＣＰＡ１により開始されるものと、を含むものとを含む。
Figure 0007261222000001
実施例２：β－アラニンを生産する菌株ＦＭ０８の製造及びβ－アラニンの生産
一、β－アラニン（β－ａｌａｎｉｎｅ）を生産する菌株ＦＭ０８の製造
ＦＭ０８の製造方法は以下に示すとおりであり、使用されるプライマーは表２に示す。
（１）クロロフレクサス・オーランティアカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）マロニルＣｏＡレダクターゼのトランケーション体遺伝子ｍｃｒＣを表現するプラスミドの構築：
（１－ａ）ｍｃｒＣ遺伝子のＰＣＲ増幅
遺伝子操作したクロロフレクサス・オーランティアカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）マロニルＣｏＡレダクターゼのトランケーション体遺伝子ｍｃｒＣのヌクレオチド配列は、配列番号２２に示すとおりであり、配列表中の配列番号２３に示されるタンパク質をコードし、全遺伝子合成によって配列番号２２に示されるｍｃｒＣ遺伝子を構築し、その後ギブソンアセンブリ法（Ｇｉｂｓｏｎ ＤＧ、Ｙｏｕｎｇ Ｌ、ｅｔ ａｌ．Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｐ ｔｏ ｓｅｖｅｒａｌ ｈｕｎｄｒｅｄ ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．Ｎａｔ．ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９；６（５）：３４３－３４５）で配列番号２２に示されるｍｃｒＣ遺伝子をｐＵＣ５７ベクターに結合させ、ベクターｐＵＣ５７－ｍｃｒＣを得て、ｍｃｒＣ－ＦとｍｃｒＣ－Ｒとをプライマーとし、ベクターｐＵＣ５７－ｍｃｒＣをテンプレートとし、高忠実度のＴｒａｎｓＳｔａｒｔ ＦａｓｔＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（北京全式金バイオテクノロジー有限会社、製品カタログはＡＰ２２１である）でＰＣＲ増幅を行い、配列の正しいｍｃｒＣ遺伝子断片を得る。
（１－ｂ）ｍｃｒＣ遺伝子を含む組換え発現ベクターの構築：
ＮｃｏＩとＸｈｏＩとでベクターｐＬＢ１ａ（ベクターｐＬＢ１ａのヌクレオチド配列は、配列番号２４に示すとおりである）を消化し、ベクターの大きな断片ＬＢ１ａ－ＮＸを回収し、ギブソンアセンブリ法で上記（１－ａ）で得られた配列の正しいｍｃｒＣ遺伝子断片をＬＢ１ａ－ＮＸ断片とライゲーション反応させ、ＣａＣｌ２法によって大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞（北京全式金バイオテクノロジー有限会社、製品カタログはＣＤ２０１である）に形質転換し、アンピシリンを含むＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩培養し、クローンを選択し、プライマーＦ１０５－Ｆ／ｍｃｒＣ－Ｒで同定し、目的断片配列の正しい陽性クローンを選択してプラスミドを抽出し、得られた陽性組換えプラスミドをｐＬＢ１ａ－ｍｃｒＣと名付ける。
（２）コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子、即ちａｃｃ遺伝子クラスターを表現するプラスミドの構築：
全遺伝子合成によってコリネバクテリウム・グルタミカムアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子、即ちａｃｃ遺伝子クラスターを構築し、ギブソンアセンブリ法でｐＵＣ５７ベクターに結合させ、ベクターｐＵＣ５７－ａｃｃを得る。ａｃｃ遺伝子クラスターのヌクレオチド配列は、配列番号２５に示すとおりである。ここで、ａｃｃＢＣ遺伝子の前のＲＢＳ１部位に位置し、配列は配列番号２５の第２～７位である。ａｃｃＢＣのヌクレオチド配列は配列番号２５の第１５～１７９０位であり、アミノ酸配列は配列番号２６であり、ａｃｃＤＡのヌクレオチド配列は配列番号２５の第１８０５～３２５９位であり、アミノ酸配列は配列番号２７であり、ａｃｃＢＣとａｃｃＤＡ配列との間はＲＢＳ２部位を含み、配列は配列番号２５の第１７９２～１７９７位である。ａｃｃ－Ｆとａｃｃ－Ｒをプライマーとし、ベクターｐＵＣ５７－ａｃｃをテンプレートとし、高忠実度のＴｒａｎｓＳｔａｒｔ ＦａｓｔＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼで配列の正しいａｃｃ遺伝子断片がＰＣＲによって増幅される。
ＸｈｏＩとＥｃｏＲＩとでステップ（１）のプラスミドｐＬＢ１ａ－ｍｃｒＣを消化し、大きな断片ＬＢ１ａ－ｍｃｒＣ－ＸＥを得る。ギブソンアセンブリ法で上記ａｃｃ遺伝子断片をＬＢ１ａ－ｍｃｒＣ－ＸＥ断片とライゲーション反応させる。ＣａＣｌ２法によって大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換する。アンピシリンを含むＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩培養する。クローンを選択し、プライマーａｃｃ－Ｆ／Ｔ５８－Ｒで同定し、目的断片配列の正しい陽性クローンを選択してプラスミドを抽出し、得られた陽性組換えプラスミドをｐＬＢ１ａ－ｍｃｒＣ－ａｃｃと名付ける。
（３）マリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）外因性アルカン取り込み外膜タンパク質遺伝子、即ちａｌｋＬ遺伝子を表現するプラスミドの構築：
細菌ゲノム抽出キット（天根生化学科技有限会社、製品カタログはＤＰ３０２である）を用いてマリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカスゲノムＤＮＡを抽出する。抽出されたマリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカスゲノムの総ＤＮＡをテンプレートとし、プライマーａｌｋＬ－Ｆ／ａｌｋＬ－ＲでＰＣＲによってａｌｋＬ遺伝子断片が増幅され、同時にＲＢＳ配列をプライマーに導入する。ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩとでステップ（２）得られたベクターｐＬＢ１ａ－ｍｃｒＣ－ａｃｃを消化し、大きな断片ＬＢ１ａ－ｍｃｒＣ－ａｃｃ－ＥＰを得る。ギブソンアセンブリ法で上記ａｌｋＬ遺伝子断片をＬＢ１ａ－ｍｃｒＣ－ａｃｃ－ＥＰ断片とライゲーション反応させる。大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、プライマーａｌｋＬ－Ｆ／Ｔ５８－Ｒで同定し、目的断片配列の正しい陽性クローンを選択してプラスミドを抽出し、得られた陽性組換えプラスミドをｐＬＢ１ａ－ｍｃｒＣ－ａｃｃ－ａｌｋＬと名付ける。
ｐＬＢ１ａ－ｍｃｒＣ－ａｃｃ－ａｌｋＬは、配列番号２２に示されるｍｃｒＣ遺伝子、配列番号２５に示されるａｃｃ遺伝子クラスター、及び配列番号２８に示されるＤＮＡ断片を含み、ここで、配列番号２８の第２～７位がＲＢＳの配列であり、配列番号２８の第１５～６８６位がａｌｋＬのヌクレオチド配列である。ｐＬＢ１ａ－ｍｃｒＣ－ａｃｃ－ａｌｋＬは、配列番号２３に示されるｍｃｒＣタンパク質、配列番号２６に示されるａｃｃＢＣタンパク質、配列番号２７に示されるａｃｃＤＡタンパク質、及び配列番号２９に示されるａｌｋＬタンパク質を発現することができる。
（４）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）β－アラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子、即ちｂａａｔ遺伝子（ｐｕｕＥ遺伝子）を表現するプラスミドの構築：
大腸菌からゲノムＤＮＡを抽出し、プライマーｐｕｕＥ－Ｆ／ｐｕｕＥ－ＲでｐｕｕＥ遺伝子断片を増幅する。ＮｃｏＩとＸｈｏＩとでベクターｐＳＢ１ｓ（ベクターｐＳＢ１ｓのヌクレオチド配列は、配列番号３０に示すとおりである）を消化し、ベクターの大きな断片ＳＢ１ｓ－ＮＸを回収する。ギブソンアセンブリ法でｐｕｕＥ遺伝子断片をＳＢ１ｓ－ＮＸ断片とライゲーション反応させる。大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、プライマーＦ１０５－Ｆ／ｐｕｕＥ－Ｒで同定し、目的断片配列の正しい陽性クローンを選択してプラスミドを抽出し、得られた陽性組換えプラスミドをｐＳＢ１ｓ－ｐｕｕＥと名付ける。
（５）バチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、即ちｇｄｈ遺伝子（ｒｏｃＧ遺伝子）を表現するプラスミドの構築：
大腸菌からゲノムＤＮＡを抽出し、プライマーｒｏｃＧ－Ｆ／ｒｏｃＧ－ＲでｒｏｃＧ遺伝子断片を増幅し、同時にＲＢＳ配列をプライマーに導入する。ＸｈｏＩとＰｓｔＩとでベクター、即ちステップ（４）のｐＳＢ１ｓ－ｐｕｕＥを消化し、大きな断片ＳＢ１ｓ－ｐｕｕＥ－ＸＰを得る。ｒｏｃＧ遺伝子断片をＳＢ１ｓ－ｐｕｕＥ－ＸＰ断片とライゲーション反応させる。大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、プライマーｒｏｃＧ－Ｆ／Ｔ－５８で同定し、目的断片配列の正しい陽性クローンを選択してプラスミドを抽出し、得られた陽性組換えプラスミドをｐＳＢ１ｓ－ｐｕｕＥ－ｒｏｃＧと名付ける。
ｐＳＢ１ｓ－ｐｕｕＥ－ｒｏｃＧは、配列番号３１に示されるｐｕｕＥ遺伝子と配列番号３３に示されるＤＮＡ断片とを含み、ここで、配列番号３３の第２～７位がＲＢＳの配列であり、配列番号３３の第１５～１２８９位がｒｏｃＧ遺伝子の配列である。ｐＳＢ１ｓ－ｐｕｕＥ－ｒｏｃＧは、配列番号３２に示されるｐｕｕＥタンパク質と配列番号３４に示されるｒｏｃＧタンパク質とを発現することができる。
（６）遺伝子組換え大腸菌ＦＭ０８の構築：
実施例１の菌株ＦＭ０７からコンピテント細胞を製造し、上記ステップで製造したｐＬＢ１ａ－ｍｃｒＣ－ａｃｃ－ａｌｋＬ及びｐＳＢ１ｓ－ｐｕｕＥ－ｒｏｃＧをＦＭ０７に導入する。ストレプトマイシンとアンピシリンを含むＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩培養する。ｐＬＢ１ａ－ｍｃｒＣ－ａｃｃ－ａｌｋＬ及びｐＳＢ１ｓ－ｐｕｕＥ－ｒｏｃＧを含む陽性クローンを選択し、ＦＭ０８と名付ける。
ＦＭ０８は大腸菌ＢＷ２５１１３に対する以下の（ａ１）～（ａ１２）のような遺伝子操作を行って得られた菌株である。
（ａ１）は、脂肪酸分解に関わる転写因子遺伝子、即ちｆａｄＲ遺伝子をノックアウトすることであり、
（ａ２）は、ｆａｄＬ遺伝子のプロモーターを大腸菌構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換することであり、
（ａ３）は、ｆａｄＤ遺伝子のプロモーターを大腸菌構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換することであり、
（ａ４）は、ｓｔｈＡ遺伝子のプロモーターを大腸菌構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換することであり、
（ａ５）は、β－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼＩＩ遺伝子、即ちｆａｂＦ遺伝子をノックアウトすることであり、
（ａ６）は、β－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼＩＩＩ遺伝子、即ちｆａｂＨ遺伝子をノックアウトすることであり、
（ａ７）は、ａｔｏＳＣ遺伝子クラスタープロモーターを大腸菌構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換することであり、
（ａ８）は、マロニルＣｏＡレダクターゼのトランケーション体遺伝子、即ちｍｃｒＣ遺伝子を導入することであり、
（ａ９）は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子、即ちａｃｃ遺伝子クラスターを導入することであり、
（ａ１０）は、外来性アルカン摂取外膜タンパク質遺伝子、即ちａｌｋＬ遺伝子を導入することであり、
（ａ１１）は、β－アラニンアミノトランスフェラーゼ遺伝子、即ちｐｕｕＥ遺伝子を導入することであり、
（ａ１２）は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、即ちｒｏｃＧ遺伝子を導入することであり、
菌株ＦＭ０７からコンピテント細胞を製造し、プラスミドｐＳＢ１ｓ及びｐＬＢ１ａをＣａＣｌ２法によってＦＭ０７に導入する。ストレプトマイシンとアンピシリンを含むＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩培養する。プラスミドｐＳＢ１ｓ及びｐＬＢ１ａを含むクローンを選択し、それをＦＭ００と名付け、対照とする。
Figure 0007261222000002
二、β－アラニンの製造
１．培地の製造
Ａ培地：Ａ培地は、溶質と溶媒とからなる無菌培地であり、溶媒は水であり、溶質及びその濃度はそれぞれ、２５ｍＭのＮａＨＰＯ４、２５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、５０ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、５ｍＭのＮａ２ＳＯ４、２ｍＭのＭｇＳＯ４、体積パーセント濃度が０．５％であるグリセリン、質量パーセント濃度が０．５％である酵母粉末、５０μｍのＦｅＣｌ３、２０μｍのＣａＣｌ２、１０μｍのＭｎＣｌ２、１０μｍのＺｎＳＯ４、２μｍのＣｏＣｌ２、２μｍのＮｉＣｌ２、２μｍのＮａ２ＭＯ４、２μｍのＮａ２ＳｅＯ３、及び２μｍのＨ３ＢＯ３である。
Ｂ培地：Ｂ培地は、Ａ培地に、パルミチン酸、ポリオキシエチレンエーテルＢｒｉｊ５８乳化剤、Ｂｉｏｔｉｎ、及びビタミンＢ６を添加して得られた無菌培地であり、ここで、パルミチン酸の質量パーセント濃度が０．５％で、ポリオキシエチレンエーテルＢｒｉｊ５８乳化剤の質量パーセント濃度が０．２％で、Ｂｉｏｔｉｎの濃度が４０ｍｇ／Ｌで、ビタミンＢ６の濃度が１０ｍｇ／Ｌである。
Ｃ培地：Ｃ培地は、Ａ培地に、パルミチン酸、ポリオキシエチレンエーテルＢｒｉｊ５８乳化剤、Ｂｉｏｔｉｎ、ＮａＨＣＯ３、ビタミンＢ６、及びグルタミン酸を添加して得られた無菌培地であり、ここで、パルミチン酸の質量パーセント濃度が１％で、ポリオキシエチレンエーテルＢｒｉｊ５８乳化剤の質量パーセント濃度が０．２％で、Ｂｉｏｔｉｎの濃度が４０ｍｇ／Ｌで、ＮａＨＣＯ３の濃度が２０ｍＭで、ビタミンＢ６の濃度が１０ｍｇ／Ｌで、グルタミン酸の濃度が２ｍＭである。
２．β－アラニンの製造
実験を３回繰り返し、毎回に繰り返す実験は、具体的には、
菌体を培養するというステップ２．１であって、
一晩培養してステップ一で得られた菌株ＦＭ０８を以下の方法に応じて培養し、菌株を１％の接種量でストレプトマイシンとカナマイシンを含む２０ｍｌのＡ培地（ストレプトマイシンとカナマイシンの濃度がいずれも５０ｍｇ／Ｌである）に接種し、３７℃で１２時間培養した後、菌体を収集し、収集した菌体をストレプトマイシンとカナマイシンを含む２０ｍｌのＢ培地（ストレプトマイシンとカナマイシンの濃度がいずれも５０ｍｇ／Ｌである）に移し、３７℃で６時間培養した後、培養液を得て、該培養液のＯＤ６００は６であり、培養液におけるアラビノース誘導の質量パーセント濃度が０．２％となるように培養液にアラビノース誘導を添加し、３７℃で１２時間培養し、菌体を収集し、ＦＭ０８菌体を得て、
上記方法に応じて、ストレプトマイシンとカナマイシンが含まれていないＡ培地とＢ培地でＦＭ００を培養し、ＦＭ００菌体を得るものと、
β－アラニンの全細胞触媒を製造するというステップ２．２であって、
上記ステップ２．１で収集した乾燥重量が３０ｍｇ（即ち、１×１０１１ｃｆｕ）であるＦＭ０８菌体を２０ｍｌのＣ培地を含む振盪フラスコに再懸濁し、３７℃で２４時間培養した後、遠心分離して上澄み液を０．２２μｍのフィルターで濾過し、濾液を得て、ＦＭ０８の検体であり、
上記方法に応じて、ＦＭ０８をＦＭ００菌体に変え、他のステップはいずれも変化せず、ＦＭ００の検体を得て、
β－アラニン（Ｓｉｇｍａ、０５１５９－１００Ｇ）を標準物として標準曲線法（外部標準法）でＨＰＬＣによって各の検体中のβ－アラニンの含有量を定量的に分析するものと、を含む。
定量的な検出結果は図１に示すように、ＦＭ０８の検体中のβ－アラニンの平均含有量が０．３６ｇ／Ｌ（即ち、０．３６ｇ／５×１０１２ｃｆｕ）であり、パルミチン酸の質量パーセント濃度が０．７８％である。ＦＭ００の検体中のβ－アラニンの平均含有量が０ｍｇ／Ｌであり、パルミチン酸の質量パーセント濃度が０．８９％である。ＦＭ０８を利用してパルミチン酸を基質としてβ－アラニンを製造する変換率が１６．３６％であり、ＦＭ００を利用してβ－アラニンを得ることができない。それは、ＦＭ０８を利用してβ－アラニンを製造することができることを示す。
実施例３：３－ヒドロキシプロピオン酸を生産する菌株ＦＩ０８の製造及び３－ヒドロキシプロピオン酸の製造
一、３－ヒドロキシプロピオン酸を生産する菌株ＦＩ０８の製造
ＦＩ０８の製造方法は以下に示すとおりであり、使用されるプライマーは表３に示す。
（１）コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子、即ちａｃｃ遺伝子クラスターを表現するプラスミドの構築：
（１－ａ）コリネバクテリウム・グルタミカムゲノムＤＮＡの抽出とａｃｃ遺伝子クラスターのＰＣＲ増幅：
細菌ゲノム抽出キット（天根生化学科技有限会社、製品カタログはＤＰ３０２である）を用いてコリネバクテリウム・グルタミカムゲノムＤＮＡを抽出し、抽出されたコリネバクテリウム・グルタミカムゲノムの総ＤＮＡをテンプレートとし、ａｃｃＢＣ－ＦとａｃｃＬ－Ｒをプライマーとし、高忠実度のＴｒａｎｓＳｔａｒｔ ＦａｓｔＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲによって遺伝子断片ａｃｃＢＣが増幅され、アガロースゲル電気泳動で目的断片を回収し、コリネバクテリウム・グルタミカムゲノムの総ＤＮＡをテンプレートとし、ａｃｃＬ－ＦとａｃｃＤＡ－Ｒとをプライマーとし、ＴｒａｎｓＳｔａｒｔ ＦａｓｔＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲによって遺伝子断片ａｃｃＤＡが増幅され、アガロースゲル電気泳動で目的断片を回収し、ここで、後続工程で遺伝子断片を容易に挿入できるようにａｃｃＤＡ－ＲプライマーにＮｈｅＩ部位を導入し、ａｃｃＢＣ断片の３’末端とａｃｃＤＡ断片の５’末端とにプライマーによってＲＢＳを含む相補的配列を導入して次の回の接合に用いられ、ａｃｃＢＣ、ａｃｃＤＡの２つの断片の混合物をテンプレートとし、ａｃｃＢＣ－ＦとａｃｃＤＡ－Ｒをプライマーとし、更にＰＣＲによって全長遺伝子配列を有するａｃｃ断片が増幅され、アガロースゲル電気泳動で目的断片を回収する。
（１－ｂ）ａｃｃ遺伝子を含む組換え発現ベクターの構築：
ＮｃｏＩとＸｈｏＩとでベクターｐＳＢ１ｓ（ベクターｐＳＢ１ｓのヌクレオチド配列は、配列番号３０に示すとおりである）を消化し、ベクターの大きな断片ＳＢ１ｓ－ＮＸを回収し、ギブソンアセンブリ法で上記ａｃｃ断片をＳＢ１ｓ－ＮＸ断片とライゲーション反応させ、ＣａＣｌ２法によって大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換し、それを均一にストレプトマイシンを含むＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩培養し、クローンを選択し、プライマーＦ－１０５／ａｃｃＬ－Ｒで目的断片を増幅できるクローンを同定して配列解析を行い、陽性クローンを選択してプラスミドを抽出し、陽性プラスミドを得て、ｐＳＢ１ｓ－ａｃｃと名付け、ｐＳＢ１ｓ－ａｃｃは配列番号２５の第１５～３２５９位に示されるＤＮＡ断片を含む。
（２）マリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）外因性アルカン取り込み外膜タンパク質遺伝子、即ちａｌｋＬ遺伝子を表現するプラスミドの構築：
マリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカスからゲノムＤＮＡを抽出し、プライマーａｌｋＬ－Ｆ／ａｌｋＬ－Ｒ’でａｌｋＬ遺伝子断片を増幅し、同時にＲＢＳ配列をプライマーに導入する。ＮｈｅＩとＳｐｅＩとでベクターｐＳＢ１ｓ－ａｃｃを消化し、大きな断片ＳＢ１ｓ－ａｃｃ－ＨＳを得る。ギブソンアセンブリ法でａｌｋＬ断片をＳＢ１ｓ－ａｃｃ－ＨＳ断片とライゲーション反応させる。大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、プライマーａｌｋＬ－Ｆ／Ｔ－５８で同定し、目的断片配列の正しい陽性クローンを選択してプラスミドを抽出し、得られた陽性組換えプラスミドをｐＳＢ１ｓ－ａｃｃ－ａｌｋＬと名付ける。
ｐＳＢ１ｓ－ａｃｃ－ａｌｋＬは配列番号２５の第１５～３２５９位に示されるＤＮＡ断片と配列番号２８に示されるＤＮＡ断片とを含み、ここで、配列番号２８の第２～７位がＲＢＳの配列であり、配列番号２８の第１５～６８６位がａｌｋＬのヌクレオチド配列である。ｐＳＢ１ｓ－ａｃｃ－ａｌｋＬは配列番号２６に示されるａｃｃＢＣタンパク質、配列番号２７に示されるａｃｃＤＡタンパク質及び配列番号２９に示されるａｌｋＬタンパク質を発現することができる。
（３）クロロフレクサス・オーランティアカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）マロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子ｍｃｒを表現するプラスミドの構築：
（３－ａ）ｍｃｒ遺伝子のＰＣＲ増幅：
遺伝子操作したクロロフレクサス・オーランティアカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）マロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子、即ちｍｃｒ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号３６に示すとおりであり、ここで、ｍｃｒのＮ端ドメインヌクレオチド配列は配列番号３６の第１～１６８９位であり、ｍｃｒのＣ端ドメインヌクレオチド配列は配列番号３６の第１７０４～３７４９位であり、Ｎ端ドメインとＣ端ドメインとの間はＲＢＳ部位を含み、配列は配列番号３６の第１６９１～１６９６位であり、ｍｃｒ遺伝子配列は全遺伝子合成により、ギブソンアセンブリ法でｐＵＣ５７ベクターに結合され、ベクターｐＵＣ５７－ｍｃｒを得て、ｐＵＣ５７－ｍｃｒをテンプレートとしてプライマーｍｃｒ－Ｆ／ｍｃｒ－Ｒで増幅し、配列の正しいｍｃｒ遺伝子断片を得る。
（３－ｂ）ｍｃｒ遺伝子を含む組換え発現ベクターの構築：
上記（３－ａ）で得られた配列の正しいｍｃｒ遺伝子断片に対するアガロースゲル電気泳動を行い、目的断片を回収し、ＮｃｏＩとＸｈｏＩでベクターｐＸＢ１ｋ（ベクターｐＸＢ１ｋヌクレオチド配列は、配列番号３５に示すとおりである）を消化し、ベクターの大きな断片ＸＢ１ｋ－ＮＸを回収し、ギブソンアセンブリ法で上記（３－ａ）で得られた配列の正しいｍｃｒ遺伝子断片をＸＢ１ｋ－ＮＸ断片とライゲーション反応させ、ＣａＣｌ２法によって大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換し、ストレプトマイシンを含むＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩培養し、クローンを選択し、プライマーＦ－１０５／ｍｃｒ－Ｒで目的断片を増幅できるクローンを同定して配列解析を行い、陽性クローンを選択してプラスミドを抽出し、陽性プラスミドを得て、ｐＸＢ１ｋ－ｍｃｒと名付ける。
ｐＸＢ１ｋ－ｍｃｒは配列番号３６に示されるＤＮＡ断片を含み、配列番号３７に示されるｍｃｒタンパク質を発現することができる。
（４）遺伝子組換え大腸菌ＦＭ０８の構築：
実施例１の菌株ＦＭ０７からコンピテント細胞を製造し、プラスミドｐＳＢ１ｓ－ａｃｃ－ａｌｋＬ及びｐＸＢ１ｋ－ｍｃｒをＣａＣｌ２法によってＦＭ０７に形質転換する。ストレプトマイシンとカナマイシンを含むＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩培養する。ｐＳＢ１ｓ－ａｃｃ－ａｌｋＬ及びｐＸＢ１ｋ－ｍｃｒを含む陽性クローンを選択し、ＦＩ０８と名付ける。
ＦＩ０８は大腸菌ＢＷ２５１１３に対する以下の（ｂ１）～（ｂ１０）のような遺伝子操作を行って得られた菌株である。
（ｂ１）は、脂肪酸分解に関わる転写因子遺伝子、即ちｆａｄＲ遺伝子をノックアウトすることであり、
（ｂ２）は、ｆａｄＬ遺伝子のプロモーターを大腸菌構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換することであり、
（ｂ３）は、ｆａｄＤ遺伝子のプロモーターを大腸菌構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換することであり、
（ｂ４）は、ｓｔｈＡ遺伝子のプロモーターを大腸菌構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換することであり、
（ｂ５）は、β－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼＩＩ遺伝子、即ちｆａｂＦ遺伝子をノックアウトすることであり、
（ｂ６）は、β－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼＩＩＩ遺伝子、即ちｆａｂＨ遺伝子をノックアウトすることであり、
（ｂ７）は、ａｔｏＳＣ遺伝子クラスタープロモーターを大腸菌構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換することであり、
（ｂ８）は、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ遺伝子、即ちａｃｃ遺伝子クラスターを導入することであり、
（ｂ９）は、外来性アルカン摂取外膜タンパク質遺伝子、即ちａｌｋＬ遺伝子を導入することであり、
（ｂ１０）は、マロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子、即ちｍｃｒ遺伝子を導入することである。
実施例１の菌株ＦＭ０７からコンピテント細胞を製造し、プラスミドｐＳＢ１ｓ及びｐＸＢ１ｋをＣａＣｌ２法によってＦＭ０７に導入する。ストレプトマイシンとアンピシリンを含むＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩培養する。プラスミドｐＳＢ１ｓ及びｐＸＢ１ｋを含むクローンを選択し、それをＦＣ００と名付け、対照とする。
Figure 0007261222000003
二、３－ヒドロキシプロピオン酸（３－ＨＰ）の製造
１．培地の製造
Ｄ培地：Ｄ培地は実施例２のＡ培地にパルミチン酸とポリオキシエチレンエーテルＢｒｉｊ５８乳化剤とを添加して得られた無菌培地であり、ここで、パルミチン酸の質量パーセント濃度が０．５％で、ポリオキシエチレンエーテルＢｒｉｊ５８乳化剤の質量パーセント濃度が０．２％である。
Ｅ培地：Ｅ培地は、実施例２のＡ培地に、パルミチン酸、ポリオキシエチレンエーテルＢｒｉｊ５８乳化剤、ＢｉｏｔｉｎとＮａＨＣＯ３とを添加して得られた無菌培地であり、ここで、パルミチン酸の質量パーセント濃度が１％で、ポリオキシエチレンエーテルＢｒｉｊ５８乳化剤の質量パーセント濃度が０．２％で、Ｂｉｏｔｉｎの濃度が４０ｍｇ／Ｌで、ＮａＨＣＯ３の濃度が２０ｍＭである。
２．３－ヒドロキシプロピオン酸の製造
実験を３回繰り返し、毎回に繰り返す実験は、具体的には、
菌体を培養するというステップ２．１であって、
一晩培養してステップ一で得られた菌株ＦＩ０８を以下の方法に応じて培養し、菌株を１％の接種量で実施例２のストレプトマイシンとカナマイシンを含む２０ｍｌのＡ培地（ストレプトマイシンとカナマイシンの濃度がいずれも５０ｍｇ／Ｌである）に接種し、３７℃で１２時間培養した後、菌体を収集し、収集した菌体をストレプトマイシンとカナマイシンを含む２０ｍｌのＤ培地（ストレプトマイシンとカナマイシンの濃度がいずれも５０ｍｇ／Ｌである）に移し、３７℃で６時間培養した後、培養液を得て、該培養液のＯＤ６００は６であり、培養液におけるアラビノース誘導の質量パーセント濃度が０．２％となるように培養液にアラビノース誘導を添加し、３７℃で１２時間培養し、菌体を収集し、即ち、ＦＩ０８菌体であり、
上記方法に応じて、ストレプトマイシンとカナマイシンが含まれていないＡ培地とＤ培地とでＦＣ００を培養し、ＦＣ００菌体を得るものと、
３－ヒドロキシプロピオン酸を全細胞触媒により製造するというステップ２．２であって、
上記ステップ２．１で収集した乾燥重量が３０ｍｇ（即ち、１×１０１１ｃｆｕ）であるＦＩ０８菌体を２０ｍｌのＥ培地を含む振盪フラスコに再懸濁し、３７℃で２４時間培養した後、遠心分離して上澄み液を０．２２μｍのフィルターで濾過し、濾液を得て、ＦＩ０８の検体であり、
上記方法に応じて、ＦＩ０８をＦＣ００菌体に変え、他のステップはいずれも変化せず、ＦＣ００の検体を得るものと、を含む。
３－ヒドロキシプロピオン酸（ＴＣＩ、Ｈ０２９７－１０Ｇ）を標準物として標準曲線法（外部標準法）でＨＰＬＣによって各の検体中の３－ヒドロキシプロピオン酸の含有量を定量的に分析する。
定量的な検出結果は図２に示すように、ＦＩ０８の検体中の３－ヒドロキシプロピオン酸の平均含有量が０．５３９ｇ／Ｌ（即ち、０．５３９ｇ／５×１０１２ｃｆｕ）であり、パルミチン酸の質量パーセント濃度が０．８１％である。ＦＣ００の検体中の３－ヒドロキシプロピオン酸の平均含有量が０ｇ／Ｌであり、パルミチン酸の質量パーセント濃度が０．９１％である。ＦＩ０８を利用してパルミチン酸を基質として３－ヒドロキシプロピオン酸を生産する変換率が２８．３７％であり、ＦＣ００を利用して３－ヒドロキシプロピオン酸を得ることができない。それは、ＦＩ０８を利用して３－ヒドロキシプロピオン酸を生産することができることを示す。
実施例４：β－アラニンを生産する菌株ＦＡ１１の製造及びβ－アラニンの製造
一、β－アラニンを生産する菌株ＦＡ１１の製造
ＦＡ１１の製造方法は以下に示すとおりであり、使用されるプライマーは表４に示す。
（１）グリオキシル酸経路転写抑制因子遺伝子ｉｃｌＲをノックアウトする。
実施例１の遺伝子組換え菌ＦＭ０７から、ＦＭ０７のｉｃｌＲ遺伝子をノックアウトし、ＦＡ０８を得て、具体的には、
ｉｃｌＲノックアウト形質を有する大腸菌の遺伝子断片を含むＰ１バクテリオファージを製造するというステップ（１－ａ）であって、
ｉｃｌＲノックアウト形質を有する大腸菌の遺伝子断片は大腸菌の菌株ＪＷ３９７８からのものであり、ＪＷ３９７８は日本国立遺伝学研究所（ＮＩＧ、Ｊａｐａｎ）の製品であり、実施例１におけるステップ（１）のＰ１バクテリオファージの製造方法に応じて、ＪＷ１１７６菌株を菌株ＪＷ３９７８に置換し、ｉｃｌＲノックアウト形質を有する大腸菌の遺伝子断片を含有するバクテリオファージＰ１ｖｉｒ ｉｃｌＲを得るものと、
Ｐ１バクテリオファージの形質導入技術によって大腸菌の菌株ＦＡ０８－Ｋａｎを構築するというステップ（１－ｂ）であって、
実施例１におけるステップ（１）の方法に応じて、大腸菌ＢＷ２５１１３を実施例１の遺伝子組換え菌ＦＭ０７に置換し、ｉｃｌＲ－ＩＦ／ｉｃｌＲ－ＩＲプライマーでＰＣＲによって増幅と同定を行い（陽性である１７００ｂｐの目的バンドが増幅される）、陽性クローンを選択してＦＡ０８－Ｋａｎと名付けるものと、
耐性を除去するというステップ（１－ｃ）であって、
実施例１におけるステップ（１）の方法に応じて、ＦＭ０１－ＫａｎをＦＡ０８－Ｋａｎに置換し、菌株のカナマイシン耐性を除去し、ｉｃｌＲ－ＩＦ／ｉｃｌＲ－ＩＲプライマーでＰＣＲによって増幅と同定を行い（陽性である４００ｂｐの目的バンドが増幅される）、陽性クローンを選択してＦＡ０８と名付け、
ここで、ＦＡ０８は実施例１におけるＦＭ０７のｉｃｌＲ遺伝子をノックアウトした菌株であり、ＦＭ０７において、ｉｃｌＲ遺伝子は配列番号３９に示されるタンパク質をコードし、ｉｃｌＲ遺伝子のコード配列は配列番号３８に示すとおりであり、ｉｃｌＲ－ＩＦ／ｉｃｌＲ－ＩＲはＦＡ０８のゲノムＤＮＡから１つの約４００ｂｐの断片が増幅され、ＦＭ０７のゲノムＤＮＡから１つの約１２００ｂｐの断片が増幅され、ここで、ｉｃｌＲ－ＩＦとｉｃｌＲ－ＩＲプライマーとの結合位置はそれぞれ大腸菌ＢＷ２５１１３のｉｃｌＲ遺伝子の上流領域と下流領域であり、配列解析結果からＦＡ０８のゲノムにｉｃｌＲ遺伝子がないことを示し、ＦＡ０８は実施例１におけるＦＭ０７のｉｃｌＲ遺伝子をノックアウトして得られた菌株であるものと、を含む。
（２）α－ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ遺伝子ｓｕｃＡをノックアウトする。
ＦＡ０８から、ＦＡ０８のｓｕｃＡ遺伝子をノックアウトし、ＦＡ０９を得て、具体的には、
ｓｕｃＡノックアウト形質を有する大腸菌の遺伝子断片を含むＰ１バクテリオファージを製造するというステップ（２－ａ）であって、
ｓｕｃＡノックアウト形質を有する大腸菌の遺伝子断片は大腸菌の菌株ＪＷ０７１５からのものであり、ＪＷ０７１５は日本国立遺伝学研究所（ＮＩＧ、Ｊａｐａｎ）の製品であり、実施例１におけるステップ（１）のＰ１バクテリオファージの製造方法に応じて、ＪＷ１１７６菌株を菌株ＪＷ０７１５に置換し、ｓｕｃＡノックアウト形質を有する大腸菌の遺伝子断片を含有するバクテリオファージＰ１ｖｉｒ ｓｕｃＡを得るものと、
Ｐ１バクテリオファージの形質導入技術によって大腸菌の菌株ＦＡ０９－Ｋａｎを構築するというステップ（２－ｂ）であって、
実施例１におけるステップ（１）の方法に応じて、大腸菌ＢＷ２５１１３をＦＡ０８に置換し、ｓｕｃＡ－ＩＦ／ｓｕｃＡ－ＩＲプライマーでＰＣＲによって増幅と同定を行い（陽性である１７００ｂｐの目的バンドが増幅される）、陽性クローンを選択してＦＡ００－Ｋａｎと名付けるものと、
耐性を除去するというステップ（２－ｃ）であって、
実施例１におけるステップ（１）の方法に応じて、ＦＭ０１－ＫａｎをＦＡ０９－Ｋａｎに置換し、菌株のカナマイシン耐性を除去し、ｓｕｃＡ－ＩＦ／ｓｕｃＡ－ＩＲプライマーでＰＣＲによって増幅と同定を行い（陽性である４００ｂｐの目的バンドが増幅される）、陽性クローンを選択してＦＡ０９と名付け、
ここで、ＦＡ０９はＦＡ０８のｓｕｃＡ遺伝子をノックアウトした菌株であり、ＦＡ０８において、ｓｕｃＡ遺伝子は配列番号４１に示されるタンパク質をコードし、ｓｕｃＡ遺伝子のコード配列は配列番号４０に示すとおりであり、ｓｕｃＡ－ＩＦ／ｓｕｃＡ－ＩＲはＦＡ０９のゲノムＤＮＡから１つの約４００ｂｐの断片が増幅され、ＦＭ０８ゲノムＤＮＡから１つの約３２００ｂｐの断片が増幅され、ここで、ｓｕｃＡ－ＩＦとｓｕｃＡ－ＩＲプライマーとの結合位置はそれぞれ大腸菌ＢＷ２５１１３のｓｕｃＡ遺伝子の上流領域と下流領域であり、配列解析結果からＦＡ００のゲノムにｓｕｃＡ遺伝子がないことを示し、ＦＡ０９ＦＡ０８のｓｕｃＡ遺伝子をノックアウトして得られた菌株であるものと、を含む。
（３）プロモーター置換によってａｃｅＢ遺伝子とａｃｅＡ遺伝子との発現を増強する。
遺伝子組換え菌ＦＡ０９から、該菌株におけるグリオキシル酸経路ａｃｅＢＡ遺伝子クラスター（該遺伝子クラスターはａｃｅＢ遺伝子とａｃｅＡ遺伝子とを含む）のプロモーターを大腸菌構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換し、遺伝子組換え大腸菌ＦＡ１０を得て、具体的には、
ｐＫＤ４６プラスミドを含む宿主菌株を製造するというステップ（３－ａ）であって、
実施例１におけるステップ（２）の方法に応じて、ｐＫＤ４６プラスミドを前のステップで得られたＦＡ０９菌株に形質転換し、プラスミドｐＫＤ４６を含む遺伝子組換え大腸菌ＦＡ０９／ｐＫＤ４６を得て、その後ＦＡ０９／ｐＫＤ４６コンピテント細胞を製造するものと、
ターゲティング断片ａｃｅＢＡｕｐ－ｋａｎ－ＰＣＰＡ１－ａｃｅＢＡｄｏｗｎを製造するというステップ（３－ｂ）であって、
実施例１におけるステップ（２）のｐＵＣ５７－９Ｋをテンプレートとし、プライマーａｃｅＢＡ－ＰＦ／ａｃｅＢＡ－ＰＲでａｃｅＢＡｕｐ－ｋａｎ－ＰＣＰＡ１－ａｃｅＢＡｄｏｗｎ断片が増幅され、ａｃｅＢＡｕｐ－ｋａｎ－ＰＣＰＡ１－ａｃｅＢＡｄｏｗｎ断片の配列は配列表中の配列番号４２であり、該断片は、
ヌクレオチド配列が配列番号４２の第１～５１位であるａｃｅＢＡ遺伝子クラスターのプロモーターの上流相同性アームａｃｅＢＡｕｐ（ａ）、ヌクレオチド配列が配列番号４２の第５２～１４９２位であるＬＯＸＰサイトを持つカナマイシン耐性遺伝子（ＬＯＸＰ－ｋａｎ－ＬＯＸＰ）（ｂ）、ヌクレオチド配列が配列番号４２の第１４９３～１６７０位である大腸菌構成的プロモーターＰＣＰＡ１（ｃ）、ヌクレオチド配列が配列番号４２の第１６７１～１７２２位であるａｃｅＢＡ遺伝子クラスターのプロモーターの下流相同性アームａｃｅＢＡｄｏｗｎ（ｄ）を含む。
相同組換えを行うというステップ（３－ｃ）であって、
上記ａｃｅＢＡｕｐ－ｋａｎ－ＰＣＰＡ１－ａｃｅＢＡｄｏｗｎ断片を電気穿孔法によって（３－ａ）で製造したＦＡ０９／ｐＫＤ４６コンピテント細胞に導入し、カナマイシン（濃度が５０μｇ／ｍｌである）を含むＬＢプレートにおいて３７℃で一晩培養し、クローンを選択し、ａｃｅＢＡ－ＰＩＦ／ａｃｅＢＡ－ＰＩＲプライマーでＰＣＲによって増幅と同定を行い（陽性である約２０００ｂｐの目的バンドが増幅され、陰性である約４００ｂｐの目的バンドが増幅される）、陽性クローンを選択してＦＡ１０－ｋａｎと名付け、ここで、プライマーの結合位置はそれぞれ大腸菌ＢＷ２５１１３のａｃｅＢＡ遺伝子クラスターのプロモーターの上流領域と下流領域であり、配列解析結果からＦＡ１０－ｋａｎのゲノムにステップ（３－ｂ）のａｃｅＢＡｕｐ－ｋａｎ－ＰＣＰＡ１－ａｃｅＢＡｄｏｗｎ断片を含むことを示すものと、
耐性を除去するというステップ（３－ｄ）であって、
実施例１におけるステップ（２）の方法に応じてｐＣＰ２０プラスミドを利用しＦＡ１０－ｋａｎのカナマイシン耐性を除去し、ａｃｅＢＡ－ＰＩＦ／ａｃｅＢＡ－ＰＩＲプライマーでＰＣＲによって増幅と同定を行い（陽性である約６００ｂｐの目的バンドが増幅され、陰性である約２０００又は４００ｂｐの目的バンドが増幅される）、陽性クローンを選択してＦＡ１０と名付け、
ここで、ＦＡ１０はＦＡ０９のａｃｅＢＡ遺伝子クラスターのプロモーターを構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換した菌株であり、ＦＡ０９において、ａｃｅＢＡ遺伝子クラスターにおけるａｃｅＢ遺伝子は配列番号４４に示されるタンパク質をコードし、ａｃｅＢ遺伝子のコード配列は配列番号４３に示すとおりであり、ａｃｅＡ遺伝子は配列番号４６に示されるタンパク質をコードし、ａｃｅＡ遺伝子のコード配列は配列番号４５に示すとおりであり、配列解析結果からＦＡ１０のゲノムにおけるａｃｅＢＡ遺伝子クラスターのプロモーターが構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換されたことを示し、ａｃｅＢＡ遺伝子クラスターにおけるａｃｅＢ遺伝子とａｃｅＡ遺伝子との発現はＰＣＰＡ１により開始されるものと、を含む。
（４）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）アスパラギン酸トランスアミナーゼ遺伝子ａｓｐＣを表現するプラスミドを構築する。
大腸菌ゲノムＤＮＡの抽出とａｓｐＣ遺伝子のＰＣＲ増幅とを行うというステップ（４－ａ）であって、
細菌ゲノム抽出キット（天根生化学科技有限会社、製品カタログはＤＰ３０２である）を用いて大腸菌ゲノムＤＮＡを抽出し大腸菌ゲノムの総ＤＮＡを抽出してテンプレートとし、ａｓｐＣ－ＦとａｓｐＣ－Ｒをプライマーとし、高忠実度のＴｒａｎｓＳｔａｒｔ ＦａｓｔＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（北京全式金バイオテクノロジー有限会社、製品カタログはＡＰ２２１である）で配列の正しい遺伝子断片ａｓｐＣがＰＣＲによって増幅されるものと、
ａｓｐＣ遺伝子を含む組換え発現ベクターを構築するというステップ（４－ｂ）であって、
ＮｃｏＩとＸｈｏＩとでベクターｐＬＢ１ａ（ベクターｐＬＢ１ａのヌクレオチド配列は、配列番号２４に示すとおりである）を消化し、ベクターの大きな断片ＬＢ１ａ－ＮＸを回収し、ギブソンアセンブリ法で上記ステップで得られた配列の正しい遺伝子断片ａｓｐＣをＬＢ１ａ－ＮＸ断片とライゲーション反応させ、ＣａＣｌ２法によって大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞に形質転換する。それを均一にアンピシリンを含むＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩培養しクローンを選択し、プライマーＦ１０５－Ｆ／ａｓｐＣ－Ｒで同定し、目的断片配列の正しい陽性クローンを選択してプラスミドを抽出し、得られた陽性組換えプラスミドをｐＬＢ１ａ－ａｓｐＣと名付けるものと、を含む。
（５）大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、即ちｇｄｈＡ遺伝子を表現するプラスミドを構築する。
大腸菌からゲノムＤＮＡを抽出し、プライマーｇｄｈＡ－Ｆ／ｇｄｈＡ－ＲでｇｄｈＡ遺伝子断片を増幅し、同時にＲＢＳ配列をプライマーに導入する。ＸｈｏＩとＳｐｅＩとでベクターｐＬＢ１ａ－ａｓｐＣを消化し、大きな断片ＬＢ１ａ－ａｓｐＣ－ＸＰを得る。ギブソンアセンブリ法でｇｄｈＡ遺伝子断片をＬＢ１ａ－ａｓｐＣ－ＸＰ断片とライゲーション反応させる。大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、プライマーｇｄｈＡ－Ｆ／Ｔ５８－Ｒで同定し、目的断片配列の正しい陽性クローンを選択してプラスミドを抽出し、得られた陽性組換えプラスミドをｐＬＢ１ａ－ａｓｐＣ－ｇｄｈＡと名付ける。
（６）マリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）外因性アルカン取り込み外膜タンパク質遺伝子、即ちａｌｋＬ遺伝子を表現するプラスミドを構築する。
マリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカスからゲノムＤＮＡを抽出し、プライマーａｌｋＬ－Ｆ’’／ａｌｋＬ－Ｒ’’でａｌｋＬ遺伝子断片を増幅し、同時にＲＢＳ配列をプライマーに導入する。ＳｐｅＩとＥｃｏＲＩとでベクターｐＬＢ１ａ－ａｓｐＣ－ｇｄｈＡを消化し、大きな断片ＬＢ１ａ－ａｓｐＣ－ｇｄｈＡ－ＰＥを得る。ギブソンアセンブリ法でａｌｋＬ遺伝子断片をＬＢ１ａ－ａｓｐＣ－ｇｄｈＡ－ＰＥ断片とライゲーション反応させる。大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、プライマーでａｌｋＬ－Ｆ／Ｔ５８－Ｒを同定し、目的断片配列の正しい陽性クローンを選択してプラスミドを抽出し、得られた陽性組換えプラスミドをｐＬＢ１ａ－ａｓｐＣ－ｇｄｈＡ－ａｌｋＬと名付ける。
ｐＬＢ１ａ－ａｓｐＣ－ｇｄｈＡ－ａｌｋＬは、配列番号４７に示されるａｓｐＣ遺伝子、配列番号４９に示されるｇｄｈＡ遺伝子、及び配列番号２８に示されるＤＮＡ断片（ａｌｋＬ遺伝子を含む）を含む。ここで、配列番号４９の第２～７位がＲＢＳの配列であり、配列番号４９の第１５～１３５８位がｇｄｈＡ遺伝子の配列である。ｐＬＢ１ａ－ａｓｐＣ－ｇｄｈＡ－ａｌｋＬは、配列番号４８に示されるａｓｐＣタンパク質、配列番号５０に示されるｇｄｈＡタンパク質、及び配列番号２９に示されるａｌｋＬタンパク質を発現することができる。
（７）コクヌストモドキ（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ）Ｌ－アスパラギン酸－α－デカルボキシラーゼ遺伝子、即ちｐａｎＤ遺伝子を表現するプラスミドを構築する。
全遺伝子合成によってコクヌストモドキ（Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ）のＬ－アスパラギン酸－α－デカルボキシラーゼ遺伝子、即ちｐａｎＤ遺伝子を構築し、ｐＵＣ５７ベクターに結合され、ベクターｐＵＣ５７－ｐａｎＤを得る。ｐａｎＤ遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号５１に示すとおりである。ｐａｎＤ－ＦとｐａｎＤ－Ｒとをプライマーとし、ベクターｐＵＣ５７－ｐａｎＤプラスミドをテンプレートとし、高忠実度のＴｒａｎｓＳｔａｒｔ ＦａｓｔＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼでＰＣＲによってｐａｎＤ遺伝子断片が増幅される。ＮｃｏＩとＸｈｏＩとでベクターｐＸＢ１ｋ（ベクターｐＸＢ１ｋヌクレオチド配列は、配列番号３５に示すとおりである）を消化し、ベクターの大きな断片ＸＢ１ｋ－ＮＸを回収する。ギブソンアセンブリ法でｐａｎＤ遺伝子断片をＸＢ１ｋ－ＮＸ断片とライゲーション反応させる。大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシンを含むＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩培養し、クローンを選択する。プライマーでＦ１０５－Ｆ／ｐａｎＤ－Ｒを同定し、目的断片配列の正しい陽性クローンを選択してプラスミドを抽出し、得られた陽性組換えプラスミドをｐＸＢ１ｋ－ｐａｎＤと名付ける。ｐＸＢ１ｋ－ｐａｎＤは配列番号５１に示されるｐａｎＤ遺伝子を含み、配列番号５２に示されるｐａｎＤタンパク質を発現することができる。
（８）遺伝子組換え大腸菌ＦＡ１１を構築する。
ステップ（３）で得られた菌株ＦＡ１０からコンピテント細胞を製造し、プラスミドｐＬＢ１ａ－ａｓｐＣ－ｇｄｈＡ－ａｌｋＬ及びｐＸＢ１ｋ－ｐａｎＤをＣａＣｌ２法によってＦＡ１０に形質転換する。アンピシリンとカナマイシンとを含むＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩培養する。ｐＬＢ１ａ－ａｓｐＣ－ｇｄｈＡ－ａｌｋＬ及びｐＸＢ１ｋ－ｐａｎＤを含む陽性クローンを選択し、ＦＡ１１と名付ける。
ＦＡ１１は大腸菌ＢＷ２５１１３に対する以下の（ｃ１）～（ｃ１４）のような遺伝子操作を行って得られた菌株である：
（ｃ１）は、脂肪酸分解に関わる転写因子遺伝子、即ちｆａｄＲ遺伝子をノックアウトすることであり、
（ｃ２）は、ｆａｄＬ遺伝子のプロモーターを大腸菌構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換することであり、
（ｃ３）は、ｆａｄＤ遺伝子のプロモーターを大腸菌構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換することであり、
（ｃ４）は、ｓｔｈＡ遺伝子のプロモーターを大腸菌構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換することであり、
（ｃ５）は、β－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼＩＩ遺伝子、即ちｆａｂＦ遺伝子をノックアウトすることであり、
（ｃ６）は、β－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼＩＩＩ遺伝子、即ちｆａｂＨ遺伝子をノックアウトすることであり、
（ｃ７）は、ａｔｏＳＣ遺伝子クラスタープロモーターを大腸菌構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換することであり、
（ｃ８）は、グリオキシル酸経路転写抑制因子遺伝子、即ちｉｃｌＲ遺伝子をノックアウトすることであり、
（ｃ９）は、α－ケトグルタル酸デカルボキシラーゼ遺伝子、即ちｓｕｃＡ遺伝子をノックアウトすることであり、
（ｃ１０）は、ａｃｅＢＡ遺伝子クラスタープロモーターを大腸菌構成的プロモーターＰＣＰＡ１に置換することであり、
（ｃ１１）は、アスパラギン酸トランスアミナーゼ遺伝子、即ちａｓｐＣ遺伝子を導入することであり、
（ｃ１２）は、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子、即ちｇｄｈＡ遺伝子を導入することであり、
（ｃ１３）は、外来性アルカン摂取外膜タンパク質遺伝子、即ちａｌｋＬ遺伝子を導入することであり、
（ｃ１４）は、Ｌ－アスパラギン酸－α－デカルボキシラーゼ遺伝子、即ちｐａｎＤ遺伝子を導入することである。
菌株ＦＡ１０からコンピテント細胞を製造し、プラスミドｐＬＢ１ａ及びｐＸＢ１ｋをＣａＣｌ２法によってＦＡ１０に形質転換する。アンピシリンとカナマイシンを含むＬＢプレートに塗布し、３７℃で一晩培養する。ｐＬＢ１ａ及びｐＸＢ１ｋを含む陽性クローンを選択し、ＦＡ００と名付ける。
Figure 0007261222000004
二、β－アラニンの製造
１．培地の製造
Ｆ培地：Ｆ培地は、実施例２のＡ培地に、パルミチン酸、ポリオキシエチレンエーテルＢｒｉｊ５８乳化剤、及びビタミンＢ６を添加して得られた無菌培地であり、ここで、パルミチン酸の質量パーセント濃度が０．５％で、ポリオキシエチレンエーテルＢｒｉｊ５８乳化剤の質量パーセント濃度が０．２％で、ビタミンＢ６の濃度が１０ｍｇ／Ｌである。
Ｇ培地：Ｇ培地は、実施例２のＡ培地に、パルミチン酸、ポリオキシエチレンエーテルＢｒｉｊ５８乳化剤、ビタミンＢ６、及びグルタミン酸を添加して得られた無菌培地であり、ここで、パルミチン酸の質量パーセント濃度が１％で、ポリオキシエチレンエーテルＢｒｉｊ５８乳化剤の質量パーセント濃度が０．２％で、ビタミンＢ６の濃度が１０ｍｇ／Ｌで、グルタミン酸の濃度が２ｍＭである。
２．β－アラニンの製造
実験を３回繰り返し、毎回に繰り返す実験は、具体的には、
菌体を培養するというステップ２．１であって、
一晩培養してステップ１で得られた菌株ＦＡ１１を以下の方法に応じて培養し、菌株を１％の接種量で２０ｍｌの実施例２のストレプトマイシンとカナマイシンを含むＡ培地（ストレプトマイシンとカナマイシンの濃度がいずれも５０ｍｇ／Ｌである）に接種し、３７℃で１２時間培養した後、菌体を収集し、収集した菌体を２０ｍｌのストレプトマイシンとカナマイシンを含むＦ培地（ストレプトマイシンとカナマイシンの濃度がいずれも５０ｍｇ／Ｌである）に移し、３７℃で６時間培養した後、培養液を得て、該培養液のＯＤ６００は６であり、培養液におけるアラビノース誘導の質量パーセント濃度が０．２％となるように培養液にアラビノース誘導を添加し、３７℃で１２時間培養し、菌体を収集し、ＦＡ１１菌体を得て、
上記方法に応じて、ストレプトマイシンとカナマイシンが含まれていないＡ培地とＦ培地でＦＡ００を培養し、ＦＡ００菌体を得るものと、
β－アラニンの全細胞触媒を製造するというステップ２．２であって、
上記ステップ２．１で収集した乾燥重量が３０ｍｇ（即ち、１×１０１１ｃｆｕ）であるＦＡ１１菌体を２０ｍｌのＧ培地を含む振盪フラスコに再懸濁し、３７℃で２４時間培養した後、遠心分離して上澄み液を０．２２μｍのフィルターで濾過し、濾液を得て、ＦＡ１１の検体であり、
上記方法に応じて、ＦＡ１１をＦＡ００菌体に変え、他のステップはいずれも変化せず、ＦＡ００の検体を得て、
β－アラニン（Ｓｉｇｍａ、０５１５９－１００Ｇ）を標準物として標準曲線法（外部標準法）でＨＰＬＣによって各の検体中のβ－アラニンの含有量を定量的に分析し、
定量的な検出結果は図３に示すように、ＦＡ１１の検体中のβ－アラニンの平均含有量が４．２ｇ／Ｌ（即ち、４．２ｇ／５×１０１２ｃｆｕ）であり、パルミチン酸の質量パーセント濃度が０．３１％である。ＦＡ００の検体中のβ－アラニンの平均含有量が０ｇ／Ｌであり、パルミチン酸の質量パーセント濃度が０．９０％であり、ＦＡ１１を利用してパルミチン酸を基質としてβ－アラニンを製造する変換率が６０．８７％であり、ＦＡ００を利用してβ－アラニンを得ることができない。それは、ＦＡ１１を利用してβ－アラニンを製造することができることを示すものと、を含む。
本発明は、脂肪酸を原料として３－ヒドロキシプロピオン酸を合成し、理論上の変換率が２１７．８６％に達し、グルコース（理論上の変換率が１００％である）より顕著に高い。本発明は、更に、脂肪酸を原料として３－ヒドロキシプロピオン酸を生産する遺伝子組換え菌を製造し、該遺伝子組換え菌は石油製品の粗加工生成物、下水油などの供給源から安価な価額で入手した脂肪酸原料を利用することができ、微生物発酵と生物学的変換によって３－ヒドロキシプロピオン酸を生産するのに用いられる。そのため、脂肪酸原料を利用して３－ヒドロキシプロピオン酸を合成することは潜在的なコスト上の利点を有する。本発明の遺伝子組換え菌を利用して脂肪酸を原料として３－ヒドロキシプロピオン酸を生産することによる変換率が２８．３７％であり、それは、本発明の遺伝子組換え菌を利用して３－ヒドロキシプロピオン酸を生産することができることを示す。

Claims (13)

  1. 遺伝子組換え菌又は真菌の構築方法であって、ｆａｄＲ遺伝子、ｆａｂＦ遺伝子、及びｆａｂＨ遺伝子を含む受容菌又は真菌に対して以下の遺伝子操作を行うことを含み、
    ｉ）前記受容菌又は真菌の脂肪酸分解に関わる転写因子、即ちｆａｄＲ遺伝子をノックアウトし、又は前記ｆａｄＲ遺伝子の発現を抑制すること、
    ｉｉ）前記受容菌又は真菌のβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼＩＩ遺伝子、即ちｆａｂＦ遺伝子をノックアウトし、又は前記ｆａｂＦ遺伝子の発現を抑制すること、
    ｉｉｉ）前記受容菌又は真菌のβ－ケトアシル－ＡＣＰシンターゼＩＩＩ遺伝子、即ちｆａｂＨ遺伝子をノックアウトし、又は前記ｆａｂＨ遺伝子の発現を抑制すること、
    ｉｖ）前記受容菌又は真菌におけるｆａｄＬ遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を増加させること、
    ｖ）前記受容菌又は真菌におけるｆａｄＤ遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を増加させること、
    ｖｉ）前記受容菌又は真菌におけるｓｔｈＡ遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を増加させること、及び
    ｖｉｉ）前記受容菌又は真菌における短鎖脂肪酸分解を制御する遺伝子クラスター、即ちａｔｏＳＣ遺伝子クラスターにおける遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を増加させること、
    ｖｉｉｉ）前記受容菌又は真菌におけるアセチルＣｏＡカルボキシラーゼａｃｃ遺伝子又はａｃｃ遺伝子クラスターによってコードされるタンパク質の発現を増加させること、
    ｉｘ）前記受容菌又は真菌における外因性アルカン取り込み外膜タンパク質遺伝子、即ちａｌｋＬ遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を増加させること、及び
    ｘ）前記受容菌又は真菌におけるマロニルＣｏＡレダクターゼ遺伝子、即ちｍｃｒ遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を増加させること、
    を特徴とする遺伝子組換え菌の構築方法。
  2. 前記受容菌は、
    １）大腸菌、又は
    ２）大腸菌ＢＷ２５１１３である、
    ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 前記ａｃｃ遺伝子又はａｃｃ遺伝子クラスターはコリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）又は／及びロドコッカス・オパカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｏｐａｃｕｓ）から由来し、
    前記ａｌｋＬ遺伝子はマリノバクター・ハイドロカーボノクラスティカス（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｎｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）又は／及びシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）から由来し、
    前記ｍｃｒ遺伝子はクロロフレクサス・オーランティアカス（Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ）から由来する、
    ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  4. 前記ｆａｄＲ遺伝子は、
    ａ１）配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
    ａ２）配列番号２と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、
    前記ｆａｂＦ遺伝子は、
    ａ３）配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
    ａ４）配列番号１４と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、
    前記ｆａｂＨ遺伝子は、
    ａ５）配列番号１６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
    ａ６）配列番号１６と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、
    前記ａｔｏＳＣ遺伝子クラスターは、
    ａ２３１）配列番号１９に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
    ａ２３２）配列番号１９と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であるａ２３）のタンパク質、及び
    ａ２４１）配列番号２１に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
    ａ２４２）配列番号２１と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であるａ２４）のタンパク質、を含むタンパク質をコードし、
    前記ｆａｄＬ遺伝子は、
    ａ１７）配列番号６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
    ａ１８）配列番号６と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、
    前記ｆａｄＤ遺伝子は、
    ａ１９）配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
    ａ２０）配列番号９と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、及び／又は
    前記ｓｔｈＡ遺伝子は、
    ａ２１）配列番号１２に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
    ａ２２）配列番号１２と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、
    ことを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ａｃｃ遺伝子又はａｃｃ遺伝子クラスターは、
    ａ７１）配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
    ａ７２）配列番号２６と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であるａ７）のタンパク質、及び
    ａ８１）配列番号２７に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
    ａ８２）配列番号２７と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であるａ８）のタンパク質をコードし、
    前記ａｌｋＬ遺伝子は、
    ａ９）配列番号２９に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
    ａ１０）配列番号２９と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードし、及び／又は
    前記ｍｃｒ遺伝子は、
    ａ１１）配列番号３７に示されるアミノ酸配列を有するタンパク質、又は
    ａ１２）配列番号３７と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする、
    ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  6. ｉｖ）は、前記ｆａｄＬ遺伝子のプロモーターをプロモーターＰ ＣＰＡ１ に置換することによって達成され、
    ｖ）は、前記ｆａｄＤ遺伝子のプロモーターをプロモーターＰ ＣＰＡ１ に置換することによって達成され、
    ｖｉ）は、前記ｓｔｈＡ遺伝子のプロモーターをプロモーターＰ ＣＰＡ１ に置換することによって達成され、及び／又は
    ｖｉｉ）は、前記ａｔｏＳＣ遺伝子のプロモーターをプロモーターＰ ＣＰＡ１ に置換することによって達成され、
    前記プロモーターＰ ＣＰＡ１ は、
    １）配列番号３の第１４４３位～第１６２２位の配列、又は
    ２）１）の配列と９０％以上同一である配列を有する、
    ことを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. ｖｉｉｉ）は、前記受容菌又は真菌に前記ａｃｃ遺伝子又はａｃｃ遺伝子クラスターを導入することによって達成され、
    ｉｘ）は、前記受容菌又は真菌に前記ａｌｋＬ遺伝子を導入することによって達成され、
    ｘ）は、前記受容菌又は真菌に前記ｍｃｒ遺伝子を導入することによって達成される、
    ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  8. 前記ｆａｄＲ遺伝子は、ｂ１）又はｂ２）であり、
    ｂ１）は配列番号１に示される配列を有するｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子であり、
    ｂ２）はｂ１）に限定されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有し、かつ同じ機能を有するｃＤＮＡ分子又はゲノムＤＮＡ分子であり、
    前記ｆａｂＦ遺伝子は、ｂ３）又はｂ４）であり、
    ｂ３）は配列番号１３に示される配列を有するｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子であり、
    ｂ４）はｂ３）に限定されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有し、かつ同じ機能を有するｃＤＮＡ分子又はゲノムＤＮＡ分子であり、
    前記ｆａｂＨ遺伝子は、ｂ５）又はｂ６）であり、
    ｂ５）は配列番号１５に示されるｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子であり、
    ｂ６）はｂ５）に限定されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有し、かつ同じ機能を有するｃＤＮＡ分子又はゲノムＤＮＡ分子である、
    ことを特徴とする請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ａｃｃ遺伝子又はａｃｃ遺伝子クラスターは、ｂ７）又はｂ８）であり、
    ｂ７）は配列番号２５の第１５位～第３２５９位に示される配列を有するｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子であり、
    ｂ８）はｂ７）に限定されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有する配列を有し、かつ同じ機能を有するｃＤＮＡ分子又はゲノムＤＮＡ分子であり、
    前記ａｌｋＬ遺伝子は、ｂ９）又はｂ１０）であり、
    ｂ９）は配列番号２８に示される配列を有するｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子であり、
    ｂ１０）はｂ９）に限定されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有する配列を有し、かつ同じ機能を有するｃＤＮＡ分子又はゲノムＤＮＡ分子であり、
    前記ｍｃｒ遺伝子は、ｂ１１）又はｂ１２）であり、
    ｂ１１）は配列番号３６に示される配列を有するｃＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子であり、
    ｂ１２）はｂ１１）に限定されるヌクレオチド配列と９０％以上の同一性を有する配列を有し、かつ同じ機能を有するｃＤＮＡ分子又はゲノムＤＮＡ分子である、
    ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  10. 請求項１から９のいずれか一項に記載の方法により製造される遺伝子組換え菌又は真菌。
  11. ３－ヒドロキシプロピオン酸の製造方法であって、脂肪酸を基質とし、請求項１０に記載の前記遺伝子組換え菌又は真菌を用いて生物変換を行い、３－ヒドロキシプロピオン酸を製造することを含む、
    ことを特徴とする３－ヒドロキシプロピオン酸の製造方法。
  12. 前記脂肪酸は、パルミチン酸、ステアリン酸、ミリスチン酸、ラウリン酸、カプリン酸、カプリル酸、及び／又はカプロン酸である、
    ことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
  13. ３－ヒドロキシプロピオン酸の製造のための、請求項１０に記載の前記遺伝子組換え菌又は真菌の使用。
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