WO2009145164A1 - 改良されたポリヒドロキシアルカノエート生産微生物及びそれを用いたポリヒドロキシアルカノエートの製造方法 - Google Patents

改良されたポリヒドロキシアルカノエート生産微生物及びそれを用いたポリヒドロキシアルカノエートの製造方法 Download PDF

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WO2009145164A1
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WO
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gene
dna
bktb
strain
polyhydroxyalkanoate
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PCT/JP2009/059564
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光架 村上
俊輔 佐藤
哲也 藤木
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株式会社カネカ
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01009—D-Xylulose reductase (1.1.1.9), i.e. xylitol dehydrogenase
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    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01036—Acetoacetyl-CoA reductase (1.1.1.36)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01016—Acetyl-CoA C-acyltransferase (2.3.1.16)

Definitions

  • the present invention relates to a microorganism that produces a polyhydroxyalkanoate copolymer having a 3-hydroxyalkanoate unit having 4 or more carbon atoms, and a method for efficiently producing the copolymer using the microorganism.
  • PHA Polyhydroxyalkanoate
  • PHA is a polyester-type organic molecular polymer produced by a wide range of microorganisms.
  • PHA is a biodegradable thermoplastic polymer.
  • PHA can also be produced from renewable resources. For these reasons, attempts have been made to industrially produce PHA as an environmentally conscious material or a biocompatible material and use it in various industries.
  • P (3HB) poly-3-hydroxybutyric acid
  • 3HB 3-hydroxybutyric acid
  • P (3HB) was first discovered in 1925 in Bacillus megaterium .
  • P (3HB) is a thermoplastic polymer and is biologically decomposed in the natural environment, and thus has attracted attention as an environmentally friendly plastic.
  • P (3HB) has a hard and brittle nature because of its high crystallinity, so its practical application range is limited. In order to expand the application range, it was necessary to give flexibility to P (3HB).
  • P (3HB-co-3HV) a copolymer comprising 3HB and 3-hydroxyvaleric acid
  • 3HV 3-hydroxyvaleric acid
  • Patent Document 1 Patent Document 2
  • P (3HB-co-3HV) is a kind of PHA. Since P (3HB-co-3HV) is more flexible than P (3HB), it was considered to be applicable to a wide range of applications. However, in practice, even if the 3HV mole fraction in P (3HB-co-3HV) is increased, the accompanying change in physical properties is scarce, which is particularly required for processing into films, sheets, flexible packaging containers, etc. Since flexibility does not improve as much, it is used only in limited fields such as shampoo bottles and disposable razor handles.
  • P (3HB-co-3HH) In order to increase the flexibility of P (3HB), it is sometimes referred to as a copolymer of 3HB and 3-hydroxyhexanoic acid (hereinafter sometimes referred to as 3HH) (hereinafter referred to as P (3HB-co-3HH). ) And its manufacturing method have been studied (Patent Literature 3, Patent Literature 4).
  • P (3HB-co-3HH) is a kind of PHA.
  • the method for producing P (3HB-co-3HH) in these reports was to fermentatively produce fatty acid such as oleic acid and palmitic acid using a wild strain of Aeromonascaviae isolated from soil as a carbon source.
  • the 3HH composition ratio was 15 mol% when oleic acid was used as the carbon source, and 5 mol% when palmitic acid was used as the carbon source.
  • Non-patent Document 1 Studies on the physical properties of P (3HB-co-3HH) have also been made (Non-patent Document 1).
  • A. caviae is cultured using a fatty acid having 12 or more carbon atoms as a sole carbon source, and P (3HB-co-3HH) having a 3HH composition of 11 to 19 mol% is produced by fermentation.
  • P (3HB-co-3HH) increases in 3HH composition, it becomes more flexible from hard and brittle properties like P (3HB), and more flexible than P (3HB-co-3HV) It was revealed that That is, P (3HB-co-3HH) can have a wide range of physical properties applicable from hard polymers to soft polymers by changing the 3HH composition ratio. Therefore, P (3HB-co-3HH) has a low 3HH composition ratio.
  • Non-Patent Document 2 by using Aeromonas hydrophila and performing fed-batch culture for 43 hours using oleic acid as a carbon source, the cell mass is 95.7 g / L, the polymer content is 45.2%, and the 3HH composition ratio is 17 mol%. Of P (3HB-co-3HH) was produced. Moreover, 3HH composition ratio was 11 mol%, the amount of bacterial cells was 50 g / L, and the polymer content was 50% by cultivation using glucose and lauric acid as a carbon source using A. hydrophila (Non-patent Document 3). . However, A.
  • Non-Patent Document 4 hydrophila is pathogenic to humans (Non-Patent Document 4), and therefore cannot be said to be a microorganism suitable for industrial production. Moreover, since the carbon source used in these culture productions is expensive, use of an inexpensive carbon source has been demanded from the viewpoint of manufacturing cost.
  • the composition ratio of 3HH was 4 to 5 mol%, and the bacterial cell amount was 4 g / L and the polymer content was 80% (Non-patent Document 6).
  • the latter production method uses inexpensive vegetable oils and fats as a carbon source and has a high polymer content, but the amount of cells is low, so the polymer productivity is low, and a 3HH composition ratio of 4 to 5 mol% is applicable to applications such as films. It was not soft.
  • a P (3HB-co-3HH) producing strain using E. coli as a host was also constructed.
  • a strain was constructed in which the PHA synthase gene belonging to the genus Aeromonas and the NADP-acetoacetyl-CoA reductase gene of C. necator were introduced into E. coli.
  • the amount of cells was 79 g / L
  • the polymer content was 27.2%
  • the 3HH composition ratio was 10.8 mol% (Non-patent Document 8). Escherichia coli into which A.
  • Non-patent Document 10 PHA synthase was artificially modified.
  • a mutant enzyme in which the 149th amino acid asparagine is replaced with serine and a mutant enzyme in which the 171st aspartic acid is replaced with glycine are It has been shown that PHA synthase activity and 3HH composition are improved, and the mutant enzyme in which the 518th phenylalanine is replaced with isoleucine and the mutant enzyme in which the 214th valine is replaced with glycine are It has been reported that PHA synthase activity and polymer content have been improved. However, these use special E. coli as a host, and the polymer content is as low as about 13%. Therefore, further improvements for industrial production utilizing the characteristics of these mutant enzymes were necessary. .
  • Patent Document 5 C.Necator by the polyester synthase gene and R- enoyl -CoA hydratase gene such pJRDEE32 and pJRDEE32d13 like was introduced (Patent Document 5, Non-Patent Document reference 5) PHA synthase expression plasmid in pJRD215 (ATCC 37533) And the PHA productivity of the transformant has been examined.
  • the amount of bacterial cells of the strain was as low as 4 g / L, but the amount of bacterial cells was 45 g / L, the polymer content was 62.5%, and the 3HH composition ratio was 8.1 mol% by improving the culture conditions of the same strain using vegetable oil as a carbon source. The polymer productivity has been improved.
  • Patent Document 6 an attempt was made to improve the 3HH composition ratio and polymer productivity of P (3HB-co-3HH) by a culture method
  • Patent Document 6 A method of controlling the physical properties of P (3HB-co-3HH) is also disclosed (Patent Document 6).
  • P (3HB-co-) By using at least two types of fats and oils and / or fatty acids having different carbon numbers as a carbon source, it becomes possible to produce a polyester having a 3HH composition ratio of 1 to 40 mol%, and P (3HB-co-) having various physical properties. 3HH) can be produced.
  • this production method it is necessary to add relatively expensive hexanoic acid, octanoic acid or the like for 3HH composition control, and high concentration hexanoic acid exhibits cytotoxicity, so that the cell productivity decreases. It is the result.
  • the production equipment since a multi-component carbon source is added, the production equipment may be complicated and expensive.
  • a method for improving 3HH composition by culturing with C. necator as a host and fructose as a carbon source is also disclosed.
  • the polyester synthase gene and the crotonyl-CoA reductase gene (hereinafter abbreviated as ccr) derived from Streptomycescinnamonensis were introduced, the 3HH composition was 0.9%, but when the R-enoyl-CoA hydratase gene and the like were further introduced.
  • the 3HH composition was improved to 1.6%.
  • the amount of cells at that time was about 1.5 g / L
  • the polymer content was as low as about 40%, and further improvement was necessary for industrial production of high 3HH composition P (3HB-co-3HH) ( Non-patent document 7).
  • P (3HB-co-3HH) having a 3HH composition ratio of 12 mol% or more is desired for application to films, sheets, flexible packaging containers, and the like.
  • attempts to improve the 3HH composition ratio resulted in a decrease in the polymer content or the amount of cells.
  • the object of the present invention is to produce a PHA having a high 3HH composition ratio, which is excellent in flexibility and expected to be used in a wide range of applications, with a practical productivity using vegetable oil which is an inexpensive carbon source.
  • the objective is to efficiently ferment and produce P (3HB-co-3HH) having a 3HH composition ratio of 12 mol% or more while maintaining a polymer content of the cells of 70% or more and a cell amount of 150 g / L or more. .
  • the present inventors have increased the amount of PHA synthase in microorganisms, decreased the ability to synthesize 3HB monomer, and created a new 3HH monomer synthesis route. It was found that PHA having an improved 3HH composition ratio can be produced and accumulated in large quantities in the microorganism by enhancing the supply system, and the present invention has been completed.
  • the first of the present invention is that the phbA gene is inactivated, phaC gene and bktB ( ⁇ -ketothiolase) gene expression is enhanced, and a butyryl-CoA synthesis pathway is newly introduced by introduction of the ccr gene.
  • the present invention relates to a microorganism capable of producing a 3-hydroxyhexanoic acid unit-containing polyhydroxyalkanoate with improved 3HH monomer synthesis ability.
  • a microorganism having the following requirements (1) to (3); (1) The expression of the phbA gene is suppressed, or the catalytic activity of the enzyme encoded by the gene is suppressed, (2) The expression of the bktB gene is enhanced or the catalytic activity of the enzyme encoded by the gene is improved, (3) A polyhydroxyalkanoate synthase gene and / or a crotonyl-CoA reductase gene is introduced.
  • the second aspect of the present invention is that the above-described microorganism is used, and the 3HH composition ratio is 12 mol% or more while maintaining a polymer content of 70% or more and a cell amount of 150 g / L or more using an inexpensive carbon source.
  • the present invention relates to a method for producing 3HH unit-containing PHA.
  • PHA having a 3HH composition ratio of 12 mol% or more can be produced by fermentation while maintaining a polymer content of the cells of 70% or more and a cell amount of 150 g / L or more. .
  • the 3HH unit-containing PHA of the present invention is 3HH, 3HB, 3HV, 3-hydroxyoctanoic acid, and one or more 3-hydroxyalkanoic acids selected from the group consisting of 3-hydroxyalkanoic acids having a longer alkyl chain. Is a copolymerized polyester.
  • the phbA gene of the present invention is a gene encoding an enzyme that catalyzes a reaction of condensing two molecules of acetyl-CoA among enzymes having ⁇ -ketothiolase activity, but hardly catalyzes ⁇ -ketovaleryl-CoA thiolysis.
  • the phbA gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 is exemplified. Encodes an enzyme that has a sequence identity of 85% or more with the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 and catalyzes a reaction of condensing two molecules of acetyl-CoA, but hardly catalyzes thiolysis of ⁇ -ketovaleryl-CoA.
  • the gene can be preferably used in the present invention.
  • the sequence identity is more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more.
  • the bktB gene of the present invention well catalyzes both the condensation of two molecules of acetyl-CoA and the condensation of acetyl-CoA and a longer chain, such as propionyl-CoA, among enzymes having ⁇ -ketothiolase activity.
  • a gene encoding an enzyme that catalyzes the thiolysis of 3-ketovaleryl-CoA for example, a gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 29 (SLATER et al., J. Bacteriol., Vol.180, 1979) -1987, 1998).
  • sequence identity with the base sequence shown in SEQ ID NO: 29, and both condensation of two molecules of acetyl-CoA and condensation of acetyl-CoA and longer chain length, for example, propionyl-CoA
  • a gene encoding an enzyme that catalyzes well and catalyzes 3-ketovaleryl-CoA thiolysis can be preferably used in the present invention.
  • the sequence identity is more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more.
  • Examples of a gene encoding a polymerase capable of synthesizing a 3HH unit-containing PHA include the A. caviae phaC gene or the phaC mutant gene comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 4, and the host results in the PHA. As long as it can be produced.
  • the sequence identity is more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and still more preferably 98% or more.
  • the endogenous promoter of the bktB structural gene is DNA that induces transcription of the bktB structural gene, and is inherent in the microorganism originally having the phbA gene and the bktB gene used as a host.
  • the microorganism originally having the phbA gene and the bktB gene in the present invention is not particularly limited as long as it is a wild strain having the phbA gene and the bktB gene, or a microorganism genetically manipulated to the wild strain, and 3HH unit-containing PHA can be synthesized. Can be used as hosts.
  • the C. necator for example, C.
  • necator H16 (ATCC17699), and the like.
  • the strain can be obtained from the American Type Culture Collection (ATCC). Of course, even if it is a mutant obtained by artificially mutating the microorganism, or a similar strain mutated by genetic engineering techniques, it can be used in the present invention as long as it can synthesize PHA containing 3HH units. it can.
  • the phbA gene present on the chromosome of the microorganism originally having the phbA gene and the bktB gene is inactivated.
  • the enzyme encoded by the phbA gene catalyzes the reaction to produce acetoacetyl-CoA, a precursor of 3-hydroxybutyryl-CoA, which is one of PHA monomers, by condensation of acetyl-CoA molecules as described above.
  • the enzyme encoded by the phbA gene does not catalyze the reaction of condensing acetyl-CoA and butanoyl-CoA. Therefore, inactivation of the phbA gene lowers the 3HB ratio in the polymer, and as a result, the 3HH ratio is considered to be improved.
  • the method for inactivating the phbA gene is sufficient if phbA is inactivated as a result.
  • a new stop codon is introduced between the start codon and the stop codon of the phbA gene, and 2) ribosome binding Introduce a mutation that decreases the ribosome binding activity into the site, 3) Introduce a mutation that decreases the catalytic activity of the enzyme inside the phbA structural gene, 4) Use RNA interference, 5) Insert a transposon, 6) phbA Examples thereof include a method of deleting part or all of the structural gene. These methods are well known to those skilled in the art.
  • the enzyme encoded by the bktB gene catalyzes not only the condensation of two acetyl-CoA molecules but also the reaction of condensing acetyl-CoA and butanoyl-CoA. Condensation of acetyl-CoA and butanoyl-CoA yields 3-ketohexanoyl-CoA, a precursor of 3-hydroxyhexanoyl-CoA.
  • the activity of the enzyme encoded by the bktB gene is higher for the condensation reaction of acetyl-CoA and butanoyl-CoA than for the condensation reaction of two acetyl-CoA molecules.
  • the method for enhancing the enzyme encoded by the bktB gene is not particularly limited, but high expression by an expression vector and high expression by modification of an expression regulatory region are possible.
  • the promoter of the gene on the chromosome of the microorganism originally having the phbA gene and the bktB gene is modified to increase transcription activity, for example, the bktB gene inherent in the microorganism originally having the phbA gene and the bktB gene If a promoter that induces the transcription of the bktB gene is further incorporated upstream of, a high expression can be achieved by increasing the transcriptional activity.
  • a promoter that induces transcription of the bktB gene is preferably inserted upstream of the start codon of the bktB gene. Any promoter can be used in the present invention as long as it induces transcription of the bktB gene.
  • the promoter is preferably at least one of a promoter inherent in a microorganism originally having a phbA gene and a bktB gene and a promoter of a heterologous microorganism.
  • the promoter of the C. necator phbCAB operon consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 and the promoter of the A. caviae phaPCJ operon consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 are originally derived from the phbA gene and the bktB gene. This is suitable when C. necator is used as the microorganism.
  • the DNA used as the promoter preferably has 70% or more sequence identity with the base sequences shown in SEQ ID NOS: 1 and 2, more preferably 85% or more, and still more preferably 90% or more. Even more preferably, it is 95% or more, and most preferably 98% or more. As long as it induces transcription of the bktB gene, it can be used in the present invention.
  • DNA used as a promoter colony hybridization method, plaque hybridization method, Southern hybridization method or the like was performed using a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequences shown in SEQ ID NOS: 1 and 2 as a probe.
  • DNA can be used that hybridizes under stringent conditions. As long as it induces transcription of the bktB gene, it can be used in the present invention.
  • the hybridization can be performed according to the method described in Molecular Cloning, A Laboratory manual, Second edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) and the like.
  • the DNA to hybridize is, for example, after hybridization at 65 ° C. in the presence of 0.7 to 1.0 M NaCl using a filter on which colony or plaque-derived DNA is immobilized.
  • DNA that can be obtained by washing a filter under a condition of 65 ° C. using a double-concentration SSC solution (composition of a single-concentration SSC solution consists of 150 mM sodium chloride and 15 mM sodium citrate) can be mentioned. .
  • it is washed with an SSC solution of 2 times concentration at 65 ° C., more preferably washed with an SSC solution of 0.2 times concentration at 65 ° C., and more preferably washed with an SSC solution of 0.1 times concentration at 65 ° C. DNA that can be obtained.
  • hybridization conditions are described as described above, the conditions are not particularly limited.
  • a plurality of factors such as temperature and salt concentration can be considered as factors affecting the stringency of hybridization, and those skilled in the art can realize optimum stringency by appropriately selecting these factors.
  • the DNA that can hybridize under the above conditions is 70% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95%, with the DNA shown in SEQ ID NO: 1 or 2. % Or more, and most preferably 98% or more of the DNA can be mentioned and is included in the promoter as long as it induces transcription of the bktB gene.
  • Crotonyl-CoA reductase encoded by the ccr gene is an enzyme that reduces crotonyl-CoA, which is an intermediate in the fatty acid ⁇ -oxidation pathway, to produce butyryl-CoA, which is a substrate for the enzyme encoded by the bktB gene.
  • 3-hydroxyhexanoyl-CoA is not only supplied directly from the ⁇ -oxidation pathway but also from acetyl-CoA derived from the ⁇ -oxidation pathway.
  • the ccr gene used in the present invention can be used in the present invention as long as it encodes an enzyme having the activity of reducing crotonyl-CoA to produce 3-hydroxyhexanoyl-CoA. It is preferably a gene comprising a base sequence having 70% or more sequence identity, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and most preferably Is 98% or more.
  • Soy DNA can also be used in the present invention as long as it encodes an enzyme having the activity of reducing crotonyl-CoA to produce butyryl-CoA.
  • the polyhydroxyalkanoate synthase gene used in the present invention can be used in the present invention as long as it encodes an enzyme having polyhydroxyalkanoate synthesizing activity.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and a sequence of 70% or more are used. It is preferably a gene comprising a base sequence having identity, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, still more preferably 95% or more, and most preferably 98% or more. is there.
  • a colony hybridization method, a plaque hybridization method, a Southern hybridization method, or the like is performed using a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 as a probe, it hybridizes under stringent conditions.
  • Soy DNA can also be used in the present invention as long as it encodes an enzyme having polyhydroxyalkanoate synthesis activity.
  • examples of carbon sources that can be used for the production of 3HH-containing PHA include sugars such as glucose and fructose, alcohols such as methanol, ethanol, and butanol, acetic acid, propionic acid, hexanoic acid, octanoic acid, decanoic acid, Fatty acids such as saturated and unsaturated fatty acids such as lauric acid, oleic acid, palmitic acid, linoleic acid, linolenic acid and myristic acid, fatty acid derivatives such as esters and salts of these fatty acids, organic acids such as lactic acid, Fats and oils rich in saturated / unsaturated fatty acids that are 10 or more, for example, vegetable oils and fats, especially palm oil, palm oil, palm kernel oil, palm kernel oil olein (hereinafter also referred to as PKOO), palm double olein (hereinafter referred to as POO) Also described).
  • sugars such as glucose and fructose
  • 3- hydroxy-hexanoyl -CoA as genes encoding high enzyme capable of converting into PHA, A.
  • the method for producing a microorganism capable of producing the 3HH-containing PHA of the present invention is not particularly limited, but is exemplified below using C. necator as a host.
  • a polyester synthase mutant gene encoding an enzyme having high ability to convert 3-hydroxyhexanoyl-CoA to PHA derived from A. caviae is replaced on the chromosome with the original polyester synthase gene by homologous recombination method or the like. .
  • the gene disruption method is used to inactivate the phbA gene present on the chromosome, and any mode may be used as long as the activity of the protein that is the phbA gene product is reduced or eliminated.
  • a stop codon may be introduced into the phbA gene, or the promoter and / or ribosome binding site upstream of the gene may be modified.
  • the expression of the bktB gene is enhanced, and any mode may be used as long as the activity of the bktB gene product is increased.
  • a bktB mutant gene with improved specific activity may be used, a DNA containing a heterologous or homologous promoter and ribosome binding site may be inserted upstream of the start codon of the bktB gene, Alternatively, the promoter and / or ribosome binding site may be replaced with a DNA comprising a base sequence containing a heterologous or homologous promoter and / or ribosome binding site.
  • the original promoter may be completely lost from the chromosome, or a part of it may be deleted.
  • a method for site-specific insertion / replacement of an arbitrary gene on the chromosome is well known to those skilled in the art, and typical methods include, but are not limited to, the following methods.
  • Site-specific integration and second-stage homologous recombination caused by transposon and homologous recombination methods Ohman et al., J. Bacteriol., Vol. 162, p1068 (1985)
  • homologous recombination mechanisms There is a method based on the principle of omission (Noti et al., Methods Enzymol., Vol.
  • a method of inserting DNA consisting of a nucleotide sequence including a promoter and a ribosome binding site of A. caviae phaC gene immediately before the start codon of C. necator bktB gene is illustrated more specifically.
  • a replacement fragment is prepared.
  • DNA consisting of a base sequence including the promoter and ribosome binding site of the A. caviae phaC gene (hereinafter also referred to as phaC) is linked immediately before the start codon of the bktB gene, and then the bktB gene is linked. .
  • it is a DNA fragment in which a DNA comprising a nucleotide sequence including a phaC promoter and a ribosome binding site is inserted immediately before the start codon of the gene.
  • the upstream and downstream of the phaC promoter and ribosome binding site-containing DNA are sandwiched between the upstream and downstream, which are homologous sequences necessary for causing homologous recombination with DNA on the chromosome. The longer the length, the higher the frequency of recombination.
  • a gene that serves as a selection marker at the time of gene replacement can be added to the replacement fragment.
  • a gene serving as a selection marker for example, an antibiotic resistance gene such as kanamycin, chloramphenicol, streptomycin, ampicillin, a gene that complements various auxotrophy, and the like can be used. When C. necator is used as a host, a kanamycin resistance gene is preferred.
  • a gene for facilitating selection of a microbial strain in which the region containing the selection marker gene has been eliminated by the second-stage homologous recombination can be added.
  • An example of such a gene is a sacB gene derived from Bacillus subtilis. Microbial strains expressing this gene are known to be unable to grow on a medium containing sucrose, and it becomes easy to select a strain that has lost this gene by dropping off due to growth on a medium containing sucrose. .
  • the replacement fragment composed of these is prepared as a plasmid for gene replacement by connecting to a vector that does not replicate in the host microorganism strain.
  • vector plasmids that can be used in the genus Ralstonia and Pseudomonas include, for example, pUC vectors, pBluescript vectors, pBR322 vectors, and vectors having the same origin of replication. Furthermore, it is possible to coexist DNA sequences such as mob and oriT that enable junction transfer.
  • the plasmid DNA for gene replacement prepared in such a configuration can be introduced into C. necator by a known method such as electroporation method or conjugation transfer method, and homologous recombination can be performed.
  • a strain having a plasmid DNA for gene replacement inserted on the chromosome by homologous recombination is selected.
  • Strains can be selected by a method based on a gene for selection coexisting with plasmid DNA for gene replacement.
  • a kanamycin resistance gene is used, it can be selected from strains grown in a medium containing kanamycin.
  • a strain in which the region containing the selection marker gene has been removed from the chromosome by the second homologous recombination is selected. Based on the selection gene used at the time of insertion, for example, a strain that can no longer grow on a medium containing kanamycin may be selected, but if the sacB gene is coexisting with the gene replacement plasmid, sucrose is included. It can be easily selected from strains that grow on the medium. In order to confirm whether the strain thus obtained is a strain in which a gene is substituted as desired, a known method such as a PCR method, Southern hybridization method, or determination of a DNA base sequence can be used.
  • Expression vectors usually used in C. necator include an expression vector derived from pJRD215 (for example, Patent Document 5) and an expression vector derived from pBBR122 (Non-Patent Document 7). It is desirable that the expression vector be stably replicated and maintained in the host cell even under non-selective pressure conditions. Therefore, pCUP2 and the like described in International Publication WO / 2007/049716 [0041] is more preferable. pCUP2 contains a region necessary for the replication and stable maintenance of the plasmid derived from the megaplasmid pMOL28 possessed by the Cupriavidus metallidurans CH34 strain, which is closely related to C. necator .
  • a plasmid in which a phaC gene expression unit derived from A. caviae and a ccr gene expression unit derived from S. cinnamonensis are inserted into pCUP2 is a pCUP2-631 vector.
  • a phaP gene encoding a fasin derived from A. caviae and a phaJ gene encoding an R-specific enoyl-CoA hydratase derived therefrom may be further inserted into pCUP2-631.
  • a phbP gene encoding a fasin derived from C. necator and a phaJ gene encoding an R-specific enoyl-CoA hydratase derived from A. caviae may be further inserted into pCUP2-631.
  • strains obtained by introducing this expression vector into a strain in which the phbA gene on the chromosome has been disrupted and the bktB gene expression has been enhanced include strains such as the KNK-631 strain. All of these strains should be fermentatively produced PHA having a 3HH composition ratio of 12 mol% or more using an inexpensive and safe carbon source while maintaining a cell content of 70% or more and a cell amount of 150 g / L or more. Can do.
  • a method for producing 3HH-containing PHA using the microorganism produced by the above-described method will be described.
  • the method is not particularly limited, but can be performed as follows.
  • it is preferable to culture the microorganism using a medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and other organic nutrient sources.
  • the carbon source saccharides, fats and oils, fatty acids and the like are preferable, vegetable oils and fats are more preferable, and palm oil and palm kernel oil are more preferable.
  • the nitrogen source include ammonium salts such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, and ammonium phosphate, peptone, meat extract, yeast extract, and the like.
  • inorganic salts include potassium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride and the like.
  • organic nutrient sources include amino acids such as glycine, alanine, serine, threonine, and proline, and vitamins such as vitamin B1, vitamin B12, and vitamin C.
  • antibiotics kanamycin etc.
  • the recovery of 3HH-containing PHA from the microbial cells is not particularly limited, but can be performed, for example, by the following method.
  • the cells are separated from the culture solution with a centrifuge, and the cells are washed with distilled water, methanol, or the like and dried.
  • 3HH-containing PHA is extracted from the dried cells using an organic solvent such as chloroform.
  • Cellular components are removed from the organic solvent solution containing the 3HH-containing PHA by filtration or the like, and a poor solvent such as methanol or hexane is added to the filtrate to precipitate the 3HH-containing PHA. Further, the supernatant is removed by filtration or centrifugation, and dried to recover 3HH-containing PHA.
  • Analysis of the weight average molecular weight (Mw) and 3HH composition (mol%) of the obtained 3HH-containing PHA can be performed by, for example, a gas chromatographic method, a nuclear magnetic resonance method, or the like.
  • the highly flexible PHA obtained by the present invention is suitably used for films, sheets, flexible packaging containers and the like.
  • Example 1 ⁇ Preparation of plasmid vector for gene insertion>
  • a DNA comprising a base sequence including a promoter of phaC of A. caviae and a ribosome binding site was prepared as follows.
  • PCR was performed using A. caviae genomic DNA as a template and the primers shown in SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7.
  • PCR was (1) 98 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 20 seconds for 25 cycles, and the polymerase used was KOD-plus- (manufactured by TOYOBO).
  • the DNA fragment obtained by PCR was terminally phosphorylated and digested with EcoRI. This DNA fragment was designated as P Ac -5P + Eco.
  • the DNA insertion site is set immediately before the start codon of the bktB gene of the chromosomal DNA of the KNK-005AS strain described in JP2008-029218 [0038], and upstream of the start codon of the gene by the following procedure.
  • a DNA consisting of the nucleotide sequence was prepared.
  • PCR was performed using the primers shown in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 9 to initiate the bktB gene. DNA consisting of a base sequence upstream of the codon was obtained. PCR was (1) 98 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 15 seconds, 64 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 30 seconds for 25 cycles, and the polymerase used was KOD-plus-.
  • the DNA fragment obtained by PCR was simultaneously digested with the restriction enzymes BamHI and EcoRI. This DNA fragment was designated as P bktB -Bam + Eco.
  • PCR was carried out using the primers shown in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 7 with the DNA generated in the ligation solution as the template DNA.
  • PCR was (1) 98 ° C. for 2 minutes, 98 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 50 seconds for 25 cycles.
  • the polymerase used was KOD-plus-.
  • the DNA fragment obtained by PCR was terminally phosphorylated and digested with BamHI. This DNA fragment was designated as bPac-5P + Bam.
  • PCR was performed using the genomic DNA of the KNK-005 strain as a template DNA source and the primers shown in SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 11 to obtain a DNA comprising a base sequence downstream from the start codon of the bktB gene. .
  • PCR was (1) 98 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 15 seconds, 64 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 30 seconds for 25 cycles, and the polymerase used was KOD-plus-.
  • the DNA fragment obtained by PCR was terminally phosphorylated and digested with ClaI. This DNA fragment was designated ORF-5P + Cla.
  • BPac-5P + Bam and ORF-5P + Cla were ligated, and PCR was performed using the primers shown in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 11 using the DNA generated in the ligated solution as a template DNA.
  • PCR (1) 98 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 1 minute 30 seconds were repeated 25 cycles, and the polymerase used was KOD-plus-.
  • the DNA fragment obtained by PCR was co-digested with BamHI and ClaI. This DNA fragment was subcloned into the site digested with the same restriction enzyme of the vector pBluescript II KS (-) (manufactured by TOYOBO).
  • the obtained vector was designated as bAO / pBlu.
  • the base sequence was determined using a DNA sequencer 3130xl Genetic Analyzer manufactured by APPLIED BIOSSYSTEMS, and it was confirmed that it was the same as the base sequence of the template DNA.
  • a pSACKm described in JP 2008-029218 A [0037] was treated with a restriction enzyme NotI to cut out a DNA fragment of about 5.7 kb containing a kanamycin resistance gene and a sacB gene. This was inserted into a site cleaved with the same enzyme of bAO / pBlu to prepare a plasmid bAO / pBlu / SacB-Km for gene disruption / insertion.
  • the obtained transformant was mixed and cultured on KNK-005AS strain and Nutrient Agar medium (manufactured by Difco) for conjugation transfer.
  • Son agar medium containing 250 mg / L kanamycin (sodium citrate 2 g / L, sodium chloride 5 g / L, magnesium sulfate heptahydrate 0.2 g / L, ammonium dihydrogen phosphate 1 g / L, dihydrogen phosphate 2
  • a strain that had grown on potassium 1 g / L, agar 15 g / L, pH 6.8 was selected to obtain a strain in which the plasmid was integrated on the chromosome of the KNK-005AS strain.
  • This strain is cultured for 2 generations in Nutrient Broth medium (manufactured by Difco), then diluted and applied to Nutrient Agar medium containing 15% sucrose, and the grown strain is selected to perform the second recombination. The resulting stock was acquired. Furthermore, a desired gene insertion strain was isolated by PCR analysis.
  • This gene insertion strain was named Pac-bktB / AS strain, its nucleotide sequence was determined using a DNA sequencer 3130xl Genetic Analyzer, and DNA comprising a phaC promoter and a ribosome binding site immediately before the start codon of the bktB gene. was confirmed to be an inserted strain.
  • a DNA (hereinafter referred to as Pre) having a base sequence including a C. necator phbC promoter and a ribosome binding site was prepared as follows.
  • PCR was performed using the genomic DNA of the KNK-005 strain as a template and the primers shown in SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 13.
  • PCR (1) 98 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 15 seconds, 54 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 25 seconds were repeated 25 cycles, and the polymerase used was KOD-plus-.
  • the DNA fragment obtained by PCR was terminally phosphorylated. This DNA fragment was P re -5P.
  • the DNA insertion site was set immediately before the start codon of the bktB gene of the chromosomal DNA of the KNK-005AS strain.
  • ORF-5P + Cla produced in Example 1 was used as DNA consisting of a base sequence downstream from the start codon of the bktB gene.
  • P re -5P and ORF-5P-Cla were ligated, and PCR was performed using the primers shown in SEQ ID NO: 12 and SEQ ID NO: 11 with the DNA produced in the ligated solution as the template DNA.
  • PCR (1) 98 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 15 seconds, 54 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 50 seconds were repeated 25 cycles.
  • the polymerase used was KOD-plus-.
  • the DNA fragment obtained by PCR was terminally phosphorylated and digested with ClaI. This DNA fragment was designated as PRO-5P + Cla.
  • PCR was performed using the genomic DNA of the KNK-005 strain as a template DNA source and the primers shown in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 14 to obtain a DNA comprising a base sequence upstream from the start codon of the bktB gene. .
  • PCR (1) 98 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 15 seconds, 58 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 20 seconds were repeated 25 cycles, and the polymerase used was KOD-plus-.
  • the DNA fragment obtained by PCR was terminally phosphorylated and digested with BamHI. This DNA fragment was designated as P bktB ⁇ 5P + Bam.
  • P bktB -5P + Bam and PRO-5P + Cla were ligated, and PCR was performed using the DNAs generated in the ligation solution as template DNAs and the primers shown in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 11.
  • PCR was performed using the DNAs generated in the ligation solution as template DNAs and the primers shown in SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 11.
  • 98 ° C. for 2 minutes (1) 98 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 30 seconds, and 68 ° C. for 1 minute 30 seconds were repeated 25 cycles, and the polymerase used was KOD-plus-.
  • the DNA fragment obtained by PCR was co-digested with BamHI and ClaI. This DNA fragment was subcloned into a site obtained by digesting the vector pBluescript II KS ( ⁇ ) with the same restriction enzyme. The obtained vector was designated as bRO / pBlu.
  • the base sequence
  • pSACKm was treated with the restriction enzyme NotI to cut out a DNA fragment of about 5.7 kb containing the kanamycin resistance gene and the sacB gene. This was inserted into a site cleaved with the same enzyme of bRO / pBlu to prepare a gene disruption / insertion plasmid bRO / pBlu / SacB-Km.
  • Pre-bktB / AS strain ⁇ Preparation of gene insertion strain Pre-bktB / AS strain>
  • a nucleotide sequence including a phbC promoter and a ribosome binding site immediately before the start codon of the bktB gene A strain into which DNA consisting of was inserted was prepared.
  • This DNA insertion strain was designated as Pre-bktB / AS strain.
  • the nucleotide sequence was determined, and it was confirmed that the strain had a DNA having a nucleotide sequence including a phbC promoter and a ribosome binding site inserted immediately before the start codon of the bktB gene.
  • Example 3 Production of BAB3 / AS strain ⁇ Production of plasmid vector for gene insertion> The DNA insertion position was set between the 91st and 92nd bases upstream of the start codon of the bktB gene of the chromosomal DNA of the KNK-005AS strain, that is, immediately after the stop codon of the ORF existing upstream of the bktB gene.
  • a DNA comprising a base sequence including a promoter of phaPCJ of A. caviae and a ribosome binding site was prepared as follows.
  • PCR was performed using A. caviae genomic DNA as a template and the primers shown in SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16. PCR was (1) 98 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 20 seconds for 25 cycles, and the polymerase used was KOD-plus-. The DNA fragment obtained by PCR was digested with MunI. This DNA fragment was designated as P Ac -Mun / 3.
  • DNA consisting of a base sequence upstream from the insertion site was prepared according to the following procedure.
  • PCR was performed using the genomic DNA of the KNK-005 strain as a template DNA source and the primers shown in SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18 to obtain DNA consisting of the base sequence of the upstream ORF of the bktB gene.
  • PCR was (1) 98 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 15 seconds, 64 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 30 seconds for 25 cycles, and the polymerase used was KOD-plus-.
  • the DNA fragment obtained by PCR was digested with the restriction enzyme MunI. This DNA fragment was designated as miaB-Mun / 3.
  • P Ac -Mun / 3 and miaB-Mun / 3 were ligated, and PCR was performed using the primers shown in SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 16 with the DNA produced in the ligation solution as the template DNA.
  • PCR was (1) 98 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 60 seconds for 25 cycles, and the polymerase used was KOD-plus-.
  • the DNA fragment obtained by PCR was digested with BamHI and ClaI. This DNA fragment was designated as BAB3-Bam + Cla.
  • This DNA fragment was subcloned into a site digested with the same restriction enzyme of the vector pBluescript II KS (-).
  • the obtained vector was designated as BAB3 / pBlu.
  • the base sequence was determined and confirmed to be the desired base sequence.
  • pSACKm was treated with the restriction enzyme NotI to cut out a DNA fragment of about 5.7 kb containing the kanamycin resistance gene and the sacB gene. This was inserted into the site of BAB3 / pBlu cleaved with the same enzyme to prepare a gene BAB3 / pBlu / SacB-Km for gene disruption / insertion.
  • the nucleotide sequence was determined, and the strain was confirmed to be a strain in which a DNA comprising a nucleotide sequence including a phaPCJ promoter and a ribosome binding site was inserted between nucleotides 91 and 92 upstream of the start codon of the bktB gene.
  • Example 4 Production of BAB4 / AS strain ⁇ Production of plasmid vector for gene insertion> The DNA insertion position was set between the 65th and 66th bases upstream of the start codon of the bktB gene of the chromosomal DNA of the KNK-005AS strain, that is, 26 bases downstream from the stop codon of the ORF existing upstream of the bktB gene.
  • a DNA comprising a base sequence including a promoter of phaPCJ of A. caviae and a ribosome binding site was prepared as follows.
  • PCR was performed using A. caviae genomic DNA as a template and the primers shown in SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 19. PCR was (1) 98 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 20 seconds for 25 cycles, and the polymerase used was KOD-plus-. The DNA fragment obtained by PCR was digested with MunI. This DNA fragment was designated as P Ac -Mun / 4.
  • DNA consisting of a base sequence upstream from the insertion site was prepared according to the following procedure.
  • PCR was performed using the genomic DNA of the KNK-005 strain as a template DNA source and the primers shown in SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 20 to obtain DNA consisting of the base sequence of the upstream ORF of the bktB gene.
  • PCR was (1) 98 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 15 seconds, 64 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 30 seconds for 25 cycles, and the polymerase used was KOD-plus-.
  • the DNA fragment obtained by PCR was digested with the restriction enzyme MunI. This DNA fragment was designated as miaB-Mun / 4.
  • P Ac -Mun / 4 and miaB-Mun / 4 were ligated, and PCR was performed using the primers shown in SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 19 with the DNA produced in the ligation solution as the template DNA.
  • PCR was (1) 98 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 60 seconds for 25 cycles, and the polymerase used was KOD-plus-.
  • the DNA fragment obtained by PCR was digested with BamHI and ClaI. This DNA fragment was designated as BAB4-Bam + Cla.
  • This DNA fragment was subcloned into a site digested with the same restriction enzyme of the vector pBluescript II KS (-).
  • the obtained vector was designated as BAB4 / pBlu.
  • the base sequence was determined and confirmed to be the desired base sequence.
  • pSACKm was treated with the restriction enzyme NotI to cut out a DNA fragment of about 5.7 kb containing the kanamycin resistance gene and the sacB gene. This was inserted into the site of BAB4 / pBlu cleaved with the same enzyme to prepare a gene BAB4 / pBlu / SacB-Km for gene disruption / insertion.
  • the nucleotide sequence was determined, and the strain was confirmed to be a strain in which a DNA comprising a nucleotide sequence including a phaPCJ promoter and a ribosome binding site was inserted between the 65th and 66th bases upstream of the start codon of the bktB structural gene.
  • Example 5 Production of BAB5 / AS strain ⁇ Production of plasmid vector for gene insertion> The DNA insertion position was set between the 58th and 59th bases upstream of the start codon of the bktB gene of the chromosomal DNA of the KNK-005AS strain, that is, 33 bases downstream from the stop codon of the ORF existing upstream of the bktB gene.
  • a DNA comprising a base sequence including a promoter of phaPCJ of A. caviae and a ribosome binding site was prepared as follows.
  • PCR was performed using A. caviae genomic DNA as a template and the primers shown in SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 21. PCR was (1) 98 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 20 seconds for 25 cycles, and the polymerase used was KOD-plus-. The DNA fragment obtained by PCR was digested with MunI. This DNA fragment was designated as P Ac -Mun / 5.
  • a DNA comprising a base sequence upstream from the insertion site was prepared by the following procedure.
  • PCR was performed using the genomic DNA of the KNK-005 strain as a template DNA source and the primers shown in SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 22 to obtain DNA consisting of the base sequence of the upstream ORF of the bktB gene.
  • PCR was (1) 98 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 15 seconds, 64 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 30 seconds for 25 cycles, and the polymerase used was KOD-plus-.
  • the DNA fragment obtained by PCR was digested with the restriction enzyme MunI. This DNA fragment was designated as miaB-Mun / 5.
  • P Ac -Mun / 5 and miaB-Mun / 5 were ligated, and PCR was performed using the primers shown in SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 21 with the DNA generated in the ligation solution as the template DNA.
  • PCR was (1) 98 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 60 seconds for 25 cycles, and the polymerase used was KOD-plus-.
  • the DNA fragment obtained by PCR was digested with BamHI and ClaI. This DNA fragment was designated as BAB5-Bam + Cla.
  • This DNA fragment was subcloned into a site digested with the same restriction enzyme of the vector pBluescript II KS (-).
  • the obtained vector was designated as BAB5 / pBlu.
  • the nucleotide sequence was determined and confirmed to be DNA consisting of the desired nucleotide sequence.
  • pSACKm was treated with the restriction enzyme NotI to cut out a DNA fragment of about 5.7 kb containing the kanamycin resistance gene and the sacB gene. This was inserted into a site where BAB5 / pBlu was cleaved with the same enzyme to prepare a gene disruption / insertion plasmid BAB5 / pBlu / SacB-Km.
  • the base sequence was determined, and it was confirmed that the strain had a DNA having a base sequence including a phaPCJ promoter and a ribosome binding site inserted between the 58th and 59th bases upstream of the start codon of the bktB gene.
  • a DNA consisting of a C. necator phbC promoter and a base sequence containing a ribosome binding site was prepared as follows.
  • PCR was performed using C. necator genomic DNA as a template and the primers shown in SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24.
  • PCR was (1) 98 ° C. for 2 minutes, (2) 98 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 20 seconds for 25 cycles, and the polymerase used was KOD-plus-.
  • the DNA fragment obtained by PCR was digested with the restriction enzyme MunI. This DNA fragment was designated as P Re -Mun / 5.
  • P Re -Mun / 5 and miaB-Mun / 5 prepared in Example 5 were ligated, and PCR was performed using the DNA generated in the ligation solution as a template DNA and the primers shown in SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 24 It was.
  • PCR was (1) 98 ° C. for 2 minutes, 98 ° C. for 15 seconds, 60 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 60 seconds for 25 cycles, and KOD-plus- was used as the polymerase.
  • the DNA fragment obtained by PCR was digested with BamHI and ClaI. This DNA fragment was designated as BRB5-Bam + Cla.
  • This DNA fragment was subcloned into a site digested with the same restriction enzyme of the vector pBluescript II KS (-).
  • the obtained vector was named BRB5 / pBlu.
  • the nucleotide sequence was determined and confirmed to be DNA consisting of the desired nucleotide sequence.
  • pSACKm was treated with the restriction enzyme NotI to cut out a DNA fragment of about 5.7 kb containing the kanamycin resistance gene and the sacB gene. This was inserted into a site where BRB5 / pBlu was cleaved with the same enzyme to prepare a gene disruption / insertion plasmid BRB5 / pBlu / SacB-Km.
  • the base sequence was determined, and it was confirmed that the strain had a DNA having a base sequence containing a phbC promoter and a ribosome binding site inserted between the 58th and 59th bases upstream of the start codon of the bktB structural gene.
  • Example 7 ⁇ Cloning of ccr gene and expression unit construction>
  • the ccr gene encoding an enzyme that converts crotonyl-CoA to butyryl-CoA, a precursor of 3HH monomer, was cloned from the chromosomal DNA of the Streptomyces cinnamonensis Okami strain (DSM 1042).
  • PCR was performed using the DNAs described in SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 as primers.
  • the conditions were (1) 98 ° C. for 2 minutes, (2) 94 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 20 seconds, and 68 ° C. for 90 seconds for 25 cycles.
  • the polymerase used was KOD-plus-.
  • the fragment amplified by PCR was purified and then cleaved with restriction enzymes BamHI and AflII. Subcloning the EE32d13 fragment (J. Bacteriol., 179, 4821 (1997)) into the EcoRI site of the pUC19 vector, cutting this plasmid with BglII and AflII, and replacing the ccr gene with the BamHI and AflII fragments.
  • the ccr expression unit was constructed by
  • Example 8 ⁇ Cloning of phaC gene and preparation of expression unit>
  • a phaC expression unit containing SEQ ID NO: 4 was prepared as a SpeI fragment.
  • PCR was performed using HG :: P Re -N149S / D171G-T / pBlu described in JP-A-2007-228894 [0031] as a template and primers shown in SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 28.
  • the conditions were (1) 98 ° C. for 2 minutes, (2) 94 ° C. for 10 seconds, 55 ° C. for 30 seconds and 68 ° C. for 2 minutes for 25 cycles, and the polymerase used was KOD-plus-.
  • the fragment amplified by PCR was purified and then cleaved with the restriction enzyme SpeI to prepare an expression unit.
  • Expression vector pCUP2-631 was constructed as follows. As a plasmid vector for constructing an expression vector in C. necator , pCUP2 described in WO / 2007/049716 [0041] was used. First, the ccr gene expression unit constructed in Example 7 was excised by EcoRI treatment, and this fragment was ligated with pCUP2 cleaved with MunI. Next, the phaC expression unit prepared in Example 8 was prepared as a SpeI fragment and inserted into the SpeI site of pCUP2 containing the ccr gene expression unit to construct a pCUP2-631 vector.
  • Example 10 Preparation of transformed cells Introduction of the pCUP2-631 vector into various cells was carried out by electrical introduction as follows.
  • the gene introduction apparatus used was a gene pulser manufactured by Biorad, and the cuvette used was a gap 0.2 cm manufactured by Biorad. 400 ⁇ l of competent cells and 20 ⁇ l of expression vector were injected into a cuvette and set in a pulse device, and an electric pulse was applied under the conditions of electrostatic capacity 25 ⁇ F, voltage 1.5 kV, and resistance value 800 ⁇ .
  • the bacterial solution in the cuvette was cultured with shaking on Nutrient Broth medium (manufactured by DIFCO) at 30 ° C. for 3 hours, and then on a selection plate (NutrientAgar medium (manufactured by DIFCO), kanamycin 100 mg / L) at 30 ° C.
  • the cultured transformants were cultured for a day to obtain transformed transformants.
  • Example 11 The produced various transformants were cultured.
  • the composition of the pre-medium is 1% (w / v) Meat-extract, 1% (w / v) Bacto-Trypton, 0.2% (w / v) Yeast-extract, 0.9% (w / v) Na
  • the pH was adjusted to 6.7 with 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O and 0.15% (w / v) KH 2 PO 4 .
  • the composition of the polyester production medium is 1.1% (w / v) Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O, 0.19% (w / v) KH 2 PO 4 , 0.6% (w / v) (NH 4 ) 2 SO 4 , 0.1% (w / v) MgSO 4 .7H 2 O, 0.5% (v / v) trace metal salt solution (1.6% (w / v) FeCl in 0.1 N hydrochloric acid) 3 ⁇ 6H 2 O, 1% (w / v) CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, 0.02% (w / v) CoCl 2 ⁇ 6H 2 O, 0.016% (w / v) CuSO 4 ⁇ 5H 2 O, 0.012% (w / v) NiCl 2 ⁇ 6H 2 O, and 0.01% (w / v) CrCl 3 ⁇ 6H 2 O. This was carried out by fed-batch culture in which PKOO (palm kernel oil
  • the glycerol stock of each transformant was inoculated into the pre-culture medium and cultured for 20 hours, and 10% (v) was added to a 5 L jar fermenter (MD-500 type, manufactured by Maruhishi Bioengine) containing 2.5 L of polyester production medium. / v) Inoculated.
  • the operating conditions were a culture temperature of 28 ° C., a stirring speed of 420 rpm, an aeration rate of 0.6 vvm, and a pH controlled between 6.6 and 6.8. For control, 14% aqueous ammonia was used. Incubation was carried out for up to 65 hours. After incubation, the cells were collected by centrifugation, washed with methanol, lyophilized, and analyzed for the 3HH composition ratio.
  • 3HH composition analysis of the produced polyester was measured by gas chromatography as follows. To 20 mg of the dried polyester, 2 ml of a sulfuric acid-methanol mixture (15:85) and 2 ml of chloroform were added and sealed, and heated at 100 ° C. for 140 minutes to obtain a methyl ester of a polyester degradation product. After cooling, 1.5 g of sodium bicarbonate was added little by little to neutralize it, and the mixture was allowed to stand until the generation of carbon dioxide gas stopped. After adding 4 ml of diisopropyl ether and mixing well, the mixture was centrifuged and the monomer unit composition of the polyester degradation product in the supernatant was analyzed by capillary gas chromatography.
  • the gas chromatograph used was Shimadzu Corporation GC-17A, and the capillary column used was GL Science's NEUTRABOND-1 (column length 25 m, column inner diameter 0.25 mm, liquid film thickness 0.4 ⁇ m). He was used as the carrier gas, the column inlet pressure was 100 kPa, and 1 ⁇ l of the sample was injected. As temperature conditions, the temperature was raised from an initial temperature of 100 to 200 ° C. at a rate of 8 ° C./min, and further from 200 to 290 ° C. at a rate of 30 ° C./min. As a result of analysis under the above conditions, it was a copolymer polyester P (3HB-co-3HH) as shown in chemical formula (1). Table 1 shows the dry cell weight, polymer content, and 3HH ratio.

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Abstract

　本発明は、ポリヒドロキシアルカノエート（ＰＨＡ）を生産する微生物であって、（１）ｐｈｂＡ遺伝子の発現が抑制されているか、該遺伝子がコードする酵素の触媒活性が抑制されており、（２）ｂｋｔＢ遺伝子の発現が強化されているか、該遺伝子がコードする酵素の触媒活性が向上されており、及び（３）ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子及びクロトニル－ＣｏＡ還元酵素遺伝子が導入されている微生物に関する。当該微生物を培養することにより、柔軟性にすぐれ適応用途範囲が広いＰＨＡであるＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）を、安価な炭素源を用いて効率よく製造することができる。

Description

改良されたポリヒドロキシアルカノエート生産微生物及びそれを用いたポリヒドロキシアルカノエートの製造方法
　本発明は、炭素数４以上の３－ヒロドキシアルカノエート単位を有するポリヒドロキシアルカノエート共重合体を生産する微生物および該微生物を用いて該共重合体を効率よく製造する方法に関する。
　ポリヒドロキシアルカノエート（以下、ＰＨＡと記す）は、広範な微生物によって生成されるポリエステル型有機分子ポリマーである。ＰＨＡは生分解性を有する熱可塑性高分子である。また、ＰＨＡは再生可能資源から産生されうる。これらのことから、ＰＨＡを環境調和型素材または生体適合型素材として工業的に生産し、多様な産業へ利用する試みが行われている。
　現在までに数多くの微生物において、エネルギー貯蔵物質としてポリエステルを菌体内に蓄積することが知られている。その代表例としては３－ヒドロキシ酪酸（以下、３ＨＢと記すこともある）のホモポリマーであるポリ－３－ヒドロキシ酪酸（以下、Ｐ（３ＨＢ）と記すこともある）が挙げられる。Ｐ（３ＨＢ）は１９２５年にBacillusmegateriumで最初に発見された。Ｐ（３ＨＢ）は熱可塑性高分子であり、自然環境中で生物学的に分解されることから、環境にやさしいプラスチックとして注目されている。しかし、Ｐ（３ＨＢ）は結晶性が高いために硬くて脆い性質を持っていることから実用的には応用範囲が限られている。応用範囲を広げるためには、Ｐ（３ＨＢ）に柔軟性を付与することが必要であった。
　そこで、３ＨＢと３－ヒドロキシ吉草酸（以下、３ＨＶと記す）とからなる共重合体（以下、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）と記す）の製造方法が開示されている（特許文献１、特許文献２）。Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）はＰＨＡの一種である。Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）は、Ｐ（３ＨＢ）に比べると柔軟性に富むため、幅広い用途に応用できると考えられた。しかしながら、実際にはＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）中の３ＨＶモル分率を増加させてもそれに伴う物性の変化が乏しく、特にフィルムやシート、軟質系包装容器等へ加工するために要求される程には柔軟性が向上しないため、シャンプーボトルや使い捨て剃刀の取手等、硬質成型体の限られた分野にしか利用されていない。
　Ｐ（３ＨＢ）の柔軟性を高めるために、３ＨＢと３－ヒドロキシヘキサン酸（以下、３ＨＨと記すこともある）からなる共重合体（以下、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）と記すこともある）及びその製造方法について研究がなされた（特許文献３、特許文献４）。Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）もＰＨＡの一種である。これら報告におけるＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）の製造方法は、土壌より単離されたAeromonascaviaeの野生株を用い、オレイン酸、パルミチン酸等の脂肪酸を炭素源として発酵生産するものであった。３ＨＨ組成比はオレイン酸を炭素源としたとき１５ｍｏｌ％、パルミチン酸を炭素源としたとき５ｍｏｌ％であった。
　Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）の物性に関する研究もなされている（非特許文献１）。この報告では、炭素数が１２個以上の脂肪酸を唯一の炭素源としてA. caviaeを培養し、３ＨＨ組成が１１～１９ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）を発酵生産している。Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）が３ＨＨ組成の増加にしたがって、Ｐ（３ＨＢ）の様な硬くて脆い性質から次第に柔軟な性質を示すようになり、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）を上回る柔軟性を示すことが明らかにされた。すなわち、Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）は３ＨＨ組成比を変えることで、硬質ポリマーから軟質ポリマーまで応用可能な幅広い物性を持たせることができるため、低３ＨＨ組成比のＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）を用いたテレビの筐体等のように硬さを要求されるものから、高３ＨＨ組成比のＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）を用いたフィルム等のように柔軟性を要求されるものまで、幅広い分野への応用が期待できる。しかしながら、前記製造方法では菌体生産量４ｇ／Ｌ、菌体あたりのポリマー含量３０％とポリマー生産性は低いものであったため、実用化に向けて更に高い生産性、特にポリマー含量を向上させる方法が探索されてきた。
　Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）の工業生産を目指した取組みの例として、以下の技術が挙げられる。非特許文献２では、Aeromonas hydrophilaを用い、オレイン酸を炭素源とした４３時間の流加培養を行うことにより、菌体量９５．７ｇ／Ｌ、ポリマー含量４５．２％、３ＨＨ組成比１７ｍｏｌ％のＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）が生産された。また、A.hydrophilaを用いたグルコース及びラウリン酸を炭素源とした培養により、３ＨＨ組成比が１１ｍｏｌ％であり、菌体量５０ｇ／Ｌ、ポリマー含量５０％が達成された（非特許文献３）。しかしながら、A.hydrophilaはヒトに対して病原性を有する（非特許文献４）ことから、工業生産に適した微生物とはいえなかった。また、これらの培養生産で用いられている炭素源は高価であるため、製造コストの観点より安価な炭素源の利用が求められていた。
　このため、安全な宿主での生産及び生産性の向上を目指して以下のような取組みが行なわれた。A. caviaeよりクローニングされたポリヒドロキシアルカン酸（ＰＨＡ）合成酵素遺伝子をCupriavidusnecator (旧分類：Ralstonia eutropha或いはAlcaligenes eutrophus)に導入した形質転換体を用い、オクタン酸を炭素源としてＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）の生産を行った結果、３ＨＨ組成比は２２ｍｏｌ％であり、菌体量４ｇ／Ｌ、ポリマー含量は３３重量％であった（特許文献５、非特許文献５）。更に前記形質転換体を、炭素源として植物油脂を用いて培養した結果、３ＨＨ組成比は４～５ｍｏｌ％であり、菌体量４ｇ／Ｌ、ポリマー含量８０％が達成された（非特許文献６）。後者の製造方法は安価な植物油脂を炭素源とし、ポリマー含量も高いものの、菌体量が低いため、ポリマー生産性が低く、且つ３ＨＨ組成比４～５ｍｏｌ％ではフィルム等の用途に適用できるほど柔らかいものではなかった。
　大腸菌を宿主としたＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産株も構築された。Aeromonas属のＰＨＡ合成酵素遺伝子、C. necatorのＮＡＤＰ－アセトアセチル－ＣｏＡ還元酵素遺伝子等を大腸菌に導入した株が構築された。ドデカンを炭素源として該大腸菌を４０．８時間培養した結果、菌体量７９ｇ／Ｌ、ポリマー含量２７．２％、３ＨＨ組成比１０．８ｍｏｌ％であった（非特許文献８）。A.caviaeのＰＨＡ合成酵素遺伝子、エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子及びアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ遺伝子を導入した大腸菌も構築された。ラウリン酸を含む培地で該大腸菌を培養すると、菌体生産性は１ｇ／Ｌ、ポリマー含量約１６％、３ＨＨ組成比約１６ｍｏｌ％であった（非特許文献９）。これらの大腸菌でもポリマー生産性は低く、工業的生産への適用は困難であった。
　Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）の生産性向上並びに３ＨＨ組成制御を目指して、ＰＨＡ合成酵素の人為的な改変が行なわれた（非特許文献１０）。A. caviae由来のＰＨＡ合成酵素変異体のなかで、１４９番目のアミノ酸アスパラギンがセリンに置換された変異体酵素や、１７１番目のアスパラギン酸がグリシンに置換された変異体酵素は、大腸菌内でのＰＨＡ合成酵素活性や３ＨＨ組成が向上していることが示され、また、５１８番目のフェニルアラニンがイソロイシンに置換された変異体酵素や２１４番目のバリンがグリシンに置換された変異体酵素は大腸菌でのＰＨＡ合成酵素活性やポリマー含量が向上したことが報告されている。しかし、これらは宿主として特殊な大腸菌を用いており、更にポリマー含量は約１３％と低いことから、これらの変異体酵素の特徴を活かした工業的生産に向けた更なる改良が必要であった。
　また、ｐＪＲＤ２１５（ATCC 37533）にポリエステル合成酵素遺伝子やＲ－エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子等を導入したｐＪＲＤＥＥ３２やｐＪＲＤＥＥ３２ｄ１３等（特許文献５、非特許文献５参照）のＰＨＡ合成酵素発現プラスミドにによってC.necatorを形質転換し、該形質転換体のＰＨＡ生産性が調べられている。該菌株の菌体量は４ｇ／Ｌと低かったが、植物油脂を炭素源とした同菌株の培養条件改善により菌体量４５ｇ／Ｌ、ポリマー含量６２．５％、３ＨＨ組成比８．１ｍｏｌ％にまでポリマー生産性が向上した。このように、培養方法によってＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）の３ＨＨ組成比やポリマー生産性を改善する試みがなされた（特許文献６）。
　Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）の物性を制御する方法も開示されている（特許文献６）。少なくとも２種類の炭素数の異なる油脂および／または脂肪酸を炭素源として用いることによって、３ＨＨ組成比が１～４０ｍｏｌ％のポリエステルを生産することが可能となり、種々の物性を有するＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）が生産できるようになった。しかしながら、本製造方法では、３ＨＨ組成制御のために比較的高価なヘキサン酸、オクタン酸等を添加する必要があり、また高濃度のヘキサン酸は細胞毒性を示すことから菌体生産性が低下する結果となっている。また、多成分の炭素源を添加するため、生産設備が複雑・高価になる場合がある。
　C. necatorを宿主とし、果糖を炭素源とした培養で３ＨＨ組成を向上させる方法も開示されている。ポリエステル合成酵素遺伝子と放線菌Streptomycescinnamonensis由来のクロトニル－ＣｏＡ還元酵素遺伝子（以下ｃｃｒと略記する）を導入すると３ＨＨ組成は０．９％であったものの、更にＲ－エノイル－ＣｏＡヒドラターゼ遺伝子等を導入すると３ＨＨ組成は１．６％に向上した。しかし、その時の菌体量は約１．５ｇ／Ｌ、ポリマー含量は４０％前後と低く、高３ＨＨ組成Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）の工業的生産には一層の改良が必要であった（非特許文献７）。
　フィルムやシート、軟質系包装容器等への応用には３ＨＨ組成比が１２ｍｏｌ％以上のＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）が望まれている。しかし、従来のＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）生産において、３ＨＨ組成比を向上させようとすれば、ポリマー含量あるいは菌体量の低下を招いていた。工業生産において望ましいとされる７０％以上のポリマー含量且つ１５０ｇ／Ｌ以上の菌体量かつ３ＨＨ組成比１２ｍｏｌ％以上を実現する方法はなく、一層の改良が必要であった。
特開昭５７－１５０３９３号公報 特開昭５９－２２０１９２号公報 特開平５－９３０４９号公報 特開平７－２６５０６５号公報 特開平１０－１０８６８２号公報 特開２００１－３４００７８号公報
Y. Doi, S. Kitamura, H. Abe; Macromolecules, 28, 4822-4823 (1995) Biotechnology and Bioengineering, vol.67, 240 (2000) Appl. Microbiol. Biotechnol., vol.57, 50 (2001) 国立感染症研究所、病原体等安全管理規定、別表１付表１（１９９９） T. Fukui, Y. Doi; J. Bacteriol, 179, 15, 4821-4830 (1997) T. Fukui等、Appl. Microbiol. Biotecnol., 49, 333 (1998) T. Fukui等、Biomolecules, vol.3, 618 (2002) S. Park等、Biomacromolecules, vol.2, 248 (2001) X. Lu等、FEMS Microbiology Letters, vol.221, 97 (2003) T. Kichise等、Appl. Environ. Microbiol., 68, 2411-2419 (2002)
　本発明は、柔軟性に優れ幅広い用途が期待される高３ＨＨ組成比のＰＨＡを、安価な炭素源である植物油を用いて、実用的な生産性で製造することを目的とする。特には、菌体のポリマー含量７０％以上且つ菌体量１５０ｇ／Ｌ以上を保ったまま、３ＨＨ組成比１２ｍｏｌ％以上のＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）を効率よく発酵生産することを目的とする。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、微生物中のＰＨＡ合成酵素量を増加させるとともに、３ＨＢモノマー合成能を減少させ且つ新たな３ＨＨモノマー合成経路を創出し３ＨＨモノマー供給系を増強させることによって前記微生物中に、３ＨＨ組成比率の向上したＰＨＡが大量に生成・蓄積できる事を見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明の第一は、ｐｈｂＡ遺伝子が不活性化され、ｐｈａＣ遺伝子及びｂｋｔＢ（β－ケトチオラーゼ）遺伝子発現が増強されると共に新たにｃｃｒ遺伝子導入でブチリル－ＣｏＡ合成経路が導入されることによって３ＨＨモノマー合成能が向上した３－ヒドロキシヘキサン酸単位含有ポリヒドロキシアルカノエートを生産可能な微生物に関する。
　より詳細には、次の（１）から（３）の要件を備えた微生物に関する；
（１）ｐｈｂＡ遺伝子の発現が抑制されているか、該遺伝子がコードする酵素の触媒活性が抑制されていること、
（２）ｂｋｔＢ遺伝子の発現が強化されているか、該遺伝子がコードする酵素の触媒活性が向上されていること、
（３）ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子、および／または、クロトニル－ＣｏＡ還元酵素遺伝子が導入されていること。
　本発明の第二は、上記記載の微生物を用い、安価な炭素源を用いて菌体のポリマー含量７０％以上且つ菌体量１５０ｇ／Ｌ以上を保ったまま、３ＨＨ組成比１２ｍｏｌ％以上であることを特徴とする３ＨＨ単位含有ＰＨＡの製造方法に関する。
　本発明により、安価で安全な炭素源を用いて、菌体のポリマー含量７０％以上且つ菌体量１５０ｇ／Ｌ以上を保ったまま、３ＨＨ組成比１２ｍｏｌ％以上のＰＨＡを発酵生産することができる。
　以下、本発明につき、さらに詳細に説明する。本発明の３ＨＨ単位含有ＰＨＡとは、３ＨＨとともに、３ＨＢ、３ＨＶ、３－ヒドロキシオクタン酸、および、それらよりアルキル鎖の長い３－ヒドロキシアルカン酸からなる群より選らばれる1以上の３－ヒドロキシアルカン酸が共重合したポリエステルである。
　本発明のｐｈｂＡ遺伝子とは、β－ケトチオラーゼ活性を有する酵素のうち、２分子のアセチル－ＣｏＡを縮合する反応を触媒するが、β－ケトバレリル－ＣｏＡのチオリシスを殆ど触媒しない酵素をコードする遺伝子で、例えば配列番号５に示される塩基配列からなるｐｈｂＡ遺伝子が例示される。配列番号５に示される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、２分子のアセチル－ＣｏＡを縮合する反応を触媒するが、β－ケトバレリル－ＣｏＡのチオリシスを殆ど触媒しない酵素をコードする遺伝子は本発明に好適に用いることができる。配列同一性は９０％以上であればより好ましく、更に好ましくは９５％以上、更により好ましくは９８％以上である。
　本発明のｂｋｔＢ遺伝子とは、β－ケトチオラーゼ活性を有する酵素のうち、２分子のアセチル－ＣｏＡの縮合およびアセチル－ＣｏＡとそれよりも鎖長の長い、例えばプロピオニル－ＣｏＡの縮合の両方をよく触媒し、且つ３－ケトバレリル－ＣｏＡのチオリシスを触媒する酵素をコードする遺伝子で、例えば配列番号２９に示される塩基配列からなる遺伝子が例示される（SLATER等、J.Bacteriol., vol.180, 1979-1987, 1998）。配列番号２９に示される塩基配列と８５％以上の配列同一性を有し、２分子のアセチル－ＣｏＡの縮合およびアセチル－ＣｏＡとそれよりも鎖長の長い、例えばプロピオニル－ＣｏＡの縮合の両方をよく触媒し、且つ３－ケトバレリル－ＣｏＡのチオリシスを触媒する酵素をコードする遺伝子は本発明に好適に用いることができる。配列同一性は９０％以上であればより好ましく、更に好ましくは９５％以上、更により好ましくは９８％以上である。
　また、３ＨＨ単位含有ＰＨＡを合成可能なポリメラーゼをコードする遺伝子としては、A. caviaeのｐｈａＣ遺伝子或いは、配列番号４に示される塩基配列からなるｐｈａＣ変異遺伝子などが例示でき、宿主が結果として該ＰＨＡを産生可能であればよい。ｐｈａＣ遺伝子が有する塩基配列あるいは配列番号４に示される塩基配列と、８５％以上の配列同一性を有する遺伝子で、３ＨＨ単位含有ＰＨＡを合成可能なポリメラーゼをコードする遺伝子は本発明に好適に用いることができる。配列同一性は９０％以上であればより好ましく、更に好ましくは９５％以上、更により好ましくは９８％以上である。
　本発明において、ｂｋｔＢ構造遺伝子の内在のプロモーターとは、ｂｋｔＢ構造遺伝子の転写を誘発するＤＮＡのことであり、宿主として用いるｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物中に内在する。
　本発明におけるｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物とは、ｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を有する野生株、或いは該野生株に遺伝子操作した微生物であれば特に制限はなく、３ＨＨ単位含有ＰＨＡを合成可能な菌株であれば、それらを宿主として使用することができる。具体的にはラルストニア（Ralstonia）属、カプリアビダス（Cupriavidus）属、ワウテルシア（Wautersia）属、アエロモナス(Aeromonas)属、エシェリキア(Escherichia)属、アルカリゲネス(Alcaligenes)属、シュードモナス(Pseudomonas)属等の細菌類を使用することが好ましい。安全性及び生産性の観点から、より好ましくはラルストニア属、カプリアビダス属、ワウテルシア属に属する細菌であり、特に好ましくはCupriavidusnecatorである。C. necatorとしては、例えば、C. necator H16（ATCC17699）等が挙げられる。当該株はAmerican Type Culture Collection (ATCC)等から入手することができる。勿論、前記微生物を人工的に突然変異処理して得られる変異株、遺伝子工学的手法により変異処理された類縁菌株であっても、３ＨＨ単位含有ＰＨＡを合成可能な菌株であれば本発明に使用できる。
　そして、３ＨＨ組成比を高めるためには、ｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物の染色体上に存在するｐｈｂＡ遺伝子が不活性化されていることが好ましい。ｐｈｂＡ遺伝子がコードする酵素は、前記のようにアセチル－ＣｏＡ２分子の縮合によって、ＰＨＡモノマーの一つである３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡの前駆体であるアセトアセチル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する。一方、ｐｈｂＡ遺伝子がコードする酵素はアセチル－ＣｏＡとブタノイル－ＣｏＡを縮合する反応を触媒しない。従って、ｐｈｂＡ遺伝子の不活性化はポリマー中の３ＨＢ比率を低くするため、結果として３ＨＨ比率が向上すると考えられる。
　ｐｈｂＡ遺伝子を不活性化する方法は、結果としてｐｈｂＡが不活性化されていればよく、例えば、１）phbA遺伝子の開始コドンと終止コドンの間に新たな終止コドンを導入する、２）リボソーム結合部位にリボソーム結合活性が低下する変異を導入する、３）ｐｈｂＡ構造遺伝子内部に酵素の触媒活性を低下させる変異を導入する、４）ＲＮＡ干渉を利用する、５）トランスポゾンを挿入する、６）ｐｈｂＡ構造遺伝子の一部或いは全部を欠失させる等の方法が挙げられる。これらの方法は当業者に周知である。
　また、ＰＨＡの生産性を高めつつ３ＨＨ組成比を高めるためには、ｂｋｔＢ遺伝子がコードする酵素を増強することが好ましい。ｂｋｔＢ遺伝子がコードする酵素は、アセチル－ＣｏＡ２分子の縮合だけではなく、アセチル－ＣｏＡとブタノイル－ＣｏＡを縮合する反応も触媒する。アセチル－ＣｏＡとブタノイル－ＣｏＡが縮合すると、３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡの前駆体である３－ケトヘキサノイル－ＣｏＡが生じる。ｂｋｔＢ遺伝子がコードする酵素の活性は、アセチル－ＣｏＡ２分子の縮合反応に対してよりもアセチル－ＣｏＡとブタノイル－ＣｏＡの縮合反応に対しての方が高い。
　ｂｋｔＢ遺伝子がコードする酵素を増強する方法は特に限定しないが、発現ベクターによる高発現化や発現調節領域の改変による高発現化が可能である。好ましくはｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物の染色体上にある該遺伝子のプロモーターを改変して転写活性を上げること、例えば、ｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物に内在しているｂｋｔＢ遺伝子の上流に、さらにｂｋｔＢ遺伝子の転写を誘発するプロモーターが組み込まれていると、転写活性が上がることによって高発現化が可能である。
　ｂｋｔＢ遺伝子の転写を誘発するプロモーターは、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンの上流に挿入されることが好ましい。プロモーターは、ｂｋｔＢ遺伝子の転写を誘発する限りはどのようなプロモーターでも本発明に用いうる。該プロモーターはｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物内在のプロモーター及び異種微生物のプロモーターの少なくとも何れかであることが好ましい。例えば、配列番号１に示される塩基配列からなるC.necatorのｐｈｂＣＡＢオペロンのプロモーターや、配列番号２に示される塩基配列からなるA. caviaeのｐｈａＰＣＪオペロンのプロモーターは、ｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物としてC.necatorを用いる場合に好適である。
　ここで、プロモーターとして用いるＤＮＡは、配列番号１および２に示した塩基配列と７０％以上の配列同一性を有することが好ましく、より好ましくは８５％以上であり、更に好ましくは９０％以上であり、更により好ましくは９５％以上であり、最も好ましくは９８％以上である。ｂｋｔＢ遺伝子の転写を誘発する限りは本発明に用いることができる。
　さらに、プロモーターとして用いるＤＮＡとして、配列番号１および２に示した塩基配列と相補的な塩基配列をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザン・ハイブリダイゼーション法等を行った時に、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡを用いることができる。ｂｋｔＢ遺伝子の転写を誘発する限りは本発明に用いることができる。
　前記ハイブリダイゼーションは、Molecular Cloning, A laboratory manual, second edition（ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989）等に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ハイブリダイズするＤＮＡとは、例えば、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７～１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃の条件下でフィルターを洗浄することにより取得できるＤＮＡをあげることができる。好ましくは６５℃で２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、より好ましくは６５℃で０．２倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄、更に好ましくは６５℃で０．１倍濃度のＳＳＣ溶液で洗浄することにより取得できるＤＮＡである。
　以上のようにハイブリダイゼーション条件を記載したが、これらの条件に特に制限されない。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度や塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで最適なストリンジェンシーを実現することが可能である。
　上記の条件にてハイブリダイズ可能なＤＮＡとしては、配列番号１、或いは２に示されるＤＮＡと、配列同一性が７０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上のＤＮＡをあげることができ、ｂｋｔＢ遺伝子の転写を誘発する限り、上記プロモーターに包含される。
　更に３ＨＨ組成を高める方法として、ｃｃｒ遺伝子導入で３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡ合成経路を導入することが有効である。ｃｃｒ遺伝子がコードするクロトニル－ＣｏＡ還元酵素は脂肪酸のβ酸化経路の中間体であるクロトニル－ＣｏＡを還元し、ｂｋｔＢ遺伝子がコードする酵素の基質であるブチリル－ＣｏＡを生成する酵素である。この遺伝子を導入することにより、３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡはβ酸化経路からの直接的な供給のみでなく、β酸化経路から派生するアセチル－ＣｏＡからも供給される。
　本発明に用いるｃｃｒ遺伝子は、クロトニル－ＣｏＡを還元し３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードする限り本発明に用いることができるが、配列番号３に示した塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であることが好ましく、より好ましくは８５％以上であり、更に好ましくは９０％以上であり、更により好ましくは９５％以上であり、最も好ましくは９８％以上である。
　さらに、配列番号３に示した塩基配列と相補的な塩基配列をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザン・ハイブリダイゼーション法等を行った時に、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡも、クロトニル－ＣｏＡを還元しブチリル－ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードする限り、本発明に用いることができる。
　本発明に用いるポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子は、ポリヒドロキシアルカノエート合成活性を有する酵素をコードする限り、本発明に用いることができるが、配列番号４に示した塩基配列と７０％以上の配列同一性を有する塩基配列からなる遺伝子であることが好ましく、より好ましくは８５％以上であり、更に好ましくは９０％以上であり、更により好ましくは９５％以上であり、最も好ましくは９８％以上である。
　さらに、配列番号４に示した塩基配列と相補的な塩基配列をプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法、あるいはサザン・ハイブリダイゼーション法等を行った時に、ストリンジェントな条件でハイブリダイズするＤＮＡも、ポリヒドロキシアルカノエート合成活性を有する酵素をコードする限り、本発明に用いることができる。
　本発明において、３ＨＨ含有ＰＨＡの生産に用い得る炭素源としては、例えばグルコース、フルクトース等の糖類や、メタノール、エタノール、ブタノール等のアルコール類、酢酸、プロピオン酸、ヘキサン酸、オクタン酸、デカン酸、ラウリン酸、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸、リノレン酸、ミリスチン酸等の飽和・不飽和脂肪酸などの脂肪酸類、あるいはこれら脂肪酸のエステルや塩等の脂肪酸誘導体、乳酸等の有機酸類、炭素数が１０以上である飽和・不飽和脂肪酸を多く含む油脂、例えば植物油脂、中でも、ヤシ油、パーム油、パーム核油、パーム核油オレイン（以下、ＰＫＯＯとも記載する）、パームダブルオレイン（以下、ＰＯＯとも記載する）等が挙げられる。培養する際の炭素源の添加量としては、菌株が増殖し、ポリエステルを合成できる範囲であれば良い。
　本発明において、宿主に用いるｐｈｂＡ遺伝子とｂｋｔＢ遺伝子を元来有する微生物の野生株が、３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡを殆どＰＨＡへと変換させる事ができない場合、３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡをＰＨＡへと変換する能力の高い酵素をコードする遺伝子を染色体上へ挿入するか、或いはプラスミドベクターなどを用いて導入する事で、細胞内にて合成された３３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡをＰＨＡへと変換する効率を向上させる必要がある。例えば、宿主としてC.necatorを使用する場合、３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡをＰＨＡへと変換する能力の高い酵素をコードする遺伝子として、A. caviaeのｐｈａＣ遺伝子或いは配列番号４に示したその変異体遺伝子を導入することが好ましい。
　本発明の３ＨＨ含有ＰＨＡを生産可能な微生物の作製方法は、特に限定するわけではないが、C. necatorを宿主として以下に例示する。A.caviae由来で３－ヒドロキシヘキサノイル－ＣｏＡをＰＨＡへと変換する能力の高い酵素をコードするポリエステル合成酵素変異体遺伝子を染色体上に相同組換え法などで元のポリエステル合成酵素遺伝子と置換する。そして遺伝子破壊法を用いて、染色体上に存在するｐｈｂＡ遺伝子を不活性化するが、その態様はｐｈｂＡ遺伝子産物であるタンパク質の活性が低下或いは消失すればどのような方法でも良い。例えば、ｐｈｂＡ遺伝子の内部に終止コドンを導入しても良いし、遺伝子上流のプロモーター及び／又はリボソーム結合部位を改変しても良い。更にｂｋｔＢ遺伝子の発現を増強するが、その態様はｂｋｔＢ遺伝子産物の活性が上がればどのような方法でも良い。例えば、より比活性の向上したｂｋｔＢ変異体遺伝子を用いてもよく、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンの上流に異種又は同種のプロモーター及びリボソーム結合部位を含むＤＮＡを挿入してもよいし、ｂｋｔＢ遺伝子の本来のプロモーター及び／又はリボソーム結合部位を異種又は同種のプロモーター及び／又はリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡに置換する方法でもよい。本来のプロモーターは染色体上からすべて失われていてもよいし、一部が欠失していてもよい。
　前記染色体の改変において、染色体上に任意の遺伝子を部位特異的に挿入／置換する方法は当業者に周知であり、代表的な方法としては特に限定するわけではないが以下の方法が挙げられる。トランスポゾンと相同組換えの機構を利用した方法（Ohman等、J.Bacteriol., vol.162, p1068 (1985)）や相同組換えの機構によって起こる部位特異的な組み込みと第二段階の相同組換えによる脱落を原理とした方法（Noti等、MethodsEnzymol., vol.154, p197 (1987)）などがあり、また、Bacillus subtilis由来のｓａｃＢ遺伝子を共存させて、第二段階の相同組換えによって遺伝子が脱落した微生物株をシュークロース添加培地耐性株として容易に単離する方法（Schweizer;Mol. Microbiol., vol.6, p1195 (1992)、Lenz等; J. Bacteriol., vol.176, p4385(1994)）も利用することができるが、染色体上に任意遺伝子を挿入／置換出来ればその方法は特に制限されない。
　例えばC. necatorのｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前に、A. caviaeのｐｈａＣ遺伝子のプロモーター及びリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡを挿入する場合の方法を、より具体的に例示する。まず、置換フラグメントを作製する。置換フラグメントはｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンの直前にA.caviaeのｐｈａＣ遺伝子（以下、ｐｈａＣとも記す）のプロモーター及びリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡがつながり、その後にｂｋｔＢ遺伝子がつながった形とする。すなわち、該遺伝子の開始コドンの直前にｐｈａＣのプロモーター及びリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入されたＤＮＡ断片である。ｐｈａＣのプロモーター及びリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡを挟んで存在する上流と下流は染色体上のＤＮＡと相同組換えを起こすために必要な相同配列であって、一般的にはその長さが長いほど組換え頻度は高くなるが、相同組換えさえ起こればよく、その長さは任意に設定できる。
　置換断片には、遺伝子置換の際に選択マーカーとなる遺伝子を付加することができる。選択マーカーとなる遺伝子は、例えばカナマイシン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、アンピシリン等の抗生物質の耐性遺伝子や各種の栄養要求性を相補する遺伝子等が使用できる。C.necatorを宿主とする場合にはカナマイシンの耐性遺伝子が好適である。さらにそれらに加えて、第二段階の相同組換えによって選択マーカー遺伝子を含む領域が脱落した微生物株の選択を容易にするための遺伝子が付加できる。そのような遺伝子としてはBacillussubtilis由来のｓａｃＢ遺伝子が例示できる。この遺伝子が発現している微生物株はシュークロースを含む培地で生育できないことが知られており、シュークロースを含む培地での生育によりこの遺伝子を脱落によって失った株を選択することが容易となる。
　これらで構成された置換フラグメントは、宿主微生物株中で複製しないベクターに接続することによって遺伝子置換用のプラスミドとして作製される。ラルストニア属やシュードモナス属等で利用できるこのようなベクタープラスミドには、例えばｐＵＣベクター、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＢＲ３２２ベクター、或いはそれらと同じ複製起点を持つベクター等が挙げられる。さらには、接合伝達を可能にするｍｏｂ、ｏｒｉＴなどのＤＮＡ配列を共存させることも可能である。
　このような構成で作製された遺伝子置換用のプラスミドＤＮＡは、エレクトロポレーション法や接合伝達法など公知の方法によりC. necatorに導入することができ、相同組換えを行うことができる。
　次に相同組換えによって染色体上に遺伝子置換用のプラスミドＤＮＡが挿入された株の選択を行う。株の選択は、遺伝子置換用プラスミドＤＮＡに共存させた選択用の遺伝子に基づいた方法によって行うことができる。カナマイシン耐性遺伝子を用いた場合には、カナマイシンを含む培地で生育してきた株から選ぶことができる。
　次の段階で、第二の相同組換えによって染色体上から選択マーカー遺伝子を含む領域が脱落した株を選択する。挿入時に利用した選択用の遺伝子に基づいて、例えばカナマイシンを含む培地で生育できなくなった株を選択してもよいが、ｓａｃＢ遺伝子を遺伝子置換用プラスミドに共存させている場合は、シュークロースを含む培地で生育してくる株から容易に選択できる。このようにして得られた株が、所望するように遺伝子が置換された株かどうか確認するには、ＰＣＲ法やサザン・ハイブリダイゼーション法、ＤＮＡ塩基配列の決定など、公知の方法が使用できる。
　以上のようにして、C. necatorの染色体上にあるｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンの上流にA. caviaeのｐｈａＣのプロモーター及びリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された株を取得することができる。
　次に発現ベクターについて説明する。C. necatorで通常用いられる発現ベクターにはｐＪＲＤ２１５由来の発現ベクター（例えば特許文献５）やｐＢＢＲ１２２由来の発現ベクター（非特許文献７）がある。発現ベクターはその宿主細胞内において、非選択圧条件下でも安定に複製・維持されることが望ましい。従って国際公開公報WO/2007/049716号公報［0041］に記載のｐＣＵＰ２等がより好適である。ｐＣＵＰ２にはC.necatorと近縁であるカプリアビダス・メタリデュランス（Cupriavidus metallidurans）ＣＨ３４株が保有するメガプラスミドｐＭＯＬ２８由来のプラスミドの複製や安定維持に必要な領域が含まれている。
　このｐＣＵＰ２にA. caviae由来のｐｈａＣ遺伝子発現ユニットとS. cinnamonensis由来のｃｃｒ遺伝子発現ユニットを挿入したプラスミドがｐＣＵＰ２－６３１ベクターである。ｐＣＵＰ２－６３１に更にA.caviae由来のフェイシンをコードするｐｈａＰ遺伝子及び同由来のＲ－特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードするｐｈａＪ遺伝子を挿入しても良い。また、ｐＣＵＰ２－６３１に更にC.necator由来のフェイシンをコードするｐｈｂＰ遺伝子及びA. caviae由来のＲ－特異的エノイル－ＣｏＡヒドラターゼをコードするｐｈａＪ遺伝子を挿入しても良い。
　前述した染色体上のｐｈｂＡ遺伝子を破壊し、且つｂｋｔＢ遺伝子発現を増強した株に、この発現ベクターを導入して得られる菌株としてＫＮＫ－６３１株等の菌株が例示できる。これらの株はいずれも安価で安全な炭素源を用いて、菌体のポリマー含量７０％以上且つ菌体量１５０ｇ／Ｌ以上を保ったまま、３ＨＨ組成比１２ｍｏｌ％以上のＰＨＡを発酵生産することができる。
　前述した方法で作製した微生物を用いて３ＨＨ含有ＰＨＡを製造する方法について説明する。その方法は特に限定するわけではないが、以下のようにして行う事ができる。本発明のＰＨＡの生産においては、炭素源、窒素源、無機塩類、そのほかの有機栄養源を含む培地を用いて、前記微生物を培養することが好ましい。
　炭素源としては、糖類、油脂類、脂肪酸類などが好ましく、より好ましくは植物油脂類であり、更に好ましくはパーム油及びパーム核油である。窒素源としては、例えばアンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩の他、ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えばリン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。
　そのほかの有機栄養源としては、例えばグリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。また、培養液中に、発現プラスミドに存在する薬剤耐性遺伝子に対応する抗生物質（カナマイシン等）を添加しても良い。
　本発明において、菌体からの３ＨＨ含有ＰＨＡの回収は、特に限定はないが、例えば次のような方法により行うことができる。培養終了後、培養液から遠心分離機等で菌体を分離し、その菌体を蒸留水およびメタノール等により洗浄し、乾燥させる。この乾燥菌体から、クロロホルム等の有機溶剤を用いて３ＨＨ含有ＰＨＡを抽出する。この３ＨＨ含有ＰＨＡを含んだ有機溶剤溶液から、濾過等によって菌体成分を除去し、そのろ液にメタノールやヘキサン等の貧溶媒を加えて３ＨＨ含有ＰＨＡを沈殿させる。さらに、濾過や遠心分離によって上澄み液を除去し、乾燥させて３ＨＨ含有ＰＨＡを回収する。
　得られた３ＨＨ含有ＰＨＡの重量平均分子量（Ｍｗ）や３ＨＨ組成(ｍｏｌ％)の分析は、例えば、ガスクロマトグラフ法や核磁気共鳴法等により行うことができる。
　本発明で得られる柔軟性の高いＰＨＡは、フィルムやシート、軟質系包装容器などに好適に用いられる。
　以下に実施例を示し、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。なお一般的な遺伝子操作は、MolecularCloning（Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その取扱説明書に従い使用することができる。なお、酵素は、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。
　（実施例１）
　＜遺伝子挿入用プラスミドベクターの作製＞
　挿入用ＤＮＡとしてA. caviaeのｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡを次のように作製した。A.caviaeのゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号６および配列番号７で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－（ＴＯＹＯＢＯ製）を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＥｃｏＲＩ消化した。このＤＮＡ断片をＰＡｃ－５Ｐ＋Ｅｃｏとした。
　次に、特開2008-029218号公報[0038]に記載のＫＮＫ－００５ＡＳ株の染色体ＤＮＡのｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前をＤＮＡ挿入部位と設定し、以下の手順で該遺伝子の開始コドンより上流側の塩基配列からなるＤＮＡを作製した。
　特開2008-029218号公報[0036]に記載のＫＮＫ－００５株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号８および配列番号９で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンより上流の塩基配列からなるＤＮＡを得た。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６４℃で３０秒、６８℃で３０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで２酵素同時消化した。このＤＮＡ断片をＰｂｋｔＢ－Ｂａｍ＋Ｅｃｏとした。
　ＰＡｃ－５Ｐ＋ＥｃｏおよびＰｂｋｔＢ－Ｂａｍ＋Ｅｃｏをライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号８および配列番号７で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で５０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＢａｍＨＩ消化した。このＤＮＡ断片をｂＰａｃ－５Ｐ＋Ｂａｍとした。
　次に、該遺伝子の開始コドンより下流側の塩基配列からなるＤＮＡを作製した。ＫＮＫ－００５株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号１０および配列番号１１で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンより下流側の塩基配列からなるＤＮＡを得た。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６４℃で３０秒、６８℃で３０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＣｌａＩ消化した。このＤＮＡ断片をＯＲＦ－５Ｐ＋Ｃｌａとした。
　ｂＰａｃ－５Ｐ＋ＢａｍとＯＲＦ－５Ｐ＋Ｃｌａをライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号８および配列番号１１で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で１分３０秒、を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで２酵素同時消化した。このＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ（－）（ＴＯＹＯＢＯ製）の同制限酵素で消化した部位にサブクローニングした。得られたベクターをｂＡＯ／ｐＢｌｕとした。ＡＰＰＬＩＥＤ　ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ社製のＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて塩基配列を決定し、鋳型としたＤＮＡの塩基配列と同一であることを確認した。
　続いて、特開2008-029218号公報[0037]に記載のｐＳＡＣＫｍを制限酵素ＮｏｔＩで処理することによってカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含む約５．７ｋｂのＤＮＡ断片を切り出した。これを、ｂＡＯ／ｐＢｌｕの同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子破壊・挿入用プラスミドｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ－Ｋｍを作製した。
　＜遺伝子挿入株Ｐａｃ－ｂｋｔＢ／ＡＳ株の作製＞
　次に、ＫＮＫ－００５ＡＳ株を親株としてｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ－Ｋｍを用いてｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された菌株を作製した。遺伝子挿入用プラスミドｂＡＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ－Ｋｍで大腸菌Ｓ１７－１株（ＡＴＣＣ４７００５）を形質転換した。得られた形質転換体をＫＮＫ－００５ＡＳ株とＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物０．２ｇ／Ｌ、リン酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ－００５ＡＳ株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株を選択して２回目の組換えが生じた株を取得した。さらにＰＣＲによる解析により所望の遺伝子挿入株を単離した。
　この遺伝子挿入株をＰａｃ－ｂｋｔＢ／ＡＳ株と命名し、ＤＮＡシークエンサー３１３０ｘｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて塩基配列を決定し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にｐｈａＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された株であることを確認した。
　（実施例２）　Ｐｒｅ－ｂｋｔＢ／ＡＳ株の作製
　＜遺伝子挿入用プラスミドベクターの作製＞
　挿入用ＤＮＡとしてC. necatorのｐｈｂＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡ（以下Ｐｒｅとする）を次のように作製した。ＫＮＫ－００５株のゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号１２および配列番号１３で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、５４℃で３０秒、６８℃で２５秒、を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化した。このＤＮＡ断片をＰｒｅ－５Ｐとした。
　次に、ＫＮＫ－００５ＡＳ株の染色体ＤＮＡのｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前をＤＮＡ挿入部位と設定した。
　ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンより下流側の塩基配列からなるＤＮＡとして実施例１で作製したＯＲＦ－５Ｐ＋Ｃｌａを用いた。
　Ｐｒｅ－５ＰおよびＯＲＦ－５Ｐ－Ｃｌａをライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号１２および配列番号１１で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、５４℃で３０秒、６８℃で５０秒、を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＣｌａＩ消化した。このＤＮＡ断片をＰＲＯ－５Ｐ＋Ｃｌａとした。
　次に、該遺伝子の開始コドンより上流側の配列を作製した。ＫＮＫ－００５株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号８および配列番号１４で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンより上流側の塩基配列からなるＤＮＡを得た。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、５８℃で３０秒、６８℃で２０秒、を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を末端リン酸化およびＢａｍＨＩ消化した。このＤＮＡ断片をＰｂｋｔＢ－５Ｐ＋Ｂａｍとした。
　ＰｂｋｔＢ－５Ｐ＋ＢａｍとＰＲＯ－５Ｐ＋Ｃｌａをライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号９および配列番号１１で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で１分３０秒、を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで２酵素同時消化した。このＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ（－）を同制限酵素で消化した部位に、サブクローニングした。得られたベクターをｂＲＯ／ｐＢｌｕとした。塩基配列を決定し、鋳型としたＤＮＡの塩基配列と同一であることを確認した。
　続いて、ｐＳＡＣＫｍを制限酵素ＮｏｔＩで処理することによってカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含む約５．７ｋｂのＤＮＡ断片を切り出した。これを、ｂＲＯ／ｐＢｌｕの同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子破壊・挿入用プラスミドｂＲＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ－Ｋｍを作製した。
　＜遺伝子挿入株Ｐｒｅ－ｂｋｔＢ／ＡＳ株の作製＞
　実施例１の遺伝子置換株の作製方法と同様にして、ＫＮＫ－００５ＡＳ株を親株としてｂＲＯ／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ－Ｋｍを用いてｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にｐｈｂＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された菌株を作製した。このＤＮＡ挿入株をＰｒｅ－ｂｋｔＢ／ＡＳ株と命名した。塩基配列を決定し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン直前にｐｈｂＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された株であることを確認した。
　（実施例３）　ＢＡＢ３／ＡＳ株の作製
　＜遺伝子挿入用プラスミドベクターの作製＞
　ＤＮＡ挿入位置をＫＮＫ－００５ＡＳ株の染色体ＤＮＡのｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン上流側９１塩基目と９２塩基目の間、即ちｂｋｔＢ遺伝子の上流に存在するＯＲＦの停止コドン直後と設定した。
　挿入用ＤＮＡとして、A. caviaeのｐｈａＰＣＪのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡを次のように作製した。
　A. caviaeのゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号１５および配列番号１６で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＭｕｎＩ消化した。このＤＮＡ断片をＰＡｃ－Ｍｕｎ／３とした。
　また以下の手順で挿入部位より上流側の塩基配列からなるＤＮＡを作製した。
　ＫＮＫ－００５株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号１７および配列番号１８で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｂｋｔＢ遺伝子の上流側ＯＲＦの塩基配列からなるＤＮＡを得た。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６４℃で３０秒、６８℃で３０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩで消化した。このＤＮＡ断片をｍｉａＢ－Ｍｕｎ／３とした。
　ＰＡｃ－Ｍｕｎ／３およびｍｉａＢ－Ｍｕｎ／３をライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号１７および配列番号１６で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で６０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで消化した。このＤＮＡ断片をＢＡＢ３－Ｂａｍ＋Ｃｌａとした。
　このＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ（－）の同制限酵素で消化した部位にサブクローニングした。得られたベクターをＢＡＢ３／ｐＢｌｕとした。塩基配列を決定し、所望の塩基配列であることを確認した。
　続いて、ｐＳＡＣＫｍを制限酵素ＮｏｔＩで処理することによってカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含む約５．７ｋｂのＤＮＡ断片を切り出した。これを、ＢＡＢ３／ｐＢｌｕの同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子破壊・挿入用プラスミドＢＡＢ３／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ－Ｋｍを作製した。
　＜遺伝子挿入株ＢＡＢ３／ＡＳ株の作製＞
　実施例１の遺伝子挿入株の作製方法と同様にして、ＫＮＫ－００５ＡＳ株を親株としてＢＡＢ３／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ－Ｋｍを用いてｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンの上流側にｐｈａＰＣＪのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された菌株を作製した。このＤＮＡ挿入株をＢＡＢ３／ＡＳ株と命名した。塩基配列を決定し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン上流側９１塩基目と９２塩基目の間にｐｈａＰＣＪのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された株であることを確認した。
　（実施例４）　ＢＡＢ４／ＡＳ株の作製
　＜遺伝子挿入用プラスミドベクターの作製＞
　ＤＮＡ挿入位置をＫＮＫ－００５ＡＳ株の染色体ＤＮＡのｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン上流側６５塩基目と６６塩基目の間、即ちｂｋｔＢ遺伝子の上流に存在するＯＲＦの停止コドンから２６塩基下流と設定した。
　挿入用ＤＮＡとして、A. caviaeのｐｈａＰＣＪのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡを次のように作製した。
　A. caviaeのゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号１５および配列番号１９で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＭｕｎＩ消化した。このＤＮＡ断片をＰＡｃ－Ｍｕｎ／４とした。
　また以下の手順で挿入部位より上流側の塩基配列からなるＤＮＡを作製した。
　ＫＮＫ－００５株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号１７および配列番号２０で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｂｋｔＢ遺伝子の上流側ＯＲＦの塩基配列からなるＤＮＡを得た。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６４℃で３０秒、６８℃で３０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩで消化した。このＤＮＡ断片をｍｉａＢ－Ｍｕｎ／４とした。
　ＰＡｃ－Ｍｕｎ／４およびｍｉａＢ－Ｍｕｎ／４をライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号１７および配列番号１９で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で６０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで消化した。このＤＮＡ断片をＢＡＢ４－Ｂａｍ＋Ｃｌａとした。
　このＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ（－）の同制限酵素で消化した部位にサブクローニングした。得られたベクターをＢＡＢ４／ｐＢｌｕとした。塩基配列を決定し、所望の塩基配列であることを確認した。
　続いて、ｐＳＡＣＫｍを制限酵素ＮｏｔＩで処理することによってカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含む約５．７ｋｂのＤＮＡ断片を切り出した。これを、ＢＡＢ４／ｐＢｌｕの同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子破壊・挿入用プラスミドＢＡＢ４／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ－Ｋｍを作製した。
　＜遺伝子挿入株ＢＡＢ４／ＡＳ株の作製＞
　実施例１の遺伝子挿入株の作製方法と同様にして、ＫＮＫ－００５ＡＳ株を親株としてＢＡＢ４／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ－Ｋｍを用いてｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドンの上流側にｐｈａＰＣＪのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された菌株を作製した。このＤＮＡ挿入株をＢＡＢ４／ＡＳ株と命名した。塩基配列を決定し、ｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドン上流側６５塩基目と６６塩基目の間にｐｈａＰＣＪのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された株であることを確認した。
　（実施例５）　ＢＡＢ５／ＡＳ株の作製
　＜遺伝子挿入用プラスミドベクターの作製＞
　ＤＮＡ挿入位置をＫＮＫ－００５ＡＳ株の染色体ＤＮＡのｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン上流側５８塩基目と５９塩基目の間、即ちｂｋｔＢ遺伝子の上流に存在するＯＲＦの停止コドンから３３塩基下流と設定した。
　挿入用ＤＮＡとして、A. caviaeのｐｈａＰＣＪのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡを次のように作製した。
　A. caviaeのゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号１５および配列番号２１で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＭｕｎＩ消化した。このＤＮＡ断片をＰＡｃ－Ｍｕｎ／５とした。
　また以下の手順で挿入部位より上流側の塩基配列からなるＤＮＡを作製した。
ＫＮＫ－００５株のゲノムＤＮＡを鋳型ＤＮＡの供給源として、配列番号１７および配列番号２２で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行い、ｂｋｔＢ遺伝子の上流側ＯＲＦの塩基配列からなるＤＮＡを得た。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６４℃で３０秒、６８℃で３０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩで消化した。このＤＮＡ断片をｍｉａＢ－Ｍｕｎ／５とした。
　ＰＡｃ－Ｍｕｎ／５およびｍｉａＢ－Ｍｕｎ／５をライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号１７および配列番号２１で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で６０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで消化した。このＤＮＡ断片をＢＡＢ５－Ｂａｍ＋Ｃｌａとした。
　このＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ（－）の同制限酵素で消化した部位にサブクローニングした。得られたベクターをＢＡＢ５／ｐＢｌｕとした。塩基配列を決定し、所望の塩基配列からなるＤＮＡであることを確認した。
　続いて、ｐＳＡＣＫｍを制限酵素ＮｏｔＩで処理することによってカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含む約５．７ｋｂのＤＮＡ断片を切り出した。これを、ＢＡＢ５／ｐＢｌｕを同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子破壊・挿入用プラスミドＢＡＢ５／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ－Ｋｍを作製した。
　＜遺伝子挿入株ＢＡＢ５／ＡＳ株の作製＞
　実施例１の遺伝子挿入株の作製方法と同様にして、ＫＮＫ－００５ＡＳ株を親株としてＢＡＢ５／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ－Ｋｍを用いてｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンの上流側にｐｈａＰＣＪのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された菌株を作製した。このＤＮＡ挿入株をＢＡＢ５／ＡＳ株と命名した。塩基配列を決定し、ｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン上流側５８塩基目と５９塩基目の間にｐｈａＰＣＪのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された株であることを確認した。
　（実施例６）　ＢＲＢ５／ＡＳ株の作製
　＜遺伝子挿入用プラスミドベクターの作製＞
　ＤＮＡ挿入位置をＫＮＫ－００５ＡＳ株の染色体ＤＮＡのｂｋｔＢ遺伝子の開始コドン上流側５８塩基目と５９塩基目の間、即ちｂｋｔＢ遺伝子の上流に存在するＯＲＦの停止コドンから３３塩基下流と設定した。
　挿入用ＤＮＡとしてC. necatorのｐｈｂＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡを次のように作製した。
　C. necatorのゲノムＤＮＡをテンプレートとして配列番号２３および配列番号２４で示されるプライマーを用いて、ＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、（２）９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で２０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片を制限酵素ＭｕｎＩで消化した。このＤＮＡ断片をＰＲｅ－Ｍｕｎ／５とした。
　ＰＲｅ－Ｍｕｎ／５および実施例５で調製したｍｉａＢ－Ｍｕｎ／５をライゲーションし、ライゲート液中に生成したＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして配列番号１７および配列番号２４で示されるプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲは（１）９８℃で２分、９８℃で１５秒、６０℃で３０秒、６８℃で６０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いた。ＰＣＲで得たＤＮＡ断片をＢａｍＨＩおよびＣｌａＩで消化した。このＤＮＡ断片をＢＲＢ５－Ｂａｍ＋Ｃｌａとした。
　このＤＮＡ断片を、ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＫＳ（－）の同制限酵素で消化した部位にサブクローニングした。得られたベクターをＢＲＢ５／ｐＢｌｕとした。塩基配列を決定し、所望の塩基配列からなるＤＮＡであることを確認した。
　続いて、ｐＳＡＣＫｍを制限酵素ＮｏｔＩで処理することによってカナマイシン耐性遺伝子およびｓａｃＢ遺伝子を含む約５．７ｋｂのＤＮＡ断片を切り出した。これを、ＢＲＢ５／ｐＢｌｕを同酵素で切断した部位に挿入して遺伝子破壊・挿入用プラスミドＢＲＢ５／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ－Ｋｍを作製した。
　＜遺伝子挿入株ＢＲＢ５／ＡＳ株の作製＞
　実施例１の遺伝子挿入株の作製方法と同様にして、ＫＮＫ－００５ＡＳ株を親株としてＢＲＢ５／ｐＢｌｕ／ＳａｃＢ－Ｋｍを用いてｂｋｔＢ遺伝子の開始コドンの上流側にｐｈｂＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された菌株を作製した。このＤＮＡ挿入株をＢＲＢ５／ＡＳ株と命名した。塩基配列を決定し、ｂｋｔＢ構造遺伝子の開始コドン上流側５８塩基目と５９塩基目の間にｐｈｂＣのプロモーターおよびリボソーム結合部位を含む塩基配列からなるＤＮＡが挿入された株であることを確認した。
　（実施例７）
　＜ｃｃｒ遺伝子のクローニング及び発現ユニット構築＞
　クロトニル－ＣｏＡを、３ＨＨモノマーの前駆体であるブチリル－ＣｏＡに変換する酵素をコードするｃｃｒ遺伝子を、ストレプトマイセス・シンナモネンシス（Streptomycescinnamonensis）Ｏｋａｍｉ株（ＤＳＭ　１０４２）の染色体ＤＮＡからクローニングした。配列番号２５及び配列番号２６記載のＤＮＡをプライマーとしＰＣＲを行った。その条件は（１）９８℃で２分、（２）９４℃で１０秒、５５℃で２０秒、６８℃で９０秒を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いた。ＰＣＲで増幅した断片を精製後、制限酵素ＢａｍＨＩ及びＡｆｌＩＩで切断した。ＥＥ３２ｄ１３断片（J.Bacteriol., 179, 4821 (1997)）を、ｐＵＣ１９ベクターのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングし、このプラスミドをＢｇｌＩＩとＡｆｌＩＩで切断し、ＢａｍＨＩ及びＡｆｌＩＩ断片としたｃｃｒ遺伝子と断片を置換することによってｃｃｒ発現ユニットを構築した。
　（実施例８）
　＜ｐｈａＣ遺伝子のクローニング及び発現ユニット調製＞
　配列番号４を含むｐｈａＣ発現ユニットをＳｐｅＩ断片として調製した。特開2007-228894号公報[0031]に記載のＨＧ：：ＰＲｅ－Ｎ１４９Ｓ／Ｄ１７１Ｇ－Ｔ／ｐＢｌｕを鋳型とし、配列番号２７と配列番号２８に示すプライマーとしてＰＣＲを行った。その条件は（１）９８℃で２分、（２）９４℃で１０秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分を２５サイクル繰り返し、ポリメラーゼはＫＯＤ－ｐｌｕｓ－を用いた。ＰＣＲで増幅した断片を精製後、制限酵素ＳｐｅＩで切断して発現ユニットを調製した。
　（実施例９）
　＜発現ベクターの構築＞
　発現ベクターｐＣＵＰ２－６３１は以下のようにして構築した。
C. necatorにおける発現ベクター構築用のプラスミドベクターとしては、国際公開公報WO/2007/049716号公報［0041］に記載のｐＣＵＰ２を用いた。まず実施例７で構築したｃｃｒ遺伝子発現ユニットをＥｃｏＲＩ処理により切り出し、この断片をＭｕｎＩで切断したｐＣＵＰ２と連結した。次に実施例８で作製したｐｈａＣ発現ユニットをＳｐｅＩ断片として調製し、ｃｃｒ遺伝子発現ユニットを含むｐＣＵＰ２のＳｐｅＩ部位に挿入してｐＣＵＰ２－６３１ベクターを構築した。
　（実施例１０）形質転換細胞の作製
　ｐＣＵＰ２－６３１ベクターの種々の細胞への導入は以下のように電気導入によって行った。遺伝子導入装置はＢｉｏｒａｄ社製のジーンパルサーを用い、キュベットは同じくＢｉｏｒａｄ社製のｇａｐ０．２ｃｍを用いた。キュベットに、コンピテント細胞４００μｌと発現ベクター２０μｌを注入してパルス装置にセットし、静電容量２５μＦ、電圧１．５ｋＶ、抵抗値８００Ωの条件で電気パルスをかけた。パルス後、キュベット内の菌液をＮｕｔｒｉｅｎｔＢｒｏｔｈ培地（ＤＩＦＣＯ社製）で３０℃、３時間振とう培養し、選択プレート（ＮｕｔｒｉｅｎｔＡｇａｒ培地（ＤＩＦＣＯ社製）、カナマイシン１００ｍｇ／Ｌ）で、３０℃にて２日間培養して、生育してきた形質転換体を取得した。
　（実施例１１）
　作製した種々の形質転換体の培養を行った。前培地の組成は１％(w/v)Ｍｅａｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、１％(w/v)Ｂａｃｔｏ－Ｔｒｙｐｔｏｎ、０．２％(w/v)Ｙｅａｓｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、０．９％(w/v)Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、および、０．１５％(w/v)ＫＨ２ＰＯ４で、ｐＨ６．７に調整した。
　ポリエステル生産培地の組成は１．１％(w/v)Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９％(w/v)ＫＨ２ＰＯ４、０．６％(w/v)（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１％(w/v)ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５％(v/v)微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６％(w/v)ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１％(w/v)ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２％(w/v)ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６％(w/v)ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２％(w/v)ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１％(w/v)ＣｒＣｌ３・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの。）とした。炭素源としてＰＫＯＯ（パーム核油オレイン画分）を流加する流加培養にて行った。
　それぞれの形質転換体のグリセロールストックを前培地に接種して２０時間培養し、２．５Ｌのポリエステル生産培地を入れた５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤ－５００型）に１０％(v/v)接種した。運転条件は、培養温度２８℃、攪拌速度４２０ｒｐｍ、通気量０．６ｖｖｍとし、ｐＨは６．６から６．８の間でコントロールした。コントロールには１４％のアンモニア水を使用した。培養は６５時間まで行った。培養後遠心分離によって菌体を回収し、メタノールで洗浄後、凍結乾燥し、３ＨＨ組成比率を分析した。
　生産されたポリエステルの３ＨＨ組成分析は以下のようにガスクロマトグラフィーによって測定した。乾燥ポリエステルの約２０ｍｇに２ｍｌの硫酸－メタノール混液（１５：８５）と２ｍｌのクロロホルムを添加して密栓し、１００℃で１４０分間加熱して、ポリエステル分解物のメチルエステルを得た。冷却後、これに１．５ｇの炭酸水素ナトリウムを少しずつ加えて中和し、炭酸ガスの発生がとまるまで放置した。４ｍｌのジイソプロピルエーテルを添加してよく混合した後、遠心して、上清中のポリエステル分解物のモノマーユニット組成をキャピラリーガスクロマトグラフィーにより分析した。ガスクロマトグラフは島津製作所ＧＣ－１７Ａ、キャピラリーカラムはＧＬサイエンス社製ＮＥＵＴＲＡＢＯＮＤ－１（カラム長２５ｍ、カラム内径０．２５ｍｍ、液膜厚０．４μｍ）を用いた。キャリアガスとしてＨｅを用い、カラム入口圧１００ｋＰａとし、サンプルは１μlを注入した。温度条件は、初発温度１００から２００℃まで８℃／分の速度で昇温、さらに２００から２９０℃まで３０℃／分の速度で昇温した。上記条件にて分析した結果、化学式（１）に示すような共重合体ポリエステルＰ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）であった。乾燥菌体重量、ポリマー含量、３ＨＨ比率を表１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　（式中、ｍ、ｎは１以上の整数を表す）

Claims (12)

  1. 　次の（１）から（３）の要件を備えた微生物；
    （１）ｐｈｂＡ遺伝子の発現が抑制されているか、該遺伝子がコードする酵素の触媒活性が抑制されていること、
    （２）ｂｋｔＢ遺伝子の発現が強化されているか、該遺伝子がコードする酵素の触媒活性が向上されていること、
    （３）ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子、および／または、クロトニル－ＣｏＡ還元酵素遺伝子が導入されていること。
  2. 　次の（１）から（６）の少なくとも一つにより、ｐｈｂＡ遺伝子の発現が抑制されているか、該遺伝子がコードする酵素の触媒活性が抑制されている、請求項１記載の微生物；
    （１）ｐｈｂＡ遺伝子の開始コドンと終止コドンの間に、新たな終止コドンが導入されている、
    （２）ｐｈｂＡ遺伝子のリボソーム結合部位に、リボソーム結合活性が低下する変異を導入している、
    （３）ｐｈｂＡ遺伝子内部に、ｐｈｂＡ遺伝子がコードする酵素の触媒活性が低下する変異を導入している、
    （４）ＲＮＡ干渉を利用する、
    （５）ｐｈｂＡ遺伝子内部に、トランスポゾンを挿入している、
    （６）ｐｈｂＡ遺伝子の一部或いは全部を欠失している。
  3. 　ｂｋｔＢ遺伝子の上流に、新たにｂｋｔＢ遺伝子の転写を誘発する活性を有するプロモーターが挿入されることにより、ｂｋｔＢ遺伝子の発現が強化されたている、請求項１記載の微生物。
  4. 　新たに挿入されるプロモーターが、次の（１）または（２）のＤＮＡである、請求項３記載の微生物；
    （１）ｂｋｔＢ遺伝子の上流に、配列番号１または２に示される塩基配列からなるＤＮＡと７０％以上の配列同一性を有し、ｂｋｔＢ遺伝子の転写を誘発する活性を有するＤＮＡ、
    （２）ｂｋｔＢ遺伝子の上流に、配列番号１または２に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ｂｋｔＢ遺伝子の転写を誘発する活性を有するＤＮＡ。
  5. 　次の（１）から（４）の少なくとも一つの、ポリヒドロキシアルカノエート合成酵素遺伝子、および／または、クロトニル－ＣｏＡ還元酵素遺伝子が導入されている、請求項１記載の微生物；
    （１）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡと７０％以上の配列同一性を有し、クロトニル－ＣｏＡを還元し、ブチリル－ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードする遺伝子、
    （２）配列番号３に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、クロトニル－ＣｏＡを還元し、ブチリル－ＣｏＡを生成する活性を有する酵素をコードする遺伝子、
    （３）配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡと７０％以上の配列同一性を有し、ポリヒドロキシアルカノエート合成活性を有する酵素をコードする遺伝子、
    （４）配列番号４に示される塩基配列からなるＤＮＡと相補的なＤＮＡとストリンジェントな条件でハイブリダイズし、ポリヒドロキシアルカノエート合成活性を有する酵素をコードする遺伝子。
  6. 　植物油脂を炭素源として乾燥菌体量１５０ｇ／Ｌ以上でポリマー含量７０％以上、且つ３－ヒドロキシヘキサン酸組成比１２ｍｏｌ％以上のポリヒドロキシアルカノエートを生産可能な微生物。
  7. 　遺伝子組換えにより作製した請求項５記載の微生物。
  8. 　植物油脂を炭素源として乾燥菌体量１５０ｇ／Ｌ以上でポリマー含量７０％以上、且つ３－ヒドロキシヘキサン酸組成比１２ｍｏｌ％以上のポリヒドロキシアルカノエートを生産可能な、請求項１～５の何れかに記載の微生物。
  9. 　ポリヒドロキシアルカノエートが３－ヒドロキシ酪酸と３－ヒドロキシヘキサン酸を構成単位に含むポリエステルである請求項１～８の何れかに記載の微生物。
  10. 　微生物がCupriavidus necator由来である請求項１～９の何れかに記載の微生物。
  11. 　微生物がCupriavidus necator H16株由来である請求項１０記載の微生物。
  12. 　請求項１～１１の何れかに記載の微生物を、植物油脂を炭素源として培養することを特徴とする３－ヒドロキシヘキサン酸単位含有ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
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