JPS59220192A - ベ−タ・ヒドロキシブチレ−ト重合体の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、β−ヒドロキシブチレート重合体の製造に関
する。ポリ（β−ヒドロキシブチレート）は、多くの微
生物、殊に細菌によってエネルギー備蓄物質として微生
物細胞内に顆粒状物の形で蓄積され、繰返し単位−ＣＨ
（ａ｛３）・ＣＨ２・ＣＯ−〇一カら構成される熱可塑
性ポリエステルである。

この重合体は微生物を水性培地中で適当な基質（すなわ
ちエネルギーおよび炭素源）を用いて好気培養すること
によシ都合よく製造できる。重合体の蓄積を促進するに
は、微生物の増殖（すなわち再生）にとって必須である
が重合体蓄積のためには必要とされない栄養分の制限が
なされた条件下で、培養の少なくとも一部分を実施する
のが好ましい。適当な培養方法の例は欧州特許ＥＰ−Ａ
−１５６６９および４６３４４明細書に記載されている
。

β−ヒドロキシブチレート単位とその他のヒドロキシカ
ルボキレート単位（例えばβ−ヒドロキシバレレート単
位）との両者ヲ廿む重合体も、微生物によって産生きれ
うる。従って欧州特許ＥＰ−Ａ−５２４５９および６９
４９７明細書に記載されるように、微生物をある種の基
質を用いて培養することによって種々の共重合体が産生
されることがあり、例えばプロピオン酸を基質として用
いると、重合体中にβ−ヒドロキシバレレート単位が与
えられる。

この明細書においてｒＰＨＢＪなる表記は、β−ヒドロ
キシブチレートホモ重合体のみでなく、β−ヒドロキシ
ブチレート単位が重合体鎖の少なくとも４０モル係、好
ましくは少なくとも８０モル％をなすような上記の如き
共重合体をも意味するものである。

１更用しうる炭素およびエネルギー源は、微生物の種類
によって変るものであり、従って独立栄養微生物は、エ
ネルギーを水素、硫黄化合物、望素化合物または鉄化合
物の酸化により得て、二酸化炭素を炭素源として利用で
きる。アルカリゲネス・ユウトロファス（Ａ．ｅｕｔｒ
ｏＴ）ｈｕｓ）　　は二酸化炭素および水素を利用でき
る独立栄養微生物の例である。従属栄誉微生物は、炭素
およびエネルギー源として有機基質を必要とする。その
ような有機基質の例としては、メタノールのような脂肪
族アルコール類；有機酸類およびその塩知、例えばギ酸
塩、酢酸塩、蓚酸塩、ピルビン酸塩、グリオキシル酸塩
、グリコ−ル酸塩；および炭水化物類、例えばフルクト
ース、グルコース；等がある。独立栄養微生物は、例え
ば炭水化物基質で従属栄養的に生育することもできる。

選択される基質は、もちろん、微生物が利用しうるもの
でなければならず、従って、ある種の微生物はフルクト
ースを利用しうるけれども、その微生物がメタノールま
たはグルコースを利用できないこともある。

基質のコストは、ＰＨＢの生産の総コストにおける重要
な因子である。従って、所与量の基質からのＰＨＢ収敏
ヲ増大することは望ましい。

微生物によって合成されうるＰＨＢの量は、ある場合に
は、バイオマス全体の６０重責％またはそれ以上ほどに
も達することがあるが、基質のうちの可成りの割合がＰ
ＨＢ以外の細胞物質の生成に用いられる。このような非
ＰＨＢ細胞物質（以下、これを「ＮＰＣＭ」で表わす）
は、ＰＨＢの生産においては、比較的低価値の副生物を
表わすものである。そのようなＮＰＣＭは、若干の場合
には、動物飼料補強物として０２川しうるけれども、そ
れは大豆のような慣用的な飼料補強物と商業的に競合す
るに足る高い蛋白含有量をもたないことが多く、殊に飼
料として使用するための必要な毒性規格に合格するのに
用いられるコストヲ考慮すると慣用補強物と競合しえな
いことが用い。

我々は、ＮＰＣＭの少なくともいく分かを、微生物の培
養のために用いられる基質を補充しうろことを発見した
。

従って、我々は、ＰＨＢｔ−蓄積しうる微生物を水性培
地中で資化性炭素源を用いて培養し；その培養の少なく
とも一部分を、該微生物をその微生物細胞内にＰＨＢ’
（ｒ蓄積せしめるようにする条件下で実施し；そして該
微生物細胞内に蓄積されたＰＨＢ″ｆ：ＮＰＣＭから分
離する；ことからなるＰＨＨの製造方法において：該資
化性炭素源の少なくとも一部分の炭素が、該微生物のＰ
ＨＢ含有細胞のＰＨＢから分離されたＮ　Ｐ　ＣＭから
の炭素からなることを特徴とする上記ＰＨＢの製造方法
を提供する。

ＮＰＣＭ０量、基質炭素の資源として使用することによ
り、所定量のＰＨＢ’ｉ生産するのに必要とされる新鮮
基質の量が低減され、従って原材料コストが効果的に低
減される。さらには、ＮＰＣＭはその他の種々の栄養分
、例えば鷲素、燐、硫黄、マグネシウムおよびその他の
金属類のような資化性元素源をも含んでいることがある
ので、基質と共に微生物に供給されるべきそのような栄
養類の量をも低減しうる。

再便用されるＮＰＣＭｋ生じさせるのに用いられる規模
よりも可成り小さい規模で培養を実施しない限り、再使
用されるＮＰＣＭに対して新鮮な資化性基質を補充する
ことが必要となろう。基質の補充は、特定の基質、例え
ばある種の有機酸またはそのおｊ導体が共重合体金生じ
させるのに必要とされる場合にも、必要とされよう。例
えば、ＰＨＨの分離によって回収されたＮＰＣＭ’ｅ培
養答器へ再循環させることにより、各培養を同じ規模で
実施するのが好ましい。この場合に、再使用されるＮＰ
ＣＭ０量は、再使用ＮＰＣＭの炭素言蓋が、資化性炭素
基質中の所要全炭素の５〜５０重量％をなすようにする
のが好ましい。

再循環されうるＮＰＣＭの最大割合は、就中、微生物に
よって蓄積されるＰＨＨの割合、および基質（すなわち
再使用ＮＰＣＭ十新鮮基質）中の炭素のＰＨＢおよびＮ
ＰＣＭへの転化効率によって、左右されることになろう
。

例えば、１００１の基質炭素は、ＰＨＢ炭素とＮＰＣＭ
炭素との両者への基質炭素転化率が５０チであれば、５
０ｔのバイオマス炭素を与え、細胞のＰＨＢ＠量７０重
撤チでは、その５０１のバイオマス炭素のうちの約６７
１がＰＨＢ炭素となり、そして約１５１がＮＰＣＭ炭素
となろう。この１３ＦのＮＰＣＭ炭素のうちの７０重蓋
チ、すなわち約９２が、再使用されるならば、再使用炭
素の量は所要全基質炭素の約９チである。従って、必要
な新鮮基質炭素の童は約９１２である。この９１２の新
鮮基質炭素は、９ｆの再使用ＮＰＣＭ炭素と共に、約６
７２のＰＨＢ炭素を与えるので、ＰＨＢへの新鮮基質炭
素の総合転化率は約４１％である。これと対照的に、Ｎ
　Ｐ　ＣＩＶＩが全く再使用されないとすれば、ＰＨＢ
　（３７９炭素）への顆鮮基負ｚｏｏｒ炭素）の総合転
化率は、６７％にすぎないであろう。基質の一例として
グルコースを用いる場合について述べれば、ＰＨＢホモ
重合体への総合転化率４１％は、ｉ　ｋｇのＰＨＢホモ
ポリマーヲ埋生するのに約３．４３にりのグルコースが
必要とされることを意味するけれども、６７％の炭素転
化率においては約５．７７ｋｇのグルコースが必要とさ
れ、従って炭素転化率が６７％から４１％へ向上するこ
とによって、約９軍量−の基質の節減がもたらされる。

同様に細胞のＰＨＢ含歓が約５０電蓋チであるならば、
ＰＨＢ炭素およびＮＰＣＭ炭素両者への基質炭素転化率
５０％においては、１００りの基質炭素は約２７７のＰ
ＨＢ炭素および約２６２のＮＰＣＭ炭素を与える。もし
このＮＰＣＭ炭素のすべてが回収され再使用されるなら
ば、再使用ＮＰＣＭ炭素の量は、必要とされる全基質炭
素の２３重量％である。これはＰＨＢ炭素への新鮮基質
炭素への約６５％の総合炭素転化率に相当する。

この場合にＮＰＣＭｋ全く再使用しないと、ＰＨＢへの
炭素転化率は約２７％である。

回収ＮＰＣＭおよび新鮮基質の混合物を培養槽へ供給す
るならば、微生物は、回収ＮＰＣＭ（ｉ７資化するより
も優先して新鮮基質を利用する傾向を示すことがある。

若干の場合には、初期に培養槽に対して回収ＮＰＣＭの
みを供給し、その回収ＮＰＣＭが利用されてしまったと
きはじめて新鮮基質を導入することにより、上記の問題
を解決することが可能でありうるが、我々は、ＮＰＣＩ
ｎ再使用の前に可溶化して微生物によって一層答易に資
化されうるようにＮＰ　ＣＭ’１ｌｉ−処理するのが好
ましい。これは再使用の前にＮＰＣＭｆｆ１、例えば加
水分解による可溶化処理に付すことによって実施しうる
。

ＮＰＣＭの刀日水分解は酵素作用により、例えばＰＨＢ
抽出工程の一部として実施することができ、かくしてＰ
’ＨＢは、微生物細胞を、蛋白質分解酵素組成物（およ
び場合によっては脂質分解酵素組成物）で消化し、次い
で可溶比隣のＮＰＣＭ’ｅＰＨＢから分離することによ
り、抽出できる。別法として、Ｐ’ＨＢｉ微生物細胞か
ら別の紅路、例えば溶剤抽出により、抽出する場合には
、残留ＮＰＣＭは、水性培質中に分散させたそのＮＰＣ
Ｍを加熱（好ましくは５０〜１５０℃）することにより
加水分解できる。実際に、そのような加熱工程は、ＮＰ
ＣＭがまず酵素作用により可溶化された場合に望ましい
ことがある。そのような熱処理段階においては、許容し
うる加水分解速度を得るために、ＮＰＣＭの等電点がら
離れたｐＨ値で加水分ｙＮヲ実施するのが好ましい　。

加水分解後に、可溶比隣のＮＰＣＭは、資化性炭素源と
しての再使用の前に、必要に応じて中和されるべきであ
る。

酸性の力日水分解栄件がｈ足な加水分解を与えることが
判明したけれども、アンモニアとして　揮発す藺Ｐ　Ｃ
Ｍ中璧素の量を低減するにはアルカリ性加水分解が望ま
しいことがある。殊にその水性媒質は１〜１０重歓チの
水酸化ナトリウムのようなアルカリヲ含むのが好ましい
。ＮＰＣＭの水性懸濁液には、１〜１０重＊チのＮＰＣ
Ｍを含ませるようにするのが好ましい。

ＮＰＣＭの幾分かは、残シのものよシも可溶化に対して
高い抵抗性を示すことがある。従ってＮＰＣＭからのＰ
ＨＢの分離をＮＰＣＭの加水分解によって行なう場合に
はＮＰＣＭのすべてを酵素作用により可溶化するのは経
済的でなかったり、不可能であったシすることがある。

従って、ＮＰ　ＣＭのほとんど全酵素作用により可溶化
させ、ＰＨＢと幾分かの残留ＮＰＣＭとからなる残留分
を残すようにすることができる。その他の可溶化方法、
ガえば界面活性剤による消化法は、そのような残留ＮＰ
ＣＭ’に可溶化させるのに採用しうる。別法として、あ
るいは追加的に、ＰＨＢは、ＰＨＢの溶剤抽出により残
留ＮＰＣＭから分離することができる。

界面活性剤で可溶化されたＮＰＣＭは、その界面活性剤
が培養全妨害し易いので、基質の一部分として再使用し
ないのが好ましい。

同様にＮＰＣＭｅＰＨＢの溶剤抽出によりＰＨＢから分
離する場合にも、回収Ｎ　Ｐ　ＣＩＶＩのすべて全可溶
化させるのは経済的でないことがある。

再使用される可溶化ＮＰＣＭの量は、ＰＨＨの分離前の
微生物細胞中に存在するＮＰＣＭのうちの少なくとも５
０重量％、殊に６０〜８５重量％に相当するのが好まし
い。

微生物は回分式（バッチ）培養しうる。回分式培養条件
下では、増殖に必要とされる栄養の１つまたはそれ以上
が使用し尽されるまではＰＨＢ’ｔはとんどまたは全く
蓄積せずに増殖に、そのような栄養の１つまたはそれ以
上が使用し尽された後にＰＨＢｆｆｉ合成するようにな
ろう。再使用ＮＰＣＭ、例えば加水分解生成物は、可成
りの量の増殖必須栄養分を含むことが多いので、回分式
培養槽への初期基質供給物の一部またはすべてとして回
収ＮＰＣＭを用い、そしてＰＨＢ蓄積段階中に新鮮基質
のみ全添加するのが好ましい。

別法として微生物は連続式に培養しうる。

ある種の微生物については、微生物の増殖の進行中にＰ
ＨＢが蓄積されることもあるが、そのように蓄積される
ＰＨＨの飯は、普通少なく、典型的には、産生される細
胞の約１０重量％以下である。従って、効率的な基質便
用のために多鎗の回収Ｎ　Ｐ　ＣＩＩ／Ｉ　’に再循環
する必要性を避けるには、微生物が全細胞重量に基き少
なくとも２５重量％、好ましくは少なくとも５０重量％
の程度までＰＨＢを蓄積するような条件下で連続培養を
実施するのが好ましい。前述のように、高いＰＨＢ含量
も、ＰＨＢ炭素への新鮮基質炭素の一層尚い総合転化率
を与える傾向がある。また高いＰＨＢ含量は、後続のＮ
ＰＣＭからのＰＨＢの分離処理ヲー階促進するので、高
ＰＨＢ含歓が望ましい。必要なＰＨＩＩＩ量は、増殖に
は必須であるがＰＨＢ蓄積には必須ではない１またはそ
れ以上の栄養の制限の条件下で培養を実施することによ
り達成しうる。

連続培養は二段階で実施することができ、微生物を一つ
の培養槽で増殖させ、次いでその微生物細胞を言む水性
培地をその第１檜から第２槽へ連続的または間欠的に移
し、その第２檜に対してさらに基質を供給してＰＨＢ蓄
積は起こるが増殖はほとんどまたは全く生じないように
する。そのような二段階法では、第２段階に存在する増
殖に必要とされる制限用栄養の量は、第１の培養槽から
第２の培養槽へ移される水性培地に存在するもの（もし
存在するならば）のみであるのが好ましい。

若干の場合には、そのような二段階連続培養法は、第１
培養槽へ供給される増殖に必要な制限用栄養の量が、第
１段階において第１槽中の産生細胞の全重量に基き少な
くとも２５蔦量チの程度までＰＨＢを蓄積させるような
餅であるようにするのが望ましいことがある。別の場合
には、第１段階を炭素制限下で実施して第１段階では微
生物によりＰＨＢが実質的に全く蓄積されないようにす
るのが好ましいことがある。

基質および酵素（このものは培養槽中の水性培地中へ空
気を射入することに↓シ普通供給されるン以外に、微生
物を増殖可能にするのに種々の栄養塩類が必要とされる
。かくして、資化性の形（通常は水溶性塩の形）の下記
元素の資源が普通必要とされる二窒素、燐、硫黄、カリ
ウム、ナトリウム、マグネシウム、カルシウム、および
鉄；ならびにマンガン、亜鉛および銅のような微量元素
である。培養槽への酸素の供給を制限することによりＰ
ＨＢ蓄積ヲ誘起することは可能であるけれども、１種ま
たはそれ以上の栄養塩の蕾を制限するのが好ましい。制
限するのが最も実除的な元素は、窒素、燐、硫黄であり
、あるいは少し好ましいものはマグネシウムである。こ
れらのうちで、窒素（このものは好適にはアンモニウム
塩として供給される）または燐の量を制限するのが最も
好ましい。必要とされる費化性窒累の量は、個々の微生
物によって変るが、一般的には、産生されるＮＰＣＭの
８〜１５重量％の範囲内である。

基質の一部分として使用される回収ＮＰＣＭは一般に幾
分かの栄養、例えば貧化性窒素を含むので、連続式二段
階培養法を実施するときには、回収ＮＰＣＭを第１段ｉ
智におりてのみ使用するのが好ましく（その場合でも一
般的には第１段階基質の一部としてのみ使用）、そして
第２段階培養槽には新鮮基質のみを供給するのが好まし
い。連続式二段階培養法を実施する場合には、回収ＮＰ
ＣＭの炭素は第１段階での必要炭素のうちの４０〜８０
重量％をなすのが好ましい（殊に第１段階が炭素制限条
件下に実施される場合には、そうである）。

細胞中に蓄積されるＰＨＢの割合は、就中、培養槽にお
ける懸濁微生物貧有培地の滞留時間に左右される。充分
な基質が供給されていれば、滞留時間が長けれは長いほ
ど、ＰＨＢ含量が高くなる。

任意の所望ＰＨＢ含蓋において最適炭素転化率を得るに
は、使用される基質の量は経済的操作と調和した最低量
に維持されるべきである。一般的には、やや過剰の基質
を用いて、培養槽から取り出される水性培地中に低濃度
の残留基質が存在するようにするのが望ましい。

微生物は比較的高割合のＰＨＢ　、例えば細胞の全重量
に基き７５〜８０重量％寸でのＰＨＢを蓄積することが
できるけれども、そのような高いＰ　ＨＢ含ｋを達成す
るための滞留時間は一段式連続培養法においては長すぎ
て不経済であるのが普通である。従って、そのような培
養法では、ＰＨＢ＠鼠が７０％以下、殊に６５〜６５％
（重量）となるような滞留時間が好ましい。

培養法は、ＰＨＢ含有細胞の乾燥重量が水性培地１を当
り少なくとも５１となるように実施するのが好ましい。

従って、例えば１０重量係のＰＨＢ含量のＰＨＢ含有細
胞を１を当り１０９ｍ生させようとする場合には、制限
用栄養の歌は、１を当り６２のＮＰＣＭの増殖を支持す
るのに必要とされる量であるべきであり、従って窒素を
増殖制限用栄養と１．て窒素が用いられる８なＡ７とな
ればＰＨＢを含まない細菌細胞の窒累廿鎗は普通８〜１
５重量係であり、必要とされる資化性窒素の量は１を当
り約０．５〜１ｙであるからである。

の量は、就中、使用される微生物に応じて左右される。

培養は、当＃微生物について慣用の条件、例えばｐＨ１
温匿、および曝気度（酸素が制限栄養と１−て利用され
ない限り）の下に実施できる。同時に栄養塩類の使用量
（ただしその電が前記概説の考慮に従って決定される増
殖制限栄養以外のものの量）は、当該微生物の増殖のた
めに通常使用される量である。

二段階培養法が採用される場合に、第２段階において細
胞のＰＨＢ含量が５０〜８０重量％まで増加されるのが
好ましい。第２段階で使用される新鮮基質は、第１段階
で使用されるものと同一であっても、または異なるもの
でもよい。若干の場合には、この培養工程の全体的効率
は、第１段階における基質として、回収Ｎ　Ｐ　ＣＭと
細胞物質に可成り効率的に転化される炭水化物のような
物質との混合物を用い、しかるに第２段階における基質
がＰＨＢへ効率的に転化されるが微生物を低効率で増殖
させる有機酸またはその塩、例メば酢酸塩、のような物
質であるようにすることにより、向上させることができ
る。

共重合体が所望される場合には、第２段階の基質は当該
共重合体単位をもたらす物質を含有すべきである。

培養が所望の程度まで進行した後に、ＰＨＢを微生物細
胞から抽出する。好ましくは一水性細胞懸濁液を、まず
例えば遠心処理により濃縮する。

この分離された水性培地は再使用でき、例えば必要に応
じて滅菌した後に培養槽へ再循環させてその分離水性培
地中の残留基質を再便用１７、かくして総合炭素転化率
を改善することができる。ＰＵＢは上記濃縮懸濁液中の
細胞から抽出される。種々の抽出方法が提案されてきて
いるが、普通それらの方法においては、細胞をＰＨＢｆ
ｇ解性の浴剤と接触させることが行なわれ、若干の場合
にはそのような溶剤との接触前に細胞破砕のような１ま
たはそれ以上の予備処理がなされる。従来から提案され
ている溶媒の例としては、ピリジン（米国特許第３０３
６９５９号）、塩化メチレン／メタノール混合物（米国
特許第３０４４９４２号）、クロロホルム（米国特許第
３２７５６１０号）、環式カーボネート類（米国特許第
４１０１５３３号）および１，２−ジクロルエタン（欧
州特許第１４４９０および１５１２３号）等がある。

好ましい抽出法の一例は下記の諸工稈からなる＝（１）
績縮懸濁液の噴霧乾燥、 （１１）乾燥細胞を、ＰＨＢ’に溶解しないメタノール
、アセトンのような溶剤と（例えば還流条件下に）接触
させることによる脂質の抽出、（１１１１）　　脂質を
除いた細胞を脂質含有溶剤溶液から（例乏ば濾過による
）分離すること、（１ｖ）脂質を除いた細胞ｔＰＨＢ溶
解性溶剤と、（例えば還流条件下で）接触させることに
よるＰＨＨの抽出（１，２−ジクロルエタンおよびクロ
ロホルムは殊に適当な溶剤である）、（Ｖ）　　抽出溶
剤中のＰＨＢ溶液を細胞残留物から（例えば濾過による
）分離すること、（■１）そのＰＨＢ溶液を、ＰＨＢを
溶解しえない液体、例えばメタノール／水混合物、へ添
加することによるＰＨＨの沈澱生成、および（ｖｌｌ）
沈澱したＰＨＢの（例えば濾過による）分離。

上記のような方法は前記の欧州特許第１５１２３号明細
書中に記載されている。

その他の分離方法、例えば前記の酵素による消化方法ケ
、使用できることはもちろんである。

ＰＨＢ抽出溶剤との接触後にＰＨＢからＮＰＣＭを分離
する場合、溶剤が微生物に対して有毒であることが多い
ので、ＮＰＣＭの再使用の前にＮＰＣＭ中に含まれうる
溶剤を、例えば洗浄または乾燥により除去することが普
通必要である。乾燥は、ＮＰＣＩＩ適当なオープン中で
加熱することにより簡単に実施できる。その際に放出さ
れる残留溶剤は回収し、さらに別置の細胞からのＰＨＢ
の抽出のために使用することができる。あるいは、ＮＰ
ＣＭ’に再使用前に加水分解する場合には、残留溶剤は
、若干の場合には、その加水分解中に揮発されうる。

ＰＨＢ産生のために使用できる微生物の例としては下記
のものがある： ノカルジア（Ｎｎｃａｒｄｉａ）　：例えばＮ、サルモ
ニコロル（ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ）、Ｎ、アステロ
イデス（ａｓｔｅｒｏｉｄｅｓ　）、Ｎ、オパカ（ｏｐ
ａｃａ）、Ｎ、コラルリナ（ｃｎｒａｌｌｉｎａ）、Ｎ
、ルブラ（ｒｕｂｒａ）ニアシトバクター；例えばＡ、
クロオコキウム（ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ）、Ａ、ペイ
ジエリンキイ（ｂｅ　ｉ　ｊ　ｅｒ　１ｎｃｋｉ　ｉ　
）、Ａ。アギリス（ａｇｉｌｉｓ）、Ａ。

インジクス（ｉｎｄｉｃｕｓ）　： バシラス；例えばＢ、マガテリウム（ｍａｇａｔｅｒ　
ｉｕｍ）、Ｂ、ミコイデス（ｍｙｃ　ｎｉ　ｄｅｓ　）
、Ｂ、アンスラシス（ａｎｔｈｒａｃｉｓＧ ミクロコツカス；例えばＭ、ハロデニトリフィカンス（
ｈａｌｏｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、Ｍ、デニトリ
フィカンス（ｄｅｎｉ　ｔｒｉ　ｆｉ　ｃａｎｓ　）、
：リゾビウム１例えばＲｈ、レグミノサルム（ｌｅｇｕ
ｒｎｉｎｎｓａｒｕｍ）、Ｒｈ、ノアセロ１ハｐｈａｓ
ｅｏｌ　ｉ　）、Ｒｈ、）リフオリ（ｔｒｉｆｏｌｉ）
、Ｒｈ、ルピニ（ｌｕｐｉｎｉ　）、Ｒｈ、ジャポニク
ム（ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）　：ロドスビリルム；例ｔハ
Ｒ，ルブルム （ｒｕｂｒｕｍ）、Ｒ，フルルム（ｆｕｌｒｕｍ）　：
メチロバクテリウム；例えばｆＶｌｅ、オルガノフイ浴
液からｒ別１．た細胞残渣を６Ｎ塩酸中に懸濁させて、
１を当り２００２の細胞残渣を含む懸濁液を得た。次い
でこの懸濁液を２４時間還流して、細胞残渣を加水分解
処理した。得られた混合物を水酸化ナトリウムでＤＨ７
に中和１２、放冷し、次いでｒ過１．た。

加水分解物をその容積の２０倍に稀釈し、そして分析し
た（水性培地Ａ）。

この稀釈された加水分解物の１００容を１２１℃で１時
間加熱（７て滅菌し、微生物アルカリゲネス・ユウトロ
ファス（ＮＣＩＢ第１１５９９号）の培養物（＃度１０
り／１）の０．５答をそれに接種１．た。この混合物を
６４℃で４８時間好気培養１、た。この好気培養後の混
合物は約”）ｆ／ｌの微生物細胞を含んでいた。

遠心分離法により細＆Ｊを水性培地から分離し、細胞お
よび残留水性培地（水性培地Ｂ）？ｒ−分析］−た。

分析結果を下記の表に示す。

加水分解物中の炭素のうちの約８４重ｔ％の炭明細書の
浄書（内容に変更なし） ＮＭ−測定せず。

手続補正書（方式） １、事件の表示 昭和すγ年目ｉ讐願第　　ｔ＞ｙｇｚ　　号６、補正を
する者 事件との関係　　出　願　人 住所 名　情〒、　インへ０９７−レ・ケミかし・イ７タ゛ス
１〜＋１−。

ヒ０−エＩｔ／シー ４、代理人 ５、補正命令の日付　　昭和し７年　９月　ν日（発送
日）６、補正の対象

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）β−ヒドロキシブチレート重合体全蓄積しうる微
   生物を水性培地中で骨化性炭素源を用いて培養し、その
   培養の少なくとも一部分を、該微生物乞その微生物細胞
   内に該重合体を蓄積せしめるような条件下で実施し、そ
   して該微生物細胞内に蓄積された該重合体をその他の細
   胞物質から分離することからなる１合体鎖中に少なくと
   も４０モルチのβ−ヒドロキシブチレート単位を有する
   β−ヒドロキシブナレート１合体の製造方法において： 該資化性炭素源の少なくとも一部分の炭素が、該微生物
   のβ−ヒドロキシブチレート重合体含有細胞のβ−ヒド
   ロキシブチレート重合体から分離された細胞物質からの
   炭素からなることを特徴とする上記方法。
2. （２）負化性炭素源の少なくとも一部分は、該微生物の
   β−ヒドロキシブチレート重合体含有細胞のβ−ヒドロ
   キシブチレート重合体から分離された可溶化細胞物質か
   らなることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の
   方法。
3. （３）培養段階で産生された該微生物細胞のβ−ヒドロ
   キシブチレート重合体以外の細胞物質の少なくとも一部
   分を可溶化し、そして該可酸化細胞物質を培養段階で使
   用される資化性炭素源の一部分として培養段階へ再循環
   させることを特徴とする特許請求の範囲第２項に記載の
   方法。
4. （４）該可溶化は、細胞物質を酵素組成物で処理するこ
   とからなることを特徴とする特許請求の範囲第２または
   ６項に記載の方法。
5. （５）可溶化は、β−ヒドロキシブチレート重合金有細
   胞を蛋白質分解酵素組成物で消化し、そしてその後回醇
   化細胞物質をβ−ヒドロキシブチレート東会合体含有残
   留物ら分離することからなることを特徴とする特許請求
   の範囲第４項にｄピ載の方法。
6. （６）可酸化は該細胞物質を水性媒質中で５０〜１５０
   ℃において加熱することからなる特許請求の範囲第２〜
   ５項のいずれかに記載の方法。
7. （７）微生物の培養を連続的に実施する特許請求の範囲
   第１〜６項のいずれかに記載の方法。
8. （８）最初に微生物を、第１の各器内の水性培地中で資
   化性炭素源を用いて培養し；次いで微生物細胞を含む水
   性培地を連続約１たは間欠的に第２の容器へ移し；その
   第２の容器中で資化性炭素源での該微生物の培養を、増
   殖に必侵とされるが重合体の蓄積に必要とされない栄養
   分の制限歓の存在下で継続して、第２の容器中での培養
   中に該重合体が微生物によって蓄積されるようにする；
   特許請求の範囲第７項に記載の方法において：該第１芥
   器での培養のために用いられる資化性炭素源の炭素のみ
   が、該微生物のβ−ヒドロキシブチレート重合体含有細
   胞のβ−ヒドロキシブチレート重合体から分離された細
   胞物質から誘導された炭素を含むことを特徴とする特許 項に記載の方法。