JP7123909B2 - ポリヒドロキシアルカノエート粒子及びその水分散液 - Google Patents
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Description
[1]粒子状のポリヒドロキシアルカノエートと、該ポリヒドロキシアルカノエートの表面の一部又は全部を被覆するペプチドグリカンとを有し、
ポリヒドロキシアルカノエートの含有量が98.0重量%以上、ペプチドグリカンの含有量が0.1重量%以上1.0重量%以下である、ポリヒドロキシアルカノエート粒子。
[2]タンパク質の含有量が1.0重量%以下である[1]に記載のポリヒドロキシアルカノエート粒子。
[3]水系媒体と、該水系媒体中に分散した[1]又は[2]に記載のポリヒドロキシアルカノエート粒子と、を有するポリヒドロキシアルカノエート水分散液。
[4]水系媒体中に分散したポリヒドロキシアルカノエート粒子の平均粒子径が0.05μm以上10μm以下である、[3]に記載のポリヒドロキシアルカノエート水分散液。
本発明のPHA粒子は、粒子状のPHAと、該PHAの表面の一部又は全部を被覆するペプチドグリカンとを少なくとも有する粒子である。
本発明のPHA粒子を構成するPHAは、ヒドロキシアルカン酸をモノマー成分とする重合体である。中でも、PHAとしては、本発明のPHA粒子を容易に得られる点で、微生物から生産される微生物産生PHAが好ましく、より好ましくは下記一般式(1)
[-CHR-CH2-CO-O-] (1)
(式中、RはCnH2n+1で表されるアルキル基で、nは1以上15以下の整数である。)で示される繰り返し単位を含む微生物産生PHA(脂肪族ポリエステル)である。
本発明のPHA粒子を構成するペプチドグリカンは、微生物など大部分の原核生物の細胞壁成分をなす糖ペプチドのポリマーである。ペプチドグリカンは、N-acetylmuramic acidまたはN-glycosylmuramic acidとD-アミノ酸を含み、グリカン鎖とペプチド鎖とが網目状に結合して三次元構造を構築し、物理的に極めて堅固な構造を形成している。
本発明のPHA粒子は、PHAとペプチドグリカンのみを構成成分とするものであってもよく、さらにその他の成分を含むものであってもよい。その他の成分の代表例としては、微生物由来の不純物が挙げられる。当該不純物として代表的なものとして、タンパク質が挙げられる。当該タンパク質は、微生物など大部分の原核生物を構成する成分である、アミノ酸のポリマーである。アミノ酸同士がペプチド結合にて結合し、タンパク質となる。タンパク質は通常、PHA以外の微生物由来の不純物の40%程度を占める。
本発明のPHA水分散液(ポリヒドロキシアルカノエート水分散液)は、水系媒体と、当該水系媒体中に分散したPHA粒子(本発明のPHA粒子)とを少なくとも有する水分散液である。後述のように本発明のPHA水分散液は、その他の成分を含んでいてもよい。本発明における「PHA水分散液」とは、媒体として水を含有する分散液に限定されず、後述するように、媒体として、水と相溶性のある有機溶媒を含有する分散液も含む用語である。
本発明のPHA粒子は、特に限定されず、公知乃至慣用の技術を利用した製造方法により製造することができる。例えば、PHAを体内に蓄積した微生物(PHA類生産能を有する微生物)について、PHA以外の微生物由来の成分(特に有機物)を分解、可溶化及び/又は除去し、その後、粒子状のPHAを回収する工程を含む方法等が挙げられる。本方法において、微生物の細胞壁由来のペプチドグリカンが所定量(0.1重量%以上1.0重量%以下)となるように残しつつ、その他の不純物を除去するためには、例えば、細胞壁分解酵素を使用しないか、その使用量を少なくすること;高圧破砕時の圧力を低過ぎず高過ぎない範囲に設定すること;高圧破砕の時間を制御すること;これらを組み合わせて制御すること等、を実施することが好ましい。高圧破砕時の圧力は特に限定されないが、100~500kg/cm2が好ましい。
エスペラーゼ、アルカラーゼ、ペプシン、トリプシン、パパイン、キモトリプシン、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ等
(2)脂質分解酵素
リパーゼ、ホスホリパーゼ、コリンエステラーゼ、ホスファターゼ等
(3)核酸分解酵素
リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ等
PHA粒子以外の微生物由来成分等の不純物の分解に用いられる酵素は、上記のものに限定されるわけではなく、工業的な製品に用いられ得るものであれば、微生物由来成分を分解する活性を有する任意の酵素であってよい。また、一般に市販されている洗濯用酵素洗剤等も用いることができる。さらには、例えば、酵素の安定化剤や再汚染防止剤等と酵素とを含有する酵素組成物であってもよく、酵素のみには限定されない。好ましい蛋白質分解酵素としては、上記例示に含まれるもののうち、プロテアーゼA、プロテアーゼP、プロテアーゼN(以上、天野エンザイム社製)、エスペラーゼ、アルカラーゼ、ザビナーゼ、エバラーゼ(以上、ノボザイム社製)等が工業的に使用可能なものとして挙げられ、分解活性の点からも好適に使用できる。しかし、これらに限られるものではない。
リゾチーム、アミラーゼ、セルラーゼ、マルターゼ、サッカラーゼ、α-グリコシダーゼ、β-グリコシダーゼ、N-グリコシダーゼ等
酵素処理時間は、所望の処理度を達成するまで行うのが好ましく、通常0.5~2時間である。酵素の使用量は、酵素の種類及び活性に依存し、特に制限はされないが、PHA粒子100重量部に対して、0.001~10重量部が好ましく、さらにはコストの点から0.001~5重量部がより好ましい。
PHAを含む菌体培養液の製造
培養生産にはKNK-631株(国際公開第2009/145164号参照)を用いた。
上記の方法で得た乾燥菌体1gに100mlのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のPHAを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が30mlになるまで濃縮後、90mlのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、1時間放置した。析出したPHAをろ別後、50℃で3時間真空乾燥し、精製PHAを得た。
上記の方法で得た精製PHAについて、DSC(エスアイアイ・ナノテクノロジー(株)製DSC220)を用い、25℃から樹脂の融点より高い温度まで10℃/minで昇温して2分間ホールドし、樹脂を融解させたあと、10℃/分で冷却した。この冷却過程において見られる、結晶化を示すピークの温度と大きさ(結晶化熱量)により結晶化度を評価した。
上記の方法で得た精製PHAについて、ゲル浸透クロマトグラフィー(昭和電工社製「Shodex GPC-101」)を用い、カラムにポリスチレンゲル(昭和電工社製「Shodex K-804」)を用い、クロロホルムを移動相として、標準ポリスチレン換算の分子量を測定し、当該分子量から重量平均分子量を算出した。
KNK-631株の代わりにKNK-005株を用いたこと以外は製造例1と同様の方法で、PHBHであるPHAを含む菌体培養液を得た。
KNK-631株の代わりにKNK-252株を用い、炭素源としてパーム油の代わりにPFAD(Palm Fatty Acid Distillate)を使用したこと以外は、製造例1に記載の方法で、PHBHであるPHAを含む菌体培養液を得た。
製造例1で得られたPHAを含む菌体培養液を、80℃で1時間加熱して滅菌した。次に、PHAの1/100量のプロテアーゼ(ノボザイム社、エスペラーゼ)を添加し、pH8.0で50℃に保持したまま、2時間攪拌した。その後、この液に対してドデシル硫酸ナトリウムが1.0重量%になるように30%ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を添加し、さらに、pHが11.5になるように30%水酸化ナトリウム水溶液を添加した後、50℃で1時間保温した。その後、高圧破砕機(ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデルPA2K型)で約200kgf/cm2の圧力で高圧破砕を行った。高圧破砕後の破砕液を遠心分離した後、上清を除去した。得られた沈殿物について、遠心分離による水洗をさらに6回繰り返し、最終的に得られた沈殿物に水を加えてPHA粒子濃度を50%に調整し、PHA水分散液を得た。該水分散体に含まれるPHA粒子は、粒子表面がペプチドグリカンで被覆されたものである。
製造例2で得られたPHAを含む菌体培養液を、80℃で1時間加熱して滅菌した。その後、この液に対してドデシル硫酸ナトリウムが1.0重量%になるように30.0%ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を添加し、さらに、pHが11.5になるように30%水酸化ナトリウム水溶液を添加した後、50℃で1時間保温した。その後、高圧破砕機(ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデルPA2K型)で約200kgf/cm2の圧力で高圧破砕を行った。高圧破砕後の破砕液を遠心分離した後、上清を除去した。得られた沈殿物について、遠心分離による水洗をさらに6回繰り返し、最終的に得られた沈殿物に水を加えてPHA粒子濃度を50%に調整し、PHA水分散液を得た。該水分散体に含まれるPHA粒子は、粒子表面がペプチドグリカンで被覆されたものである。
製造例3で得られたPHAを含む菌体培養液を、80℃で1時間加熱して滅菌した。その後、この液に対してドデシル硫酸ナトリウムが1.0重量%になるように30.0%ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を添加し、さらに、pHが11.5になるように30%水酸化ナトリウム水溶液を添加した後、50℃で1時間保温した。その後、高圧破砕機(ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデルPA2K型)で約200kgf/cm2の圧力で高圧破砕を行った。高圧破砕後の破砕液を遠心分離した後、上清を除去した。得られた沈殿物について、遠心分離による水洗をさらに6回繰り返し、最終的に得られた沈殿物に水を加えてPHA粒子濃度を50%に調整し、PHA水分散液を得た。該水分散体に含まれるPHA粒子は、粒子表面がペプチドグリカンで被覆されたものである。
上記で得られた水分散液をヌッチェで脱水後、加熱・減圧下で乾燥サンプルを得た。当該乾燥サンプル5mgをTG-DTA(エスアイアイ・ナノテクノロジ社製)にて室温から600℃まで加熱し、加熱前重量に対する300~320℃における残存重量からPHA量を求めた。
上記で得られた水分散液に、(株)和光純薬工業 SLP-HS Single Reagent Setにて調製した溶液を加え、これを30℃の条件でパワースキャンHT(DSファーマバイオメディカル製)にて、吸光度(650nm)を120分間測定した。既知の濃度に調整されたペプチドグリカンの吸光度から検量線を作製し、測定した水分散液の吸光度と比較することでPHAに含まれるペプチドグリカン量を求めた。
上記で得られた水分散液をヌッチェで脱水後、加熱・減圧下で乾燥サンプルを得た。当該乾燥サンプル1mgを、蒸留水1mlに懸濁させたのち、(株)タカラバイオBCATM Protein Assay Kitにて調製した溶液を加え、60℃で30分間処理した。これを冷却後、(株)島津製作所吸光度計UV-1700にて分析して、PHA粒子中の残存タンパク量を牛血清アルブミン換算で求めた。
上記で得たPHA水分散液の分散性は、以下の基準で評価した。
×(分散性不良):平均粒子径が10μm超
(PHA水分散液の製膜性評価)
上記で得たPHA水分散液の製膜性は、上述の方法で形成させた薄膜を目視で観察することにより評価した。均一な半透明膜又は透明膜が得られた場合には、製膜性に優れている(すなわち、良好な膜を形成できる)と評価できる。
上述の方法で形成させた薄膜の臭いを嗅ぎ、臭気の有無を評価した。
製造例1で得られたPHAを含む菌体培養液を、80℃で1時間加熱して滅菌した。次に、PHAの1/100量のプロテアーゼ(ノボザイム社、エスペラーゼ)を添加し、pH8.0で50℃に保持したまま、2時間攪拌した。その後、この液に対してドデシル硫酸ナトリウムが1.0重量%になるように30%ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を添加し、さらに、pHが11.5になるように30%水酸化ナトリウム水溶液を添加した後、50℃で1時間保温した。その後、高圧破砕機(ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデルPA2K型)で約550kgf/cm2の圧力で高圧破砕を行った。高圧破砕後の破砕液を遠心分離した後、上清を除去した。得られた沈殿物について、遠心分離による水洗をさらに6回繰り返し、最終的に得られた沈殿物に水を加えてPHA粒子濃度を30%に調整し、PHA水分散液を得た。
製造例1で得られたPHAを含む菌体培養液を、80℃で1時間加熱して滅菌した。次に、その後、この液に対してドデシル硫酸ナトリウムが1.0重量%になるように30.0%ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を添加し、さらに、pHが11.5になるように30%水酸化ナトリウム水溶液を添加した後、50℃で1時間保温した。その後、高圧破砕機(ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデルPA2K型)で約10kgf/cm2の圧力で高圧破砕を行った。高圧破砕後の破砕液を遠心分離した後、上清を除去した。得られた沈殿物について、遠心分離による水洗をさらに6回繰り返し、最終的に得られた沈殿物に水を加えてPHA粒子濃度を50%に調整し、PHA水分散液を得た。
製造例2で得られたPHAを含む菌体培養液を、80℃で1時間加熱して滅菌した。次に、この液に対してドデシル硫酸ナトリウムが1.0重量%になるように30.0%ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を添加し、さらに、pHが11.5になるように30%水酸化ナトリウム水溶液を添加した後、50℃で1時間保温した。その後、高圧破砕機(ニロソアビ社製高圧ホモジナイザーモデルPA2K型)で約10kgf/cm2の圧力で高圧破砕を行った。高圧破砕後の破砕液を遠心分離した後、上清を除去した。得られた沈殿物について、遠心分離による水洗をさらに6回繰り返し、最終的に得られた沈殿物に水を加えてPHA粒子濃度を50%に調整し、PHA水分散液を得た。
Claims (4)
- 粒子状のポリヒドロキシアルカノエートと、該ポリヒドロキシアルカノエートの表面の一部又は全部を被覆するペプチドグリカンとを有し、
ポリヒドロキシアルカノエートは、結晶化度が30%以下のポリヒドロキシアルカノエートであり、
ポリヒドロキシアルカノエートの含有量が98.0重量%以上、ペプチドグリカンの含有量が0.2重量%以上1.0重量%以下である、ポリヒドロキシアルカノエート粒子。 - タンパク質の含有量が1.0重量%以下である請求項1に記載のポリヒドロキシアルカノエート粒子。
- 水系媒体と、該水系媒体中に分散した請求項1又は2に記載のポリヒドロキシアルカノエート粒子と、を有するポリヒドロキシアルカノエート水分散液。
- 水系媒体中に分散したポリヒドロキシアルカノエート粒子の平均粒子径が0.05μm以上10μm以下である、請求項3に記載のポリヒドロキシアルカノエート水分散液。
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