JP5651017B2 - ポリ−3−ヒドロキシアルカン酸の生産方法 - Google Patents
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Description
一方、PHAを有機溶媒に溶解した後、溶解度の低い有機溶媒や水を添加することで、溶解したPHAを析出させる方法が知られていた。この方法によると、PHA溶液を精製できるため、最も純度の高いPHAが得られていた。このような溶媒抽出方法として、低級ケトンなどを抽出溶剤とする例(特許文献6)、テトラヒドロフランを用いる例(特許文献7)などが報告されている。PHAを溶解した有機溶媒に貧溶媒を添加すれば、PHAを析出させることができ、添加する溶媒種や、温度や添加量などの添加条件や、添加時の攪拌条件などにより析出体の形状や大きさを比較的任意にコントロールすることが可能であった。
このように有機溶媒からPHAを析出させることで析出物の形状や大きさをコントロールできる点は、水溶性溶媒を用いて精製したPHAに微粉が多いという課題に対して非常に有効なものであった。しかし、抽出する際に大量の有機溶媒を使用する点や、そもそも分解性の高いPHAを溶解させるためにこれを加熱すると、精製工程においてPHAの分子量が低下してしまう点など根本的な課題を抱えていた。
本発明によると、微生物が産出したPHAを有機溶媒による抽出操作によらず精製することができ、しかも、塩や高分子凝集剤などの第三成分を添加せず、PHAの融点よりも低い温度でPHAを凝集させることができる。菌体構成成分の混入を防ぎつつ、生産性よく、微粉の少ないPHA凝集体を得ることができる。得られるPHA凝集体は、第三物質添加による品質への影響を懸念する必要がなくなり、また、加熱によるPHAの分子量低下を避けることができる。
本発明においてPHA以外の生物由来成分等の不純物を分解および/または除去する前に、予め、PHAを含有する細胞を物理的処理、化学的処理もしくは生物学的処理によって破砕することが好ましい。これにより、後の分解および/または除去工程を効率的に実施することができる。破砕の方法としては特に限定されないが、従来公知のフレンチプレスやホモジナイザー、X−プレス、ボールミル、コロイドミル、DYNOミル、超音波ホモジナイザーなどの、流体せん断力や固体せん断力、磨砕を利用した方法が使用しうる。また、酸やアルカリ、界面活性剤、有機溶剤、細胞壁合成阻害剤などの薬剤を用いる方法、リゾチーム、ペクチナーゼ、セルラーゼ、チモリアーゼなどの酵素を用いる方法、超臨界流体を用いる方法や、浸透圧破砕法、凍結法、乾燥粉砕法などが挙げられる。また、細胞自身に含まれるプロテアーゼやエステラーゼなどの作用を利用する自己消化法も破砕法の一種として挙げられる。上記破砕方法においては、一連の処理によるPHAの分子量低下を抑える方法を選択することが望ましい。また、これらの破砕方法は単独で用いても良いし、複数の方法を組み合わせても良い。また、バッチ処理でも良いし、連続処理を行っても良い。
通常、上記方法にてPHA含有菌体を破砕して得たPHA水性懸濁液には、細胞中のタンパク質や核酸、脂質、糖成分およびその他の菌体構成成分や、培養基質残分などが混入している。以降に述べる分解および/または除去工程の前に、これらのタンパク質等を含む水を分離する脱水工程を実施することが好ましい。これにより、PHA水性懸濁液に含まれる不純物の量を低減し、後の分解および/または除去工程を効率よく実施することができる。脱水の方法としては特に限定されないが、ろ過や遠心分離、沈降分離による方法が挙げられる。分解および/または除去工程に供する水性懸濁液中のPHAの濃度は特に限定されないが、50g/L以上が好ましく、100g/L以上がより好ましく、さらに好ましくは200g/L以上、さらにより好ましくは300g/L以上である。また、水性懸濁液中のPHAの濃度を調整することを目的に、上記脱水工程を実施してもよい。
エスペラーゼ、アルカラーゼ、ペプシン、トリプシン、パパイン、キモトリプシン、アミノペプチダーゼ、カルボキシペプチダーゼ等
(2)脂質分解酵素
リパーゼ、ホスホリパーゼ、コリンエステラーゼ、ホスファターゼ等
(3)細胞壁分解酵素
リゾチーム、アミラーゼ、セルラーゼ、マルターゼ、サッカラーゼ、α−グリコシダーゼ、β−グリコシダーゼ、N−グリコシダーゼ等
(4)核酸分解酵素
リボヌクレアーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ等
PHA以外の生物由来成分等の不純物の分解に用いられる酵素は、上記のものに限定されるわけではなく、工業的な製品に用いられ得るものであれば、生物由来成分を分解する活性を有する任意の酵素であってよい。また、一般に市販されている洗濯用酵素洗剤等も用いることができる。さらには、例えば、酵素の安定化剤や再汚染防止剤等と酵素とを含有する酵素組成物であってもよく、酵素のみには限定されない。好ましい蛋白質分解酵素としては、上記例示に含まれるもののうち、プロテアーゼA、プロテアーゼP、プロテアーゼN(以上、天野エンザイム社製)、エスペラーゼ、アルカラーゼ、ザビナーゼ、エバラーゼ(以上、ノボザイム社製)等が工業的に使用可能なものとして挙げられ、分解活性の点からも好適に使用できる。しかし、これらに限られるものではない。
以上説明したとおり、本発明の最も好適な態様によると、細胞内にPHAを生成する能力を有する微生物を培養する培養工程、PHAを含有する前記微生物を破砕する破砕工程、破砕した微生物を含む水性懸濁液から水を分離する脱水工程、不純物を分解および/または除去する精製工程、PHAを洗浄する洗浄工程、及び得られたPHA水性懸濁液中でPHAを凝集させてPHA凝集体を得る凝集工程を順次実施することにより、PHAの凝集体を効率よく製造することができる。しかし本発明は必ずしも上記すべての工程を実施することを必要とするものではない。
PHA水性懸濁液中の水溶性溶媒を全量蒸発させ残存する固形分を得た。この固形分に対して5MのNaOHを添加し、95℃で加水分解反応を実施した。この加水分解液を等量の60%酢酸水溶液で中和し、酢酸緩衝液とニンヒドリン溶液を添加し100℃で呈色反応を行った。この呈色反応液の吸光度を日立製作所社製レシオビーム分光光度計U−1800形により測定した。この吸光度と、ロイシン試料を用いて作成した検量線とを比較することで、固形分中の有機窒素量を算出した。固形分の重量あたりの有機窒素量をもって、PHA水性懸濁液中の有機窒素量(PHA重量あたり)とした。
PHA水性懸濁液中のPHA粒子の体積平均粒径はレーザー回折散乱式の粒度分布測定器により求めた。
国際公開第2008/010296号[0049]に記載のラルストニア・ユートロファKNK−005株を、同[0050]−[0053]に記載の方法で培養し、PHAを含有する菌体を含む菌体培養液を得た。なお、ラルストニア・ユートロファは、現在では、カプリアビダス・ネケータに分類されている。
得られた培養液を内温60〜80℃で20分加熱・攪拌処理し、滅菌処理を行った。
上記記載の方法にて培養し、滅菌操作を行なった培養液をアルカリ処理(30%NaOHを添加してpH11.8に調整、温度50℃で1hr攪拌保持)した後、機械的破砕処理(高圧ホモジナイザー処理(NS3015型、Niro Soavi S.P.A)、pH12.5以上、600barで7回通液)した。この破砕処理を施した培養液に対して、含有するPHAの1/100重量のプロテアーゼ(ノボザイム社製、商品名:エスペラーゼ)を添加し、pH10、内温60℃で1時間攪拌保持した。これを遠心分離(1400G、20分)し、上清を一部除去し、続いて同量の純水を添加しPHAを懸濁する操作を、複数回行い、様々な有機窒素量を有するPHA水性懸濁液を調製した。
上記記載の方法で調製したPHA水性懸濁液のpHを10に調整し攪拌しながら加熱した。加熱する前の各々のPHA水性懸濁液中のPHA粒子の体積平均粒径は、1μmであった。PHA水性懸濁液中の有機窒素量が3119ppm以上のPHA水性懸濁液に関しては、80℃まで加熱したが凝集は観察されなかった。一方で、3119ppmより低い有機窒素量を有するPHA水性懸濁液に関しては、80℃まで加熱することでPHA粒子の体積平均粒径が10μm以上となり凝集した。なお加熱時間は60分であった。このことより、PHA水性懸濁液中の有機窒素量を低減するに従い、PHAの融点(約140℃)付近まで加熱することなく、融点より低い温度で凝集が容易に起こることが分かった。これら一連の結果を表1に示した。
(表1)PHA水性懸濁液中の有機窒素量と凝集性
◎:体積平均粒径が10μmを超えるまで、極めて十分に凝集が進行した。
○:体積平均粒径が5〜10μmの範囲で凝集が進行した。
×:凝集が十分に進行せず、体積平均粒径は5μm未満であった。
Claims (11)
- ポリ−3−ヒドロキシアルカン酸を含む水性懸濁液中の有機窒素量をポリ−3−ヒドロキシアルカン酸重量あたり1500ppm以下に調整した後、前記水性懸濁液を加熱することにより前記水性懸濁液中でポリ−3−ヒドロキシアルカン酸を凝集させてポリ−3−ヒドロキシアルカン酸の凝集体を得ることを特徴とする、ポリ−3−ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- ポリ−3−ヒドロキシアルカン酸を含む水性懸濁液に含まれる溶媒が、水、水と相溶性のある有機溶媒、又は、水と前記有機溶媒との混合溶媒を含む請求項1に記載のポリ−3−ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- ポリ−3−ヒドロキシアルカン酸が、3−ヒドロキシプロピオネート、3−ヒドロキシブチレート、3−ヒドロキシバレレート、3−ヒドロキシヘキサノエート、3−ヒドロキシヘプタノエート、および3−ヒドロキシオクタノエートからなる群より選択される2種以上の3−ヒドロキシアルカン酸から構成される共重合体である請求項1または2に記載のポリ−3−ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- ポリ−3−ヒドロキシアルカン酸が、3−ヒドロキシヘキサノエートと3−ヒドロキシブチレートの2成分共重合体、または3−ヒドロキシヘキサノエートと3−ヒドロキシブチレートと3−ヒドロキシバレレートの3成分共重合体である請求項3に記載のポリ−3−ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- ポリ−3−ヒドロキシアルカン酸が、ポリ−3−ヒドロキシアルカン酸を産出する微生物により産生されたポリ−3−ヒドロキシアルカン酸である請求項1〜4のいずれか1項に記載のポリ−3−ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- 前記ポリ−3−ヒドロキシアルカン酸を産出する微生物が、アエロモナス属、アルカリゲネス属、ラルストニア属、または、カプリアビダス属に属する微生物である請求項5に記載のポリ−3−ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- 前記ポリ−3−ヒドロキシアルカン酸を産出する微生物が、カプリアビダス・ネケータである請求項6に記載のポリ−3−ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- 前記ポリ−3−ヒドロキシアルカン酸を産出する微生物が、アエロモナス・キャビエ由来のポリ−3−ヒドロキシアルカン酸合成酵素遺伝子および/またはその変異体が導入された形質転換体である請求項5に記載のポリ−3−ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- ポリ−3−ヒドロキシアルカン酸を含む水性懸濁液中の有機窒素量がポリ−3−ヒドロキシアルカン酸重量あたり600ppm以下に調整される請求項1〜8のいずれか1項に記載のポリ−3−ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- ポリ−3−ヒドロキシアルカン酸を含む水性懸濁液を20℃以上90℃以下に加熱することにより前記水性懸濁液中でポリ−3−ヒドロキシアルカン酸を凝集させる請求項1〜9のいずれか1項に記載のポリ−3−ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
- ポリ−3−ヒドロキシアルカン酸を含む水性懸濁液に含まれる溶媒が、水のみである請求項1〜10のいずれか1項に記載のポリ−3−ヒドロキシアルカン酸の製造方法。
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