WO2004033700A1

WO2004033700A1 - ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の凝集方法

Info

Publication number: WO2004033700A1
Application number: PCT/JP2003/012485
Authority: WO
Inventors: Noriko Ogawa; Kenji Miyamoto; Fumio Osakada; Keiji Matsumoto
Original assignee: Kaneka Corporation
Priority date: 2002-09-30
Filing date: 2003-09-30
Publication date: 2004-04-22
Also published as: RU2005113285A; BR0314749A; JPWO2004033700A1; US20080118963A1; CN1694963A; PL376044A1; CA2499607A1; AU2003266709A1; EP1550724A1

Abstract

　ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸粒子を凝集させ、その粒度を高める方法を提供する。本発明は、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸粒子を、親水性溶媒、又は、水と親水性溶媒との混合液体に懸濁し、該懸濁液の沸点以下の温度で攪拌することからなる、ポリ−３−ヒドロキシアルカン酸の凝集方法である。

Description

明細書

ポリ一 3—ヒドロキシアルカン酸の凝集方法技術分野

本発明はポリ一 3—ヒドロキシアルカン酸粒子を凝集させる方法に関する。背景技術

ポリ一 3—ヒドロキシアルカン酸（以後 P HAと称す）は多くの微生物種の細胞にエネルギー蓄積物質として生成、蓄積される熱可塑性ポリエステルであり、生分解性を有している。現在プラスチック廃棄物は、焼却、埋立などにより処理されているが、これらの処理方法には地球の温暖化や埋立地の地盤弛緩等の問題点がある。そのためプラスチックリサイクルへの社会意識の高まりとともに、リサイクルシステム化が進みつつある。し力し、リサイクル可能な用途には限りがあり、実際には、プラスチック廃棄処理方法としては、焼却、埋立、リサイクルだけでは対応しきれず、自然界に放置されたままになるものも多いのが現状である。そこで、廃棄後は自然界の物質循環に取り込まれ、分解生成物が有害とならない P HAの様な生分解性プラスチックが注目されており、その実用化が切望されている。特に、微生物が菌体内で生成蓄積する P HAは、自然界の炭素循環プ口セスに取り込まれることから生態系への悪影響がほとんどないと予想されている。また、医療分野においても、回収不要のインプラント材料や薬物担体としての利用が可能と考えられる。

微生物が生成する P HAは、通常直径 1 /z m以下の顆粒体で菌体内に蓄積されるため、この P HAをプラスチックとして利用するためには、菌体内から P HA を分離して取り出すという工程が必要である。 P H Aを微生物菌体から分離精製する既知の方法として、大別すると、 P HAが可溶である有機溶媒を用いて菌体力ら P HAを抽出する方法と、 P H A以外の菌体構成成分を破砕もしくは可溶化させて除くことにより P HAを得る方法に分けられる。

有機溶媒による抽出を利用した P H Aの分離精製方法では、 P H Aが可溶である溶媒として、例えば 1 , 2—ジクロロェタンやクロ口ホルムといったハロゲン化炭化水素を用いて抽出する方法（特開昭 55— 1 18394号公報、特開昭 5 7-65193号公報参照）、ジォキサン（特開昭 63— 198991号公報参照）またはプロパンジオール（特開平 02— 69187号公報参照）またはテトラヒドロフラン（特開平 07— 79788号公報参照）のような親水性溶媒を用いた抽出方法も提案されている。しかしこれらの方法で PHAを抽出した溶媒層は極めて粘稠性が高く、溶解しなかった菌体残渣と PHAを含む溶媒層との分離が非常に困難である。また溶媒の使用量が膨大なため、コストがかさむといった欠点がある。

—方 PHA以外の菌体構成成分を、機械的処理、化学的処理、酵素的処理で可溶化させて除くことにより PHAを得る方法として、例えば J . Ge n. M i c r o b i o 1 o g y, 1958年，第 19卷， p. 198— 209には、菌体懸濁液を次亜塩素酸ナ卜リゥムで処理して P H A以外の菌体構成成分を可溶化し P HAを得る方法が記載されている。

特公平 04— 61638号公報には、 P H Aを含有する微生物菌体懸濁液を 1 00 以上で熱処理することで菌体構造を破壌し、次いでタンパク質分解酵素処理と、リン脂質分解酵素処理あるヽは過酸化水素処理とを組み合わせて P H A以外の菌体構成成分を可溶化して P H Aを得る方法が記載されている。

PH A含有菌体を界面活性化剤で処理した後に、菌体から放出された核酸を過酸化水素で処理して分解し、 PHAを分離する方法も提案されている（特表平 0 8-502415号公報参照）。

物理的処理方法として P H A含有微生物菌体を高圧ホモジナイザ一で破砕して PHAを分離する方法が提案されている（特開平 07—177894号公報、特開平 07— 31488号公報参照）。

また、 PH A含有微生物懸濁液にアルカリを添加して加熱し、細胞を破砕して PHAを分離する方法も提案されている（特開平 07— 31487号公報参照）。さらにアルカリ添加後に物理的破碎を行う方法がいくつ力提案されている（B i o s e p a r a t i on, 1991年，第 2卷， p. 95— 105、特開平 07 - 31489号公報参照）。

また P H A含有微生物懸濁液を r> H 2未満の酸性に調整し、 50 °C以上で P H A以外の菌体構成成分を可溶化して P H Aを得る方法も提案されている（特開平 1 1-266891号公報参照）。

このようにして製造される PHAは、微生物菌体内で作られた直径 1 μιη以下の微細な粒子そのままの形で得られる。これらのような微細な粒子を液体媒質から分離することは、より粒子が大きい場合に比べてしばしば困難である。

さらに、微粒子は爆発に必要なエネルギーが低いために粉麈爆発を起こす危険性、吸引した場合の肺での蓄積などが考えられ、取扱に注意が必要である。

このため ΡΗΑを凝集させる技術が検討されており、加熱、アルカリ金属塩による凝集、浮上'凝集させる方法などが開発されている。

加熱させて凝集させる方法としては、ポリ一 3—ヒドロキシプチレート（以下 ΡΗΒ) 含有懸濁液を ΡΗΒの融点付近まで加熱して凝集させる方法がある（Β a i l e y, Ne i l A. ； Ge o r g e, Ne i l ； N i r a n j a n, K. ； V a r 1 e y , J u l l e. B i o c h em i c a l En g i n e e r i n g g r o u p, Un i v e r s i t y Re a d i n g, 「I Ch emE R e s . Ev e n t, Eu r. C o n f . Yo un g Re s. C h e m. En g. 」 , (英国），第 2版， I n s t i t u t i on o f Ch em i c a l E n g i n e e r s, 1996年，第 1巻， p. 196— 198参照）。また、特表平 07— 509131号公報では、水に懸濁した PHBと D— 3—ヒドロキシバレレート（3HV) の共重合体（以下 PHBV) に、適切な温度と圧力の蒸気を直接注入し、 120〜160°Cで加熱攪拌することにより PHBVの粒度を高める方法を提案している。これらの方法は加熱 '加圧された蒸気を注入して、非常に高い温度まで加熱する必要がある。このため、高温の加熱 ·保温が可能であり、さらに耐圧性を持った特別な装置を設置する必要がある。またかなりの高温で処理するために、分子量の低下が起こる可能性がある。

また特開平 04— 264125号公報では、 P H B含有菌体から P H Bを塩化メチレンゃクロロホルム、トリクロ口エチレンのように水と混和しないかつ沸点が 100°C未満であるような有機溶媒で、含水下、加熱攪拌を行いながら抽出し、抽出された P H Bを含む該有機相を熱水中に注入することで、 P H Bをフロック状態で析出させて回収する方法が提案されている。この方法は PHBの晶析方法の一つであって、実質的には PHBを凝集させているわけではない。また、この方法は操作が非常に複雑であり、工業化は困難である。さらには乾燥菌体重量当たり、 10〜 30倍の有機溶剤が必要であり、加えて近年、環境保護の観点から有機ハ口ゲン化合物の使用は制限される方向にあるので、これらの使用は望ましくない。

アルカリ金属塩を添加して PHAを凝集させる方法として、 2価の陽イオンで凝集させる方法（J. B i o t e c hn o l . ， 1998年，第 65 (2， 3) 卷， p. 173- 182) が知られており、特に塩化カルシウム、硫酸マグネシゥム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウムを PHB懸濁液に添加して凝集させ、 PHBを分離する方法が報告されている（特表平 05— 507 10号公報）。し力し、この方法ではポリマーに金属塩が混入することになり、製品によっては望ましくない。発明の要約

本発明の目的は、従来技術における上記の課題を解決し、 PH Aの分子量低下を抑制しながら、純度が高く、取扱が容易な PHA凝集体を得る方法を提供することにある。

本発明者らは、 PH A凝集体を工業的に有利に得る方法を鋭意検討した。その結果、微細な PH A粒子を、親水性溶媒、又は、水と親水性溶媒との混合液体に懸濁させ、該懸濁液の沸点以下の温度で攪拌することで PHA粒子が凝集し、純度が高く、濾過性、取扱に優れた PH A凝集体が得られることを見いだし、本発明に達した。

本発明は、 PHA粒子を、親水性溶媒、又は、水と親水性溶媒との混合液体に懸濁させ、攪抻することによって凝集させることからなる。親水性溶媒、又は、水と親水性溶媒との混合液体に懸濁させた PHAを凝集させる温度は該懸濁液の沸点以下であるが、より効率的に、十分に凝集した PHAを得るために、好ましくは該懸濁液の沸点で保温、攪拌する。本発明の凝集方法によると、 PHAに含まれる不純物（脂質など）を溶解させて除去することができるので、 PHAの純度を高めることが可能となる。さらに本発明の方法では、実施するのに特別な装置が必要となる高温や高圧の条件はかならずしも必要ではない。図面の簡単な説明

図 1は、 P HB 体の走査型電子顕微鏡写真（倍率 2 , 000倍）を示す。図 2は、 1個の PHB H凝集体の走査型電子顕微鏡写真（倍率 5， 000倍）を示す。

図 3は、 P HB H凝集体の走査型電子顕微鏡写真（倍率 50， 000倍）を示す。発明の詳細な開示

本発明における PHAとは、ヒドロキシアルカン酸の重合体の総称である。ヒドロキシアルカン酸成分としては特に限定されないが、具体的には、 D— 3—ヒドロキシプチレート（以下 3HB) のホモポリマ一や、 3 HBと他の 3—ヒドロキシアルカン酸との共重合体、または D— 3—ヒドロキシへキサノエート（以下 3HH) と他の D— 3—ヒドロキシアルカン酸との共重合体などが挙げられる。さらに、 3—ヒドロキシプロピオネート、 3—ヒドロキシプチレート、 3—ヒドロキシバレレート、 3—ヒドロキシへキサノエート、 3—ヒドロキシヘプタノェートおよび 3—ヒドロキシォクタノエートからなる群より選択される少なくとも 2種のモノマーから構成される共重合体なども挙げられる。なかでもモノマー成分として 3 HHを含む重合体、例えば、 3HBと 3HHとの 2成分共重合体（P HBH) (Ma c r omo l e c u l e s, 28， 4822-4828 (1 99 5) ) または、 3 HBと D— 3—ヒドロキシバレレート（以下 3HV) と 3 HH との 3成分共重合体（PHBVH) (特許第 277757号，特開平 08— 28 9797号）が、得られるポリエステルの物性の面からより好ましい。ここで 3 HBと 3HHの 2成分共重合体 PHBHを構成する各モノマーュニットの組成比については特に限定されるものではないが、 3HHュニットを 1〜99モル％といった組成比のものが好適である。また、 3HBと 3HVと 3HHとの 3成分共重合体 PHBVHを構成する各モノマーュニットの組成比については特に限定されるものではないが、例えば、 3HBユニットの含量は 1〜95モル⁰ /₀、 3HV ュニットの含量は 1〜 96モル⁰ /₀、 3 HHュュットの含量は 1〜 30モル⁰ /₀といつた範囲のものが好適である。

本癸明で使用する親水性溶媒としては特に限定されるものではないが、例えばメタノーノレ、エタノーノレ、 1—プロパノーノレ、 2—プロパノール、 1—ブタノーノレ、 2—ブタノーノレ、 i s o—ブタノ一ノレ、ペンタノ一ノレ、へキサノール、ヘプタノールなどのアルコール類、ァセトンゃメチルェチルケトンなどのケトン類、テトラヒドロフラン、ジォキサンなどのエーテノレ類、ァセトニトリノレやプロピオ二トリルなどの二トリル類、ジメチルホルムァミドゃァセトアミドなどのァミド類、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ピぺリジンなどが挙げられる。好ましくは、メタノール、エタノール、 1—プロパノール、 2—プロパノール、 1ープタノーノレ、 2—プタノーノレ、 i s o—ブタノーレ、アセトン、メチ /レエチノレケトン、テトラヒドロフラン、ジォキサン、ァセトニトリル、プロピオ二トリルなどが除去性の面などから好適である。さらに好ましくは、メタノール、エタノール、 1 一プロパノール、 2—プロパノール、プタノール、アセトンなどが入手が容易であることから好ましい。さらに好ましくは、メタノール、エタノール、アセトンである。

懸濁液中の PH Aの濃度としては特に限定されないが、好ましくは 1 g/L以上、より好ましくは 10 gZL以上、さらに好ましくは 30 g/L以上である。また、好ましくは 500 g/L以下、より好ましくは 300 gZL以下、さらに好ましくは 200 g/L以下である。 PH A濃度が極端に高い場合、懸濁液の粘度が増し、実質的に非流動性となる傾向がある。

懸濁液は、その媒質として、親水性溶媒のみからなるものであってもよいし、水と親水性溶媒との混合液体からなるものであってもよい。混合液体中の親水性溶媒の濃度としては、使用する親水性溶媒の水への溶解度以下であれば特に限定されないが、より十分な凝集効果を得るために、好ましくは 10°/ovZv以上、より好ましくは 20°/o vZv以上である。

本発明の凝集方法においては、 PHA粒子を、親水性溶媒、又は、水と親水性溶媒との混合液体に懸濁させてなる懸濁液を、該懸濁液の沸点以下の温度で攪拌することによって、 PHA粒子を凝集させる。攪拌する手段としては、攪拌槽など、乱流を生じさせるものが挙げられるが、特に限定されるものではない。

攪拌時の温度は、室温以上が好ましく、 40 °C以上がより好ましく、更には 6 0°C以上が好ましいが、凝集の効率性の観点から、懸濁液の沸点に近い温度ほど好ましく、懸濁液の沸点が最も好ましい。本願明細書において、懸濁液の沸点とは、懸濁液が沸騰を開始する温度のことをいう。本宪明の方法では、一般的に 1 00°C以下で PHA粒子を凝集させることができる。さらに本発明の凝集方法は、加圧下で行ってもよいが、加圧する必要はなく、常圧下で行うことができる。凝集に要する時間は温度や濃度などの条件によって異なるが、一般に数分〜数時間程度で十分に凝集を起こさせることができる。

本発明の凝集方法によって、 PHA凝集体の粒径を高めることが可能となる。例えば、体積平均直径が 20 μ m以上、好ましくは 50 m以上、より好ましくは 100 ; in以上の凝集体を得ることができる。上限は特に限定されないが、体積平均直径が 1000 μ m以下、好ましくは 500 /i m以下の凝集体を得ることができる。粒径の増大に伴い濾過による回収が容易になり、工業生産において設備費が軽減できることになる。

本発明の凝集方法は、微生物によって産生された PH Aを当該微生物菌体から分離精製してなる PHAに対して、好適に適用することができる。この場合、少なくとも PHA粒子がお互いに懸濁液中で接触しうるのに十分な程度に、粒子を取り卷く菌体構成物質が分解されている必要がある。

最初に回収された P H A粒子が可溶性の菌体構成物質及び分解生成物その他 P H A以外の物質で汚染されている場合は、特にそれらを第 2液体媒質に再懸濁させ、攪拌による洗浄、化学処理などの後続加工（たとえば漂白剤、たとえば過酸化水素、あるいは次亜塩素酸ソーダによる処理）を行い、粒子をこの新たな液体媒質から回収することも可能である。本発明の凝集方法は、このプロセスのいかなる時点で行うこともできる。

上記微生物は、細胞内に P HAを蓄積している微生物であれば特に限定されない。例えばアルカリゲネス属（A l c a l i g e n e s) 、ラルストニア属（R a 1 s t o n i a ) 、シュゥドモナス属 (P s e u d omo n a s) 、くチノレス属（B a c i 1 1 u s) 、ァゾトバクター属（Az o t o b a c t e r) 、ノカノレディア属（No c a r d i a) 、ァエロモナス属（Ae r omo n a s) の菌が挙げられる。特に、アルカリゲネス ' リポリティ力（A. l i p o l y t i c a) 、ァノレ力リゲネス 'ラトウス（A. l a t u s) 、ァエロモナス 'キヤビエ (A. c a V i a e) 、ァエロモナス · /ヽィドロフイラ（A. h y d r o p h i 1 a) 、ラルストニア ·ユートロファ .（R. e u t r o p h a) 等の菌株、更には、ァエロモナス ·キヤビエ由来の PH A合成酵素群の遺伝子を導入したラルストニア -ユートロファ (R. e u t r o p h a) (旧名 A l e a l i g e n e s e u t r o p hu s AC 32) (ブダペスト条約に基づく国際寄託、国際寄託当局：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地中央第 6) 、寄託日 1997年 8月 7日、寄託番号 FERM BP— 6038、原寄託 FERM P— 15786より移管）（J. B a c t e r i o l . , 179, 4821— 4830頁（1997) ) 等がより好ましい。これら微生物を適切な条件で培養して菌体內に PHAを蓄積させた微生物菌体が用いられる。その培養方法については特に限定されないが、例えば特開平 05— 93049号等に挙げられる方法が用いられる。

本発明の凝集方法において用いられる PHA粒子は、従来の技術の項で記載したような公知の方法によって P H A含有菌体から得られる任意の P H A粒子を用いることができる。また、 PH A含有菌体から PHA粒子を分離する好ましい方法として、 PH A含有菌体の懸濁液を攪拌しつつ、物理的破砕と同時にアルカリを添加することにより PH A以外の菌体構成物質を可溶化して PH Aを分離する方法が挙げられる。これによつて、 PHA含有菌体から PHA粒子の凝集体を、非常に簡便な方法で、かつ効率よく得ることが可能となる。

菌体の懸濁液とは、培養終了後の培養懸濁液そのまま、又は、培養液から遠心分離等で分離した菌体を水に懸濁させた水性の懸濁液である。ここでの菌体の懸濁濃度は、乾燥菌体換算で 500 gZL以下が好ましく、より好ましくは 300 g/L以下である。

物理破砕処理としては、アルカリ処理により菌体内より溶出し、主に粘度の上昇の原因となる核酸を効率よく破砕し、かつ、菌体細胞壁や細胞膜や不溶性蛋白質などのポリマー以外の不溶生物質を十分に分散できるものであればこれらに限定されるものではない。具体的には、超音波による破砕、乳化分散機、高圧ホモジナイザーゃミル等による破砕が挙げられる。

アル力リとしては特に限定されないが、水酸化ナトリゥム、水酸化力リゥム、水酸化リチウム、水酸化カルシウムなどのアル力リ金属又はアル力リ土類金属の水酸化物；炭酸ナトリウム、炭酸力リゥムなどのアルカリ金属の炭酸塩；酢酸ナトリウム、酢酸力リゥムなどの有機酸のアルカリ金属塩；ほう砂等のアルカリ金属のホウ酸塩；リン酸 3ナトリウム、リン酸水素 2ナトリウム、リン酸 3力リウム、リン酸水素 2カリゥムなどのアルカリ金属のリン酸塩；あるいはアンモニア水などが挙げられる。この中でも、工業生産に適し、また価格の点で、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウムなどが好ましい。

ァゾレカリを添加する際には、当該アルカリの添加によって懸濁液の pHをコントロールすることが好ましい。特に、 pH8〜13. 5、更には1>«[10〜13、より好ましくは！） HI 1~1 3の範囲でコントロールするのが好ましい。 pHをコントロールするために、アルカリは、懸濁液の pHを測定しつつ、連続的又は断続的に添加するのが好ましい。

物理的破砕とアルカリ処理を行う際の温度としては特に限定されないが、室温から 50°Cの範囲が好ましく、 30°Cから 40°Cの範囲がより好ましい。

図 1は本発明の一実施態様にかかる PHAの凝集体の様子を走査型電子顕微鏡 (SEM) で撮影したものである。当該凝集体は、 1個の粒径が約 0. 1 /xm力、ら約 1. 5 μΐηの PHBH微粒子が多数接着することにより 1個の凝集体を形作つていることがわかる。ここで微粒子径の求め方は走査型電子顕微鏡写真を用いる当業者に周知の方法で行った。すなわち、微粒子径は PH A凝集塊の表面写真を 5000倍の解像度で撮影し、得られた写真から直接個々の微粒子の直径を読み取ることにより得られる。発明を実施するための最良の形態

本実施例では PHAとして PHBHを用いた。本発明での実施は PHBHになんら限られるものではない。

PHBHの懸濁液は、ァエロモナス ·キヤビエ由来の PHA合成酵素群遺伝子を導入した R. e u t r o p h a (上述の寄託番号 FERM BP— 6038) を J, B a c t e r i o 1. , 179, 4821— 4830頁（1997) に記載の方法で培養し、 PHBHを約 67w t%含有した菌体を得た。遠心（500 0 r pm、 1 Om i n) により培養液から分離したペースト状の菌体に水を加えて 75 g乾燥菌体 ZLの水性懸濁液とし、アル力リとして水酸化ナトリウム水溶液を添加して p HI 1. 7に保ちながら攪拌と物理的破砕とを行うことで PHB H以外の菌体構成物質を可溶化し、遠心分離 (3000 r pm, 1 Om i n) を行って沈殿物を得た。沈殿物はさらに水洗を行い、平均分子量約 140万、 3H Hモル分率 7%、純度 97%の PHBHを分離した。得られた PHBHを 20% w/vの水性懸濁液とし、以後の実験に使用した。

各実施例で使用した P HB Hの純度は以下のようにして決定した（但し、実施例 3と実施例 4は後述する H PLC法で純度を決定した）。 PHBHの粉体 10 mgを、クロ口ホルム lm 1に溶解したのち、メタノール 0. 85mlと濃硫酸 0. 15m 1を加えて 100°Cで 140分間処理した。これを冷却後、硫酸アンモユア飽和水溶液 0. 5m 1を加えて激しく攪拌した後静置した。下層部をキヤピラリーガスクロマトグラフィーにて分析して、分離物中の PHBHの純度および PHBH中の 3HB、 3 HHのモル分率を求めた。

菌体から分離して得られた PHBHの分子量は、菌体より分離して得られた沈殿物 10m gを、クロ口ホルム lm 1に溶解したのち、不溶物を濾過により除いた。この溶液を Sh o d e x K805 L (300 X 8mm、 2本連結）を装着した SH I MAD ZU社製 G PCシステムを用いクロ口ホルムを移動相として分析した。

P H A粒子の粒径は日機装社製マイクロトラック粒度計を用いて測定を行った。該装置によって測定した粒径値は体積平均粒径として得られる。体積平均粒径は、一般的に粒径を表すときに用いられ、粒子の体積によって重み付けられた平均粒径を意味している。

(実施例 1 )

PHBHの 20%wノ V水性懸濁液 40m 1とエタノーノレ 160m 1を混合し、バス温 90°Cの攪拌槽内で、 10分間、加熱 ·攪拌した。その後、 -れを攪拌しながら室温まで冷却した。ポリマーを遠心分離（2400 r pm、 5 m i n) にて回収し、水洗後粒径を測定した結果を表 1に示す。

この結果から、水と親水性溶媒の混合液体からなる懸濁液を加熱 ·攪拌すると、

PH Aの分子量は大きく低下することなく、 PH A粒子が凝集し、粒径が増大することが分かった。

(実施例 2 )

実施例 1で用いたものと同じ PHBH懸濁液 25m lに各種親水性溶媒を加えてパス温 80でで 15分間加熱攪拌を行った。そののち、攪拌しながら室温まで冷却し、遠心分離（2400 r pm、 15m i n) により P HAを回収した。これを水で洗浄後、水に再懸濁し粒径を測定した。表 2

有機溶媒 Hi度分子量

(ml) X 10⁴

メタノ一ノレ (75) 201 141

アセトン（25) 29 137

ァセトン（75) > 1000 1 31

ァセトニトリル（25) > 1000 132

テトラヒドロフラン（25) > 1000 1 27

.の結果から、水と親水性溶媒の混合液体からなる懸濁液を加熱■攪拌すると. P HAの分子量は大きく低下することなく、 PH A粒子が凝集し、粒径が増大することが分かった。特に、ァセトニトリルゃテトラヒドロフランなど PHA溶解能の高い溶媒を用いると、粒径はより大きくなることが判明した。

(実施例 3 )

実施例 1で用いた PHBHスラリーを、 PHBH10 gを含む懸濁液 100 m L中のエタノール量がそれぞれ 8 OmL、 70 m Lとなるように P HB H水性懸濁液を調整し（それぞれの懸濁液の pHは、 7. 62と 7. 36) 、パス温 90 °Cの攪拌槽内で、加熱攪拌を行った。懸濁液から適時サンプルを採取し、これを攪拌しながら室温まで冷却した。これを遠心分離 (2400 r pm, 15m i n ) にて回収し、再度水に懸濁させて粒径を測定した結果を表 3に示す。表 3 エタノー/レ量カロ熱時間粒径分子量純度

(mL) (m i n) ( m) x 1 0— ⁴ (%)

0 8. 6 144 97

80 10 123 144 98. 6

15 21 1 135 > 99

0 8. 6 144 97

70 10 140 142 98. 9

15 118 140 > 99

この結果から、水と親水性溶媒の混合液体からなる懸濁液を加熱 ·攪拌すると、 PH Aの分子量は大きく低下することなく、 PH A粒子が凝集し、粒径が増大することが分かった。また PHAの純度が向上することも分かった。 (実施例 4)

実施例 1と同様な方法で菌体から分離された PHBH (分子量 156万、純度 99%) を加熱'減圧乾燥した。得られた乾燥 PHBH8 gをエタノールに十分に懸濁させ、 8 OmLの PHBHエタノール懸濁液（pH7. 05) を得た。これを実施例 1と同様な方法で加熱 ·攪拌し、冷却後、水に懸濁させて粒径を測定した結果を表 4に示す。表 4

この結果から、親水性溶媒からなる懸濁液を加熱-攪拌すると、 PHAの分子量は低下することなく、 PH A粒子が凝集し、粒径が増大することが分かった。また PHAの純度が向上することも分かった。なお実施例 3及び実施例 4において、処理後の PHBHの純度は以下のようにして測定した。

処理後の PHBH懸濁液を遠心分離して上清を除去し、回収した PHBHに対し、上記 P H B H懸濁液と同容量に達するまでエタノールを加えることで 2回洗浄した。洗浄後、加熱 (50°C) 減圧乾燥して得られた PHBHの純度を、高速液体クロマトグラフィーを用いて測定した。

高速液体クロマトグラフィ一の条件：

カラム：資生堂カプセルパック UG 80 4. 6mmX 25 Omm 移動相： 2 Ommo 1 リン酸バッファー（pH3. 0) ：メタノール =80 : 20 (リン酸 1カリウム +リン酸で調整）

流速： 1. 0 m L/ m i n

カラム温度： 40°C

なお、ポリマー約 25mg、メタノーノレ 4mL、メタンスゾレホン酸 300 L を混合し 100 °Cで 3時間加熱した後、室温まで冷却し、 10 m Lにメタノールでメスアップしたもの 10 _μ Lを、高速液体クロマトグラフィ一に注入した。

(実施例 5) 実施例 2のメタノール凝集で得られた凝集体の走查型電子顕微鏡写真を撮影した（図 1〜3 ) 。凝集体を分散法によりサンプリングし、表面を日立 S— 4 0 0 0走査型電子顕微鏡にて加速電圧 3 k Vで観察した結果、凝集体はサブミクロンオーダーの丸みを帯びた P H B H粒子が凝集し、不定形の 2次凝集体を形成していることが判明した（図 1、 2 ) 。さらに日立 S—5 0 0 0走査型電子顕微鏡にて加速電圧 1 k Vで高倍率観察した結果、粒子と粒子が接合している部分が存在することが明らかとなった（図 3 ) 。産業上の利用の可能性

本発明による P HAの凝集方法は、極めて簡便な方法によって、 P HAの分子量低下を抑制しながら、純度の高い P HAの凝集体を得ることが可能である。この方法により P HAは、濾過性や取扱に優れた粒径の粒子となる。

Claims

請求の範囲

1 . 液体に懸濁させたポリ一 3—ヒドロキシアルカン酸を凝集させる方法であつて、ポリ一 3—ヒドロキシアル力ン酸粒子を、親水性溶媒、又は、水と親水性溶媒との混合液体に懸濁し、該懸濁液の沸点以下の温度で攪拌することを特徴とする、ポリ一 3—ヒドロキシアルカン酸の凝集方法。

2 . ポリ一 3—ヒドロキシアルカン酸が、 3—ヒドロキシプロピオネート、 3 ーヒドロキシブチレート、 3—ヒドロキシバレレート、 3—ヒドロキシへキサノエート、 3—ヒドロキシヘプタノエートおよぴ 3—ヒドロキシォクタノエ一トからなる群より選択される少なくとも 2種のモノマーから構成される共重合体である請求項 1記載の凝集方法。

3 . ポリ一 3—ヒドロキシアルカン酸が、 D— 3—ヒドロキシへキサノエートと他の D— 3—ヒドロキシアルカン酸との共重合体である請求項 1記載の凝集方法。

4 . ポリ一 3—ヒドロキシァノレカン酸が、 D— 3—ヒドロキシへキサノエートと D— 3—ヒドロキシブチレートとの 2成分共重合体、または、 D— 3—ヒドロキシへキサノエ一トと D— 3—ヒドロキシプチレートと D— 3—ヒドロキシバレレートとの 3成分共重合体である請求項 3記載の凝集方法。

5 . ポリ一 3—ヒドロキシアルカン酸が、微生物によって産生され、当該微生物菌体から分離精製されたものである請求項 1〜 4のヽずれかに記載の凝集方法。

6 . ポリ一 3—ヒドロキシアルカン酸を産生する微生物がァエロモナス属である請求項 5記載の凝集方法。

7 . ポリ _ 3—ヒドロキシアルカン酸を産生する微生物が、ァエロモナス -キャビエ又はァエロモナス 'ハイドロフイラである請求項 6記載の凝集方法。

8 . ポリ一 3—ヒドロキシアルカン酸を産生する微生物が、ァエロモナス 'キャビエ由来のポリー 3—ヒドロキシアル力ン酸合成酵素群遺伝子を導入された菌株である請求項 5記載の凝集方法。

9 . ポリ一 3—ヒドロキシアルカン酸を含有する微生物が、ァエロモナス 'キャビエ由来のポリ一 3—ヒドロキシアル力ン酸合成酵素群遺伝子を導入されたラルストエア ·ユートロファである請求項 5記載の凝集方法。

1 0 . ポリ一 3—ヒドロキシアル力ン酸粒子が、ポリ一 3—ヒドロキシァノレ力ン酸含有菌体の懸濁液を攪拌しつつ、物理的破碎と同時にアル力リを添加することによりポリ一 3—ヒドロキシアルカン酸以外の菌体構成物質を可溶化してポリ — 3—ヒドロキシアルカン酸を分離したものである請求項 1〜9のいずれかに記載の凝集方法。

1 1 . 親水性溶媒が、アルコール類、ケトン類、二トリル類、アミド類及びェ一テル類からなる群より選択されたものである請求項 1〜1 0のいずれかに記載の凝集方法。

1 2 . アルコール類が、メタノール又はエタノールであり、ケトン類がァセトンであり、二トリル類がァセトニトリルであり、アミド類がジメチルホルムァミドであり、エーテル類がテトラヒドロフランである請求項 1 1記載の凝集方法。

1 3 . 粒径 0 . l /z m以上、 1 . 5 μ πι以下のポリ一 3—ヒドロキシアル力ン酸微粒子同士が接着してなることを特徴とする、ポリ一 3—ヒドロキシアル力ン酸の凝集体。 2

図 2

差替え紙（規則 26)