WO2004029266A1

WO2004029266A1 - ３−ヒドロキシアルカン酸共重合体の精製方法

Info

Publication number: WO2004029266A1
Application number: PCT/JP2003/012486
Authority: WO
Inventors: Noriko Ogawa; Kenji Miyamoto; Fumio Osakada; Keiji Matsumoto
Original assignee: Kaneka Corporation
Priority date: 2002-09-30
Filing date: 2003-09-30
Publication date: 2004-04-08
Also published as: US20060127998A1; AU2003266710A1; CN1685048A; EP1550723A1; BR0314784A; RU2005113292A; DE60328029D1; EP1550723B1; EP1550723A4; JPWO2004029266A1; PL375578A1; CA2499608A1; US7435566B2

Abstract

　本発明は、ＰＨＡ含有菌体から分離されるＰＨＡを、著しい分子量の低下を引き起こすことなく高純度で精製する方法を提供すること。　微生物が産生した３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を精製する方法であって、微生物から分離した３−ヒドロキシアルカン酸共重合体を含む水性懸濁液にアルカリを連続的又は断続的に添加することによって、前記水性懸濁液のｐＨをコントロールしながら過酸化水素による処理を行うことからなる精製方法である。

Description

明細書

3—ヒドロキシアルカン酸共重合体の精製方法技術分野

本発明は、微生物菌体によって産生された 3—ヒドロキシアルカン酸共重合体を精製する方法に関する。 . 背景技術

ポリ一 3—ヒドロキシアルカン酸（以後 P HAと称す）は多くの微生物種の細胞にエネルギー蓄積物質として生成、蓄積される熱可塑性ポリエステルであり、生分解性を有している。現在、プラスチック廃棄物は焼却、埋立などにより処理されているが、これらの処理方法には地球の温暖化や埋立地の地盤弛緩等の問題点がある。そのためプラスチックリサイク/レへの社会意識の高まりとともに、リサイクルシステム化が進みつつある。し力し、リサイクル可能な用途には限りがあり、実際には、プラスチック廃棄処理方法としては、焼却、埋立、リサイクルだけでは対応しきれず、自然界に放置されたままになるものも多いのが現状である。そこで、廃棄後は自然界の物質循環に取り込まれ、分解生成物が有害とならない P HAの様な生分解性プラスチックが注目されており、その実用化が切望されている。特に、微生物が菌体内で生成蓄積する P HAは、自然界の炭素循環プ口セスに取り込まれることから生態系への悪影響がほとんどないと予想されている。また、医療分野においても、回収不要のインプラント材料、薬物担体としての利用が可能と考えられる。

微生物が生成する P H Aは、通常顆粒体を形成してその微生物の菌体内に蓄積されるため、 P HAをプラスチックとして利用するためには、微生物の菌体内から P HAを分離して取り出すという工程が必要である。 P HAを微生物菌体から分離精製する既知の方法として、大別すると、 P HAが可溶である有機溶媒を用いて菌体から P H Aを抽出する方法と、 P H A以外の菌体構成成分を破碎もしくは可溶化させて除くことにより P H Aを得る方法に分けられる。

有機溶媒による抽出を利用した P H Aの分離精製方法では、 P HAが可溶である溶媒として、例えば 1， 2—ジクロロェタンやクロ口ホルムといったハロゲン含有炭化水素を用いて抽出する方法がある（特開昭 55- 118394号公報、特開昭 57— 65193号公報参照）。し力し、これらハロゲン含有炭化水素は疎水性溶媒であるため、抽出前に、菌体を予め乾燥する等の、溶媒が菌体中の P HAと接触できるようにするための工程が必要となる。また、これらの方法においては PHAを実用に値する濃度（たとえば 5%) 以上に溶解すると抽出液は極めて粘稠となり、溶解しなかった菌体残渣と PHAを含む溶媒層との分離が非常に困難である。更に、溶媒層から PHAを高い回収率で再沈殿させるためには溶媒層の 4〜 5倍容のメタノールやへキサン等の P H A不溶性溶媒が必要であるなど、再沈殿工程には大容量の容器が必要とされる。さらには、溶媒の使用量が膨大なため、溶媒の回収コストと損失溶媒のコストがかさむことになる。加えて近年、環境保護の観点から有機ハロゲン化合物の使用は制限される方向にあり、この方法での工業化は難しいのが現状である。

そこで、 PHAが可溶でありかつ水と混ざり合う溶媒、例えばジォキサン（特開昭 63— 198991号公報参照）またはプロパンジオール（特開平 02— 6 9187号公報参照）またはテトラヒドロフラン（特開平 07— 79788号公報参照）の様な親水性溶媒を用いた抽出方法も提案されている。これらの方法は乾燥菌体ゃ湿菌体からでも P H Aを抽出することが可能な点と、菌体残渣と分離した溶媒層を冷却するだけで P H Aの沈殿物が得られる点では好ましいと考えられる。し力し、これらの方法でも PHAの溶解した溶媒層の粘稠性の問題は解決されておらず、加えて抽出効率を上げるためには加熱が必要であり、水存在下で加熱するために P H Aの低分子化が避けられないことや、回収率が劣ることなどの欠点を有している。

一方、 PHA以外の菌体構成成分を可溶化させて除くことにより PHAを得る方法として、 J. Ge n. Mi c r o b i o l o g y, 1958年，第 19卷， p. 198— 209には、菌体懸濁液を次亜塩素酸ナトリゥムで処理して P HA 以外の菌体構成成分を可溶化し、 PHAを得る方法が記載されている。この方法は、プロセスとしては簡単ではあるが、大量の次亜塩素酸ナトリウムを使用する必要があるためにコストが高くなる。また、 PHAの著しい低分子化が引き起こされることや、得られた P H A内に無視できない量の塩素が残存することから実用には適さないと考えられる。

特公平 04— 61638号公報には、 PHAを含有する微生物菌体懸濁液を 1 0 o°c以上で熱処理することで菌体構造を破壊し、次いでタンパク質分解酵素処理と、リン脂質分解酵素処理あるいは過酸化水素処理とを組み合わせて、 PHA 以外の菌体構成成分を可溶化し、 PHAを得る方法が記載されている。この方法は、熱処理によってタンパク質が変性'不溶化するために、次のタンパク質分解酵素処理工程での負荷が増大すること、更には、処理工程が多く複雑であること、酵素は比較的高価であることからコストがかかる等の欠点を有している。

PH A含有微生物菌体を破碎する方法として、界面活性剤で処理したのち、菌体から放出された核酸を過酸化水素処理して分解し、 PHAを分離する方法が提案されている（特表平 08— 502415号公報参照）が、界面活性剤を含む廃液は発泡が激しいことに加えて高い B OD負荷値を持つ。このような観点から界面活性剤の使用は工業的規模において望ましくない。

PH A含有微生物菌体を高圧ホモジナィザ一で破砕して P H Aを分離する方法が提案されている（特開平 07— 177894号公報、特開平 07— 31488 号公報参照）。しかし、これらの方法は微生物菌体懸濁液を少なくとも 3回、場合によっては加温して 10回も高圧処理しなければ純度の高い PHAを得ることは出来ず、なおかつ得られる PHAの純度は 65〜89%程度と低いという欠点がある。

また、 PH A含有微生物懸濁液にアルカリを添加して加熱し、細胞を破碎して PHAを分離する方法が提案されている（特開平 07— 31487号公報参照）。しかし、得られるポリマーの純度は 75. 1〜80. 5%と低く、収率向上のためにアル力リ添加量を増やすとポリマーの低分子化が起こるなどの欠点があった。さらに、アルカリ添加後に物理的破砕を行う方法もいくつ力提案されているが（特開平 07—31489号公報、 B i o s e p a r a t i o ti, 199 1年，第 2巻，第 95— 105項参照）、アル力リ処理だけでは菌体構成成分は少量しか菌体外に出ておらず、続く高圧破碎処理後でも菌体構成成分が P HA画分に残存しており効率的でないこと、従って微生物菌体懸濁液を少なくとも 5回高圧処理しなければ純度の高い P HAを得ることは出来ず、なおかつ得られる P HAの純度は 7 7〜8 5 %程度と低いという欠点がある。加えて、アルカリを添加する方法においては、一般に、微生物菌体から流出する菌体成分、特に核酸が、菌体懸濁液の粘度を上昇させ、その後の処理が困難になるという問題があった。

また、 P HA含有微生物懸濁液を p H 2未満の酸性に調整し 5 0 °C以上で P H Aを分離する方法が提案されている（特開平 1 1— 2 6 6 8 9 1号公報参照）。しかし、この方法は p H 2未満のような強酸性で処理を行うために工業的規模では望ましくないこと、純度向上のためには酸処理の後にアルカリ性に調整する必要があり大量の塩が発生すること、また、得られる P HAの分子量が 2 4 7万から 1 0 0万程度にまで低下するなどの欠点を有している。

特開平 0 7— 1 7 7 8 9 4号公報では菌体を高圧破碎処理したあと酸素系漂白剤で処理することによりポリ一 3—ヒドロキシプチレート（以後 P H B ) を分離精製する方法を提案している。 P H Bのスラリーを各種酸素系漂白剤で処理する方法を提示しているが、漂白処理時の p Hについては記載されていない。発明の要約

本発明の目的は、上記現状に鑑み、微生物菌体によって産生された 3—ヒドロキシアル力ン酸共重合体から少ない工程で 3—ヒドロキシアル力ン酸共重合体以外の菌体構成成分を効率よく取り除き、深刻な分子量の低下を引き起こすことなく、高純度で溶融時の黄変や異臭のない 3—ヒドロキシアル力ン酸共重合体を高収率で得ることのできる精製方法を提供することにある。

本発明者らは、 3—ヒドロキシァルカン酸共重合体が、 3—ヒドロキシァルカン酸単独重合体の場合と比較して、過酸化水素処理に伴う分子量低下が顕著であるという課題を見出し、この課題を解決するため鋭意検討した。その結果、過酸化水素処理を行う際に、 3—ヒドロキシアル力ン酸共重合体を含む水性懸濁液の p Hをアルカリでコント口ールすることによつて深刻な分子量低下を防止することができることを見出した。

すなわち本発明は、微生物が産生した 3—ヒドロキシアル力ン酸共重合体を精製する方法であって、微生物から分離した 3—ヒドロキシアルカン酸共重合体を含む水性懸濁液にアル力リを連続的又は断続的に添加することによって、上記水性懸濁液の p Hをコント口ールしながら過酸化水素による処理を行うことからなる精製方法に関する。

以下、本発明を詳述する。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の精製方法を実施するための装置の一例の概略図を示す。符号の説明

1 攪拌槽

2 攪拌装置

3 H検知制御装置

4 ポンプ

5 管路

6 アル力リ貯留槽

7 pH計発明の詳細な開示

本発明における微生物は、細胞内に 3—ヒドロキシァ /レカン酸共重合体を蓄積している微生物であれば特に限定されない。例えばアルカリゲネス属（Al c a 1 i g e n e s ) 、ラノレストニア属 (R a 1 s t o n i a ) 、シュゥドモナス属 (P s e u d omon a s) 、パチノレス属 (B a c i 1 1 u s ) 、ァゾトバクター属 (Az o t o b a c t e r) 、ノカスレディァ属 (N o c a r d i a ) 、ァェ口モナス属（Ae r omo n a s) の菌等が挙げられる。特に、アルカリゲネス - リポリティ力（A. 1 i p o l y t i c a) , アル力リゲネス 'ラトウス（A. 1 a t u s ) 、ァエロモナス -キヤビエ（A. c a V i a e) 、ァエロモナス · ハイドロフイラ（A, hy d r o p h i l a) ラルストニア ■ユートロファ（ R. e u t r o p h a) 等の菌株、更には、ァエロモナス ■キヤビエ由来の 3— ヒドロキシアル力ン酸共重合体合成酵素群の遺伝子を導入した菌株、特にラルストニア ·ユートロファ（R, e u t r o p h a) (旧名 A l e a l i g e n e s e u t r o p hu s AC 32) (ブダぺスト条約に基づく国際寄託、国際寄託当局：独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地中央第 6) 、寄託日 1997年 8月 7日、寄託番号 FERM BP— 6038、原寄託 FERM P— 15786より移管）（J. B a c t e r i o l . , 179, 4821— 4830頁（1997) ) 等がより好ましい。これら微生物を適切な条件で培養して菌体内に 3—ヒドロキシアル力ン酸共重合体を蓄積させた微生物菌体が用いられる。その培養方法については特に限定されないが、例えば特開平 05— 93049号等に挙げられる方法が用いられる。

本楽明における 3—ヒドロキシアル力ン酸共重合体とは、 3—ヒドロキシアルカン酸から構成される共重合体の総称である。 3—ヒドロキシアルカン酸成分としては特に限定されないが、具体的には、 D— 3—ヒドロキシプチレート（3H B) と他の 3—ヒドロキシアルカン酸との共重合体、または、 D— 3—ヒドロキシへキサノエート（3HH) を含む 3—ヒドロキシアルカン酸の共重合体などが挙げられる。さらに、 3—ヒドロキシプロピオネート、 3—ヒドロキシプチレート、 3—ヒドロキシパレレート、 3—ヒドロキシへキサノエート、 3—ヒドロキシヘプタノエート及び 3—ヒドロキシォクタノエートからなる群より選択される 2種以上のモノマーから構成される共重合体なども挙げられる。なかでもモノマ ^"成分として 3 HHを含む共重合体、例えば、 3HBと 3HHとの 2成分共重合体（PHBH) (Ma c r omo l e c u l e s, 28, 4822— 4828 ( 1995) ) 、または、 3 HBと D— 3—ヒドロキシバレレート（3HV) と 3 HHとの 3成分共重合体（PHBVH) (特許第 277757号，特開平 08— 289797号）が、得られるポリエステルの物性の面からより好ましい。ここで 3HBと 3 HHの 2成分共重合体 PHBHを構成する各モノマーユエットの組成比については特に限定されるものではないが、 3HHュ-ットを 1〜99モル %といった組成比のものが好適である。また、 3HBと 3HVと 3HHとの 3成分共重合体 PHBVHを構成する各モノマーュ-ットの組成比については特に限定されるものではないが、例えば、 3HBユニットの含量は 1〜95モル⁰ /。、 3 H Vュニットの含量は 1〜 9 6モ /レ％、 3 HHュニットの含量は 1〜 3 0モル⁰ /₀ といった範囲のものが好適である。

本宪明における「微生物から分離した 3—ヒドロキシァノレ力ン酸共重合体」とは、 3—ヒドロキシアル力ン酸共重合体を含有する微生物菌体を破砕することによって、微生物から遊離した 3—ヒドロキシアルカン酸共重合体のことをいう。微生物菌体の破砕方法としては特に限定されないが、従来公知の物理的破砕や、アルカリ添加による破砕等が挙げられる。

本発明における「微生物から分離した 3—ヒドロキシアルカン酸共重合体を含む水性懸濁液」とは、微生物から分離した 3—ヒドロキシアル力ン酸共重合体を水に懸濁させたものであれば特に限定されない。また、悪影響がない範囲で有機溶剤が共存しても差し支えない。通常、当該懸濁液には、微生物菌体の破砕によつて生じた菌体構成物質等が混入している。

上記水性懸濁液は、 3—ヒドロキシアルカン酸共重合体含有菌体の懸濁液を攪拌しつつ、物理的破砕と同時にアルカリを添加することによって 3—ヒドロキシアル力ン酸共重合体以外の菌体構成物質の全てまたは一部を可溶化して 3—ヒドロキシアルカン酸共重合体を分離し、 3—ヒドロキシアルカン酸共重合体を水に懸濁させたものであることが好ましい。

本発明における「 3—ヒドロキシアル力ン酸共重合体を含む水性懸濁液」の 3 —ヒドロキシアルカン酸共重合体濃度は、精製を効率よく行うという観点から、 5 0 0 g / L以下が好ましく、 3 0 0 g Z L以下がより好ましい。

本発明においては、過酸化水素による上記水性懸濁液の処理と並行して、上記水性懸濁液にアル力リを連続的又は断続的に添加することによって、上記水性懸濁液の; p Hをコントロールする。これによつて、過酸化水素によるタンパク質（懸濁液に残存する菌体構成物質）の分解を行うとともに、 3—ヒドロキシアル力ン酸共重合体の分子量の深刻な低下を防止することができる。

本発明で使用するアル力リとしては、 p Hを特定の範囲に調整できるものであれば特に限定されるものではない。具体的には、水酸化ナトリウム、水酸化カリゥム、水酸化リチウム、水酸化カルシウムなどを含めたアルカリ金属又はアル力リ土類金属の水酸化物；炭酸ナトリウム、炭酸力リゥムなどのアル力リ金属の炭酸塩；酢酸ナトリウム、酢酸力リゥムなどの有機酸のアルカリ金属塩；ほう砂等のアルカリ金属のホウ酸塩；リン酸 3ナトリウム、リン酸水素 2ナトリウム、リン酸 3カリゥム、リン酸水素 2カリゥムなどのアル力リ金属のリン酸塩；あるいはアンモニア水などが挙げられる。この中でも、工業生産に適し、また価格の点で、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化力リゥムなどが好ましい。本発明において、アルカリの添加によってコントロ^^ルする p Hの範囲は特に限定されないが、共重合体の分子量低下防止という観点から、 P H 7以上が好ましく、 p H 8以上がより好ましい。また上限は i> H I 3以下が好ましく、 p H l 2以下がより好ましい。特に、 p H 8から p H l 1の間で調整されることが好ましい。

コントローノレする _p Hの上下幅としては設定値のそれぞれ 1以内が好ましく、さらに好ましくは上下それぞれ 0 . 5以内である。

本発明においては、アルカリの添加速度は特に限定されず、上記水性懸濁液の p Hの推移を計測しながら、上記 p Hを所望の範囲にコントロールできるような速度でアル力リを添加することが好ましい。

—般に、 3—ヒドロキシアル力ン酸共重合体を過酸化水素で処理すると、精製が進むにつれて、上記水性懸濁液の p Hが徐々に下がっていく現象が見られる。本発明は、この現象を抑止するために、アルカリを連続的又は断続的に添加して上記水性懸濁液の ρ Ηを一定範囲内にコントロールするものである。 p H l 4を越えるような過剰なアル力リを添加すると、過酸化水素の分解が起こり精製の効率が下がるだけではなく、かえって 3—ヒドロキシアル力ン酸共重合体の分子量の低下を招きやすい。また、アルカリの添加量が不足すれば、過酸化水素の活性が下がり十分な精製効果が得られず、また、酸性側に傾くと、 3—ヒドロキシァルカン酸共重合体の分子量も大きく低下する傾向がある。適正な量のアル力リを連続的又は断続的に添加して ι> Ηをコントロールすることによってはじめて、精製効率の向上と分子量低下の抑止という 2つの目的を同時に達成することができる。

本発明において、過酸化水素の添加量は特に制限されないが、水性懸濁液中の濃度として 1 0重量％以下が好ましく、 5重量％以下がより好ましく、 1重量％以下がさらに好ましい。また適切な精製効果を得るためには、 0. 0 1重量％以上が好ましく、 0 . 0 5重量％以上がより好ましく、 0 . 1重量％以上がさらに好ましい。

特に本発明の場合、アル力リの添加による水性懸濁液の p Hのコント口ールによって、過酸化水素の添加量を低減しても優れた精製効果を得ることが可能となる。過酸化水素の添加量の低減は、精製工程のコストダウンや、排水処理負担の削減を可能にするため非常に好ましい。すなわち本発明においては、例えば、 1 重量％以下、さらには 0 . 5重量％未満であっても優れた精製効果を得ることができる。アル力リの添加による水性懸濁液の p Hのコント口ールを行わず過酸化水素の処理のみを行った場合、このような低濃度では十分な精製効果を達成することができない。

本発明において、過酸化水素による処理は、室温以上の温度から水'！¹生懸濁液の沸点までの範囲で行うのが好ましい。短期間でより精製の効果を高めるために、好ましくは 5 0 °C以上、より好ましくは 7 0 °C以上で処理を行う。また、通常 1 0分から 1 0時間、好ましくは 3 0分から 5時間、さらに好ましくは 1時間から 3時間処理を行う。

過酸化水素処理を行った後、遠心分離を行って得られた沈殿物を水や有機溶媒、好ましくは親水性溶媒、具体的にはメタノール、エタノール、アセトン、ァセト二トリル、テトラヒドロフランなどの溶媒で洗浄し、乾燥させることによって、 3—ヒドロキシアル力ン酸共重合体を単離することができる。発明を実施するための最良の形態

以下に実施例を掲げて本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。

(重合体の純度の測定方法）

重合体の水性懸濁液を遠心分離（2 4 0 0 r p m、 1 5 m i n ) して上清を除去し、メタノール（ただし実施例 4と比較例 3の場合のみエタノールを使用）で 2回洗浄した後、加熱'減圧下で乾燥して重合体の粉体を得た。重合体の粉体 1 Omgを、クロ口ホルム lmlに溶解したのち、メタノール 0. 85mlと濃硫酸 0. 15mlを加えて 100°Cで 140分間処理した。これを冷却後、硫酸ァンモア飽和水溶液 0. 5m 1を加えて激しく攪拌して静置し、下層部をキヤピラリーガスクロマトグラフィーにて分析して、重合体の純度を求めた。

(重合体の分子量の測定方法）

重合体の分子量は、菌体より分離して得られた沈殿物 1 Omgを、クロ口ホルム 1mlに溶解したのち、不溶物を濾過により除いた。この溶液を Sh o d e x K 805 L (300X8mm、 2本連結）を装着した S H I MAD Z U社製 G PCシステムを用いクロ口ホルムを移動相として分析した。

(重合体の溶融時の Y I値の測定方法）

重合体の水性懸濁液を遠心分離（2400 r pm、 15m i n) して上清を除去し、メタノール（ただし実施例 4と比較例 3の場合のみエタノールを使用）で 2回洗浄した後、加熱 ·減圧下で乾燥して各サンプルを得た。サンプルは 170 °C、 P H Bサンプルは 190 °Cに熱したアルミプロックで 10分間溶融させてペレットとし、日本電色工業（株）製分光式色彩計 SE— 2000で測定を行い、黄色度指数（Y I値）を求めた。 (重合体中の残留窒素量の測定方法）

重合体の水性懸濁液を遠心分離（2400 r pm、 15m i n) して上清を除去し、メタノールで 2回洗浄した後、加熱■減圧下で乾燥して各サンプルを得た。各サンプルに関しダイヤインスツルメンッ社製の微量窒素分析装置 T N— 10を用いて測定した窒素濃度に 6. 38をかけてタンパク質換算を行った値で表示した。

(微生物から分離した P H B Hを含む水性懸濁液の調製）

PHBHの懸濁液は、ァエロモナス ·キヤビエ由来の 3—ヒドロキシアルカン酸共重合体合成酵素群遺伝子を導入したラルストニア .ユウトロファ（旧名アルカリゲネス ·ユウトロファス AC 32 (上述の寄託番号 FERM B P— 60 38) ) を J. B a c t e r i o l . , 1 79, 48 21— 4830頁（1 9 9 7) に記載の方法で培養し、 PHBHを約 6 7w t°/o含有した菌体を得た。遠心 (5000 r pm. 1 Om i n) によって培養液から分離したペースト状の菌体に水を加えて 7 5 g乾燥菌体/ Lの水性懸濁液とし、アル力リとして水酸化ナトリウム水溶液を添加して P H I 1. 7に保ちながら攪拌と物理的破砕とを行うことで PHBH以外の菌体構成物質を可溶化し、遠心分離（3000 r pm、 1 0 m i n) を行って沈殿物を得た。沈殿物はさらに水洗を行い、平均分子量約 70 万、 3HHモル分率 5%、純度 9 1%の PHBHを分離した。得られた PHBH を 75 g Z Lの水性懸濁液として、以下の実施例 1〜 2及ぴ比較例 1〜 2で使用した。

図 1は本発明の 3—ヒドロキシアル力ン酸共重合体の精製方法を実施するための装置の一例の概略図である。もちろん本発明はこの装置例に限定されるものではない。

(実施例 1 )

PHBHの水性懸濁液 5 Om 1を、 pH電極を装着した 1 0 Om 1攪拌槽に入れて 70°Cに保温した。電極は丸菱バイオエンジン社製ラボコントローラー MDL-6 C型に接続し、 p Hが設定値以下になるとペリスタポンプが作動して水酸化ナトリゥム水溶液が設定値に達するまで該懸濁液内に入るように設定した。ラボコントローラーの pHを 1 0に設定し、該懸濁液に 30%過酸化水素水を過酸化水素濃度がポリマー重量に対して 5重量％ (懸濁液重量に対して 0. 3 75 重量％) となるように添加して 1時間攪拌を行った。次いでこの懸濁液を遠心分離によって 2回水洗し、さらにメタノールで 2回浄を行ったあと、乾燥して粉体を得た。

同様にラボコントローラーの pHを 7および 8に設定して上記処理を行つた。これらの結果を表 1に示す。 pH 純度 (%) 分子量 Y I値

処理前 91 70万 40. 9 1. 21

7 97 70万 28. 2

8 > 99 70万 28. 3

10 >99 70万 18. 2 0. 59 この結果から、過酸化水素処理時にアル力リを添加して p Hをコントロールすると、共重合体の純度が向上し残留窒素量が減少するとともに、共重合体の分子量は変化せず、さらには共重合体の溶融時の黄変が抑えられることが分かつた。

(実施例 2 )

実施例 1と同様な方法で、ラボコントローラーの pHを 10に設定して、 50 °Cで 3時間攪拌を行った。次いでこの懸濁液を遠心分離によって 2回水洗し、さらにメタノールで 2回洗浄を行つたあと、乾燥して粉体を得た。

この結果を表 2に示す。表 2

サンプル純度 (%) 分子量 Y I値

過酸化水素処理前 91 70万 40. 9

過酸化水素処理後 98 70万 30. 2

この結果から、アルカリを添加して ί Ηをコントロールしながら過酸化水素処理を行うと、共重合体の純度が向上するとともに、共重合体の分子量は変化せず、さらには共重合体の溶融時の黄変が抑えられることが分かった。

(実施例 3 )

上記と同様な処理を行って得られた分子量 148万、 3 ΗΗモル分率 Ί %、純度 99%の PHBHl 1 0 gを水 100 Om 1に懸濁させた懸濁液を作成し、 p H電極とシルバーソンミキサーを装着した 2000 ra 1攪拌槽に入れて Ί 0 に保温した。； H電極は丸菱バイォエンジン社製ラボコントローラー MD L— 6 C 型に接続し、 P Hが設定値以下になるとペリスタポンプが作動して水酸化ナトリゥム水溶液が設定 P H 1 0に達するまで該懸濁液内に入るように設定した。シルバーソンミキサーの回転数を 500 0回転に設定し、該懸濁液に 30%過酸化水素水を過酸化水素濃度がポリマー重量に対して 5重量％ (懸濁液重量に対して 0. 3 7 5重量％) となるように添加して 5 0分間攪拌を行った。次いでこの懸濁液を遠心分離によって 3回水洗し、さらにメタノールで 2回洗浄を行ったあと、乾燥して粉体を得た。結果を表 3に示す。表 3

サンプル純度 (%) 分子量 Y I値

過酸化水素処理前 99 148万 17. 7

過酸化水素処理後 99 144万 1 1. 3

この結果から、アル力リを添加して pHをコントロールしながら過酸化水素処理を行うと、共重合体の分子量は変化せず、共重合体の溶融時の黄変が抑えられることが分かった。

(比較例 1 )

実施例 1で用いたものと同じ ΡΗΒΗの水性懸濁液（ρ Η7. 1 9) (処理 1 ) 50m lと、これに水酸化ナトリウムを添加して pH 9. 1 6とした懸濁液（処理 2) 5 0m lを、それぞれ、 1 0 Om 1攪拌槽にいれて 70°Cに保温した。該懸濁液に 3 0 %過酸化水素水を過酸化水素濃度がポリマー重量に対して 5重量 % (懸濁液重量に対して 0. 3 7 5重量％) となるように添加し、 p Hの調整を行わずに 3時間攪拌した。次いでこの懸濁液を遠心分離によって 2回水洗し、さらにメタノールで 2回洗浄を行ったあと、乾燥して粉体を得た。この結果を表 4 に示す。表 4 サンプル纖 pH 終了純度 ( 分子量 Y I値過酸化水素処理前 91 70万 40. 9 処理 1 7. 19 4. 60 > 99 62万 31. 7 処理 2 9. 16 5. 32 > 99 58万 30. 9

この結果から、 pHの調整をせずに過酸化水素の処理を行うと、共重合体の分子量は処理前の分子量の 90%未満にまで低下することが分かった。 (比較例 2)

実施例 1で用いた PHBHの懸濁液 5 Om 1の p Hを希塩酸を用いて p H 5に調整し、実施例 1と同様に p H電極を装着した 100 m 1の攪拌槽に入れて 70 に保温した。ラボコントローラーの; pHを 5に設定して、 30%過酸化水素水を過酸化水素濃度がポリマー重量に対して 5重量％ (懸濁液重量に対して 0. 3 75重量％) となるように添加し、 1時間攪拌を行つた。次、でこの懸濁液を遠心分離によって 2回水洗し、さらにメタノールで 2回洗浄を行ったあと、乾燥して粉体を得た。結果を表 5に示す。表 5

サンプル純度 (%) 分子量 Y I値

過酸化水素処理前 91 70万 40. 9

過酸化水素処理後 99 45万 29. 1 以上の結果から、酸によって: pHをコントロールしながら共重合体の過酸化水素処理を行うと、共重合体の純度は向上し、溶融時の黄変は抑えられたものの、共重合体の分子量が大幅に低下することが判明した。

(実施例 4)

上記と同様な処理を行って得られた分子量 80万、 3HHモル分率 5%、純度 > 99 %の P H B Hの懸濁液 50 m 1に対して、実施例 1と同様の処理を行った _c ただしラボコントローラ一は p H 8に設定した。この結果を表 6に示す。 (比較例 3 )

過酸化水素を添加しないこと以外は、実施例 4と同様の処理を行った。この結果を表 6に示す。表 6 サンプル純度 (%) 分子量 Y I値

処理刖 > 9 9 8 0万 1 5、 9

実施例 4

> 9 9 8 0万 8. 3

(アル力リ +過酸化水素処 a)

比較例 3

> 9 9 6 3万 1 4 . 1

(アルカリ加熱処理のみ）

表 6の結果から、アル力リを添加して p Hをコントロールしながら過酸化水素処理を行うことで、共重合体の分子量の低下を防止し、共重合体の溶融時の黄変を抑えられるが、過酸化処理を行わずにアル力リ添加による p Hコント口一のみを行った場合は、分子量は低下し、溶融時の黄変もほとんど抑制できないことがわかった。 (参考例 1 )

ポリ一 3—ヒドロキシプチレート [アルドリツチ社製、純度 9 5 %、分子量 6 5万] の 1 0 %水性懸濁液に 3 0 %過酸化水素水を過酸化水素濃度がポリマー重量に対して 5重量⁰ /₀ (懸濁液重量に対して 0. 3 7 5重量％) となるように添加した。この水性懸濁液の ρ Ηを調整せずに、 7 0 °Cで 3時間加熱攪拌した。次いでこの懸濁液を遠心分離によって 2回水冼し、さらにメタノールで 2回洗浄を行つたあと、乾燥して粉体を得た。この粉体の結果を表 7に示す。 W

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表 7

サンプ /レ始発 p H 終了 p H 純度 (%) 分子量 Y I値過酸化水素処理前 9 5 6 5万 2 6 . 5 過酸化水素処理後 6 . 9 0 5 . 4 9 7 6 5万 1 5. 2 単独重合体に対して ϊ> Ηの調整をせずに過酸化水素処理を行っても、分子量の低下はみられず、溶融時の黄変も抑えられることが分かった。

(参考例 2 )

Ρ ΗΒ [純度 9 5 %、分子量 6 5万:] の 1 0 %水性懸濁液の D Ηを希塩酸で ρ Η 5にし、 7 0 °Cで保温した。該懸濁液に 3 0 %過酸化水素水を過酸化水素濃度がポリマー重量に対して 5重量％ (懸濁液重量に対して 0. 3 7 5重量％) となるように添加して、 3時間攪拌を行った。次いでこの懸濁液を遠心分離によって 2回水洗し、さらにメタノールで 2回洗浄を行ったあと乾燥して粉体の P HBを得た。この粉体の分子量は 6 5万であり、過酸化水素処理前の分子量を保持していた。 P HBは酸を添加して過酸化水素処理を行っても分子量を保持していることがわかった。

参考例 1及ぴ 2の結果から、単独重合体の場合には過酸化水素処理の際にアルカリで p Hをコントロールしなくとも分子量が低下しないことがわかった。すなわち、過酸化水素処理の際に分子量が低下するのは共重合体に特異な現象であり、本発明の精製方法によればこの共重合体の分子量低下を防止することができる。産業上の利用可能性

本発明の 3—ヒドロキシアル力ン酸共重合体の精製方法によれば、きわめて簡便な方法によって、 3—ヒドロキシアルカン酸共重合体の過酸化水素処理時の深刻な分子量の低下を防止し、かつ、高純度で溶融時の黄変や異臭のない 3—ヒド口キシアル力ン酸共重合体を高収率で得ることができる。

この方法により得られる極めて高純度な 3—ヒドロキシアルカン酸共重合体は幅広い用途に用いることができ、工業的に非常に有用である。

Claims

請求の範囲

1 . 微生物が産生した 3—ヒドロキシアル力ン酸共重合体を精製する方法であつて、 .

微生物から分離した 3—ヒドロキシアル力ン酸共重合体を含む水性懸濁液にアル力リを連続的又は断続的に添加することによって、前記水性懸濁液の ί> Hをコントロールしながら過酸化水素による処理を行うことを特徴とする精製方法。

2 . 水性懸濁液の ρ Ηを 7〜 1 3の間にコントロールすることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の精製方法。

3 . 水性懸濁液中の過酸化水素の濃度が 0 . 0 1重量％〜1重量％の範囲であることを特徴とする請求の範囲第 1又は 2項記載の精製方法。

4 . 3—ヒドロキシアル力ン酸共重合体が、 D— 3—ヒドロキシへキサノエ一トと他の D— 3—ヒドロキシァノレ力ン酸との共重合体である請求の範囲第 1〜 3 項のいずれかに記載の精製方法。

5 . 3—ヒドロキシアル力ン酸共重合体が、 3—ヒドロキシプロピオネ^"ト、 3—ヒドロキシプチレート、 3—ヒドロキシパレレート、 3—ヒド、ロキシへキサノエ一ト、 3—ヒドロキシヘプタノエート及ぴ 3—ヒドロキシォクタノエ一トからなる群より選択される 2種以上のモノマーから構成される共重合体である請求の範囲第 1〜 3項のいずれかに記載の精製方法。

6 . 3—ヒドロキシアルカン酸共重合体が、 D— 3—ヒドロキシへキサノエ一トと D— 3—ヒドロキシプチレートとの 2成分共重合体、または、 D—3—ヒドロキシへキサノエ一トと D— 3—ヒドロキシプチレートと D— 3—ヒドロキシバレレートとの 3成分共重合体である請求の範囲第 1〜 3項のいずれかに記載の精製方法。

7 . 3—ヒドロキシアルカン酸共重合体を産生する微生物が、ァエロモナス属に属する微生物である請求の範囲第 1〜 6項のいずれかに記載の精製方法。

8 . 3—ヒドロキシアルカン酸共重合体を産生する微生物が、ァエロモナス ' キヤビエまたはァエロモナス ·ハイドロフイラである請求の範囲第 7項記載の精製方法。

9 . 3—ヒドロキシアルカン酸共重合体を産生する微生物が、ァエロモナス · キヤビエ由来の 3—ヒドロキシアル力ン酸共重合体合成酵素群遺伝子を導入された菌株である請求の範囲第 1〜 6項のいずれかに記載の精製方法。

1 0 . 3—ヒドロキシアル力ン酸共重合体の水性懸濁液が、 3—ヒドロキシァルカン酸共重合体含有菌体の懸濁液を攪拌しつつ、物理的破砕と同時にアル力リを添加することによって 3—ヒドロキシアルカン酸共重合体以外の菌体構成物質の全てまたは一部を可溶化して 3—ヒドロキシアルカン酸共重合体を分離し、 3 ―ヒドロキシアル力ン酸共重合体を水に懸濁させたものである請求の範囲第 1〜 9項のいずれかに記載の精製方法。