JPH0779787A

JPH0779787A - ポリヒドロキシアルカノエートの分離精製法

Info

Publication number: JPH0779787A
Application number: JP5227070A
Authority: JP
Inventors: Osamu Yamamoto; 修山本; Yoshiaki Miyata; 喜明宮田; Shinichi Yanagi; 慎一柳
Original assignee: Denki Kagaku Kogyo KK
Current assignee: Denka Co Ltd
Priority date: 1993-09-13
Filing date: 1993-09-13
Publication date: 1995-03-28

Abstract

(57)【要約】【構成】ポリヒドロキシアルカノエートを含有する微
生物よりポリヒドロキシアルカノエートを分離精製する
際に、界面活性剤を用いてポリヒドロキシアルカノエー
トが実質的にアモルファス状態を保持することを特徴と
するポリヒドロキシアルカノエートの分離精製法。【効果】本発明の方法によれば、ポリヒドロキシアル
カノエートの結晶化を抑制して分離精製することができ
るので、コーティング材料としてより適したものを得る
ことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ポリヒドロキシアルカ
ノエートを含有する微生物より、ポリヒドロキシアルカ
ノエートを分離精製する際に、界面活性剤を用いて実質
的にアモルファス状態を保持してポリヒドロキシアルカ
ノエートを分離精製する方法に関する。ポリヒドロキシ
アルカノエートは疎水性で優れた生分解性を有し、特に
結晶化が抑制されたポリヒドロキシアルカノエートはポ
リマーコーティング材料として有用である。

【０００２】

【従来の技術】ポリヒドロキシアルカノエートは、数多
くの微生物のエネルギー貯蔵物質として直径約１ミクロ
ンのグラニュラとして蓄積される。ポリヒドロキシアル
カノエートとしては、３−ヒドロキシブチリックアシッ
ドのホモポリマーであるポリヒドロキブチレートや、３
−ヒドロキシブチレートと３−ヒドロキシバリレートの
コポリマー、３−ヒドロキシブチレートと４−ヒドロキ
シ酪酸のコポリマー等非常に多くのコポリマーが知られ
ている。微生物は、炭素源の豊富な環境でポリヒドロキ
シアルカノエートを生合成し、資化する炭素源がなくな
ると、ポリヒドロキシアルカノエートを分解しエネルギ
ー源とする。微生物菌体中ではポリヒドロキシアルカノ
エートはアモルファス状態で存在し、精製工程での化学
的刺激や物理的刺激により結晶化する。微生物によるポ
リヒドロキシアルカノエートの製造は、微生物を窒素制
限下、酸素制限下、もしくは燐制限下で培養し、菌体内
にグラニュラとして蓄積させ、菌体からポリヒドロキシ
アルカノエートを分離して行う。

【０００３】現在までに提案されているポリヒドロキシ
アルカノエートの分離精製方法は、ポリヒドロキシアル
カノエートが可溶である溶剤によって菌体からポリヒド
ロキシアルカノエートを抽出し、その溶液を細胞残渣か
ら分離する方法と、ポリマー以外の細胞物質を酵素処理
などにより除去する方法がある。溶剤による精製方法に
おいて、抽出溶剤はクロロホルム、塩化メチレン（特開
昭５７−６５１９３号）、ピリジン（米国特許第３０４
４９４２号）、ジオキサン（特開昭６３−１９８９９１
号）等が用いられている。しかし、溶剤による抽出方法
では、溶剤が仮に再利用のために回収されたとしても回
収率には限界がある。また、単に溶剤抽出だけでは脂質
等の不純物も含まれていることが多く、ポリヒドロキシ
アルカノエートが可溶でない溶剤での予備抽出工程や、
選択分離工程などが必要となりコスト高であり、実用性
がない。

【０００４】一方、ポリマー以外の細胞物質を酵素など
により除去する方法は、J.Gen.Microbiology 19(1958)
198-209 には、微生物細胞を次亜塩素酸ナトリウムのア
ルカリ性溶液で処理することにより、ポリマーを分離精
製する方法が考案されている。また、J.Bacteriology 8
8(1964)60-71では、微生物細胞懸濁液にリゾチームを添
加し、超音波にかけ、グリセロール上に載せ、比重の違
いによりポリマーを遠心分離により精製する方法が考案
されている。特開昭６０−１４５０９７号では、熱処理
による核酸関係物質の低分子化、アルカラーゼ等のタン
パク質分解酵素による消化、硫酸ドデシルナトリウム等
の界面活性剤による消化法等の組み合わせによる方法を
考案している。また、J.A.Ramsay らは、界面活性剤と
希薄な次亜塩素酸ナトリウムのアルカリ性溶液で処理す
る方法を考案している。しかし、これらの方法では、高
純度でかつアモルファス状態を保持して精製することは
極めて困難である。

【０００５】また、この様にして分離精製したポリヒド
ロキシアルカノエート、特にポリヒドロキシブチレート
は、破壊伸びが５％と極めて小さく堅くて脆い材料であ
る。また、ポリヒドロキシブチレートは熱可塑性である
が、加工温度と分解温度が近接しており、非常に熱安定
性が悪い。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】ポリヒドロキシアルカ
ノエートは菌体内では、アモルファス状態で、分子運動
性の良い状態で存在する。しかし、ポリヒドロキシアル
カノエートを菌体から分離精製すると、分離精製工程で
の遠心分離操作や化学的な精製操作、または、乾燥によ
り結晶化する。従来から用いられている分離精製法で
は、高純度でかつアモルファス状態を保持してポリヒド
ロキシアルカノエートを精製することは困難である。ポ
リマー以外の細胞物質を酵素処理などにより除去する方
法において、ポリヒドロキシアルカノエートは、ラテッ
クス状に調製されるが、ポリヒドロキシアルカノエート
は大部分結晶化している。

【０００７】そこで、本発明者らは、結晶化指数を抑制
した状態、即ち、実質的にアモルファスを保持した状態
でポリヒドロキシアルカノエートを菌体より分離する方
法について鋭意検討を重ねた結果、ポリマー以外の細胞
物質を酵素処理などにより除去する方法において、精製
工程にある条件の界面活性剤を用いることにより、ポリ
ヒドロキシアルカノエートの結晶化を抑制して精製でき
ることを見いだし本発明を完成するに至った。

【０００８】

【問題点を解決するための手段】すなわち、本発明は、
（１）ポリヒドロキシアルカノエートを含有する微生物
よりポリヒドロキシアルカノエートを分離精製する際
に、界面活性剤を用いてポリヒドロキシアルカノエート
が実質的にアモルファス状態を保持することを特徴とす
るポリヒドロキシアルカノエートの分離精製法、（２）
用いる界面活性剤は、疎水親水性バランス（ＨＬＢ）が
２５以下であり、濃度が臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の１
０倍以上で、酵素反応を阻害しない濃度である（１）記
載の方法である。

【０００９】以下、さらに本発明について詳しく説明す
る。本発明に用いるポリヒドロキシアルカノエート（Ｐ
ＨＡ）とは、代表的にはヒドロキシアルカノエートモノ
マーにおける炭素数３〜１２程度のものであり、ポリヒ
ドロキシアルカノエートのホモポリマーのみでなく、広
くその共重合体、例えば３−ヒドロキシブチレートと炭
素数３〜１２程度のその他のヒドロキシアルカノエート
との共重合体などをいうことができる。しかし、これら
に限定することなく、本発明の目的の範囲内であれば広
く当業者に知られたものを含んでいてよく、例えば、ポ
リ−３−ヒドロキシプロピオネート、ポリ−３−ヒドロ
キシブチレート、ポリ−３−ヒドロキシバリレートおよ
びポリ−３−ヒドロキシオクタノエートなど、ポリ−４
−ヒドロキシブチレートなどが好ましく、特にポリ−３
−ヒドロキシブチレートが好ましい。

【００１０】界面活性剤の疎水親水性バランス（以下、
ＨＬＢという）は、界面活性剤が果たす効果を表す指標
の一つである。界面活性剤の分子内にもつ親水基と疎水
基のつりあいであり、ＨＬＢ値が大きいほど親水性が高
くなる。本発明に用いる界面活性剤は、ＨＬＢが２５以
下であり、好ましくは、２０以下の界面活性剤である。

【００１１】界面活性剤がポリヒドロキシアルカノエー
トグラニュラの表面に吸着し、保護層として働き、ポリ
ヒドロキシアルカノエートの結晶化を抑制するからであ
る。ポリヒドロキシアルカノエートグラニュラの表面に
はＨＬＢの低い界面活性剤ほど吸着しやすい。しかし、
ＨＬＢが２５を越えると親水性が強すぎて結晶化抑制効
果は非常に弱くなる。

【００１２】界面活性剤として、アニオン系、ノニオン
系、もしくはカチオン系でも良く、オレイン酸カリウム
（ＨＬＢ２０）、オレイン酸ナトリウム（ＨＬＢ１
８）、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル
類のＴｗｅｅｎ２０（ＨＬＢ１６．７）、Ｔｗｅｅｎ４
０（ＨＬＢ１６．９）、Ｔｗｅｅｎ６０（ＨＬＢ１４．
９）Ｔｅｅｎ８０（ＨＬＢ１５）、モノラウリン酸エチ
レン・グリコール（４００）エステル（ＨＬＢ１３．
１）等が挙げられるが、これらに制限されるものではな
い。

【００１３】そして、界面活性剤の濃度は、臨界ミセル
濃度（以下、ＣＭＣという）の１０倍以上で、酵素反応
を阻害しない濃度であり、好ましくは、ＣＭＣの２０倍
〜１００倍である。酵素反応を阻害しない濃度とは、具
体的には、酵素が界面活性剤によって変性しない濃度の
ことをいう。

【００１４】ＣＭＣとは、界面活性剤は水溶液中で低濃
度では分子状に単量体として存在するが、ある濃度以上
になると分子が急速に会合し、熱力学的に安定な集合体
いわゆるミセルを形成する。この会合を起こす濃度をＣ
ＭＣという。界面活性剤の濃度が、ＣＭＣ未満である
と、ポリヒドロキシアルカノエートの十分な結晶化抑制
効果が得られないので好ましくない。

【００１５】本発明でポリヒドロキシアルカノエート
が、実質的にアモルファス状態を保持することは、具体
的には、ポリヒドロキシアルカノエートを含有する微生
物よりポリヒドロキシアルカノエートを分離精製する際
に、ポリヒドロキシアルカノエートの結晶化指数を５％
以下に保持することである。実質的にアモルファス状態
を保持しているポリヒドロキシアルカノエートは、コー
ティング用材料として特に好ましい。

【００１６】

【実施例】以下、本発明を実施例により更に具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００１７】実施例１〜２、比較例１〜２ Alcaligenes eutrophous ATCC 17699 をフルクトースを
炭素源として窒素制限下で培養し、ポリヒドロキシブチ
レート含有率約６５％の菌体懸濁液を得た。その菌体懸
濁液を限外濾過装置によりＥＤＴＡ入り５０ｍＭトリス
塩酸緩衝液に置換した。このポリヒドロキシブチレート
含有菌体懸濁液（１６ｇ／ｌ）にＨＬＢ１８、ＣＭＣ
０．０３(w/v) ％のオレイン酸ナトリウムを０．１％も
しくは１．０％添加し、表１に示したｐＨに調製後、オ
ートクレーブ内で加圧下１２０℃、２０分間熱処理を行
い、核酸等の粘ちょう物質の低分子化を行った。冷却後
リゾチームを０．０５％添加し、３０℃にて１時間イン
キュベートして、細胞壁成分の可溶化を行った。反応
後、懸濁液を遠心分離機にかけ、固形物を回収した。再
び、オレイン酸ナトリウム０．１％もしくは１．０％入
りの５０ｍＭトリス塩酸緩衝液に再懸濁し（濃度１６ｇ
／ｌ）、タンパク質分解酵素のプロナーゼを０．１％添
加し、４０℃にて２時間反応させた。

【００１８】反応後、遠心分離にて精製されたポリヒド
ロキシブチレートを回収し、Ｘ線結晶回折にて結晶化度
を評価した。また、回収されたポリヒドロキシブチレー
トを１００℃にて５時間真空乾燥し、ガスクロマトグラ
フィーによりポリヒドロキシブチレート純度と吸着オレ
イン酸ナトリウム量を測定した。結果を表１に示す。本
発明の効果は、精製されたポリヒドロキシブチレートの
結晶化指数とポリヒドロキシブチレート純度で評価でき
る。

【００１９】結晶化抑制のための界面活性剤を加えてい
ない無添加系では、精製したポリヒドロキシブチレート
は遠心回収等の影響により、高い結晶化指数を示した。
しかし、オレイン酸ナトリウム０．１％添加では結晶化
抑制の効果は低いが、オレイン酸ナトリウム１．０％添
加により、顕著に結晶化が抑制されている。用いた界面
活性剤のオレイン酸ナトリウムがポリヒドロキシブチレ
ートグラニュラの表面に吸着し、ポリヒドロキシブチレ
ートの結晶化を抑制している。

【００２０】

【表１】

【００２１】実施例３〜４表１記載のＨＬＢ２０、ＣＭＣ０．０２(w/v) ％のオレ
イン酸カリウムを用いた以外は、実施例１と同様に実施
した。結果を表１に示す。

【００２２】比較例３実施例１と同様の精製方法において、ＨＬＢ４０、ＣＭ
Ｃ０．２(w/v) ％の硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）
を添加して精製した。結果を表１に示す。ＳＤＳは、ほ
とんど表面に吸着していないと考えられる。この違いは
オレイン酸ＮａとＳＤＳのＨＬＢ値の違いによるもので
ある。

【００２３】実施例５〜８、比較例４〜５実施例１と同様にオレイン酸ナトリウムが存在する系
で、精製方法を変えて行った。乾燥菌体１０ｇ／ｌのト
リス塩酸緩衝液に、TritonX-100 濃度１．０％になるよ
うに添加し、ｐＨ１３に調製後、室温２０分間往復振と
う行った。反応後、遠心分離にて回収した。洗浄後、ト
リス塩酸緩衝液に再懸濁し、プロナーゼ濃度０．１％に
なるように添加し、４０℃、１時間往復振とうした。こ
れに表２記載のオレイン酸ナトリウム又はオレイン酸カ
リウムを添加した。

【００２４】反応後、遠心分離にて精製されたポリヒド
ロキシブチレートを回収し、Ｘ線結晶回折にて結晶化指
数を測定した。また、回収されたポリヒドロキシブチレ
ートを１００℃にて５時間真空乾燥し、ＦＴ−ＩＲによ
り残存タンパク質量を測定した。結果を表２に示す。

【００２５】これらの系で精製したポリヒドロキシブチ
レートの残存タンパク質量は、３〜４％であった。不純
物はタンパク質が大部分であるので、精製度は表１の精
製法での場合と同レベルである。この場合もオレイン酸
ナトリウムの添加により結晶化が抑制されているが、そ
の効果は精製方法により異なる。

【００２６】比較例６実施例５と同様の精製方法において、ＨＬＢ４０、ＣＭ
Ｃ０．２(w/v) ％の硫酸ドデシルナトリウム（ＳＤＳ）
を添加して精製した。結果を表２に示す。残存タンパク
質量は、変わらないが、結晶化抑制の効果が低い。

【００２７】

【表２】

【００２８】測定方法（１）ポリヒドロキシブチレートの純度、吸着オレイン
酸Ｎａ量測定方法菌体内、もしくは精製したポリヒドロキシブチレートの
純度の測定方法は、ガスクロマトグラフィーにて行っ
た。操作方法は、乾燥菌体もしくは乾燥ポリヒドロキシ
ブチレート１０ｍｇから２０ｍｇを秤量し、これをスク
リューキャップ付き試験管に入れた。クロロホルム２ｍ
ｌと、内部標準試薬の安息香酸を０．５％含む３％硫酸
入りメタノール溶液２ｍｌを加え、栓をして１００℃で
４時間反応させた。３０分間室温で放置し、室温にまで
冷却後、水１ｍｌを加えて１０分間激しく振とうした。
静置し、２層に分離した下層の有機層をガスクロマトグ
ラフィーにより分析した。安息香酸メチルのピーク面積
とヒドロキシ酪酸メチルのピーク面積の比からポリヒド
ロキシブチレート純度を、安息香酸メチルのピーク面積
とオレイン酸メチルの面積の比から吸着オレイン酸Ｎａ
量をそれぞれ求めた。ガスクロマトグラフィーは、２ｍ
のガラスカラムで、充填剤としてReoplex400chromosorb
GAW-DMCS 60/80メッシュを使用した。分析温度は、１
１０℃にて１分間保持後、２２０℃まで毎分１５℃の昇
温で行い、２２０℃にて５分間保持した。検量線は、ポ
リヒドロキシブチレート及びオレイン酸メチルの標品に
より作製した。

【００２９】（２）残存タンパク質の定量方法乾燥した精製ポリヒドロキシブチレートグラニュラの
窒素含量を、柳本ＣＨＮコーダーにて測定した。一般的
にタンパク質の窒素含量は約１６％であり、精製ポリヒ
ドロキシブチレートの窒素含量を測定することにより残
存タンパク質量を求めた。ＦＴ−ＩＲによってもタンパク質量を測定した。高度
に精製したポリヒドロキシブチレートに、リゾチームを
添加し、リゾチームの１６５０cm^-1のＣ＝Ｏ伸縮振動と
ポリヒドロキシブチレートのＣ＝Ｏ伸縮振動吸収の面積
比により検量線を作製した。その検量線に基づき、精製
ポリヒドロキシブチレートの残存タンパク質量を定量し
た。

【００３０】（３）ポリヒドロキシブチレートの結晶化
度測定方法ポリヒドロキシブチレートグラニュラの遠心分離したペ
レット状態（水分約６０％）で、Ｘ線結晶回折用のガラ
スの試料台に載せ、フィルムをかぶせ乾燥を防いで測定
した。マックサイエンス MXP-3 にてＸ線回折測定を行
い、結晶ピークとアモルファス部分の割合を数値化し
た。０％は完全にアモルファス状態を示す。一度完全に
水分を除いたポリヒドロキシブチレートパウダーを、条
件を合わせるために水分６０％にて測定すると、結晶化
指数は４０％となる。

【００３１】

【発明の効果】本発明の方法によれば、ポリヒドロキシ
アルカノエートを含有する微生物よりポリヒドロキシア
ルカノエートを分離精製する際に、ポリヒドロキシアル
カノエートの結晶化を抑制して分離精製することができ
るので、コーティング材料としてより適したものを得る
ことができる。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ポリヒドロキシアルカノエートを含有す
る微生物よりポリヒドロキシアルカノエートを分離精製
する際に、界面活性剤を用いてポリヒドロキシアルカノ
エートが実質的にアモルファス状態を保持することを特
徴とするポリヒドロキシアルカノエートの分離精製法。
【請求項２】用いる界面活性剤は、疎水親水性バラン
ス（ＨＬＢ）が２５以下であり、濃度が臨界ミセル濃度
（ＣＭＣ）の１０倍以上で、酵素反応を阻害しない濃度
である請求項１記載の方法。