TWI792663B - 聚羥基烷酸酯生產及萃取方法 - Google Patents

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本發明提供一種聚羥基烷酸酯生產及萃取方法，其包含下列步驟：(a) 提供聚羥基烷酸酯生產菌株，該聚羥基烷酸酯生產菌株具有代謝月桂酸的能力；(b)將該聚羥基烷酸酯生產菌株加入培養基中，該培養基中含有氮源和碳源，使該聚羥基烷酸酯生產菌株利用該培養基進行發酵產生聚羥基烷酸酯；(c)破壞該聚羥基烷酸酯生產菌株的細胞膜以得到含有聚羥基烷酸酯的生質物，以月桂酸銨萃取該生質物中的聚羥基烷酸酯；及(d)回收該月桂酸銨並將該月桂酸銨加入該培養基中。藉由如上所述之聚羥基烷酸酯生產及萃取方法，可以降低PHA生產製程中所造成的環境污染。

Description

聚羥基烷酸酯生產及萃取方法
本發明係關於一種聚羥基烷酸酯生產及萃取方法，尤其是一種使用低污染且可回收之溶劑來萃取聚羥基烷酸酯的聚羥基烷酸酯生產及萃取方法。
聚羥基烷酸酯(polyhydroxyalkanoates,PHA)為一種可生物分解塑膠的類型，其具有與傳統石化塑膠相似的材料性質，因此可作為傳統石化塑膠(例如，聚乙烯或聚丙烯)的替代品。由於PHA塑膠在海洋環境中可被海洋微生物分解，由此可以減少傳統石化塑膠對海洋生態環境造成污染的問題。
然而，在傳統的PHA發酵生產製程中，一般是使用例如氯仿等化學溶劑來萃取出PHA。而前述氯仿等化學溶劑不僅本身具有毒性，並且也會產生有毒的揮發性氣體，這會對環境造成嚴重傷害。因此，如何開發出一種使用低污染溶劑來萃取聚羥基烷酸酯的PHA生產製程，藉此降低PHA生產製程中所造成的環境污染，仍為有待解決的問題。
本發明之目的即針對上述問題，提供一種聚羥基烷酸酯生產及萃取方法，其包含下列步驟：(a)提供聚羥基烷酸酯生產菌株，該聚羥基烷酸酯生產菌株具有代謝月桂酸的能力；(b)將該聚羥基烷酸酯生產菌株加入培養基中，該培養基中含有氮源和碳源，使該聚羥基烷酸酯生產菌株利用該培養基進行發酵產生聚羥基烷酸酯；(c)破壞該聚羥基烷酸酯生產菌株的細胞膜以得到含有聚羥基烷酸酯的生質物，以月桂酸銨萃取該生質物中的聚羥基烷酸酯；及(d)回收該月桂酸銨並將該月桂酸銨加入該培養基中。
如上所述之方法，該聚羥基烷酸酯生產菌株為叢毛單胞菌屬菌株。
如上所述之方法，在(b)步驟中，該培養基中含有月桂酸銨。
如上所述之方法，在(c)步驟中，該生質物與月桂酸銨的重量比為1：2至1：5。
如上所述之方法，在(d)步驟中，在該月桂酸銨加入該培養基中後，將該培養基的pH值調整至pH 5-7。
藉由如上所述之聚羥基烷酸酯生產及萃取方法，提供一種使用低污染溶劑來萃取聚羥基烷酸酯的PHA生產製程，藉此可以降低PHA生產製程中所造成的環境污染。
圖1示出本發明實施例1所使用菌株在不同碳源條件下生長的OD值。
圖2示出本發明實施例2所使用菌株分別在以月桂酸和葡萄糖作為碳源的條件下生長的比較結果。
圖3示出本發明實施例3所使用菌株分別在以未過濾月桂酸銨和已過濾月桂酸銨作為碳源的條件下生長的比較結果。
圖4示出本發明實施例4之聚羥基烷酸酯生產及萃取方法所生產PHA的氫核磁共振光譜圖。
圖5示出本發明實施例1之聚羥基烷酸酯生產及萃取方法的流程圖。
為充分瞭解本發明之目的、特徵及功效，茲藉由下述具體之實施例，並配合所附之圖式，對本發明做一詳細說明，說明如後：
實施例1之聚羥基烷酸酯生產及萃取方法
參照圖5，本實施例1中之聚羥基烷酸酯生產及萃取方法係概述如下。首先，提供聚羥基烷酸酯生產菌株，該聚羥基烷酸酯生產菌株具有代謝月桂酸的能力。接著，將該聚羥基烷酸酯生產菌株加入培養基中，該培養基中含有氮源和碳源，使該聚羥基烷酸酯生產菌株利用該培養基進行發酵產生聚羥基烷酸酯。然後，破壞該聚羥基烷酸酯生產菌株的細胞膜以得到含有聚羥基烷酸酯的生質物(此步驟在後續段落中稱為破菌)，以月桂酸銨萃取該生質物中的聚羥基烷酸酯。最後，回收該月桂酸銨並將該月桂酸銨加入該培養基中。本實施例1之聚羥基烷酸酯生產及萃取方法的具體製程如下列所述。
聚羥基烷酸酯生產菌株的選用
本實施例1中所使用的聚羥基烷酸酯生產菌株為睾丸酮叢毛單胞菌(Comamonas testosterone)，其為叢毛單胞菌屬菌株(Gordonia sp.)的一種。上述睾丸酮叢毛單胞菌是透過美國菌種中心(American Type Culture Collection,ATCC)商購獲得。
在本實施例1中，係選用睾丸酮叢毛單胞菌來發酵生產PHA，但在其他實施例中，亦可選用其他可代謝月桂酸銨且可生產PHA的菌株，例如叢毛單胞菌屬菌株或水中產氣單胞菌屬菌株(Aeromonas hydrophila)。在先前文獻中已揭示水中產氣單胞菌屬菌株亦可代謝月桂酸銨且可生產PHA(Lee S.H.,Oh D.H.,Ahn W.S.,Lee Y.,Choi J.,and Lee S.Y.Production of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate)by high-cell-density cultivation of Aeromonas hydrophila.Biotechnol.Bioeng.67：240-244.(2000))。
菌株在不同碳源條件下生長的OD值之比較實驗
首先，準備四個150mL的錐形瓶，在各個錐形瓶中分別倒入50mL的NB培養液，NB培養液中含有濃度為3g/L的牛肉萃取物(beef extract)和濃度為5g/L的蛋白腖，牛肉萃取物和蛋白腖是作為NB培養液的氮源。
接著，在上述各個錐形瓶的NB培養液中分別加入500μl的睾丸酮叢毛單胞菌菌液，接種完成後，上述四組接種有睾丸酮叢毛單胞菌的NB培養液分別命名為第一組至第四組，第一組至第四組NB培養液中的菌株OD600值以分光光度計測量落在0.04-0.39此範圍(後續段落中所提到的OD600值皆以實驗室通用的分光光度計測得)。第一組的NB培養液中加入在NB培養液中的最終濃度為2%之葡萄糖作為碳源；第二組的NB培養液中加入在NB培養液中的最終濃度為2%之木糖作為碳源；第三組的NB培養液中加入在NB培養液中的最終濃度 為2%之甘油作為碳源；第四組的NB培養液中加入在NB培養液中的最終濃度為2%之月桂酸作為碳源。
上述四組的NB培養液加入碳源後，在30℃環境中以150rpm的轉速以搖瓶方式發酵培養48小時。發酵培養完成後，測量第一組至第四組中發酵液的OD600值。前述菌株在不同碳源條件下生長的OD值結果如圖1及下列表1所示，第四組係利用月桂酸作為碳源進行發酵，第四組所測得之OD600值與其他組別一樣皆大於1。由上述實驗結果可知，月桂酸與上述三種其他碳源一樣，皆可作為碳源來培養睾丸酮叢毛單胞菌。
Figure 110141449-A0305-02-0007-1
破菌及萃取PHA流程
接著，將上述第一組至第四組的發酵液進行菌株細胞膜的破壞(以下簡稱破菌)並從中萃取出PHA。破菌及萃取PHA的流程如下所述。
首先，將第一組至第四組的發酵液以4000rpm(可視需求調整為4000-6000rpm)的轉速離心15分鐘(可視需求調整為15-30分鐘)的方式進行固液分離，去除上清液，藉此取得細菌沉澱物。接著，取出第一組至第四組的細菌沉澱物，針對各組細菌沉澱物的破菌流程為，每100mg(可視需求調整為50-100mg)的細菌沉澱物與體積為5mL且濃度為400ppm(可視需求調整為 100-400ppm)的二氧化氯混合形成混合液，在40℃(可視需求調整為25-60℃)環境中搖晃24小時進行破菌。破菌完成後，將混合液以4000rpm(可視需求調整為4000-6000rpm)的轉速離心15分鐘(可視需求調整為15-30分鐘)的方式進行固液分離，保留破菌後的生質物，去除上清液。
但在其他實施例中，仍可選擇其他方式進行破菌，例如，利用珠磨法或高壓法等物理性方法進行破菌，或是利用溶劑或酵素等化學方式進行破菌，而不以本實施例1為限。
第一組至第四組中的細菌沉澱物以前述方法破菌完成後，以月桂酸銨溶液萃取細菌沉澱物中的PHA，具體方式如下所述。月桂酸銨可溶解菌株中非聚合物型態的細胞物質(non-polymeric cell material,NPCM)，並且可用來萃取破菌生質物中的PHA。
首先，配置月桂酸銨溶液，將100mg的月桂酸加入500mL的1M NH4OH溶液中，得到0.5mmol之月桂酸銨。接著，將第一組至第四組中的破菌生質物溶於前述月桂酸銨溶液中並均勻混合形成生質物/月桂酸銨混合物，混合比例為破菌生質物(其重量以生質物乾重計算，大約為50mg)與月桂酸銨溶液的重量比為1：4(可視需求調整為1：2至1：5)。第一組至第四組的生質物/月桂酸銨混合物在反應器中以75℃(可視需求調整為70-80℃，並且可基於不同的操作環境及儀器條件，調整萃取反應溫度，而不以本實施例1所示數值為限)的條件萃取4小時(可視需求調整為3-6小時，並且可基於不同的操作環境及儀器條件，調整萃取反應時間，而不以本實施例1所示數值為限)，藉此萃取出PHA。進行四小時的萃取反應之後，將生質物/月桂酸銨混合物以4000rpm的轉速離心15分鐘進行固液分離，得到上清液與沉澱的白色固體，此白色固體即為 PHA。透過上述離心過程，PHA主要形成為沉澱的白色固體，至於菌株中其他非聚合物型態的細胞物質(以下簡稱NPCM)則溶於上清液中，此上清液即為含有月桂酸銨及NPCM的廢液。將前述含有月桂酸銨及NPCM的廢液進行回收，並以酸性溶液(例如鹽酸、硝酸等酸性溶液)將回收廢液的pH值由大約pH 10調整為適合菌株生長的酸鹼性(pH 5-pH 7)，此回收廢液可以再饋送到菌株的培養液中作為後續發酵製程中的碳源來使用。
實施例2-睾丸酮叢毛單胞菌在月桂酸銨和葡萄作為碳源的條件下生長的比較實驗
首先，準備三個150mL的錐形瓶，在各個錐形瓶中分別倒入50mL的NB培養液，在此所用之NB培養液即實施例1中的NB培養液。
接著，在上述各個錐形瓶的NB培養液中分別加入500μl的睾丸酮叢毛單胞菌菌液，接種完成後，上述三組接種有睾丸酮叢毛單胞菌的NB培養液分別命名為第一組至第三組，第一組至第三組NB培養液中的菌株OD600值以分光光度計測量大約落在0.04-0.39此範圍。第一組的NB培養液中不加入碳源；第二組的NB培養液中加入在NB培養液中的最終濃度為2%之葡萄糖作為碳源；第三組的NB培養液中加入月桂酸銨回收廢液(其中的月桂酸銨濃度為1M)作為碳源，在此所使用的回收廢液為將實施例1中的回收廢液以0.22μm過濾器進行過濾後所得之回收廢液。
上述三組的NB培養液接著在30℃環境中以150rpm的轉速以搖瓶方式發酵培養96小時。發酵培養完成後，測量第一組至第三組中發酵液的OD600值。前述菌株在不同生長環境條件下生長的OD值結果如圖2及下列表2所示，第一組至第三組中的菌株生長至24小時後，可發現到相較於添加葡萄糖為碳源 的菌株(第二組)，添加月桂酸銨廢液的菌株生長速度較快(第三組)，並且第三組的菌株OD600值於72小時達到最高峰。由上述實驗結果可知，月桂酸銨回收廢液可作為菌株生長的碳源。
Figure 110141449-A0305-02-0010-2
實施例3-菌株在未過濾的月桂酸銨和已過濾的月桂酸銨作為碳源的條件下生長之比較實驗
首先，準備兩個150mL的錐形瓶，在各個錐形瓶中分別倒入50mL的NB培養液，在此所用之NB培養液即實施例1中的NB培養液。
接著，在上述各個錐形瓶的NB培養液中分別加入500μl的睾丸酮叢毛單胞菌菌液，接種完成後，上述兩組接種有睾丸酮叢毛單胞菌的NB培養液分別命名為過濾組和未過濾組，過濾組和未過濾組的NB培養液中之菌株OD600值以分光光度計測量大約落在0.04-0.39此範圍。過濾組的NB培養液中加入將實施例1中的回收廢液以0.22μm過濾器進行過濾後所得之過濾後回收廢液(其中的月桂酸銨濃度為1M)，過濾後回收廢液可確保為無菌狀態；未過濾組的NB培養液中加入未經過濾處理之實施例1中的回收廢液(其中的月桂酸銨濃度為1M)。
上述兩組的NB培養液接著在30℃環境中以150rpm的轉速以搖瓶方式發酵培養72小時。發酵培養完成後，測量過濾組和未過濾組中發酵液的OD600值。過濾組和未過濾組的OD值結果如圖3及下列表3所示，月桂酸銨回收廢液有無進行過濾，對於睾丸酮叢毛單胞菌的生長並無明顯影響。由上述實驗結果可知，當以月桂酸銨回收廢液作為菌株生長的碳源時無須進行過濾而可直接添加使用，藉此可以減少使用濾材進行過濾處理的額外成本。
Figure 110141449-A0305-02-0011-3
實施例4-睾丸酮叢毛單胞菌所生產之PHA的氫核磁共振光譜分析與純度分析
在本實施例中係確認透過上述聚羥基烷酸酯生產及萃取方法所得到的產物確實為PHA，具體流程如下。
首先，準備一個150mL的錐形瓶，在該錐形瓶中倒入50mL的NB培養液，在此所用之NB培養液成分為採用實施例1中的NB培養液，但在NB培養液中加入最終濃度為2%的月桂酸銨。接著，在NB培養液中加入500μl的睾丸酮叢毛單胞菌菌液，接種完成後，發酵液在30℃環境中以150rpm的轉速以搖瓶方式發酵培養72小時。發酵培養完成後，將發酵液置於離心機中以4000rpm的轉速離心15分鐘，離心完成後得到大約100mg的菌體沉澱物。
然後，取上述菌體沉澱物進行破菌與萃取。先將菌體沉澱物溶於5mL的氯仿中進行破菌，並使菌體內的PHA溶解出來，接著，將上述菌體/氯仿混合液置於離心機中以4000rpm的轉速離心15分鐘，離心完成後，取下層有機相液體，將下層有機相液體烘乾得到白色固體，此時假定此白色固體中含有PHA。
最後，將上述白色固體進行純化並進行純度和氫核磁共振(NMR)光譜分析。純化方式具體如下。先進行第一次清洗，取100mg的上述白色固體並將其以30mL的去離子水震盪清洗後，將溶於去離子水的白色固體以轉速為4000rpm、離心15分鐘的條件進行離心分離，離心完成後，去掉上清液，保留經清洗過的白色固體。再進行第二次清洗，以30mL的去離子水震盪清洗前述白色固體，清洗後再次將溶於去離子水的白色固體以轉速為4000rpm、離心15分鐘的條件進行離心分離，離心完成後，去掉上清液，保留經清洗過的白色固體。最後進行第三次清洗，以30mL的95%乙醇震盪清洗前述白色固體，清洗後再次將溶於95%乙醇的白色固體以轉速為4000rpm、離心15分鐘的條件進行離心分離，離心完成後，去掉上清液，保留經清洗過的白色固體，如此完成清洗步驟。
取部分清洗完成後的白色固體溶於600μl的重氫氯仿中，以核磁共振氫譜分析儀(Varian Mercury Plus，由安捷倫公司製造)依據產品操作手冊進行NMR光譜分析，以確認上述白色固體是否為PHA。分析結果如圖4所示，由NMR圖譜中可以看出，在圖譜位置中0.833-0.9ppm、1.2-1.256ppm、2.4-2.6ppm及5.2-5.4ppm處觀察到PHA的特徵峰，由此可以確認上述白色固體即為PHA。另取部分清洗完成後的PHA固體進行冷凍乾燥處理，以氣相層析儀 (Agilent 7890A，由安捷倫公司製造)依據產品操作手冊分析所得PHA的純度，經氣相層析儀分析後，確認PHA純度為96.78%。
如上所述，藉由上述聚羥基烷酸酯生產及萃取方法，可以使用月桂酸銨此種低污染溶劑來萃取聚羥基烷酸酯，藉此降低PHA生產製程中所造成的環境污染，並且萃取完聚羥基烷酸酯之後的月桂酸銨回收廢液還可以直接添加於培養基中作為發酵料源，由於上述月桂酸銨回收廢液還可以回收再利用，減少了添加料源的成本，提供了上述聚羥基烷酸酯生產及萃取方法的進一步環保及成本效益。
本發明在上文中已以較佳實施例揭露，然熟習本項技術者應理解的是，該實施例僅用於描繪本發明，而不應解讀為限制本發明之範圍。應注意的是，舉凡與該實施例等效之變化與置換，均應設為涵蓋於本發明之範疇內。因此，本發明之保護範圍當以申請專利範圍所界定者為準。

Claims (5)

  1. 一種聚羥基烷酸酯生產及萃取方法，其包含下列步驟：(a)提供聚羥基烷酸酯生產菌株，該聚羥基烷酸酯生產菌株具有代謝月桂酸的能力；(b)將該聚羥基烷酸酯生產菌株加入培養基中，該培養基中含有氮源和碳源，使該聚羥基烷酸酯生產菌株利用該培養基進行發酵產生聚羥基烷酸酯；(c)破壞該聚羥基烷酸酯生產菌株的細胞膜以得到含有聚羥基烷酸酯的生質物，以月桂酸銨萃取該生質物中的聚羥基烷酸酯，該生質物與月桂酸銨的重量比為1：2至1：5；及(d)回收該月桂酸銨並將該月桂酸銨加入該培養基中。
  2. 如請求項1所述之方法，其中，該聚羥基烷酸酯生產菌株為叢毛單胞菌屬菌株。
  3. 如請求項2所述之方法，其中，在(b)步驟中，該培養基中含有月桂酸銨。
  4. 如請求項1所述之方法，其中，在(b)步驟中，該培養基中含有月桂酸銨。
  5. 如請求項1所述之方法，其中，在(d)步驟中，在該月桂酸銨加入該培養基中後，將該培養基的pH值調整至pH 5-7。
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