CN111893074A - 一种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌菌株及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌菌株及其用途,为赖氨酸芽孢杆菌属,命名为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌GZU‑Lys01,于2019年12月31日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC NO:M20191140。本发明纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis strain)GZU‑Lys01可以有效地解离煤矸石中的难溶性和/或不溶性的磷、钾、氮等成分,转变成有效磷、速效钾、水解氮等植物吸收的营养物质成分。特别是GZU‑Lys01能有效地使煤矸石中的难溶性磷和/或不溶性磷转变为有效磷,同时GZU‑Lys01也能有效地解离其它的含磷矿物,使用GZU‑Lys01制备煤矸石微生物肥料时,可适当掺杂其它的含磷矿物,增加制备微生物肥料的磷源。GZU‑Lys01菌株使煤矸石资源化再利用成为可能。

Description

一种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌菌株及其用途
技术领域
本发明涉及一种菌株及其应用,特别是一种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌菌株及其用途。
背景技术
我国是煤炭生产大国,煤炭在我国的能源结构中占据重要地位。在煤炭开采和洗选过程中产生的煤矸石,由于一直没有得到有效利用,已经成为了最大的工业固体废弃物。各煤炭产区基本上都以露天堆积方式来保存煤矸石,而煤矸石大量堆积造成了众多危害:煤矸石山占据了大量的土地资源;煤矸石风化自燃会释放有毒气体,产生粉尘,造成重金属污染;雨水冲刷煤矸石,导致煤矸石中的有毒物质流入土壤,污染水质。总之煤矸石的大量堆积造成了资源浪费和严重的环境污染,因此开发新的煤矸石资源化利用方法有重要意义。
对煤矸石的成份分析表明,煤矸石中含有植物生长所需的诸多营养成分如:磷、钾、钙、氮以及有机质等,如果能将这些成分有效利用起来,可以在很大程度上缓解煤矸石对环境造成的压力。研究表明,某些微生物具有解磷效果,能将土壤中的不溶性和/或难溶性磷转变为植物可吸收利用的有效磷,这类微生物称为解磷微生物。
本发明的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis strain)是一株优异的解磷菌,可以有效地解离煤矸石中的不溶性和/或难溶性的磷、钾、硅、钙、氮等成分,将其变成有效磷、速效钾、交换性钙、水解氮等植物能吸收的营养成分。
从风化煤矸石及其土壤中分离筛选解磷微生物,并利用解磷微生物来解离释放煤矸石中植物所需要的营养成分,是一种绿色化煤矸石的应用方法,这种方法也可用于其它含磷矿物的处理。
发明内容
本发明的目的在于,提供一种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌菌株及其用途。本发明的菌株能够解离煤矸石中的磷、钾、钙和氮,其工艺流程简单,效果显著,成本低,绿色环保。
本发明的技术方案:一种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌菌株,为赖氨酸芽孢杆菌属,命名为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌GZU-Lys01,于2019年12月31日保藏于中国·武汉·武汉大学的中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC NO:M20191140。
前述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌菌株GZU-Lys01是从风化煤矸石及其附近土壤中分离培育的。
一种前述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌菌株在制备解离煤矸石中的磷、钾、钙和氮的制品中的应用。
一种解离煤矸石中的磷、钾、钙和氮的制品,所述制品的活性成分包括或是前述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌GZU-Lys01。
一种解离煤矸石中的磷、钾、钙和氮的制品的制备方法,是采用前述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌GZU-Lys01作为制备所述制品的活性成分或活性成分之一。
一种解离煤矸石中的磷、钾、钙和氮的方法,在解离的过程中添加和/或使用前述的制品。
一种用于解离煤矸石中的磷、钾、钙和氮的菌剂,所述菌剂的活性成分包括或是前述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌GZU-Lys01。
前述的菌剂,所述菌剂还包括用于制备菌剂的常规成分。
一种前述的菌株在解离煤矸石中的磷、钾、钙和氮的应用。
本发明的有益效果
1、本发明从某煤炭产区煤矸石山的风化煤矸石及附近土壤中分离、纯化、培育、筛选出的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌菌株(Lysinibacillus fusiformis strain)GZU-Lys01,是一株可以有效地使煤矸石中的不溶性的磷、钾、钙、氮等成分转变成有效磷、速效钾、交换性钙、水解氮等作为植物吸收的营养物质成分的菌株,特别是能有效地解离煤矸石中的难溶性磷和/或不溶性磷,且它对煤矸石的解磷效果优于传统解磷菌株巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)。
2、本发明采用微生物解离煤矸石,工艺简单,成本低,对环境友好。
3、利用微生物细菌解离煤矸石,是煤矸石资源化利用的一种方法,能够缓解煤矸石对环境造成的压力,且利用微生物细菌解离煤矸石制备微生物肥料,不仅能将煤矸石中的难溶和/或不容成分成分转化为可溶的,施用于土壤中后,还能将土壤中已固化的磷再次溶解为植物可吸收利用的磷,并能够提高土壤的磷吸收系数,改善土壤吸收固定磷的能力。这种方法相对于用传统的化学方法来处理煤矸石,具有对环境友好的优点。
附图说明
图1是本发明GZU-Lys01菌株生长曲线;
图2是本发明GZU-Lys01菌株菌落外观图;
图3是本发明GZU-Lys01菌体形态图;
图4是GZU-Lys01菌株基于部分16S rRNA基因序列建立的系统进化树。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明,但并不作为对本发明限制的依据。
本发明的实施例
实施例:
纺锤形赖氨酸芽孢杆菌GZU-Lys01的分离,包括以下步骤:
1.功能菌株GZU-Lys01菌株的分离与筛选
1)样品的采集
(1)样品采自于某煤炭产区煤矸石山,选择完全风化煤矸石样品以及附近的土壤样品,将采集的样品装入采集袋;
(2)将采集的样品破碎、筛分,收集过100目的样品;
(3)将样品保存于4℃冰箱中备用。
2)功能菌株的筛选
(1)准确称取1g样品于灭菌的250mL的锥形瓶中,加入99mL无菌水;
(2)在180r/min,27℃左右的恒温摇床中振荡30min;
(3)振荡30min以后,取上清液逐级稀释至1.0×10-2,1.0×10-3,1.0×10-4,1.0×10-5,1.0×10-6,1.0×10-7
(4)每种浓度分别取100uL涂布于3个解磷细菌筛选固体培养基上;
(5)将平板放于35℃恒温培养箱中培养3~4天;
(6)将外观特征不同的单菌落划线接种于解磷细菌筛选固体培养上;
(7)待菌株长出后,通过菌落外观形态观察以及细菌显微形态观察,观察菌株的纯化情况,没有达到纯化要求,则进行多次重复划线培养,直到获得单一菌株;
(8)将纯化的菌株,进行革兰氏染色;
(9)对初筛的已纯化的菌株进行培养,解离煤矸石,通过测定煤矸石解离前后有效磷含量变化情况,确认菌株的解磷效果。
2.功能菌株的生长曲线的绘制
1)种子液的制备。取该菌株用接种环接种于LB液体培养基中,在35℃条件下,培养至对数期。
2)接种。取上述种子液的10mL接种于装有200mL的液体LB培养基中,混匀后分别取5mL混合液分别装于上有标记的18支无菌试管中。
3)培养。将已接种的试管置35℃,180r/min的摇床中培养。
4)测量。用未接种的LB液体培养基做空白,在600nm波长下与待测样进行光电比浊。
测定结果如图1,从图中可知,0-10h为延滞期,10-15h为对数期,15h-35h为稳定期,35h以后为衰亡期。
3.功能菌株的鉴定
1)菌落外观形态
如图2,从图中可知该菌株在LB固体培养基上呈现乳白色,不透明圆形,表面光滑湿润,边缘整齐,稍隆起,有光泽,菌落大小约为1mm。
2)细菌显微形态
经过革兰氏染色,细菌显微形态如图3,从图中可知该菌株为革兰氏阳性杆菌。
3)菌株鉴定
(1)细菌DNA的提取
挑取纯化的菌株的单菌落至装有LB液体培养基的锥形瓶中进行培养,得到纯菌种发酵液后,以细菌基因组提取试剂盒(离心柱型,天根生化科技北京有限公司)提取DNA,以其作为模版进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR),使用Taq DNA聚合物扩增16S r RNA,用27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG),1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT)的通用引物进行扩增,PCR扩增反应体系和扩增反应条件如表1所示。
表1.PCR扩增反应体系和扩增反应条件
Figure BDA0002633799690000051
以1×TBE缓冲液配制1.0%琼脂糖凝胶,加入40μL PCR扩增产物,加8μL 2000bpDNA Marker,在电压110V,电流70mA,电泳45min,观察凝胶成像结果。
(2)同源性比对
将聚合酶链式反应扩增产物经凝胶回收,由测序公司(上海立菲生物技术有限公司)测序,测序结果在NCBI(美国国立生物技术信息中心)上利用Standard NucleotideBlast进行比对,并利用ClustalW、MEGA等软件基于邻接法(Neighbor Joining Method)构建系统发育树(图4),以获得菌种的分类信息。
从图4中可知,GZU-Lys01细菌与纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillusfusiformis strain R3),聚在同一个分支上,根据生理生化特性和形态观察,GZU-Lys01鉴定为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus fusiformis strain)。
(3)生理生化实验
生化实验参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第8版)和《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等,1999)进行。
4.菌株对煤矸石的解离能力的测定
1)所用煤矸石主要成份为:C 10.52%,SiO238.71%,Al2O316.3%,Fe2O316.1%,TiO24.3%,CaO 4.25%,MgO 2.03%,K2O 1.51%,Na2O 0.88%,P2O51.78%,S 1.34%,H1.1%,N 0.86%,灰分82.21%。
2)影响煤矸石解离的四个主要因素为:接菌量,矸石粒径,解离时间,体系pH值。首先进行GZU-Lys01、巨大芽孢杆菌解离煤矸石的单因素实验,并寻找各菌的最佳单因素条件,再通过设计正交实验寻找GZU-Lys01、巨大芽孢杆菌解离煤矸石最佳条件。
3)针对成分为1)煤矸石,用GZU-Lys01、巨大芽孢杆菌进行解离实验。
4)解离实验过程如下:取指定目数的煤矸石,于控温搅拌器中,GZU-Lys01、巨大芽孢杆菌菌液浓度控制在:1.05×1010-3.52×1010cfu/mL,两株细菌与煤矸石的用量比例为2:1(体积:质量),在连续搅拌下,喷撒菌液,搅拌均匀,每间隔2-3小时翻动一次,温度控制在不高于37℃,解离煤矸石数天。
5)测定解离后煤矸石各指标含量,结果如表2。从表2中可以看出,GZU-Lys01解离煤矸石的总体效果优于巨大芽孢杆菌,主要指标有效磷、速效钾等指标均优于巨大芽孢杆菌。
表2正交设计实验结果
Figure BDA0002633799690000071
序列表
<110> 贵州大学、中国烟草总公司贵州省公司
<120> 一种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌菌株及其用途
<130> 0
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1439
<212> DNA
<213> 纺锤形赖氨酸芽孢杆菌(GZU-Lys01)
<400> 1
attcggcggc tggctcaaaa ggttacctca ccgacttcgg gtgttacaaa ctctcgtggt 60
gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat 120
tactagcgat tccggcttca tgtaggcgag ttgcagccta caatccgaac tgagaacgac 180
tttatcggat tagctccctc tcgcgagttg gcaaccgttt gtatcgtcca ttgtagcacg 240
tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccggtt 300
tgtcaccggc agtcacctta gagtgcccaa ctaaatgatg gcaactaaga tcaagggttg 360
cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca 420
cctgtcaccg ttgcccccga aggggaaact atatctctac agtggtcaac gggatgtcaa 480
gacctggtaa ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg 540
gcccccgtca attcctttga gtttcagtct tgcgaccgta ctccccaggc ggagtgctta 600
atgcgttagc tgcagcacta aggggcggaa accccctaac acttagcact catcgtttac 660
ggcgtggact accagggtat ctaatcctgt ttgctcccca cgctttcgcg cctcagcgtc 720
agttacagac cagaaagtcg ccttcgccac tggtgttcct ccaaatctct acgcatttca 780
ccgctacact tggaattcca ctttcctctt ctgcactcaa gtcccccagt ttccaatgac 840
cctccacggt tgagccgtgg gctttcacat cagacttaaa ggaccgcctg cgcgcgcttt 900
acgcccaata attccggaca acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta 960
gttagccgtg gctttctaat aaggtaccgt caaggtacag ccagttacta ctgtacttgt 1020
tcttccctta caacagagtt ttacgatccg aaaaccttct tcactcacgc ggcgttgctc 1080
catcaggctt tcgcccattg tggaagattc cctactgctg cctcccgtag gagtctgggc 1140
cgtgtctcag tcccagtgtg gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat cgtcgccttg 1200
gtgagccgtt acctcaccaa ctagctaatg cgccgcgggc ccatcctata gcgacagcga 1260
gatgccgtct ttcagtcttt caccatgaag taaaagagat tattcggtat tagccccggt 1320
ttcccggagt tatcccaaac tatagggtag gttgcccacg tgttactcac ccgtccgccg 1380
ctaacgtcaa aggagcaagc tccttttctg ttcgctcgac tgcattatag gctccccgc 1439

Claims (9)

1.一种纺锤形赖氨酸芽孢杆菌菌株,其特征在于:为赖氨酸芽孢杆菌属,命名为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌GZU-Lys01,于2019年12月31日保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号为CCTCC NO:M20191140。
2.根据权利要求1所述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌菌株,其特征在于:所述纺锤形赖氨酸芽孢杆菌GZU-Lys01是从风化的煤矸石及其附近土壤中分离提取获得。
3.一种根据权利要求1所述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌菌株在制备解离煤矸石中的磷、钾、钙和氮的制品中的应用。
4.一种解离煤矸石中的磷、钾、钙和氮的制品,其特征在于:所述制品的活性成分包括或是权利要求1所述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌GZU-Lys01。
5.一种解离煤矸石中的磷、钾、钙和氮的制品的制备方法,其特征在于:是采用权利要求1所述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌GZU-Lys01作为制备所述制品的活性成分或活性成分之一。
6.一种解离煤矸石中的磷、钾、钙和氮的方法,其特征在于:在解离的过程中添加和/或使用权利要求4中所述的制品。
7.一种用于解离煤矸石中的磷、钾、钙和氮的菌剂,其特征在于:所述菌剂的活性成分包括或是权利要求1所述的纺锤形赖氨酸芽孢杆菌GZU-Lys01。
8.根据权利要求7所述的用于解离煤矸石中的磷、钾、钙和氮的菌剂,其特征在于:所述菌剂还包括用于制备菌剂的常规成分。
9.一种根据权利要求1中所述的菌株在解离煤矸石中的磷、钾、钙和氮的应用。
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