KR101489162B1

KR101489162B1 - 방사성 물질 처리능을 갖는 리시니바실러스 푸지포르미스 및 이를 포함하는 방사성 물질 처리용 조성물

Info

Publication number: KR101489162B1
Application number: KR20130101103A
Authority: KR
Inventors: 소재성; 강창호; 최재호; 곽대영; 한상현; 오수지
Original assignee: 인하대학교 산학협력단
Priority date: 2013-08-26
Filing date: 2013-08-26
Publication date: 2015-02-06

Abstract

본 발명은 방사성 물질 내성 및 처리 활성을 갖는 리시니바실러스 푸지포르미스 TB-15 균주(Lysinibacillus fusiformis TB-15)를 제공한다. 본 발명의 리시니바실러스 푸지포르미스 TB-15 균주는 방사성 물질에 대한 내성 및 방사성 물질 처리능을 가지고 있고, 특히 국내 지하수 환경과 유사한 pH 조건 하에서도 우수한 방사성 물질 처리 활성을 나타낼 수 있는 생육 특성을 가지고 있으며, 스트론튬에 대한 내성이 우수하여 방사성 오염 지역의 토양 및 지하수 처리 등의 산업분야에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

방사성 물질 처리능을 갖는 리시니바실러스 푸지포르미스 및 이를 포함하는 방사성 물질 처리용 조성물{LYSINIBACILLUS FUSIFORMIS WITH ACTIVITY FOR TREATING RADIOACTIVE SUBSTANCE AND COMPOSITION FOR TREATING RADIOACTIVE SUBSTANCE CONTAINING THE SAME}

본 발명은 방사성 물질 내성 및 처리능을 갖는 미생물, 및 상기 미생물을 유효성분으로 포함하는 방사성 물질 처리용 조성물에 관한 발명이다.

원자력의 이용은 비화석화 에너지로 온실가스 배출이 없고, 발전비용이 저렴하며, 발전 효율이 우수한 자원으로서 세계 각 국마다 기존 원전 정책의 확대 또는 재개, 신규 원정 도입을 추진하고 있다. 국내에서도 1958년 원자력법 시행 이후 현재 23기의 원자력 발전소를 운영하고 있으며 방사선 이용기관도 매년 10% 이상 증가하여 5천여 개를 넘어서고 있고, 세계 원전 10대 국가들 가운데 단위 면적당 핵 발전의 비중이 세계 1위를 차지하는 실정이다.

이러한 원자력 에너지의 가장 큰 단점은 불가피한 방사성 물질의 누출이고, 방사성 물질이 인체에 노출되게 되면 각종 질병과 사망을 초래하기 때문에 사고 전 후로 예방 및 조치 마련이 시급한 실정이다. 이러한 방사성물질 가운데 스트론튬(⁹⁰Sr)의 경우 29년의 긴 반감기를 가지고 있고, 토양, 대기 및 수중에서 다양한 형태로 존재한다. 인체에 들어오면 뼈에서 칼슘 대신 흡수되어 골육종과 백혈병을 일으키며 갑상선 기능 저하, 태아기형, 골수 말초혈관 및 흉선과 지라의 핵산대사 저해 등을 유발하는 방사성 물질이다. 최근 후크시마 사고 1년 이후 도쿄 전력에서 분석한 자료에도 스트론튬이 주위 시설 및 부근에서 다량으로 검출된 것을 확인하였다.

이와 같은 방사성 물질에 의한 오염을 해결하기 위하여 물리적, 화학적, 생물학적 방법이 사용되고 있으나, 물리·화학적 방법을 통해서 시멘트 캠슐화(encapsulation) 과정을 거쳐 저장하게 되는데 많은 처리비용과 처리 시설 공간의 확보 및 추가적인 오염이 발생하는 등의 한계점이 드러나고 있어, 최근 생물학적 방법이 대두되고 있다. 최근 탄산칼슘(CaCO₃)과 방사성 물질과의 공침전을 통해서 방사성 물질을 격리화하는 다양한 연구가 진행되고 있고, 외국에서 탄산칼슘 형성능이 우수한 스포로사키나 파스테우리(Sporosarcina pasteurii)에 대한 보고가 있으나, 국내에서의 MICP(Microbially induced calcite precipitation)를 통한 방사성 물질 처리에 대한 연구가 미흡한 실정이다.

본 발명자들은 국내의 환경에 적합한 탄산칼슘 형성 균주를 선별하여 MICP를 통한 방사성 물질 격리에 대하여 연구하던 중, 요소분해 활성, 탄산칼슘과 탄산스트론튬(SrCO₃) 형성 활성이 우수하고, 스트론튬에 대한 내성 및 방사성 물질 처리능이 우수한 균주를 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

Choi, B. D. (2010), Kor. J. Geogr. Soc. 45: 26-48 Chen, J. P. (1997), Bioresour. Technol. 60: 185-189 Bachmeier, K. L., A. E. Williams, J. R. Warmington, 및 S. S. Bang, (2002), J. Biotechnol. 93: 171-181 Stocks-Fisher, S., J. K. Galinat, 및 S. S. Bang (1999), Soil Biol. Biochem. 31: 1563-157

본 발명의 목적은 방사성 물질 내성 및 처리 활성을 갖는 미생물 및 이를 이용한 방사성 물질 처리용 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 방사성 물질 내성 및 처리 활성을 갖는 리시니바실러스 푸지포르미스 TB-15 균주(Lysinibacillus fusiformis TB-15, KCTC12437BP)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 리시니바실러스 푸지포르미스 TB-15 균주(Lysinibacillus fusiformis TB-15, KCTC12437BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 방사성 물질 처리용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 방사성 물질 내성 및 처리 활성을 갖는 리시니바실러스 푸지포르미스 TB-15 균주(Lysinibacillus fusiformis TB-15)를 제공한다.

상기 균주는 요소 분해 활성, 탄산칼슘 생성능 및 탄산스트론튬 생성능을 가질 수 있다.

본 발명에 있어서, 리시니바실러스 푸지포르미스 TB-15 균주는 석회암 지대와 중금속으로 오염된 탄광촌 지대의 토양에서 분리된 균주로, 막대 모양의 간균형태를 가진다.

상기 리시니바실러스 푸지포르미스 TB-15 균주는 배지 내 스트론튬의 농도가 40mM 미만인 경우까지 생존이 가능하여 다른 공지의 균주보다 스트론튬에 대한 내성이 우수하고, pH 5.0 초과 내지 pH 9.0까지 생존할 수 있으며, 기아스트레스에 대한 내성을 갖고, 요소분해 활성 및 탄산칼슘 생성능이 우수하다.

16S rDNA 유전자 서열을 통하여 동정한 결과 리시니바실러스 푸지포르미스 1-7AIA균주와 99%의 상동성을 가져 리시니바실러스 푸지포르미스로 동정되었다. 상기 리시니바실러스 푸지포르미스 TB-15 균주는 한국유전자은행(KCTC, korean collection for type cultures)에 2013년 6월 28일자로 기탁하여, 수탁번호 KCTC12437BP를 부여 받았다.

상기 리시니바실러스 푸지포르미스 TB-15 균주는 통상의 배지에서 생육 가능하며, 일 예로 YE 배지에서 배양할 수 있다. 상기 배지는 특정 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다. 상기 리시니바실러스 푸지포르미스 TB-15 균주는 통상의 배양방법에 따라 배양할 수 있다.

본 발명에 있어서, 방사성 물질(radioactive material)은 방사선을 방출하는 성질을 갖는 원소를 의미하고, 핵연료물질, 사용 후 핵연료, 방사성 동위원소 및 원자핵분열 생성물을 모두 포함하며, 바람직하게는 스트론튬(Strontium, Sr) 일 수 있다.

상기 스트론튬(Sr)은 원자번호 38번의 원소로, 알칼리 토금속에 속하며, 방사성 동위원소인 스트론튬-90(⁹⁰Sr)와 비방사성 스트론튬(⁸⁴Sr, ⁸⁶Sr, ⁸⁷Sr, ⁸⁸Sr) 모두 본 발명의 미생물에 의하여 처리될 수 있다.

본 발명에 있어서 처리는 방사성물질에 대하여 화학적 작용을 일으키는 것을 모두 포함하는 의미이고, 일 예로 방사성 물질 이온을 다른 이온과 결합하여 고착화시키는 것을 의미한다.

상기 리시니바실러스 푸지포르미스 TB-15 균주의 요소를 분해할 수 있는 요소분해효소(urease)의 작용으로 탄산염(CO₃ ^2-)이온이 발생되고, 이 때 탄산염 이온은 세포벽 주위의 칼슘(Ca²⁺)과 결합하여 탄산칼슘(CaCO₃)을 형성하고, 스트론튬의 존재 하에서 스트론튬 이온과도 결합하여 탄산스트론튬(SrCO₃)을 형성하여, 방사성 오염원인 스트론튬을 고착화하여 확산을 방지하고, 오염지역으로부터 격리시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서 리시니바실러스 푸지포르미스 TB-15 균주의 탄산칼슘 및 탄산스트론튬 생성능을 X선 회절분석 및 정량 분석을 통해서 확인하였고, 따라서 상기 TB-15 균주를 이용하여 중금속, 방사성 물질 오염지역의 토양, 지하수 등의 오염원을 제거하는 토양 및 하수 처리, 환경 복원 분야에서 산업적으로 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 리시니바실러스 푸지포르미스 TB-15 균주(Lysinibacillus fusiformis TB-15, KCTC12437BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 방사성 물질 처리용 조성물을 제공한다.

상기 배양물이란 특정 미생물을 배양배지 또는 배양액에서 배양한 것을 의미하며, 배양물의 농축물도 포함한다. 상기 배양물은 상기 특정 미생물을 포함하는 것을 의미하고, 그 제형이 한정되지 아니하며, 일 예로 액체 또는 고체일 수 있다.

상기 배지는 특성 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다.

상기 방사성 물질 처리용 조성물은 pH 5.0 내지 pH 9.0, 바람직하게는 pH 6.0 내지 pH 8.0인 것 일 수 있다. 조성물의 pH가 상기 범위를 만족하는 경우, 지하수의 pH와 pH가 유사하여 방사성 물질을 위해 처리한 경우 pH에 의한 처리능의 감소가 발생하지 않고, 상기 미생물이 최적의 방사성 물질 처리 활성을 나타낼 수 있다.

상기 방사성 물질 처리용 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 상기 리시니바실러스 푸지포르미스 TB-15 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 0.001 내지 99.99 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 99 중량%로 포함할 수 있고, 상기 항진균 조성물의 사용방법 및 사용목적에 따라 유효성분의 함량을 적절히 조절할 수 있다.

본 발명의 리시니바실러스 푸지포르미스 TB-15 균주는 방사성 물질에 대한 내성 및 방사성 물질 처리능을 가지고 있고, 특히 국내 지하수 환경과 유사한 pH 조건 하에서도 우수한 방사성 물질 처리 활성을 나타낼 수 있는 생육 특성을 가지고 있으며, 스트론튬에 대한 내성이 우수하여 방사성 오염 지역의 토양 및 지하수 처리 등의 산업분야에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 미생물의 침전반응 여부를 확인하는 도이다.
도 2는 미생물의 표준곡선을 나타내는 그래프이다. 도 2a는 균주의 요소분해 활성에 대한 표준곡선을 나타내고, 도 2b는 균주 시료 내의 단백질양에 대한 표준곡선을 나타낸다.
도 3은 균주의 요소 분해 활성을 나타낸 그래프 이다. 도 3a는 16종 균주의 특정 요소분해효소에 대한 활성을 나타내는 것으로, 그래프의 세로축은 특정 요소 분해 효소 활성(U/㎍), 가로축은 각 균주의 종류를 나타낸다. 도 3b는 시간별 요소 분해 효소 활성의 결과를 나타낸 그래프이고, 그래프의 세로축은 흡광도(OD₆₂₆)를 나타내고, 그래프의 가로축은 경과 시간을 나타낸다. 그래프에서 S. pasteurii(◆)가 대조군, TB-15(■)와 TB-22(▲)가 분리 균주 각각을 나타낸다.
도 4는 균주에 의하여 생성된 광물질에 대한 X-선 회절분석을 확인한 도이다. 도 4a는 탄산칼슘의 생성, 도 4b는 탄산스트론튬의 생성을 확인한 것이고, 그래프에서 S. pasteurii는 대조군, TB-15와 TB-22는 분리 균주 각각을 나타낸다.
도 5는 각 균주의 형태 및 균주에 의하여 생성된 광물질의 SEM 사진을 나타내는 도이다. 세포는 TB-15 및 TB-22 균주 각각의 형태를 나타내고, 칼사이트(Calcite)는 각 균주에 의하여 형성된 탄산칼슘의 형태를 나타낸다.
도 6은 균주에 의하여 생성된 광물질의 정량을 나타내는 그래프이다. 도6a는 탄산칼슘의 생성량, 도 6b는 탄산스트론튬의 생성량을 나타내고, 그래프의 세로축은 광물질의 함량(건조중량, mg/ml)을 나타내고, 그래프의 가로축은 S. pasteurii가 대조군, TB-15와 TB-22가 분리 균주 각각을 나타낸다.
도 7은 균주의 오염물질 확산 억제능을 확인한 그래프이다. 그래프의 세로축은 오염물질의 이동거리(cm)를 나타내고, 그래프의 가로축은 S. pasteurii가 대조군, TB-15와 TB-22가 분리 균주 각각을 나타내며, 막대그래프의 좌측부터 노란색으로 표시된 NC는 균주 미포함군, 빨간색으로 표시된 DC는 멸균균주 포함군 그리고 녹색으로 표시된 LC는 각각의 살아있는 균주 포함군을 의미한다.
도 8은 균주의 스트론튬 처리능을 확인한 도이다. 도 8a는 ICP-MS 분석법에 의하여 분석하는 과정을 나타낸 도이고, 도 8b는 균주의 스트론튬 처리능을 나타내는 그래프이다. 그래프의 세로축은 스트론튬의 농도(ppb)를 나타내고, 그래프의 가로축은 S. pasteurii가 대조군, TB-15와 TB-22가 분리 균주 각각을 나타내며, 좌측부터 노란색으로 표시된 NC는 균주 미포함, 빨간색으로 표시된 DC는 멸균균주를 포함하고, 녹색으로 표시된 LC는 각각의 살아있는 균주를 포함하는 것을 의미한다.
도 9는 스트론튬 농도에 따른 균주의 생존활성을 확인한 그래프이다. 그래프의 세로축은 생존률(%)을 나타내고, 그래프의 가로축은 스트론튬의 농도를 나타내며, 그래프에서 S. pasteurii가 대조군, TB-15와 TB-22가 분리 균주 각각을 나타낸다.
도 10은 pH에 따른 균주의 생존활성을 확인한 그래프이다. 그래프의 세로축은 생존률(%)을 나타내고, 그래프의 가로축은 pH 조건을 나타내며, 그래프에서 S. pasteurii가 대조군, TB-15와 TB-22가 분리 균주 각각을 나타낸다.
도 11은 염분 농도에 따른 균주의 생존활성을 확인한 그래프이다. 그래프의 세로축은 생존률(%)을 나타내고, 그래프의 가로축은 염분(NaCl)농도를 나타내며, 그래프에서 S. pasteurii가 대조군, TB-15와 TB-22가 분리 균주 각각을 나타낸다.
도 12는 기아 스트레스에 따른 균주의 생존활성을 확인한 그래프이다. 그래프의 세로축은 생존률(%)을 나타내고, 그래프의 가로축은 기아 진행 일수를 나타내며, 그래프에서 S. pasteurii가 대조군, TB-15와 TB-22가 분리 균주 각각을 나타낸다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.

실험예 1. 균주의 분리 및 선별

균주분리를 위한 시료는 강원도 태백 내 탄광촌, 석회암 지대 등의 다양한 환경 조건에서 채취한 토양에서 분리하여 본 연구에 사용하였다.

채취한 토양 시료는 완충용액(0.1M 인산염 완충액 pH 7.4)에 10배 희석한 후 하룻동안 28 ℃, 200 rpm 조건에서 배양하였다. 배양 후 진동기(vibrator)를 이용하여 충분히 혼합하고, 다시 완충용액에 10배 희석한 뒤 100 μL 를 취하여 100 ㎍/mL의 시클로헥시미드(Cycloheximide)가 포함된 BPU 한천배지(Beef extract: 3g/L, Peptone: 5g/L, Urea: 20g/L, PH: 8.3)에 분산 도말하여, 28 , 200 rpm으로 하룻동안 배양하였다. 형성된 콜로니의 형태적 차이를 고려하여 총 152 종의 단일 콜로니를 분리하였다.

분리된 미생물의 탄산칼슘 형성능력을 확인하기 위하여 BPU 액체 배지에 28℃, 200rpm 으로 하룻동안 배양 후 0.2 ㎛ 주사통여과기(syringe filter)를 처리하여 미생물을 제거한 뒤 여과액 1 mL 에 100 μL 의 CaCl₂(100 mM) 수용액을 첨가하여 침전반응을 일으키는 미생물을 재선별 하였으며(도 1), 25% 글리세룰 스톡(glycerol stock)으로 -70 ℃에서 보존하였다.

침전반응을 보인 16종의 균주 중 요소 분해 효소 활성(Specific urease actvity)을 통하여 가장 높은 활성을 보인 2종의 균주를 최종 선별하였고 요소 분해 박테리아로 잘 알려진 스포로사키나 파스테우리 KCTC 3558(Sporosarcina pasteurii KCTC 3558)을 대조군으로 사용하였다. 최종 분리된 균주는 16S rDNA 유전자 서열을 통하여 분자 동정하였다.

최종 선별된 두 균주는 분자 동정결과, TB-15는 뉴클레오타이드의 길이가1485bp이고, 리시니바실러스 푸지포르미스 1-7AIA(Lysinibacillus fusiformis 1-7AIA)와 99% 상동성을 나타내어 리시니바실러스 푸지포르미스(Lysinibacillus fusiformis)로 확인되었고, TB-22는 리시니바실러스 스파에라커스 DE4(Lysinibacillus sphaericus DE4)와 99% 상동성을 나타내어, 리시니바실러스 스파에라커스(Lysinibacillus sphaericus)로 확인되었다.

실험예 2. 요소 분해 효소 활성능 확인

실험예 2-1. 특정 요소 분해 효소 활성 확인

16종의 탄산칼슘 침전반응을 보인 균주를 YE 액체 배지에 2% 접종하여 18시간 배양한 뒤 다시 8시간 동안 YE 액체 배지에 10% 접종하여 준비한 PBS 완충액(NaH₂PO₄ 0.1 g/L, Na₂HPO₄ 26.61 g/L, pH 9.0, 1 mM EDTA)로 2회 세척한 후, 분광 광도계(Spectrophotometer, Ultrospec 2000, Pharmacia Biotech)를 이용하여 OD₆₀₀에서 흡광도가 0.1이 되도록 희석하였다. 표준곡선(Standard curve)을 작성하기 위하여 맞추어 준 균주 시료를 100℃ 5분간 정치시킨 후 각각의 250 μL 의 균주 시료, PBS 완충액, 요소용액(urea solution), 0.1mM 내지 1M의 NH₄Cl을 반응시킨 뒤, 2 mL 의 페놀-니트로프루시드(phenol-nitroprusside) 용액(C₆H₅OH 43.90 mL/L, Na₂[Fe(CN)5NO]·2H₂0 60 mg/L) 과 2 mL의 치아염소산(hydrochlorite) 용액(NaOH 20 g/L, 8 % NaOCl 46.875 g/L)을 넣고 60 ℃에서 10분간 반응시킨 후, OD₆₂₆ 에서 흡광도를 측정하여 표준곡선으로 사용하였다(도 2a).

그리고 각 균주의 요소 분해 활성을 위하여 250 μL 의 균주 시료, 250 μL 완충액 그리고 500 μL 요소용액(urea solution, 3M)을 혼합하여 37 ℃에서 5 분간 반응시킨 후 2 mL의 페놀-니트로프루시드(phenol-nitroprusside) 용액과 2 mL의 치아염소산 용액을 넣어 60 ℃에서, 10분간 반응시킨 후 OD₆₂₆ 에서 흡광도를 측정하였다.

또한 균주 시료 내의 단백질양을 분석하기 위하여 초음파분쇄기(Sonicator)를 이용하여 1 분간 반응시켜 세포를 파쇄한 뒤 브래드포드 방법(bradford method)을 이용하여 세포 내 전체 단백질양을 측정하였으며 소혈청알부민(Bovine serum albumin, BSA)을 이용하여 표준곡선을 작성하여 측정한 흡광도를 계산하고 세포 내 총 단백질 당 요소 분해 효소 활성(Specific urease activity)을 측정하고(Natarajan 1995; Bradford 1976)(도 2b), 그 결과는 도 3a에 나타내었다.

상기 효소분해효소 활성은 하기 수학식1에 의하여 계산하였다.

[수학식 1]

A₅ - A₀/t=5 (Y=4.4136+0.0302, R²=0.998)

* 2㎛ NH₄(방출) = 1㎛ 요소(가수분해)

* 1㎛ 요소/분(가수분해) = 1 요소 활성 단위(unit)

* A₅: 250㎕ 균주시료, 500㎕ 요소용액, 250㎕ 완충액을 37℃에서 5분간 정치시켜 반응시킨 후 2ml 페놀-니트로프루시드 용액과 2ml 치아염소산 용액을 넣어 50℃에서 5분간 반응시킨 후 O.D₆₂₆에서 측정한 흡광도

* A₀: 대조군으로 5분간 100 ℃ 워터배스에 정치시킨 균주시료의 흡광도

도 3a에 나타낸 바와 같이, 16종의 균주에 대하여 요소 분해 활성을 측정한 결과 TB-15 및 TB-22 균주가 각각 3.54 U/㎍과 5.09 U/㎍으로 가장 높은 활성을 나타내어 두 균주를 최종 선별하여 사용하였다.

실험예 2-2. 시간별 요소 분해 활성 확인

시간별 요소 분해 활성을 알아보기 위하여 5 mL의 YE 액체 배지에 대조군 스포로사키나 파스테우리 KCTC 3558(S. pasteurii KCTC 3558)과 최종 선별된 미생물 TB-15 및 TB-22를 28 ℃, 200 rpm으로 24시간 동안 전배양한 후, 다시 5 mL의 YE 액체 배지에 10%(v/v) 접종하여 같은 조건으로 8시간 본배양하였다. 본배양이 끝난 균주를 원심분리기를 이용하여 6000 rpm, 10 분간 원심 분리하여 상등액을 제거하고 준비한 PB를 이용하여 2회 세척한 후, 분광광도계를 이용하여 OD₆₀₀=0.1 이 되도록 희석하였다. 희석한 균주 250 μL, 500 μL의 요소용액(3M), 250 μL의 완충액이 들어간 시료를 각 시간(5 분, 1 시간, 6 시간, 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 120 시간 그리고 144 시간)만큼 준비하여 각 시간 때 마다 샘플링하여 2 mL 의 페놀-니트로프루시드(phenol-nitroprusside) 용액과 2 mL의 치아염소산 용액을 넣어 60 ℃에서, 10분간 반응시킨 후 OD₆₂₆에서 흡광도를 측정하여, 그 결과를 도 3b에 나타내었다.

도 3b에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 요소 분해 활성이 늦게 개시되는 것을 확인하였고, 상기 결과를 바탕으로 상기 균주를 오염물질의 처리에 적용하는 경우 24 시간 이상 충분히 요소 분해 반응 시간이 필요한 것으로 판단하였다.

실험예 3. 광물질 생성 및 정량 확인

실험예 3-1. X-선 회절 분석

탄산칼슘과 탄산스트론튬(SrCO₃)의 형성유무를 확인하기 위하여 5 mL BPU 액체배지에 탄산칼슘형성 미생물을 접종하여 24시간 동안 배양한 후, 0.2 ㎛ 여과 처리하여 1 mL의 여과액을 얻었다. 탄산칼슘의 분석에서는 100 μL의 CaCl₂(350 mM)을 처리하고, SrCO₃의 분석에서는 100 μL SrCl₂·6H₂O(350 mM)를 각각 넣어 준 뒤 원심분리(13000 x g, 5min)하여 침전물을 획득하였다. 100 μL 멸균 증류수를 첨가한 후 진탕 혼합을 수행하였고, 커버글라스에 각각의 50 μL 혼합액을 떨어뜨려 60 ℃에서 완전히 건조시킨 다음 X-선 회절 분석기(DMAX-2500, Rigaku)를 이용하여 5° 내지 90°에서 2θ 간격으로 탄산칼슘과 탄산스트론튬(SrCO₃)의 형성유무를 확인하여, 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 대조군과 분리균주(TB-15, TB-22) 모두 탄산칼슘(도 4a)과 탄산스트론튬(도 4b)의 생성을 확인할 수 있었다.

실험예 3-2. 형성 광물질의 형태 확인(SEM)

처음 커버글라스는 에탄올에 멸균하여 말린 후 사용하였다. 균주 시료는 18시간 YE 배지에서 배양 후 0.1 M PB 완충액(pH 7.4)으로 두 번 세척한 뒤 사용하고 탄산칼슘 시료는 BPU 배지에 균을 접종한 후 CaCl₂(350 mM) 용액을 첨가하여 사용하였다. 준비된 시료는 위 커버글라스의 해당 시료를 약 10 μL 내지 20 μL 정도 처리하여 얇게 펴서 다시 말려준 후, 2.5% 글루타르알데히드(Glutaraldehyde)와 PB 완충액을 1:4의 부피비로 혼합한 뒤 40 ℃에서 4시간 동안 고정시켰다. 다시 PB 완충액을 이용하여 10분간 3회 반복하여 담근 후 50%, 70%, 90%, 95% 에탄올에 탈수하였다. 커버글라스의 에탄올을 충분히 건조시킨 후, 이온 스팟터(ion spotter)에 백금으로 코팅하였다. 코팅 후 FE-SEM(Field Emission Scanning Electron Microscopy, Hitach S-4200)을 이용하여 시료를 관찰하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 분리한 균주 TB-15, TB-22의 균주 및 균주가 형성한 칼사이트(Calcite)의 형태를 확인하기 위하여 SEM 촬영을 수행한 결과, 두 균주 모두 막대 모양의 간균형태를 지니는 것을 확인하였고, 각 균주가 형성하는 탄산칼슘의 모양이 다르다는 것을 확인하였다.

실험예 3-3. CaCO ₃ 및 SrCO ₃ 정량분석

탄산칼슘의 정량측정을 위해 대조군 및 분리한 균주를 5 mL BPU 액체배지에 28 ℃, 200 rpm으로 18시간 배양한 뒤, 0.2 ㎛ 여과를 사용하여 미생물을 제거하였다. 여과액 500 μL와 500 μL CaCl₂(350 mM)을 반응시킨 뒤 원심분리(13000 x g, 5 min)하여 상등액을 제거한 침전물을 얻었다. 침전물을 60℃에서 완전히 건조시켜 건조 중량을 측정하였다. SrCO₃의 정량 측정을 위해 상기 CaCl₂를 대신하여 SrCl₂·6H₂O(350 mM)를 이용하여 동일한 조건으로 실험을 수행하였다. 상기 탄산칼슘과 탄산스트론튬의 정량 측정 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 탄산칼슘(CaCO₃)의 경우 대조군은 19.0 mg/mL, 분리균주인 TB-15와 TB-22는 각각 7.8, 10.3 mg/mL을 생성하였고(도 6a), 탄산스트론튬(SrCO₃)의 경우 대조군은 22.5 mg/mL, TB-15와 TB-22는 각각 13.5, 15.4 mg/mL을 생성하였다(도 6b). TB-15와 TB-22의 요소 분해 활성도는 대조군에 비해 각각 21.5%, 30.8%의 요소 분해 활성도를 보였지만, CaCO₃와 SrCO₃의 정량 측정 결과, 대조군에 비해 CaCO₃는 각각 40.5%, 54.4%, SrCO₃는 각각 60.21%, 68.49%의 수치를 확인할 수 있었다.

상기 결과를 통해 CaCO₃와 SrCO₃형성에 있어서 정량적인 측면에서는 요소 분해 활성 측정 결과와 비교하였을 때, 다소 차이가 있음을 확인할 수 있었고, 이는 미생물이 MICP에 의해 생성하는 탄산칼슘은 요소 분해 효소뿐 아니라 미생물의 CA(Carbonic Anhydrase) 및 첨가 해준 칼슘원(Calcium source)의 부분적인 과포화 등에 의해 영향을 받아 이와 같은 결과를 나타낸 것이라 판단 하였다.

실험예 4. 방사성물질 처리능 확인

실험예 4-1. 투수율 저해 실험

24시간 동안 전배양한 균주를 다시 5 mL의 YE 액체 배지에 10% 접종하여 같은 조건으로 8시간 본배양한 뒤 0.9% NaCl 용액으로 2번 세척한 후 OD₆₀₀ 에서 흡광도가 1.0 인 균주 시료를 준비하였다. 균주의 대조군으로는 흡광도를 1.0으로 맞추어준 균주를 오토클레이브를 이용하여 121 ℃에서 20 분간 멸균한 것과 균주가 없는 0.9 % NaCl로 설정하여 사용하였다.

25 mL 컬럼을 준비하고, 모래(평균입경 0.45~0.7 mm, Joomoonjin Sand co., Ltd., Korea)와 염화칼슘(CaCl₂, 25 g/L)/요소(40 g/L) 용액을 모래 200g 당 53.3 mL의 염화칼슘/요소 용액을 섞어 모래 슬러리를 만들었다. 준비한 25 mL 컬럼 안에 50g 의 모래 슬러리를 패킹한 뒤, 각 조건별 균주를 넣어준 후 28 ℃에서 하룻동안 배양하였다. 배양 후 컬럼안의 용액을 충분히 빼낸 뒤에 밑 부분을 다시 막아준 후 2 mL의 크리스탈 바이올렛(Crystal violet)을 흘려 보내어 염색된 거리를 측정하였다(도 7a). 측정결과는 컬럼 내로 염색약의 이동경로가 위에서 아래로 진행되기 때문에 도 7b와 같이 그래프로 표시하였다.

도 7b에 나타낸 바와 같이, 대조군 및 분리균주인 TB-15와 TB-22 모두 살아있는 세포(Live cell)군에서 세포가 없는 경우(No cell)군과 죽은 세포(Dead cell)군 보다 이동거리가 1 내지 3 cm 저해되었고, 이는 분리균주 세포가 없는 경우나 죽은 세포를 포함하는 경우에는 탄산칼슘이 형성되지 못하지만, 살아있는 세포를 포함하는 경우 모래 내에 탄산칼슘이 형성되어 간접적으로 오염원이라 할 수 있는 염색약의 확산을 방지하고 이를 격리시켰기 때문으로 판단하였다.

실험예 4-2. ICP-MS 분석

실제 컬럼 내에 대조군 및 분리균주의 탄산칼슘을 유도한 뒤, 스트론튬이 포함된 증류수를 넣어 흘러나온 용액에 포함된 스트론튬의 양을 ICP-MS 분석기기를 통하여 측정하였다.

5 mL의 YE 액체 배지에 24시간 동안 전배양한 균주를 다시 10% 접종하여 같은 조건으로 8시간 본배양한 뒤 0.9% NaCl 용액으로 2번 세척한 후 OD₆₀₀ 에서 흡광도가 1.0 인 균주 시료를 준비하였다. 균주의 대조군으로는 흡광도를 1.0으로 맞추어준 균주를 오토클레이브에서 121℃ 20분간 멸균한 것과 균주가 없는 0.9 % NaCl을 설정하여 사용하였다. 준비한 모래와 염화칼슘(CaCl₂, 25 g/L)/요소(40 g/L)를 혼합하여 모래 슬러리를 만든 후, 50 mL 의 컬럼안에 75g 의 모래 슬러리를 패킹하였다. 그 후 20 mL 의 각 조건별 균주를 넣어 28℃에서, 하룻동안 배양한 후 60℃ 에서 충분히 건조하였다. 그 후, SrCl₂·6H₂O (100 mg/L)가 포함된 증류수를 넣어준 뒤 흘러나온 용액을 얻어 0.2 ㎛ 필터 처리하여 균을 제거하고 ICP-MS 분석을 도 8a에 나타낸 바와 같이 실시하였고, 그 결과를 도 8b에 나타내었다.

도 8b에 나타낸 바와 같이, 세 균주 모두 살아있는 세포에서 멸균한 것과 균주가 없는 경우 흘러나오는 용액 내에 스트론튬의 양이 현저히 감소하였고, 이는 초기 넣어준 스트론튬의 1 %도 안 되는 양으로서 상기와 같은 결과를 바탕으로 컬럼 내에서 스트론튬이 미생물에 의해 격리 및 모래로 흡착되는 것으로 판단된다.

실험예 5. TB-15 균주의 환경 스트레스에 대한 내성 확인

균주의 다양한 환경 스트레스 내성을 분석하기 위해 각 농도별 생장 및 생존율을 비교하였다. 각 스트레스 조건으로 실험하기 위해 미생물들을 28 ℃, 200 rpm으로 18시간 배양한 뒤 0.1 M 인산나트륨(pH 7.4)으로 2회 세척 후에 분광광도계를 이용하여 OD₆₀₀=1.0으로 균체수를 설정하였다. 스트론튬과 기아 스트레스의 경우 시간별 시료를 얻어 10^-6까지 희석한 후, YE 한천 배지에 스팟팅(spotting)하여 28 ℃ 에서 하루 동안 배양하여 생존율을 확인하였으며 pH 와 NaCl 스트레스 경우 YE 액체 배지의 흡광도를 측정하여 생존율을 확인하고, 하기 수학식2에 따라 생존율을 계산하였다.

스트레스 조건은 스트론튬의 농도는 0 내지 100 mM, pH는 5.0 내지 9.0, 기아는 0 내지 7일, 그리고 NaCl은 0 내지 2.0 mM으로 하여 각각 실험을 수행하였다.

[수학식 2]

생존률(Survivability, %) = [(시료의 흡광도 / 대조군의 흡광도) x 100]

실험예 5-1. 스트론튬 농도별 스트레스 내성 확인

스트론튬 스트레스의 경우 생장 배지(peptone 10 g/L, beef extract 1.5 g/L, yeast extract 1.5 g/L and NaCl 5 g/L, pH 7.5)를 121 ℃에서, 20분간 멸균한 후, 2% 요소(urea)가 함유된 농도별 SrCl₂·6H₂O 용액을 0.2 ㎛ 여과 처리하여 사용하였다. 흡광도를 OD₆₀₀=1.0으로 맞추어둔 균주를 5 mL의 준비한 배지에 2% 접종하였다. 다시 28 ℃에서, 200 rpm 하루 동안 배양한 뒤 볼텍스 혼합기(Vortex mixer)를 이용하여 충분히 혼합하여 PB 완충액(pH 7.4)과 10^-6까지 희석 후 YE 한천 배지에 스팟팅(Spotting)하여 CFU를 측정하였고, 세포생존능(Cell survivability)을 상기 수학식 2에 따라 계산하여 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 스트론튬의 농도를 100 mM까지 처리한 결과, 20 mM까지 TB-15 균주는 생존율을 갖는 것을 확인하였고, 이로써 TB-15 균주는 스트론튬 내성을 가짐을 확인하였다.

실험예 5-2. pH 및 삼투압 스트레스 내성 확인

pH의 경우 O.D₆₀₀=1.0 세포현탁액을 설정된 pH 배지에 2% 접종하여 하룻동안 배양한 뒤 YE 배지(pH 9.0)를 기본으로 흡광도 OD₆₀₀에서 비교하였다. 각 pH 별 배지는 효모(20 g/L)와 (NH₄)₂SO₄(9.9 g/L)를 혼합한 후 염산(3N) 과 수산화나트륨(5M)을 이용하여 보정한 뒤, 121 ℃에서 20분간 멸균하여 사용하였다. 삼투압 스트레스의 경우 YE 배지(pH 9.002)에 농도별 NaCl을 첨가하여 121 ℃에서, 20분간 멸균하여 사용하였다.

O.D₆₀₀=1.0 세포현탁액을 설정된 pH 배지에 2% 접종하여 하룻동안 배양한 뒤 pH 스트레스와 마찬가지로 OD₆₀₀에서 흡광도 측정하고, 세포생존능(Cell survivability)을 상기 수학식 2에 따라 계산하였다.

pH 스트레스에 대한 내성의 결과는 도 10에 나타내었고, 삼투압 스트레스에 대한 내성의 결과는 도 11에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, TB-15 균주는 대조군과 비교하여 pH 6.0 범위까지 80% 이상의 우수한 생존율을 갖는 것을 확인하였다.

또한, 도 11에 나타낸 바와 같이, TB-15 균주는 0.5M 이상의 농도에서 생존 저해 결과를 보임을 확인하였다.

실험예 5-3. 기아 스트레스

방사성 물질 처리를 위하여 미생물을 적용하는 지역의 토양 및 지하수의 환경은 미생물의 생장에 필요한 영양분이 제한되는 경우가 있는바, 이러한 환경 상태에서의 생존율을 확인하기 위하여 기아스트레스를 측정하는 실험을 실시하였다.

구체적으로는 1.8 mL epp 튜브를 요일별로 준비한 뒤 1 mL 의 O.D₆₀₀=1.0 세포현탁액을 넣고 28 ℃에서 정치 배양하였다. 각 날짜별 시료를 PB 완충액(pH 7.4)으로 10^-6까지 희석하여 YE 한천 배지에 스팟팅(Spotting)하여, CFU를 측정 후, 상기 수학식 2에 따라 세포생존능(Cell survivability)을 계산하였고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 대조군은 기아 스트레스 유발 후 3일 경과시 모두 사멸하였으나, TB-15 균주는 7일이 경과한 후에도 생존하고 있었고, 기아 스트레스 내성이 우수한 것을 확인하였다.

한국생명공학연구원

KCTC12437BP

20130628

Claims

스트론튬(Sr)에 대한 내성 및 처리 활성을 갖는, 신규한 리시니바실러스 푸지포르미스 TB-15 균주(Lysinibacillus fusiformis TB-15, KCTC12437BP).
제1항에 있어서,
상기 균주는 요소 분해 활성, 탄산칼슘 생성능 및 탄산스트론튬 생성능을 갖는, 신규한 리시니바실러스 푸지포르미스 TB-15 균주(KCTC12437BP).
삭제
제1항에 있어서,
상기 스트론튬(Sr)은 ⁹⁰Sr, ⁸⁴Sr, ⁸⁶Sr, ⁸⁷Sr 및 ⁸⁸Sr으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 신규한 리시니바실러스 푸지포르미스 TB-15 균주(KCTC12437BP).
제1항의 신규한 리시니바실러스 푸지포르미스 TB-15 균주(KCTC12437BP), 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물 및 상기 배양물의 건조물으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는, 스트론튬(Sr) 처리용 조성물.
제5항에 있어서,
상기 스트론튬(Sr) 처리용 조성물의 pH는 5.0 내지 9.0인 것을 특징으로 하는, 스트론튬(Sr) 처리용 조성물.
제5항에 있어서,
상기 스트론튬(Sr)은 ⁹⁰Sr, ⁸⁴Sr, ⁸⁶Sr, ⁸⁷Sr 및 ⁸⁸Sr으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 스트론튬(Sr) 처리용 조성물.