KR20180138339A

KR20180138339A - 라이시니바실러스 속 ys11 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20180138339A
Application number: KR1020170078441A
Authority: KR
Inventors: 박우준; 이광명; 김현정; 이윤석
Original assignee: 고려대학교 산학협력단; 성균관대학교산학협력단
Priority date: 2017-06-21
Filing date: 2017-06-21
Publication date: 2018-12-31
Also published as: KR102009194B1

Abstract

본 발명은 요소 분해능을 활용하지 않고 탄산칼슘을 형성하는 라이시니바실러스 속 (Lysinibacillus sp.) YS11 균주 및 이를 포함하는 조성물 등에 관한 것으로, 종래 콘크리트의 내구성 증진을 위해 이용한 미생물과 달리, 상기 YS11 균주는 요소 분해능을 사용하지 않으면서도 탄산칼슘 형성이 가능하기 때문에, 요소를 콘크리트 배합 재료로 포함할 필요가 없으며, 유해물질인 암모니아를 방출하지 않아, 암모니아에 의한 콘크리트의 화학적 부식을 막을 수 있고, 콘크리트 시설물에 접촉하는 인체에 무해한 장점이 있다. 따라서, 본 발명에 따른 라이시니바실러스 속 YS11 균주는 친환경적인 자기치유 콘크리트 또는 건설재료로 활용가능성이 높으며, 기존의 시멘트, 폴리머 수지 표면처리 기법 등의 단기적인 치유 기술을 대체할 수 있는 지속 가능한 기술로 기대된다.

Description

라이시니바실러스 속 YS11 균주 및 이의 용도{Lysinibacillus sp． YS11 and use thereof}

본 발명은 라이시니바실러스 속(Lysinibacillus sp.) YS11 균주 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 요소 분해능을 활용하지 않고 탄산칼슘을 형성하는 라이시니바실러스 속 YS11 균주 및 이를 포함하는 조성물 등에 관한 것이다.

강도, 내구성, 및 시공성이 우수한 콘크리트는 지금까지 다양한 사회기반 시설물의 주요 건설재료로 사용되고 있다. 하지만, 콘크리트의 많은 비율을 차지하는 시멘트의 생산과정에서 발생되는 이산화탄소는 4,500 만 톤에 달하며 산업공정의 40.9% 의 탄소배출이 시멘트 생산에서 발생한다고 알려져 있다 (2009년도 기준). 특히 우리나라는 시멘트 생산으로 인해 배출하는 탄소량이 연평균 약 7억톤이다. 하지만 시멘트를 주로 소비하는 나라로써 탄소배출량 감축 정책에서 자유롭지 않은 실정이다.

또한, 최근 인간 활동에 의해 증가하는 대기 중 이산화탄소 잔류량이 야기하는 외부환경 변화로 인한 콘크리트 균열 결함이 심해지고 있다. 보다 상세하게는 산성비가 염기성을 띠는 콘크리트와 반응하여 물리화학적 침식으로 인한 미세균열이 빈번하게 발생한다. 이는 콘크리트 구조물 자체의 내구성에 치명적인 영향을 끼치며 이를 해결하고자 유기섬유, 유기폴리머, 합성화학섬유 등 다양한 화학 혼화제를 적용하고 있다. 하지만 보강재 사용은 장기적 유지가 어려워 유지관리비용 및 에너지가 요구되기 때문에 또 다른 환경문제와 온실가스 배출과 관련된 문제를 야기한다. 결국 화학적 처리를 통한 균열 치유는 환경 탄소배출의 악순환이다.

이산화탄소를 감축하기 위해 여러 분야에서 생지화학적 해결 방안이 많아지는 가운데, 최근 미생물계에서 많은 학자들이 미생물을 활용한 탄소 순환 균형에 초점을 두며 활발하게 연구되고 있다. 특히 미생물의 생화학적 반응으로 유도된 탄산칼슘 광물 형성(MICP; microbially induced calcium carbonate precipitation) 과정은 탄소 순환(carbon cycle)에 긍정적인 영향을 미쳐 많은 학자들에게 관심을 받고 있다. 구체적으로는 미생물의 탄산칼슘 석출 대사과정을 통해 이산화탄소를 흡착 및 활용하여 쉽게 녹지 않는 미네랄 형태로 저장하는 것이다. 본 현상은 자연계에서 흔히 볼 수 있는 과정이며 석출된 탄산칼슘은 콘크리트 균열 치유에 활용할 수 있고 활용적 측면을 고려해 보았을 때 온실가스 감축에 큰 부분을 차지하기 때문에 친환경적이라고 말할 수 있다. 한국공개특허공보 제10-2015-0111528호에서는 콘크리트 또는 시멘트의 보수 등에 탄산칼슘을 형성하는 미생물을 이용하는 것을 개시하고 있다.

미생물의 탄산칼슘 석출능을 활용한 콘크리트 균열 치유는 최근 10년간 집중적으로 연구 개발이 진행되었고, 탄산칼슘 석출 메커니즘 중 요소 분해를 활용한 기술이 주를 이루고 있다. 요소 분해능을 보유한 미생물은 주변 환경에 요소가 있을 시 유레이스(urease)라는 요소분해효소를 활용하여 요소를 암모니아와 탄산으로 수화한다. 계속적인 요소 수화반응을 통해 암모니아와 수산화이온을 방출해 미생물 주변부의 pH를 알칼리 상태로 만들어 탄산칼슘 석출반응이 일어나기 가장 적합한 마이크로 환경으로 만들어 준다. 방출된 탄산은 중탄산염으로 전환되어 주변의 칼슘과 결합해 탄산칼슘을 석출하는 것이다. 하지만 요소 분해과정에서 생성되는 대사물질인 암모니아는 장기적인 콘크리트 내구성을 저하시키며 환경유해물질 및 독성물질로 작용해 콘크리트 시설물에 접촉이 잦은 인간 건강에도 큰 악영향을 미친다. 따라서 요소 분해를 활용하지 않아 탄산칼슘 석출 과정 중에 발생하는 2차 대사산물로 인한 환경 피해를 최소화할 수 있고, 기존 요소 분해를 이용한 탄산칼슘 석출 미생물 못지않게 탄산칼슘 석출량 및 그 강도도 우수하며 콘크리트 또는 그 시설물의 균열 치유에 적용할 수 있는 비요소 분해 탄산칼슘 석출 박테리아의 선정 및 보유 기술이 시급하다.

본 발명자들은 라이시니바실러스 속(Lysinibacillus sp.) YS11 균주가 요소 가수분해를 이용하지 않는 탄산칼슘 석출 메커니즘을 활용하는 미생물로, 요소 가수분해 과정으로부터 독성 암모니아 가스가 방출된다는 단점을 보완할 수 있다는 점을 확인한 바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 탄산칼슘 형성능을 갖는 라이시니바실러스 속(Lysinibacillus sp.) YS11 균주 (수탁번호 KACC81048BP) 를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 라이시니바실러스 속 YS11 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 라이시니바실러스 속 YS11 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 시멘트 또는 콘크리트 구조물의 균열 부위에 도말하는 것을 포함하는, 시멘트 또는 콘크리트 구조물의 균열 보수 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 탄산칼슘 형성능을 갖는 라이시니바실러스 속(Lysinibacillus sp.) YS11 균주(수탁번호 KACC81048BP)을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로서, 상기 균주는 비요소분해 메커니즘을 통해 탄산칼슘을 석출하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 균주는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 16S rRNA 유전자를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 라이시니바실러스 속 YS11 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는, 시멘트 또는 콘크리트 제조용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 라이시니바실러스 속 YS11 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는, 시멘트 또는 콘크리트 충전용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 라이시니바실러스 속 YS11 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는, 지반 강화용 조성물을 제공한다.

마지막으로, 본 발명은 라이시니바실러스 속 YS11 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 시멘트 또는 콘크리트 구조물의 균열 부위에 도말하는 것을 포함하는, 시멘트 또는 콘크리트 구조물의 균열 보수 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 신규한 미생물 라이시니바실러스 속(Lysinibacillus sp.) YS11 균주는 탄산칼슘 석출 미생물로서 탄산칼슘 생성을 통해 탄소를 고정을 하는 바, 상기 균주의 생애주기 동안 대기 중에 이산화탄소 저감 효과가 있다. 이에 따라, 친환경적으로 콘크리트의 내구성을 증진시켜 콘크리트의 사용수명을 증가시키며, 콘크리트 구조물의 균열을 보수할 수 있다.

또한, 상기 균주는 내염성, 내알칼리성, 및 내열성을 가지고 있는바, 고염, 고알칼리 환경인 콘크리트에 적용 가능성이 높아 효과적으로 콘크리트 구조물의 균열을 보수할 수 있고, 상기 균주가 콘크리트 균열 내부에서 탄산칼슘을 석출함으로써 콘크리트 구조물의 외부 균열은 물론 내부 균열의 보수에도 활용할 수 있다.

또한, 상기 균주는 비요소분해(non-ureolytic) 메커니즘을 이용하여 탄산칼슘을 석출하는바, 요소를 콘크리트 배합 재료로 포함할 필요가 없어 경제적이고, 또한 요소 분해과정에서 생성되는 환경 유해물질인 암모니아를 방출하지 않아 친환경적이며, 암모니아에 의한 콘크리트의 화학적 부식을 막을 수 있어 효율적이고, 콘크리트 시설물에 접촉하는 인체에 무해하다는 장점이 있다.

따라서, 본 발명에 따른 신규한 미생물 라이시니바실러스 속 YS11 균주는 친환경적인 자기치유 콘크리트 또는 건설재료로서 활용가능성이 높으며, 기존의 시멘트 및 폴리머 수지 표면처리 기법 등의 단기적인 치유 기술을 대체할 수 있는 지속 가능한 기술로 기대된다.

도 1은 요소 가수분해를 통해 탄산칼슘을 석출하는 미생물의 탄산칼슘 석출 반응과정을 도식화한 것이다.
도 2는 비요소분해 탄산칼슘형성 박테리아의 분리과정을 도식화한 것이다.
도 3는 라이시니바실러스 속 YS11 균주의 16S rRNA 유전자 서열을 나타낸 것이다.
도 4는 라이시니바실러스 속 YS11 균주의 16S rRNA를 암호화 하고 있는 유전자(rDNA)를 이용한 계통분류학적 모식도이다.
도 5는 라이시니바실러스 속 YS11와 상기 균주에 의해 석출된 탄산칼슘을 전자주사현미경을 이용하여 관찰한 것을 나타낸 것이다.
도 6a 및 도 6b는 라이시니바실러스 속 균주 YS11의 탄산칼슘 석출능을 에너지 분산 X선 분광 분석 및 X선 회절 분석으로 검증한 결과를 나타낸 것이다.
도 7a는 산소 조건에서 라이시니바실러스 속 균주 YS11의 생장, 주변부의 pH, 및 잔여 칼슘이온 농도의 변화를 나타낸 것이다.
도 7b는 저산소 조건에서 라이시니바실러스 속 균주 YS11의 생장, 주변부의 pH, 및 잔여 칼슘이온 농도의 변화를 나타낸 것이다.
도 7c는 무산소 조건에서 라이시니바실러스 속 균주 YS11의 생장, 주변부의 pH, 및 잔여 칼슘이온 농도의 변화를 나타낸 것이다.
도 8a 및 도 8b는 라이시니바실러스 속 YS11 균주의 내알칼리성 및 내염성 특징을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 라이시니바실러스 속 YS11 균주의 포자 및 내생포자 형성을 확인한 사진이다.

미생물의 탄산칼슘 석출능을 활용한 콘크리트 균열 치유는 최근 10년간 집중적으로 연구 개발이 진행되어 왔지만, 미생물의 요소 분해능을 활용한 치유 기술이 주를 이루고 있는 실정이다. 요소 분해능을 보유한 미생물의 유레이스(urease)는 탄산칼슘 석출반응을 촉진시킨다는 장점이 있지만, 요소 분해과정에서 생성되는 환경 유해물질인 암모니아는 콘크리트의 내구성을 저하시킬 뿐만 아니라 인체에도 악영향을 미친다는 단점이 있다.

본 발명자들은 요소 가수분해 과정을 활용하지 않는 탄산칼슘 석출 미생물을 찾기 위해 예의 연구하던 중, 서울시 성북천(37°34'44.9"N 127°01'28.8"E)의 물억새(Miscanthus sacchariflorus) 근권(rhizosphere)의 토양으로부터 분리된 라이시니바실러스 속(Lysinibacillus sp.) YS11 균주가 요소 분해능을 활용하지 않고 탄산칼슘을 석출하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 탄산칼슘 석출능을 갖는 신규 미생물 라이시니바실러스 속 YS11 균주를 제공한다. 상기 균주는 요소 분해능을 활용하지 않으며 탄산칼슘을 생성하는 것으로, 서열번호 1의 16S rRNA 유전자를 포함하며, 상기 16S rRNA 염기서열이 공시균주인 라이시니바실러스 마크로이데스(Lysinibacillus macroides)와 99.64% 유사성을 보여 신규한 균주로 인정되었다.

이에, 본 발명자들은 상기 분리된 신규한 균주를 라이시니바실러스 속(Lysinibacillus sp.) YS11로 명명하고, 2017년 5월 18일자로 농촌진흥청 농업유전자원센터에 수탁번호 KACC81048BP로 기탁하였고, YS11 균주의 16S rRNA의 염기서열은 NCBI (National Center for Biotechnology Information)에 등록번호 KY575121로 등록하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 YS11 균주를 B4 배지에 액체 배양한 후 전자주사현미경으로 관찰하고 에너지 분산 X선 분광 분석(Energy-dispersive X-ray spectroscopy) 및 X선 회절(X-ray diffraction)을 통해 상기 YS11 균주가 탄산칼슘을 주 성분으로 하는 미네랄을 생성하는 것을 확인하였다(도 5 내지 도 6b 참조). 이는 본 발명의 YS11 균주가 탄소를 탄산칼슘 형태로 석출함을 통해 대기 중에 이산화탄소 저감 효과를 나타내며 탄소순환에 큰 역할을 수행함을 시사한다.

기존에 공지된 탄산칼슘 석출 미생물은 요소 분해능을 이용하여 탄산칼슘을 생성할 수 있었으므로(도 1 참조), 미생물을 이용한 콘크리트의 내구성 증가 및 콘크리트 구조물의 균열 보수에 있어 탄산칼슘 석출 미생물과 함께 요소를 포함하여야 했다. 또한 상기 공지된 미생물은 요소를 분해하는 과정에서 질산염 또는 암모니아를 분비하는데, 암모니아는 독성물질로 콘크리트의 내구성을 저하시킬 뿐만 아니라 환경오염을 유발하고 인체에도 악영향을 미친다. 따라서 본 발명의 YS11 균주는 요소 분해과정을 활용하지 않는 탄산칼슘 석출 미생물로, 콘크리트에 적용 시 요소를 추가하는 비용을 절감할 수 있으며, 탄산칼슘 석출 과정 중에 발생하는 유해 2차 대사산물을 최소화할 수 있어, 친환경적이고 인체 무해한 자기치유 콘크리트(self-healing concrete)를 제공할 수 있으며, 또한 콘크리트 구조물의 균열 보수에도 이용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명의 YS11 균주가 탄산칼슘 석출 시 주변부의 pH를 상승시키는지 관찰하기 위하여 탄산칼슘 석출 조건에서의 생장 변화, 주변부의 pH 변화, 및 잔여 칼슘이온 농도의 변화를 관찰하였다. 또한 기존에 탄산칼슘을 석출한 220 rpm 교반을 준 산소 조건 외에도 저산소 및 무산소 조건에서도 상기 모니터링 실험을 진행하여 탄산칼슘 형성에 있어서 산소가 중요한 역할을 수행하는지 확인하였다. 그 결과, 오직 산소 조건에서만 상기 YS11 균주가 탄산칼슘을 형성하는 것이 확인되었다. 구체적으로, 산소 조건에서 상기 YS11 균주는 pH 8.9 까지의 알칼리 환경을 조성하였으며, 최초 주어진 칼슘이온의 95%를 소진하였다(도 7a 참조). 또한, 저산소 및 무산소 조건에서는 탄산칼슘을 형성하지 않는 바, 산소의 유입이 탄산칼슘 석출에 매우 중요하다는 점을 알 수 있었다(도 7b 및 도 7c 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명의 YS11 균주 그람 양성(gram-positive)의 간균(rod shape)의 형태를 가지고, 내염 및 내알칼리성 특징을 보유하고 있음을 확인하였다(도 8a, 도 8b, 및 실시예 5 참조). 구체적으로, 염(NaCl) 농도 6%, pH 11 까지의 환경에서 생존 및 생장 가능하여 다양한 환경적 스트레스에 저항성을 보이는 바, 고염, 고알칼리 환경인 콘크리트에 적용 가능성이 높으며, 콘크리트 구조물의 외부 균열은 물론 내부 균열의 보수에도 적용될 수 있다.

본 발명의 YS11 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물은 콘크리트의 내구성 증진 또는 콘크리트 구조물의 균열 보수를 위해, 시멘트 또는 콘크리트의 조성물과 지반 강화용 조성물에 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 YS11 균주의 탄산칼슘 형성 작용으로 인하여, 시멘트 또는 콘크리트 구조물의 균열 부위에 YS11 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 도말하여 상기 균열을 보수할 수 있다. 이때 도말은 스프레이를 이용하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 YS11 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 상기 배양물의 농축물을 조성물로 포함하거나 구조물의 균열 부위에 도말하는 경우에 있어서, 상기 YS11 균주, 상기 균주의 배양물, 또는 상기 배양물은 동결건조된 분말형태로 이용될 수 있으며, 상기 YS11 균주는 영양분과 함께 캡슐화된 상태로 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 라이니시바실러스 속 YS11 균주의 순수 분리

도 2에 나타낸 바와 같이, 비요소 분해(non-ureolytic) 탄산칼슘 석출 미생물을 분리하기 위하여, 물억새 근권의 토양 시료 0.1 g을 채취하여 인산염 완충 식염수(phosphate-buffered saline, PBS, pH 7.5) 1 ml 에 재현탁(resuspension)한 다음, 상온에서 13,200 rpm의 속도로 1분간 원심분리하여 씻어냈다(wash). 이하 wash 과정을 두 번 반복하여 마지막 샘플 현탁액을 100 μL씩 영양 평판 배지인 Luria-Bertani broth (LB), tryptic soy broth (TSB), 및 tryptone yeast glucose broth (TYG)에 희석하여 도말하고, 30℃ 의 온도에서 12 내지 24 시간 동안 배양하였다. 상기 평판 배지 위에 나타난 미생물 군집(colony)을 탄산칼슘 석출 유도 배지인 영양 평판 배지 B4(0.25% calcium-acetate, 0.4% yeast extract, 0.5% glucose)에 접종하여 탄산칼슘 석출 여부를 확인하였고, 다른 균주에 비해 빠른 속도의 탄산칼슘 석출능을 보인 미생물을 선별하여 이를 YS11 균주로 명명하였다.

실시예 2. 라이니시바실러스 속 YS11 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열 및 그 계통 확인

순수 분리를 통해 얻은 상기 YS11 균주의 특성을 알아보기 위하여, 먼저 YS11 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하고 그 계통분류를 파악하여 속명을 확인하였다. 구체적으로, YS11 균주의 16S rRNA 유전자를 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3')와 1492R(5'- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')의 유니버설 프라이머를 이용하여 58℃의 어닐링(annealing) 조건하에서 중합효소 연쇄반응 (polymeric chain reaction, PCR)을 수행하였다. 보다 상세하게는 94℃- 90초, [94℃- 45초, 58℃- 45초, 72℃- 45초] X 25 사이클을 통해 16S rRNA 유전자의 PCR 산물을 얻었다. 상기 PCR 산물을 이용하여 YS11 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열(sequence)을 파악하고(도 3 참조), EzTaxon 프로그램을 활용하여 타 균주와 염기서열 유사도를 비교하여 YS11 균주의 계통을 확인하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, YS11 균주의 16S rRNA 유전자는 Lysinibacillus macroides의 16S rRNA 유전자와 99.64%의 염기서열 유사성을 보이므로, YS11 균주는 열과 염에 대한 저항성이 있다고 알려진 라이니시바실러스 속(Lysinibacillus sp.)에 속하는 것으로 파악되었다.

실시예 3. 라이니시바실러스 속 YS11 균주의 탄산칼슘 석출 특성 확인

순수 분리를 통해 얻은 상기 라이시니바실러스 속 YS11 균주를 B4 배지에 5일 동안 220 rpm으로 액체 배양을 한 후 배양액 1 ml을 원심분리(13,200 rpm, 1 min)했으며, 전자주사현미경(field-emission scanning electron microscopy; FE-SEM) 및 에너지 분산 X선 분광 (energy dispersive X-ray) 분석을 위해 미생물 고정 전처리 단계를 거쳤다. 구체적으로, 4℃ 에서 2 시간 동안 카르노프스키 고정(Karnovsky's fixation: 2% paraformaldehyde, 2.5% glutaraldehyde, 0.1 M phosphate buffer, pH 7.2)을 수행하고, 상기 시료를 5,000 rpm으로 2분 동안 원심분리하여 미생물 고정 전처리를 수행하였다. 고정된 미생물 시료를 두 차례 0.01 M potassium phosphate (pH 7.8)로 상온에서 씻었으며, 오즈미움 테트라옥사이드 솔루션 (2% osmium tetroxide)을 이용한 두 번째 시료 고정단계를 4℃에서 2 시간 동안 수행하였다. 두 차례 고정된 미생물을 3차 증류수로 두 번 씻었으며, 30%, 50%, 70%, 및 100% 의 에탄올 용액에 재현탁(resuspension)하여 각각 10분 동안 탈수시켰다. 완성된 시료는 알루미늄 스터브(stub)에 올려 3-4일간 건조시켰으며, 전자현미경 관찰 직전에 플라티눔(platinum)으로 70초 동안 코팅하여 전도도를 높였다. 또한, 상기 YS11 균주를 B4 배지에 5일 동안 220 rpm으로 액체 배양한 후, 배양물을 동결건조하여 X선 회절(X-ray diffraction) 분석을 수행하였다.

상기 고정된 시료를 전자주사현미경으로 관찰한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 라이시니바실러스 속 YS11 균주는 간균 형태로 미네랄과 응집되어 있으며, 일부 YS11 균주의 세포벽 외피는 미네랄로 뒤덮여 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 에너지 분산 X선 분광과 X선 회절을 통해 분석을 한 결과, 도 6a 및 도 6b에 나타낸 바와 같이, 상기 미네랄은 탄산칼슘을 주요성분으로 포함하고 있음을 확인하였다. 상기 실험 결과는 라이니시바실러스 속 YS11 균주에 탄산칼슘 석출능이 있음을 시사한다.

실시예 4. 폭기(aeration) 정도에 따른 라이니시바실러스 속 YS11 균주의 탄산칼슘 형성 확인

상기 라이시니바실러스 속 YS11 균주가 탄산칼슘 석출한 220 rpm의 교반을 준 산소 조건(aerobic condition)에서 시간이 지남에 따라 상기 YS11 균주의 생장, 주변부의 pH, 및 잔여 칼슘이온 농도 변화를 확인하였다. 또한 콘크리트 내부의 환경과 같이 산소의 유입이 적은 경우에도 산소 조건과 동일하게 탄산칼슘이 석출되는지 확인하고자 저산소 조건(hypoxia condition)과 무산소 조건(anaerobic condition)을 설정하여 시간이 지남에 따라 상기 YS11 균주의 생장, 주변부의 pH, 및 잔여 칼슘이온 농도 변화를 확인하였다. 구체적으로, 저산소 조건은 B4 배지에 상기 YS11 균주를 접종한 직후 파라핀유를 덮고 정치 상태에서 배양하였다. 무산소 조건은 유리병에 B4 배지를 가득 채운 뒤 뚜껑(closed top cap)으로 밀봉하였다. 이때, 무산소 조건에 산소가 유입되지 않음은 완전 호기성균인 슈도모나스 푸티다 KT2440(Pseudomonas putida KT2440)를 상기 무산소 조건에서 배양하여 생존하지 못하는 것을 확인함으로써 검증하였다.

그 결과 도 7a 내지 7c에 나타낸 바와 같이, 상기 YS11 균주는 상기 모든 조건에서 생장하지만 산소가 부족한 조건으로 갈수록 생장이 줄어드는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 산소 조건에서만 시간이 지날수록 칼슘이온의 농도가 줄어드는 것을 확인할 수 있었고, 최종적으로는, 최초 칼슘이온의 95%가 소진됨을 확인할 수 있었다. 이와 더불어 산소 조건에서만 유의한 pH의 상승을 확인할 수 있었고, 최종적으로는, pH 8.9의 염기성 환경이 조성되었다. 다만, 무산소 조건에서는 초기에 칼슘이온의 농도가 줄어들었으나 시간이 지나 다시 원상태로 돌아왔으며 pH 상승은 매우 미미함을 확인하였다. 또한, 무산소 조건에서는 pH와 칼슘이온 농도의 변화가 관찰되지 않고 일정하게 유지됨을 확인할 수 있었다. 상기에 따라, 상기 YS11 균주는 산소 조건에서만 유의한 탄산칼슘 형성이 가능함을 확인하였으며, 이는 탄산칼슘 형성에 있어서 폭기가 중요한 인자라는 점을 의미한다.

실시예 5. 라이니시바실러스 속 YS11 균주의 내염, 내알칼리 특성 확인

상기 라이시니바실러스 속 YS11 균주의 내염 및 내알칼리 특성을 확인하기 위하여, YS11 균주를 LB 액체 배지에 12시간 동안 220 rpm, 30℃에서 배양한 후 배양액 1 ml을 원심분리 (13,200 rpm, 1 min)하여 샘플 펠렛(pellet)을 두 차례 인산염 완충 식염수로 씻어냈다. 600nm 파장대를 이용해 1 ml 펠렛-PBS 용액의 흡광도를 측정했으며 해당 값을 기반으로 10⁶ cell/ml를 구했다. 96 웰 플레이트(96-well plate)를 준비해 각 열(row)당 내염 및 내알칼리성 특징을 파악하기 위해 해당 액체 배지에 (내염성 테스트: 0%, 1%, 2%, 3%, 5%, 6%, 7% NaCl, 내알칼리성 테스트: pH6, pH 7, pH 9, pH 10, pH 11, pH 12) 200 μL씩 넣었다. 보다 상세하게는 기존 LB 액체 배지의 NaCl 농도, 혹은 pH를 NaOH로 적정하여 200 μL씩 취하여 사용하였다. 그 후 상기 YS11 균주를 10⁶ cell/ml 농도가 되도록 96 웰 플레이트에 각각 접종하여 배양하고, 마이크로타이터 기기를 사용하여 생장률을 모니터링하였다. 흡광도 측정 전에는 1,000 rpm으로 흔들고(shaking) 측정 직전에는 100 rpm으로 흔들어 1시간 마다 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 8a 및 도 8b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 라이시니바실러스 속 YS11 균주는 내염 및 내알칼리 특성을 나타내었다. 구체적으로, 도 8a에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 YS11 균주는 pH 11의 환경에서도 생장하였고, 도 8b에서 확인할 수 있는 바와 같이, 염(NaCl) 농도 6%의 환경에서도 생존하여 생장하였다.

실시예 6. 라이니시바실러스 속 YS11 균주의 포자 및 내생포자 형성 확인

포자는 다양한 스트레스 조건에서도 저항성을 나타내 미생물의 장기간 생존 유지를 위한 하나의 phenotype으로, 내열성 특징을 지닌 상기 YS11 균주의 포자 및 내생포자 형성 여부를 확인하였다. 구체적으로, YS11 균주를 액체 B4 배지에 배양하여 미생물이 사용할 수 있는 영양분의 고갈을 유도해 포자 혹은 내생포자 형성 여부를 파악하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 상기 YS11 균주는 포자를 형성하였고 내생포자는 center endospore 형태를 띠고 있음을 확인하였다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

농업생명공학연구원

KACC81048BP

20170518

<110> Korea University Industry and Academy Cooperation Foundation <120> Lysinibacillus sp. YS11 and use thereof <130> MP17-079 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1385 <212> RNA <213> Lysinibacillus sp. YS11 16S rRNA <400> 1 ggagcttgct cctttgacgt tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggc aacctaccct 60 atagtttggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccga ataatctctt ttgcttcatg 120 gtgaaagact gaaagacggt ttcggctgtc gctataggat gggcccgcgg cgcattagct 180 agttggtgag gtaacggctc accaaggcga cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg 240 gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc 300 cacaatgggc gaaagcctga tggagcaacg ccgcgtgagt gaagaaggtt ttcggatcgt 360 aaaactctgt tgtaagggaa gaacaagtac agtagtaact ggctgtacct tgacggtacc 420 ttattagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc 480 gttgtccgga attattgggc gtaaagcgcg cgcaggcggt cctttaagtc tgatgtgaaa 540 gcccacggct caaccgtgga gggtcattgg aaactggggg acttgagtgc agaagaggaa 600 agtggaattc caagtgtagc ggtgaaatgc gtagagattt ggaggaacac cagtggcgaa 660 ggcgactttc tggtctgtaa ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt 720 agataccctg gtagtccacg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc 780 cttagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa 840 actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca 900 acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ccgttgacca ctgtagagat atagtttccc 960 cttcgggggc aacggtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt 1020 gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt gatcttagtt gccatcattt agttgggcac 1080 tctaaggtga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc 1140 cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggacgat acaaacggtt gccaactcgc 1200 gagagggagc taatccgata aagtcgttct cagttcggat tgtaggctgc aactcgccta 1260 catgaagccg gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg 1320 ccttgtacac accgcccgtc acaccacgag agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggtaa 1380 ccttt 1385

Claims

탄산칼슘 형성능을 갖는 라이시니바실러스 속 YS11 (Lysinibacillus sp. YS11) 균주 (수탁번호 KACC81048BP).
제 1 항에 있어서,
상기 균주는 비요소분해 메커니즘을 통해 탄산칼슘을 석출하는 것을 특징으로 하는, 라이시니바실러스 속 YS11 균주.
제 1 항에 있어서,
상기 균주는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 16S rRNA 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 라이시니바실러스 속 YS11 균주.
제 1 항의 라이시니바실러스 속 YS11 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는, 시멘트 또는 콘크리트 제조용 조성물.
제 1 항의 라이시니바실러스 속 YS11 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는, 시멘트 또는 콘크리트 충전용 조성물.
제 1 항의 라이시니바실러스 속 YS11 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함하는, 지반 강화용 조성물.
제 1 항의 라이시니바실러스 속 YS11 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 시멘트 또는 콘크리트 구조물의 균열 부위에 도말하는 것을 포함하는, 시멘트 또는 콘크리트 구조물의 균열 보수 방법.