KR102348818B1 - 혼합균주를 이용한 phb의 생산방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Acinetobacter junii BP25 균주 및 Aeromonas hydrophila 균주를 포함하는 PHB(polyhydroxybutyrate) 생산용 조성물, 상기 PHB 생산용 조성물을 포함하는 PHB(polyhydroxybutyrate) 생산용 키트 및 상기 Acinetobacter junii BP25 균주 및 Aeromonas hydrophila 균주의 혼합균주를 부영양(feast) 배지와 빈영양(famine) 배지에서 순차적으로 반복하여 배양하는 단계를 포함하는 PHB(polyhydroxybutyrate)의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 PHB 생산용 조성물을 이용하면, 보다 효과적이면서도 높은 수율로 PHB를 생산할 수 있으므로, 미생물을 이용한 유용성분의 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

혼합균주를 이용한 PHB의 생산방법{Process for preparing PHB using mixed microbs}
본 발명은 혼합균주를 이용한 PHB의 생산방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 Acinetobacter junii BP25 균주 및 Aeromonas hydrophila 균주를 포함하는 PHB(polyhydroxybutyrate) 생산용 조성물, 상기 PHB 생산용 조성물을 포함하는 PHB(polyhydroxybutyrate) 생산용 키트 및 상기 Acinetobacter junii BP25 균주 및 Aeromonas hydrophila 균주의 혼합균주를 부영양(feast) 배지와 빈영양(famine) 배지에서 순차적으로 반복하여 배양하는 단계를 포함하는 PHB(polyhydroxybutyrate)의 제조방법에 관한 것이다.
플라스틱 소재는 현대인의 풍요로운 일상생활과 산업발달에 큰 공헌을 해 온 반면, 대량으로 발생되는 각종 폐비닐, 스티로폼, 플라스틱 용기 등의 소각이나 매립에 따른 환경호르몬 누출, 맹독성의 다이옥신 검출, 폐기물의 불완전 연소에 의한 대기오염 발생 등과 같은 심각한 환경오염의 원인으로 대두되고 있다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 쓸 때는 보통 플라스틱처럼 간편하게 쓸 수 있고 사용 후에는 토양 중의 미생물에 의해 썩는 환경 친화적이고 무해한 플라스틱인 생분해성 플라스틱의 상용화 및 의무화의 압력이 거세지면서 독일, 이태리, 미국 등 선진 각국에서는 쇼핑백, 플라스틱제 병의 생분해성 수지 사용을 의무화하는 등 생분해성 플라스틱의 실용화가 활발히 진행되고 있다.
PHB는 미생물에 의해 합성되는 에너지 저장 고분자물질로서 기존의 플라스틱원료가 되는 화학합성 고분자와 물리적 성질이 비슷하면서, 또한, 생분해성이 매우우수하여 토양미생물에 의하여 짧은시간 내에 물과 이산화탄소로 완전분해되는 환경친화적 플라스틱 원료이다. 그러나, 이러한 PHB의 친환경 플라스틱 원료로서의 높은 이용가치에 비하여 상대적으로 범용적인 비분해성 일반 플라스틱원료보다 생산단가가 높아 고가의 의료용품 외에는 그 사용에 있어 매우 한계가 있는 실정이다.
자연계에 존재하는 대부분의 미생물이 PHB를 에너지 저장물질로서 주변환경이 열악한 상황 하에서는 세포 내에 건조균체 중량의 20-40% 정도로만 축적할 수 있는 것으로 알려져 있었으나, 최근 PHB의 상업화를 준비중인 국내외 일부 기업체 및 연구기관 등에서는 대장균에 PHB 생합성 유전자를 전이 시키는 방법 등을 이용한 더욱 진보된 생물공학적 기법 및 유전공학 기법을 사용하여 PHB를 건조균체 중량의 80% 이상까지 축적 가능케 한 것으로 알려져 있다. 이같은 PHB 생산을 위하여 주로 알칼리게네스 유트로퍼스, 알칼리게네스 레이터스 등의 균주를 사용하는 방법이 개발되고 있으나, 최근에는 알칼리게네스 유트로퍼스의 PHB합성 유전자를 성장속도가 빠르고 산업적으로 가장 널리 이용되고 있는 대장균에 형질전환하여 PHB의 생산성을 높이기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 예를 들어, 한국공개특허 제10-2004-0046678호에는 PHB의 생산성을 향상시킬 수 있는 신규한 균주를 이용한 기술이 개시되어 있고, 한국등록특허 제10-0454250호에는 3단계 배양방법으로 형질전환 대장균을 배양하여 PHB의 생산성을 향상시키는 방법이 개시되어 있다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 PHB의 생산성을 향상시키는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, Acinetobacter junii BP25 균주 및 Aeromonas hydrophila 균주의 혼합균주를 두 가지 배지에서 순차적으로 반복배양하는 방법을 사용할 경우, PHB의 생산성을 현저히 향상시킬 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 주된 목적은 Acinetobacter junii BP25 균주 및 Aeromonas hydrophila 균주를 포함하는 PHB(polyhydroxybutyrate) 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 PHB 생산용 조성물을 포함하는 PHB(polyhydroxybutyrate) 생산용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 Acinetobacter junii BP25 균주 및 Aeromonas hydrophila 균주의 혼합균주를 부영양(feast) 배지와 빈영양(famine) 배지에서 순차적으로 반복하여 배양하는 단계를 포함하는 PHB(polyhydroxybutyrate)의 제조방법을 제공하는 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 Acinetobacter junii BP25 균주 및 Aeromonas hydrophila 균주를 포함하는 PHB(polyhydroxybutyrate) 생산용 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 PHB의 생산성을 향상시키기 위하여, 다양한 연구를 수행하던 중, 종래에 PHB를 생산하는 것으로 알려진 균주를 조합하여 배양할 경우, 균주의 성장율이 현저히 향상됨을 확인하였다. 즉, 지금까지 알려진 PHB 생산 균주 중에서 Acinetobacter junii BP25 균주 및 Aeromonas hydrophila 균주는 이들 각각을 개별적으로 배양할 경우 보다도, 균체수를 기준으로 1:1로 혼합한 후에 배양할 경우에 균주의 성장율이 현저히 향상됨을 확인하였다. 균체의 성장율이 향상되어 균체의 바이오매스가 증가되면, 이같은 균체로부터 생산되는 PHB의 생산성이 증가되므로, 상기 2종 균주를 포함하는 조성물은 PHB의 생산성이 향상된 PHB 생산용 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명의 용어 "Acinetobacter junii BP25 균주"란, 패혈증 또는 호흡기 질환을 유발시키는 것으로 알려진 병원균의 일종인 Acinetobacter junii 균주의 아종으로서 알려져 있으며, PHB를 생산하는 능력을 갖는다고 알려져 있다.
본 발명의 용어 "Aeromonas hydrophila 균주"란, 에어로모나스 속에 속하는 그람음성의 통지성형기성단가균의 일종으로서, 편모를 지니는 수생균의 형태이며, 포도당을 발효시켜서 다양한 유기가스를 생산하며, 사람에서는 병원균의 일종인 것으로 알려져 있고, PHB를 생산하는 능력을 갖는다고 알려져 있다.
본 발명의 다른 실시양태는 상기 PHB 생산용 조성물을 포함하는 PHB(polyhydroxybutyrate) 생산용 키트를 제공한다.
본 발명의 PHB 생산용 조성물을 포함하는 PHB 생산용 키트는 상기 조성물을 이용한 PHB 생산성을 증가시키는데 필요한 다양한 구성요소를 포함할 수 있다. 이러한 구성요소는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 조성물에 포함된 균주의 배양에 사용되는 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 일 예로서, 배양용기, 배양용 배지, 배양용 진탕배양기, 배양용 타이머 등이 될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 상기 Acinetobacter junii BP25 균주 및 Aeromonas hydrophila 균주의 혼합균주를 이용하여 PHB를 생산하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 본 발명의 PHB 생산방법은 (a) Acinetobacter junii BP25 균주 및 Aeromonas hydrophila 균주를 동일수준으로 포함하는 혼합균주를 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 혼합균주를 부영양(feast) 배지에 접종하고 배양한 다음, 빈영양(famine) 배지에 접종하고 배양하는 과정을 순차적으로 반복하여 수행하는 단계; 및. (c) 배양이 종료된 후, 배양물로부터 PHB를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 용어 "배양"이란, 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미하며 플라스크배양(flask culture), 회분배양(batch culture)등이 포함되나 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 부영양(feast) 배지는 상기 균주를 성장시킬 수 잇는 배지로서, 탄소원과 다양한 영양성분을 포함하는 배지인 것으로 해석될 수 있다.
상기 부영양 배지에 포함되는 탄소원은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 본 발명에서 제공하는 2종의 PHB 생산균주의 성장을 보조할 수 있는 탄소원이 될 수 있고, 다른 예로서, 소듐아세테이트, 소듐부티레이트 등을 단독으로 사용하거나 또는 조합하여 사용한 것이 될 수 있다.
상기 부여양 배지에 포함되는 영양성분은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 본 발명에서 제공하는 2종의 PHB 생산균주의 성장을 보조할 수 있는 다양한 미네랄 성분이 될 수 있고, 다른 예로서, NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, (NH4)2HPO4, MgSO47H2O, 펩톤(peptone), 효모 추출물(yeast extract) 등을 단독으로 사용하거나 또는 조합하여 사용한 것이 될 수 있다.
상기 부영양 배지와 대비되는 빈영양 배지는 상기 균주의 성장에는 별다른 영향을 미치지 않고, 상기 균주에서 생산되는 PHB의 생산성을 향상시키는 배지인 것으로 해석될 수 있다.
상기 빈영양 배지는 탄소원만을 포함하는데, 이에 포함되는 탄소원은 앞서 설명한 바와 동일하다.
상기 (b) 단계의 배양은 부영양 배지에서 배양한 다음 빈영양 배지에서 배양하고, 이후 다시 부영양 배지에서 배양하는 방식으로, 두 가지 배지를 사용하여 순차적으로 반복배양하는 방식으로 수행될 수 있다.
이때, 부영양 배지에서 배양하는 시간과 빈영양 배지에서 배양하는 시간은 동일하게 설정하여야 하는데, 이들 배양시간은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 36 내지 60시간이 될 수 있고, 다른 예로서, 72 내지 54시간이 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 48시간이 될 수 있다.
아울러, 상기 배양을 수행하는 온도조건은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 20 내지 45℃가 될 수 있고, 다른 예로서, 25 내지 40℃가 될 수 잇으며, 또 다른 예로서 30 내지 35℃가 될 수 있다.
또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.
또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 27℃ 내지 37℃, 바람직하게는 30℃ 내지 35℃이다. 배양은 상기 펩타이드의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 100시간에서 달성된다.
상기 (c) 단계의 PHB 회수는 투석, 원심분리, 여과, 용매추출, 크로마토그래피, 결정화 등의 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 배양물을 원심분리하여 형질전환체가 제거된 상등액을 수득하고, 상기 수득한 상등액을 용매추출법에 적용하여 목적하는 PHB를 회수하는 방법을 사용할 수 있고, 이외에도 상기 목적하는 PHB의 특성에 맞추어 공지된 실험방법을 조합하여 상기 PHB를 회수할 수 있는 방법이라면 특별히 제한되지 않고 사용될 수 있다.
본 발명에서 제공하는 PHB 생산용 조성물을 이용하면, 보다 효과적이면서도 높은 수율로 PHB를 생산할 수 있으므로, 미생물을 이용한 유용성분의 생산에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 2종의 균주(Acinetobacter junii BP25 균주, Aeromonas hydrophila 균주)를 각각 개별적으로 또는 공동배양할 경우, 배양시간의 경과에 따른 바이오매스의 수준변화를 나타내는 그래프이다.
도 2는 Acinetobacter junii BP25 균주를 2회의 Cycle-2 조건으로 배양하면서 배양시간의 경과에 따른, 탄소원 흡수율의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3은 Aeromonas hydrophila 균주를 2회의 Cycle-2 조건으로 배양하면서 배양시간의 경과에 따른, 탄소원 흡수율의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4는 공동배양 균주를 2회의 Cycle-2 조건으로 배양하면서 배양시간의 경과에 따른, 탄소원 흡수율의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 5a는 Acinetobacter junii BP25 균주 및 Aeromonas hydrophila 균주를 각각 개별적으로 배양하거나 또는 공동배양할 경우, 배지의 pH 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5b는 Acinetobacter junii BP25 균주 및 Aeromonas hydrophila 균주를 각각 개별적으로 배양하거나 또는 공동배양할 경우, 배지내 용존산소의 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: PHB 생산균주의 배양
PHB 생산특성을 나타내는 것으로 알려진 2종의 균주(Acinetobacter junii BP25 균주, Aeromonas hydrophila 균주)를 각각 개별적으로 또는 공동배양하고, 배양이 종료된 후, 배양물에 포함된 바이오매스의 수준을 분석하였다(도 1). 상기 바이오매스의 수준은 하기 Gompertz equation 응용공식(1)에 의해 산출되었다.
f = a x Exp (-Exp (b*2.71828 x (c-x)/a+1))+d ......(1)
상기 식에서,
f는 biomass concentration (g/L)를 나타내고;
a는 maximum biomass growth (g/L)를 나타내며;
b는 maximum growth rate (g/L-h)를 나타내고;
c는 lag phase (h)를 나타내며;
x는 time (h)를 나타내고;
d는 initial biomass concentration (g/L)를 나타낸다.
도 1은 2종의 균주(Acinetobacter junii BP25 균주, Aeromonas hydrophila 균주)를 각각 개별적으로 또는 공동배양할 경우, 배양시간의 경과에 따른 바이오매스의 수준변화를 나타내는 그래프이다.
도 1에서 보듯이, Acinetobacter junii BP25 균주의 최대 성장율은 0.25/h이고, Aeromonas hydrophila 균주의 최대 성장율은 0.17/h이며, 공동배양 균주의 최대 성장율은 0.30/h로 확인되었다.
상기 결과로부터, 공동배양 균주는 개별적으로 배양된 각 균주 보다도 성장율이 우수하므로, 상대적으로 우수한 바이오매스의 생산량을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 2: Acinetobacter junii BP25 균주의 배양
실시예 2-1: 균주배양
먼저, 탄소원(소듐아세테이트 6g/L 및 소듐부티레이트 4g/L)과 기타 영양성분(NaCl 1 g/L, Na2HPO4 0.37 g/L, KH2PO4 0.1 g/L, (NH4)2HPO4 0.05g/L, MgSO47H2O 0.02 g/L, peptone 0.5 g/L, yeast extract 0.05 g/L)을 포함하는 부영양(feast) 배지(pH 7.0±0.2)와 탄소원(소듐아세테이트 6g/L 및 소듐부티레이트 4g/L) 만을 포함하는 빈영양(famine) 배지(pH 7.0±0.2)를 각각 준비하였다.
상기 준비된 부영양 배지에 10%(v/v)의 Acinetobacter junii BP25 균주를 접종하고, 호기성 조건에서 48시간 동안 배양한 다음, 배지를 빈영양 배지로 교체하고 호기성 조건에서 48시간 동안 배양하였다(Cycle-1). 이어, 다시 배지를 부영양 배지로 교체하고 호기성 조건에서 48시간 동안 배양한 다음, 배지를 빈영양 배지로 교체하고 호기성 조건에서 48시간 동안 배양하였다(Cycle-2).
실시예 2-2: 탄소원 분석
상기 실시예 2-1의 방법으로 배양을 진행하면서, 배양시간의 경과에 따른, 탄소원의 배지내 농도변화 및 이용율을 측정하였다(도 2).
도 2는 Acinetobacter junii BP25 균주를 2회의 Cycle-2 조건으로 배양하면서 배양시간의 경과에 따른, 탄소원 흡수율의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 2에서 보듯이, 부영양 단계에서는 소듐아세테이트의 최대 이용율은 약 75%이고, 소듐부티레이트의 최대 이용율은 약 68%를 나타냄을 확인하였다. 반면, 빈영양 단계에서는 소듐아세테이트의 최대 이용율은 약 69%이고, 소듐부티레이트의 최대 이용율은 약 61%를 나타냄을 확인하였다.
실시예 2-3: PHB 생산성 분석
상기 실시예 2-1의 방법으로부터 수득한 배양물에서 생성된 PHB의 생산성을 분석하였다(표 1). 상기 PHB의 생산성 분석은 배양물로부터 PHB를 분리정제하고, 분리정제된 PHB의 수준을 HPLC를 사용하여 정량분석함으로써 수행되었다.
이때. PHB의 분리정제는 다음과 같이 수행되었다: 먼저, 배양물을 원심분리(4℃, 3000 x g, 10분)하여, 침전된 바이오매스를 수득하고, 이를 70 % 에탄올로 세척한 다음 다시 원심분리하여 불순물이 제거된 바이오매스를 수득하였다. 상기 수득한 바이오매스에 동일부피의 클로로포름과 10% 차염소산나트륨을 가하고, 진탕반응(120 rpm, 35±0.2℃, 3시간)시켜서, 바이오매스를 분쇄한 다음, PHB를 포함하는 클로로포름 하부층 분획을 수집하였다. 상기 수집한 클로로포름 하부층 분획에 차가운 메탄올을 가하여 침전물을 형성하고, 이를 원심분리하여 침전물을 회수한 다음 이를 건조하여, PHB를 분리정제하였다.
상기 분리정제된 PHB의 정량분석은 HPLC를 사용하여 수행되었는데, 대략적으로, 상기 분리정제된 PHB 시료를 황산에 용해시켜 수득한 용액을 90℃에서 30분 동안 가열하여 반응물을 수득하고, 수득한 반응물을 대상으로 HPLC 분석(Aminex HPX-87H 컬럼 (Bio-Rad Laboratories, USA), 210 nm 자외선 검출기(Waters 2487, MA, USA) 및 5mM H2SO4 이동상)을 수행하였다.
Acinetobacter junii BP25 균주의 PHB 생산성
탄소원 주기 배양방법 PHB (g/L) PHB (g/g carbon sourceadded)
Cycle-1 부영양 0.38 0.054
빈영양 1.78 0.272
Cycle-2 부영양 0.41 0.056
빈영양 1.82 0.270
상기 표 1에서 보듯이, 부영양 단계에서는 바이오매스가 급격하게 증식되었으나, PHB의 최대수율은 0.41 g/L를 나타내었고, 빈영양 단계에서는 바이오매스의 증식이 확인되지 않았으나, PHB의 최대수율은 1.82 g/L를 나타냄을 확인하였다.
상기 도 2 및 표 1의 결과로부터, Acinetobacter junii BP25 균주의 배양시 부영양 단계에서는 균체의 성장이 수행되었고, 빈영양 단계에서는 PHB의 생산이 수행된 것으로 분석되었다.
실시예 3: Aeromonas hydrophila 균주의 배양
실시예 3-1: 균주배양
Acinetobacter junii BP25 균주 대신에, Aeromonas hydrophila 균주를 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 2-1과 동일한 방법으로 균주를 배양하였다.
실시예 3-2: 탄소원 분석
상기 실시예 3-1의 방법으로 배양을 진행하면서, 배양시간의 경과에 따른, 탄소원의 배지내 농도변화 및 이용율을 측정하였다(도 3).
도 3은 Aeromonas hydrophila 균주를 2회의 Cycle-2 조건으로 배양하면서 배양시간의 경과에 따른, 탄소원 흡수율의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3에서 보듯이, 부영양 단계에서는 소듐아세테이트의 최대 이용율은 약 67%이고, 소듐부티레이트의 최대 이용율은 약 52%를 나타냄을 확인하였다. 반면, 빈영양 단계에서는 소듐아세테이트의 최대 이용율은 약 61%이고, 소듐부티레이트의 최대 이용율은 약 44%를 나타냄을 확인하였다.
실시예 3-3: PHB 생산성 분석
상기 실시예 2-1의 방법으로부터 수득한 배양물 대신에, 상기 실시예 3-1의 방법으로부터 수득한 배양물을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-3과 동일한 방법으로 PHB의 생산성을 분석하였다(표 2).
Aeromonas hydrophila 균주의 PHB 생산성
탄소원 주기 배양방법 PHB (g/L) PHB (g/g carbon sourceadded)
Cycle-1 부영양 0.15 0.026
빈영양 0.96 0.168
Cycle-2 부영양 0.17 0.027
빈영양 1.12 0.175
상기 표 2에서 보듯이, 부영양 단계에서는 바이오매스가 급격하게 증식되었으나, PHB의 수율은 0.17 g/L를 나타내었고, 빈영양 단계에서는 바이오매스의 증식이 확인되지 않았으나, PHB의 수율은 1.12 g/L를 나타냄을 확인하였다.
상기 도 3 및 표 2의 결과로부터, Aeromonas hydrophila 균주의 배양시에도 역시 부영양 단계에서는 균체의 성장이 수행되었고, 빈영양 단계에서는 PHB의 생산이 수행된 것으로 분석되었다.
실시예 4: 공동배양
실시예 4-1: 균주배양
Acinetobacter junii BP25 균주 대신에, Acinetobacter junii BP25 균주와 Aeromonas hydrophila 균주가 동량으로 혼합된 혼합균주를 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 2-1과 동일한 방법으로 균주를 배양하였다.
실시예 4-2: 탄소원 분석
상기 실시예 4-1의 방법으로 배양을 진행하면서, 배양시간의 경과에 따른, 탄소원의 배지내 농도변화 및 이용율을 측정하였다(도 4).
도 4는 공동배양 균주를 2회의 Cycle-2 조건으로 배양하면서 배양시간의 경과에 따른, 탄소원 흡수율의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 4에서 보듯이, 부영양 단계에서는 소듐아세테이트의 최대 이용율은 약 78%이고, 소듐부티레이트의 최대 이용율은 약 74%를 나타냄을 확인하였다. 반면, 빈영양 단계에서는 소듐아세테이트의 최대 이용율은 약 73%이고, 소듐부티레이트의 최대 이용율은 약 70%를 나타냄을 확인하였다.
실시예 4-3: PHB 생산성 분석
상기 실시예 2-1의 방법으로부터 수득한 배양물 대신에, 상기 실시예 4-1의 방법으로부터 수득한 배양물을 사용하는 것을 제외하고는, 상기 실시예 2-3과 동일한 방법으로 PHB의 생산성을 분석하였다(표 3).
공동배양 균주의 PHB 생산성
탄소원 주기 배양방법 PHB (g/L) PHB (g/g carbon sourceadded)
Cycle-1 부영양 0.42 0.056
빈영양 2.12 0.280
Cycle-2 부영양 0.44 0.069
빈영양 2.46 0.376
상기 표 3에서 보듯이, 부영양 단계에서는 바이오매스가 급격하게 증식되었으나, PHB의 수율은 0.44 g/L를 나타내었고, 빈영양 단계에서는 바이오매스의 증식이 확인되지 않았으나, PHB의 수율은 2.46 g/L를 나타냄을 확인하였다.
상기 도 4 및 표 3의 결과로부터, 공동배양을 수행할 경우, 각 균주를 개별적으로 배양할 경우 보다도, 탄소원의 이용율이 상향되고, PHB의 생산수율 역시 증가됨을 알 수 있었다.
실시예 5: 배지분석
상기 실시예 2 내지 4에서 배양된 배양물에 포함된 배지내 pH 변화와 용존산소 변화를 분석하였다.
실시예 5-1: 배지 pH 분석
상기 실시예 2 내지 4에서 배양된 3종의 배양물에 포함된 배지의 pH 변화를 분석하였다(도 5a).
도 5a는 Acinetobacter junii BP25 균주 및 Aeromonas hydrophila 균주를 각각 개별적으로 배양하거나 또는 공동배양할 경우, 배지의 pH 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5a에서 보듯이, 부영양 단계에서는 각 균주를 개별적으로 배양할 경우 보다도 공동배양할 경우, 전체적인 배지의 pH가 높은 수준을 나타내는 반면, 빈영양 단계에서는 Acinetobacter junii BP25 균주를 개별적으로 배양하거나 또는 공동배양할 경우 보다도, Aeromonas hydrophila 균주를 개별적으로 배양할 경우에 전체적인 배지의 pH가 높은 수준을 나타냄을 확인하였다.
실시예 5-2: 배지내 용존산소 분석
상기 실시예 2 내지 4에서 배양된 3종의 배양물에 포함된 배지내 용존산소의 변화를 분석하였다(도 5b).
도 5b는 Acinetobacter junii BP25 균주 및 Aeromonas hydrophila 균주를 각각 개별적으로 배양하거나 또는 공동배양할 경우, 배지내 용존산소의 변화를 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5b에서 보듯이, 부영양 단계 및 빈영양 단계의 수행에 따라 배지가 교체될 때, 배지내 용존산소의 수준이 급격기 증가된 후, 배양시간이 경과함에 따라, 배지내 용존산소의 수준이 감소되는 경향이 반복됨을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (10)

  1. Acinetobacter junii BP25 균주 및 Aeromonas hydrophila 균주를 유효성분으로 포함하는 PHB(polyhydroxybutyrate) 생산용 조성물.
  2. 제1항의 PHB 생산용 조성물을 포함하는 PHB(polyhydroxybutyrate) 생산용 키트.
  3. (a) Acinetobacter junii BP25 균주 및 Aeromonas hydrophila 균주를 동일수준으로 포함하는 혼합균주를 수득하는 단계;
    (b) 상기 수득한 혼합균주를 부영양(feast) 배지에 접종하고 배양한 다음, 빈영양(famine) 배지에 접종하고 배양하는 과정을 순차적으로 반복하여 수행하는 단계; 및.
    (c) 배양이 종료된 후, 배양물로부터 PHB를 회수하는 단계를 포함하는, PHB(polyhydroxybutyrate)의 생산방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 부영양(feast) 배지는 탄소원과 영양성분을 포함하는 배지인 것인, PHB의 생산방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 탄소원은 소듐아세테이트 및 소듐부티레이트인 것인, PHB의 생산방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 영양성분은 NaCl, Na2HPO4, KH2PO4, (NH4)2HPO4, MgSO47H2O, 펩톤(peptone), 효모 추출물(yeast extract) 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 성분인 것인, PHB의 생산방법.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 부영양 배지에서의 배양은 호기성 조건에서 36 내지 60시간 동안 수행되는 것인, PHB의 생산방법.
  8. 제3항에 있어서,
    상기 빈영양(famine) 배지는 탄소원 만을 포함하는 배지인 것인, PHB의 생산방법.
  9. 제3항에 있어서,
    상기 빈영양 배지에서의 배양은 호기성 조건에서 36 내지 60시간 동안 수행되는 것인, PHB의 생산방법.
  10. 제3항에 있어서,
    상기 부영양 배지에서의 배양과 빈영양 배지에서의 배양은 동일시간 동안 수행되는 것인, PHB의 생산방법.

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Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Applied and Environmental Microbiology, Vol. 72, pp. 2322-2330 (2006.)*
International Journal of Biological Macromolecules, Vol. 126, pp. 977-986 (2019.01.03.)*
Polymers, Vol. 11, pp. 1328(1-16) (2019.08.09.)*

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