TWI736413B - 微生物萃取物之製備方法 - Google Patents

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Abstract

一種微生物萃取物之製備方法，包含：(a)將經培養之含有聚羥基脂肪酸酯之微生物菌體乾燥至其水分之重量百分濃度小於約10%，以獲得經乾燥之微生物菌體，其中該微生物菌體內係含有聚羥基脂肪酸酯；(b)以超臨界二氧化碳及碳酸二甲酯萃取經步驟(a)所獲得之經乾燥之微生物菌體，以獲得該微生物萃取物。

Description

微生物萃取物之製備方法
本發明係關於一種微生物萃取物之製備方法，尤指一種以超臨界二氧化碳及碳酸二甲酯萃取經乾燥之微生物菌體之製備方法。
傳統之微生物萃取物之萃取多以有機溶劑進行，缺點為在萃取微生物中所包含之高分子時需要耗費大量有機溶劑，因而增加了萃取回收成本，也會造成大量有機廢液之處理問題。
聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates,PHA)為目前唯一可於海洋分解之塑膠，市場發展潛力高，可降低製程所造成之環境污染。PHA菌株培養所產生的PHA高分子主要是累積在細胞質，以脂粒的型態累積，因此若要從菌體中得到高純度或高回收率的高分子，其效率會隨著前處理及萃取方式而有所不同。現今之PHA的回收方法，多使用有機溶劑從細胞中提取聚合物，其中最多是以氯仿或二氯甲烷等具毒性有機溶劑進行萃取，不利於生質材料商業化開發應用。這是一種在經濟效益前提下不適用於工業大規模生產的方法，而其他如添加次氯酸鈉、機械性萃取、高壓均質法等方式，雖具有可行性，但卻會破壞PHA結構，導致原始PHA分子量變小。
為改善先前技術之微生物萃取物中聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates,PHA)分子量變小的問題，以及為改善先前技術之微生物萃取物之製備方法中需要耗費大量有機溶劑，因而增加了萃取回收成本，且產生大量須經處理之有機廢液的問題，本發明係提供新穎之微生物萃取物之製備方法。
近年來綠色萃取技術(超臨界流體萃取法)是令人矚目的發展方向，以超臨界二氧化碳(CO2)為工作流體進行萃取，超臨界CO2有高密度和低黏度特性，具有之優點包含不燃性、低毒性和中等臨界溫度和壓力(約31.1℃和73.8bar)。本發明係應用超臨界二氧化碳(CO2)來萃取PHA，取代傳統上有機溶劑提取聚合物之缺點，以降低PHA製程之生產成本與降低有機溶劑帶來之環境污染。
為達上述目的及其他目的，本發明提供一種微生物萃取物之製備方法，包含：(a)將經培養之含有聚羥基脂肪酸酯之微生物菌體乾燥至其水分之重量百分濃度小於約10%，以獲得經乾燥之微生物菌體；(b)以超臨界二氧化碳及碳酸二甲酯萃取經步驟(a)所獲得之經乾燥之微生物菌體，以獲得該微生物萃取物。
上述之製備方法，其中，步驟(b)可包含：(b-1)以超臨界二氧化碳靜態持壓萃取0.5至1小時，並藉由減壓移除二氧化碳，以獲得一淡黃色萃取物；以及 (b-2)取步驟(b-1)所獲得之淡黃色萃取物，以包含碳酸二甲酯之超臨界二氧化碳溶液動態萃取該淡黃色萃取物0.5小時，並藉由減壓移除二氧化碳、藉由減壓濃縮移除碳酸二甲酯，以獲得該微生物萃取物。
上述之製備方法，其中，步驟(b-1)可在壓力介於150bar至600bar之間、溫度介於70至80℃之間的條件下進行萃取。
上述之製備方法，其中，步驟(b-1)可在壓力介於550bar至600bar之間的條件下進行萃取。
上述之製備方法，其中，步驟(b-1)可在收集槽壓力50bar、收集槽溫度介於70至77℃之間的條件下收集該淡黃色萃取物。
上述之製備方法，其中，步驟(b-2)中該包含碳酸二甲酯之超臨界二氧化碳溶液可包含重量百分濃度介於10%至12%的碳酸二甲酯。
上述之製備方法，其中，步驟(b-2)可在溫度為45℃的條件下藉由減壓濃縮移除碳酸二甲酯。
本發明之微生物萃取物中包含聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates,PHA)，其係以超臨界二氧化碳及碳酸二甲酯進行萃取，可有效解決原始PHA分子量變小的問題。
此外，本發明之微生物萃取物之製備方法中，係以超臨界二氧化碳及碳酸二甲酯進行萃取，可有效解決萃取回收成本過高，且產生大量須經處理之有機廢液的問題。
1:微生物萃取物之製備方法
S1:步驟(a)
S2:步驟(b)
〔圖1〕係為本發明之微生物萃取物之製備方法的流程圖。
〔圖2〕係為實施例3-1所獲得的微生物萃取物的氣相層析分析結果。
〔圖3〕係為實施例3-2所獲得的微生物萃取物的氣相層析分析結果。
以下係藉由特定的具體實施例說明本發明之實施方式，熟習此技藝之人士可由本說明書所揭示之內容瞭解本發明之其他優點與功效。本發明也可藉由其他不同的具體實施例加以實施或應用，本說明書中的各項細節亦可基於不同觀點與應用，在不悖離本發明之精神下進行各種修飾與變更。
如圖1所示，本發明之微生物萃取物之製備方法，包含：(a)將經培養之含有聚羥基脂肪酸酯之微生物菌體乾燥至其水分之重量百分濃度小於約10%，以獲得經乾燥之微生物菌體(S1)；(b)以超臨界二氧化碳及碳酸二甲酯萃取經步驟(a)所獲得之經乾燥之微生物菌體，以獲得該微生物萃取物(S2)。
製備例1
本發明之微生物萃取物之製備方法中所使用之微生物菌體可經由下列流程製備，但本發明並不限於此。
首先，由中華民國食品工業發展研究所購買嗜鹽菌株(Haloferax mediterranei)AR10047，將該嗜鹽菌株AR10047進行馴化並以菌種保存樣本型態保存，該嗜鹽菌株AR10047的菌種保存樣本係以甘油在-80℃環境中保存。接著，將前述菌種保存樣本從-80℃環境中取出，置於冰上，待冷凍的菌種保存樣本溶回液體狀。該菌種保存樣本溶回液體狀之後，利用白金耳接種環從該菌種保存 樣本中取菌，以三區劃菌的方式將菌體塗佈於已滅菌之固體培養基上，本試驗中之固體培養基成分包含NaCl(156g/L)、NaHCO3(0.2g/L)、MgSO4(20g/L)、MgCl2(13g/L)、CaCl2(1g/L)、葡萄糖(1g/L)、酵母菌萃取物(Yeast extract)(5g/L)及洋菜膠(Agar)(15g/L)。將塗佈有上述嗜鹽菌株的固體培養基置於37℃環境中培養5天，由於嗜鹽菌株為會產生紅色色素的菌株，因此當觀察到前述接種有嗜鹽菌株的固體培養基其表面上出現淡紅色之菌落，淡紅色之菌落即為培養出的嗜鹽菌株。
然後，將透過前述方式培養出的嗜鹽菌株接種於不同料源中進行發酵來生產聚羥基鏈烷酸酯類，嗜鹽菌株的發酵過程如下所述。
準備四個1000ml的搖瓶，各搖瓶中分別裝有250ml的培養液，各搖瓶中的培養液分別命名為樣本1至樣本4，培養液成分包含NaCl(234g/L)、NaHCO3(0.2g/L)、MgSO4(30g/L)、MgCl2(19.5g/L)、CaCl2(1g/L)、碳源(5g/L)及酵母菌萃取物(Yeast extract)(7.5g/L)，其中，樣本1中的碳源為木屑水解糖液，樣本2中的碳源為蔗渣水解糖液，樣本3中的碳源為木糖溶液，樣本4中的碳源為葡萄糖。其中，木屑水解糖液係以木屑進行水解處理而形成的木質纖維素水解液，木屑水解糖液中含有葡萄糖和木糖；蔗渣水解糖液係以蔗渣進行水解處理而形成的木質纖維素水解液，蔗渣水解糖液中含有葡萄糖和木糖。
以白金耳接種環自固體培養基表面刮取嗜鹽菌株菌體重複三次，並將刮取起來的嗜鹽菌株菌體接種於樣本1至樣本4中。將上述已接種有嗜鹽菌株之樣本1至樣本4置於恆溫震盪培養箱，在培養溫度37℃、培養箱中轉速為180rpm的條件下進行培養，並且持續培養六天。
接種有嗜鹽菌株之樣本1至樣本4於恆溫震盪培養箱中開始培養，每經過24小時便從樣本1至樣本4中取出嗜鹽菌株菌液，並利用分光光度計(Jasco Model V-550,Japan)以OD 520nm偵測嗜鹽菌株菌液之吸光值，將所得之吸光值換算成實際菌體濃度。同時，開始培養後的第2天起，每經過24小時在樣本1至樣本4中分別加入0.5%碳源(所加入的碳源種類即樣本1至樣本4其各自原本所加入的碳源)以供嗜鹽菌株生長。嗜鹽菌株培養到第六天，從震盪培養箱中取出樣本1至樣本4，測量樣本1至樣本4中各自所含的PHA含量以及計算樣本1至樣本4中的PHA濃度。
經測試，上述樣本1至樣本4中嗜鹽菌株於不同碳源下之最高菌體濃度、PHA濃度與PHA含量係如下列表1所示：
Figure 109130807-A0305-02-0008-1
實施例1
(a)前處理步驟：將經培養之含有聚羥基脂肪酸酯之微生物菌體放置烘箱進行乾燥，烘箱溫度設定90℃，待樣品水份之重量百分濃度小於約10%後，由烘箱拿出，放置於塑膠袋內密封，儲存於常溫下，於萃取前取出進行後續步驟。
(b)超臨界二氧化碳及碳酸二甲酯萃取：將經上述步驟(a)處理之樣品置入一萃取槽中，使作為萃取劑的二氧化碳流體接觸該樣品，將該萃取槽中之壓力控制在250bar、溫度控制在60℃以使二氧化碳處於超臨界流體之狀態，並於超臨界二氧化碳中添加碳酸二甲酯使其重量百分濃度約達10~12%，動態萃取1小時，且將收集槽的壓力控制為50bar、將收集槽溫度控制為65℃，以進行減壓收集。本實施例中，減壓收集時因二氧化碳已氣化排出管線，故收集到的萃取液為乳白色碳酸二甲酯溶液，減壓濃縮移除碳酸二甲酯後獲得呈淡黃色油狀物之約0.1g之微生物萃取物。
實施例2
本實施例之(a)前處理步驟係與實施例1相同，故不再贅述。
由於玻璃珠導熱慢，因此相較於實施例1本實施例改在壓力為300bar、溫度為80℃的條件下以超臨界二氧化碳靜態持壓萃取0.5小時，之後再添加碳酸二甲酯使其重量百分濃度約達10~12%動態萃取0.5小時，且將收集槽的壓力控制為50bar、將收集槽溫度控制為80℃，萃取結果收集到的萃取液為乳白色碳酸二甲酯溶液，減壓濃縮移除碳酸二甲酯並加入乙醇，出現白色聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates,PHA)懸浮物，即得微生物萃取物。
實施例3-1
本實施例之(a)前處理步驟係與實施例1相同，故不再贅述。
實施例3-1係分成兩段式萃取：第一段先在壓力為150bar、溫度為70~80℃的條件下以超臨界二氧化碳靜態持壓萃取1小時，且將收集槽的壓力控制為50bar、將收集槽溫度控制為70~77℃，於第0.5小時無收集到萃取物，第1小時收集到淡黃色萃取物；以及 第二段係將第一段所獲得之淡黃色萃取物，以包含重量百分濃度介於10%至12%的碳酸二甲酯之超臨界二氧化碳溶液動態萃取該淡黃色萃取物0.5小時，收集到的萃取液為橘紅色碳酸二甲酯溶液，另發現萃取液上層浮有水泡，可能是二氧化碳高壓下對水溶解度較佳因此將原料的水攜出，進一步在45℃的溫度下減壓濃縮移除碳酸二甲酯後得到呈磚紅色油狀物的微生物萃取物。
實施例3-2
本實施例之(a)前處理步驟係與實施例1相同，故不再贅述。
實施例3-2係分成兩段式萃取：第一段先在壓力為350bar、溫度為70~80℃的條件下以超臨界二氧化碳靜態持壓萃取1小時，且將收集槽的壓力控制為50bar、將收集槽溫度控制為70~77℃，於第0.5小時無收集到萃取物，第1小時收集到淡黃色萃取物；以及第二段係將第一段所獲得之淡黃色萃取物，以包含重量百分濃度介於10%至12%的碳酸二甲酯之超臨界二氧化碳溶液動態萃取該淡黃色萃取物0.5小時，收集到的萃取液為橘紅色碳酸二甲酯溶液，另發現萃取液上層浮有水泡，可能是二氧化碳高壓下對水溶解度較佳因此將原料的水攜出，進一步在45℃的溫度下減壓濃縮移除碳酸二甲酯後得到呈磚紅色油狀物的微生物萃取物。
測試例
取上述實施例3-1及3-2所獲得之呈磚紅色油狀物的微生物萃取物，以氣相層析(Gas chromatography,GC)分析其中之聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates,PHA)含量。
具體分析條件如下：使用DB-WAX管柱作為固定相，使用惰性氣體氦氣作為流動相分離PHA，設置進樣量為1μl分流模式，分流比為1：8，進樣溫度為250℃，設定流速為0.7ml/min，設置如以下表1所示之溫度梯度以分離PHA：
Figure 109130807-A0305-02-0011-2
圖2係為實施例3-1之分析結果(實施例3-1之第一段係在壓力為150bar的條件下萃取)，經由GC分析，實施例3-1所獲得之呈磚紅色油狀物的微生物萃取物中之PHA含量係為1.33mg/ml。
圖3係為實施例3-2之分析結果(相較於實施例3-1，實施例3-2之第一段係在壓力為350bar的條件下萃取)，經由GC分析，實施例3-2所獲得之呈磚紅色油狀物的微生物萃取物中之PHA含量係為1.73mg/ml。
根據上述測試例之GC分析證實藉由本發明之微生物萃取物之製備方法所獲得的微生物萃取物確實包含PHA成分，可以進而將其所包含的PHA成分應用於生質塑料原料之製備。
再者，本發明之微生物萃取物之製備方法所獲得之微生物萃取物中包含聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates,PHA)，其係以超臨界二氧化碳及碳酸二甲酯進行萃取，可有效解決原始PHA分子量變小的問題。
此外，本發明之微生物萃取物之製備方法中，係以超臨界二氧化碳及碳酸二甲酯進行萃取，可有效解決萃取回收成本過高，且產生大量須經處理之有機廢液的問題。
上述實施例僅例示性說明本發明，而非用於限制本發明。任何熟習此項技藝之人士均可在不違背本發明之精神及範疇下，對上述實施例進行修飾與改變。因此，本發明之權利保護範圍，應如後述之申請專利範圍所載。
1:微生物萃取物之製備方法
S1:步驟(a)
S2:步驟(b)

Claims (6)

  1. 一種微生物萃取物之製備方法，包含：(a)將經培養之含有聚羥基脂肪酸酯之微生物菌體乾燥至其水分之重量百分濃度小於約10%，以獲得經乾燥之微生物菌體，其中該微生物菌體內係含有聚羥基脂肪酸酯；(b)以超臨界二氧化碳及碳酸二甲酯萃取經步驟(a)所獲得之經乾燥之微生物菌體，以獲得該微生物萃取物；其中，步驟(b)係包含：(b-1)以超臨界二氧化碳靜態持壓萃取0.5至1小時，並藉由減壓移除二氧化碳，以獲得一淡黃色萃取物；以及(b-2)取步驟(b-1)所獲得之淡黃色萃取物，以包含碳酸二甲酯之超臨界二氧化碳溶液動態萃取該淡黃色萃取物0.5小時，並藉由減壓移除二氧化碳、藉由減壓濃縮移除碳酸二甲酯，以獲得該微生物萃取物。
  2. 如請求項1所述之製備方法，其中，步驟(b-1)係在壓力介於150bar至600bar之間、溫度介於70至80℃之間的條件下進行萃取。
  3. 如請求項2所述之製備方法，其中，步驟(b-1)係在壓力介於550bar至600bar之間的條件下進行萃取。
  4. 如請求項2所述之製備方法，其中，步驟(b-1)係在收集槽壓力50bar、收集槽溫度介於70至77℃之間的條件下收集該淡黃色萃取物。
  5. 如請求項1所述之製備方法，其中，步驟(b-2)中該包含碳酸二甲酯之超臨界二氧化碳溶液係包含重量百分濃度介於10%至12%的碳酸二甲酯。
  6. 如請求項5所述之製備方法，其中，步驟(b-2)係在溫度為45℃的條件下藉由減壓濃縮移除碳酸二甲酯。
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