JPH07177894A - ポリ−３−ヒドロキシ酪酸の分離精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 ポリ−３−ヒドロキシ酪酸を含有する微生物
菌体から、高純度でしかも分子量の低下がみられないポ
リ−３−ヒドロキシ酪酸を、高収率でしかも低コストで
回収する方法を提供する。 【構成】 ポリ−３−ヒドロキシ酪酸を含有する微生物
菌体のを高圧ホモジナイザーで処理することにより該微
生物菌体を破砕してポリ−３−ヒドロキシ酪酸顆粒体を
菌体外に漏出せしめたのち、遠心分離等によりポリ−３
−ヒドロキシ酪酸画分を得、次いでこのポリ−３−ヒド
ロキシ酪酸画分を酸素系漂白剤で処理する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はポリ−３−ヒドロキシ酪
酸の微生物菌体からの分離精製法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ポリ−３−ヒドロキシ酪酸（以後ＰＨＢ
と称す）は多くの微生物種の細胞にエネルギー貯蔵物質
として生成、蓄積される完全生分解性および生体適合性
を有する熱可塑性ポリエステルであり、 −ＯＣＨ
（ＣＨ₃ ）ＣＨ₂ ＣＯ− なる化学式で示される単位
の繰り返しからなる。近年、合成プラスチックが環境汚
染、廃棄物処理、石油資源の観点から深刻な社会問題と
なるに至り、ＰＨＢは環境中で完全に分解される石油に
依存しない「クリーンプラスチック」として注目され、
その実用化が切望されている。ＰＨＢは、特公平03-651
54号、特公平02-20238号、特公平05-997号等に提案され
ているように、たとえばプロトモナス（Protomonas）
属、アルカリゲネス（Alcaligenes）属、アゾトバクタ
ー（Azotobacter）属、メチロバクテリウム（Meth ylo
bacterium）属等の微生物菌体を、水性培地中でたとえ
ばグルコースまたはメタノ−ル等の化合物を基質とし、
微生物の生育には必須であるけれどもＰＨＢの生合成に
は必須でない栄養素、たとえば窒素源、リン酸塩等の制
限下に培養することで効率良く生産することができる。
３−ヒドロキシ酪酸を構成単位として含む生分解性ポリ
マーには、３−ヒドロキシ酪酸単位のみからなるホモポ
リマーの他に、３−ヒドロキシ酪酸単位とたとえば３−
ヒドロキシ吉草酸単位または４−ヒドロキシ酪酸単位と
の共重合体等がある。特開昭57-150393 号、特開平03-2
92889 号等に示されるように、これらの共重合体も、Ｐ
ＨＢと同じ方法で微生物を用いて製造することが可能で
ある。本発明におけるＰＨＢとはこれらの共重合体も含
めてさすものとする。

【０００３】微生物によって生成されたＰＨＢは顆粒体
を形成して細胞内に蓄積される。ＰＨＢを微生物菌体か
ら分離精製する既知の方法は、ＰＨＢが可溶である溶剤
により菌体からＰＨＢを抽出する方法と、ＰＨＢ以外の
菌体構成成分を可溶化させて除くことによってＰＨＢ顆
粒体を得る方法に大別される。抽出によりＰＨＢを分離
精製する方法においては、ＰＨＢが可溶である溶媒とし
て、たとえば１，２−ジクロロエタンやクロロホルムと
いった部分ハロゲン化炭化水素が用いられる。この場合
菌体を予め乾燥する等、溶媒が菌体中のＰＨＢ顆粒体と
接触できるようにするための工程が必要となる（特開昭
55-118394号、特開昭57-65193号）。また、これらの方
法においてはＰＨＢを実用に値する濃度（たとえば5
％）に溶解したハロゲン化炭化水素は極めて粘稠とな
り、抽出工程後溶媒に溶解しなかった菌体残渣とＰＨＢ
を含む溶媒層との分離が困難となる。さらに、溶媒層か
らＰＨＢを回収率良く再沈澱させるためには溶媒層の４
〜５倍容のＰＨＢ不溶性溶媒（たとえばメタノール等）
の添加が必要であり、工程には大容積の容器が必要とさ
れるとともに溶媒の使用量は膨大なものとなる。従っ
て、溶媒の回収コストと損失溶媒のコストがかさむ。加
えて近年、環境保護の観点から有機ハロゲン化合物の大
量使用が敬遠される方向にある。ＰＨＢが可溶でありか
つ水と混ざり合う溶媒、たとえばジオキサン（特開昭63
-198991号）またはプロパンジオール（特開平02-6918
7）の様な親水性の溶媒を用 いた抽出方法も提案され
ている。これらの方法では乾燥菌体のみならず湿潤菌体
からもＰＨＢを抽出することが可能である点と、菌体残
渣と分離した溶媒層は冷却するだけでＰＨＢの再沈澱が
行われる点では好ましい方法と言える。しかしこれらの
方法もＰＨＢを溶解した溶媒の粘稠性の問題は未解決で
あり、加えて水存在下で加熱するためＰＨＢの加水分解
による分子量低下が避けられないこと、抽出率が（従っ
て回収率も）劣ること等の欠点も有している。

【０００４】一方、ＰＨＢ以外の菌体構成成分を可溶化
させて除くことによってＰＨＢ顆粒体を得る方法とし
て、J.Gen.Microbiology 19 198〜209頁（1958）には
菌体懸濁液を次亜塩素酸ナトリウムで処理することによ
りＰＨＢ以外の菌体構成成分を可溶化してＰＨＢ顆粒体
を得る方法が記載されている。この方法は簡単ではある
が、多量の次亜塩素酸ナトリウムを使用する必要がある
ためにそのコストが高いこと、加えて本発明者らの検討
によればＰＨＢの著しい分子量低下が引き起こされるこ
とと得られたＰＨＢ標品内に無視できない量の塩素が残
留することから、実用には適さない。特公平04-61638号
には、ＰＨＢを含有する微生物菌体懸濁液を100℃以上
で熱処理することで菌体構造を破壊し、次いでタンパク
質分解酵素（以後プロテアーゼと記す）処理と、リン脂
質分解酵素処理あるいは過酸化水素処理との組み合わせ
によりＰＨＢ以外の菌体構成成分を可溶化して除いてＰ
ＨＢ顆粒体を得る方法が提案されている。しかしこの方
法は、熱処理による可溶性タンパク質の変性・不溶化に
よって次のプロテアーゼ処理工程等での負荷を増大させ
ること、処理工程が非常に多く複雑であること等の欠点
を有している。また、不純物の除去方法として界面活性
剤で処理する方法が記載されているが、界面活性剤は低
濃度においても極めて発泡性が激しく、工業的規模で使
用する場合にはしばしばポンプや遠心分離機も発泡のた
めに機能しないという困難に見舞われる。また界面活性
剤を含む廃液は発泡が著しいことに加えて高いＢＯＤ負
荷値を持つ。この様な観点から、界面活性剤の使用は特
に工業的規模においては好ましくない。

【０００５】

【発明が解決しようとする問題点】本発明の目的は、従
来技術における上記したような課題を解決し、少ない工
程数でＰＨＢ含有微生物菌体からＰＨＢ以外の菌体構成
成分を効率よく除き、かつ純度の高いＰＨＢを高収率で
得るためのＰＨＢの分離精製方法を提供することにあ
る。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、少ない工
程数でＰＨＢ含有微生物菌体からＰＨＢ以外の菌体構成
成分を効率よく除き、かつ純度の高いＰＨＢを高収率で
得るためのＰＨＢの分離精製方法に関して検討を行った
結果、ＰＨＢ含有菌体の懸濁液を適当な条件下で高圧ホ
モジナイザーで処理すると懸濁液に存在する細胞のほと
んどが破砕されて細胞内に存在していたＰＨＢ顆粒体が
漏出、分散され、しかも不溶性菌体成分を可溶化せずに
ＰＨＢ以外の菌体構成成分とＰＨＢとの比重差によって
この高圧ホモジナイザー処理液からＰＨＢ顆粒体を効率
よく回収できること、得られたＰＨＢ画分を、たとえば
過酸化水素のような酸素系漂白剤で処理することによっ
て極めて高純度のＰＨＢ粉体が得られることを見いだ
し、本発明に到達した。即ち、本発明によれば、ＰＨＢ
を含有する微生物菌体からＰＨＢ以外の微生物菌体構成
成分を除くことによって純度の高いＰＨＢを得るＰＨＢ
の分離精製法において、ＰＨＢを含有する微生物菌体の
懸濁液を高圧ホモジナイザーで処理することによって微
生物菌体を破砕してＰＨＢ顆粒体を菌体外に漏出せしめ
た後にこの高圧ホモジナイザー処理液からＰＨＢ以外の
菌体構成成分を分離してＰＨＢ画分を得ること、およ
び、得られたＰＨＢ画分を酸素系漂白剤で処理するこ
と、を含むことを特徴とするＰＨＢの分離精製方法が提
供される。

【０００７】以下に本発明の詳細について説明する。通
常微生物の細胞は、リン脂質を主成分とする細胞膜やペ
プチドグリカン等に代表される水不溶性成分と、濃厚な
可溶性タンパク質の水溶液である細胞質によって構成さ
れ、両者の量比は水溶性成分が圧倒的に多い場合がほと
んどである。微生物菌体をたとえば緩衝液等中に懸濁し
て適当な方法により破砕すれば、細胞質は漏出して可溶
性タンパク質は不溶化せずに緩衝液と混合され、細胞膜
の様な不溶性成分は不溶性のまま分散されている。菌体
内にＰＨＢ顆粒体が存在する場合においては、ＰＨＢは
もちろん水不溶性であるため、菌体が破砕されることに
よってＰＨＢ顆粒体が緩衝液中に漏出、分散される。一
方、通常の菌体構成成分の比重は１よりやや大きい程度
であるのに対してＰＨＢの比重は1.2程度であることに
本発明者らは着目し、水溶性タンパク質に代表される可
溶性菌体構成成分を不溶化せしめることなくＰＨＢを含
有する微生物菌体を破砕し、次いでＰＨＢ顆粒体とＰＨ
Ｂ以外の菌体構成成分をそれらの遠心力場での沈降速度
の違いによって効率よく分離する方法を見いだすに至っ
た。

【０００８】本発明においては菌体破砕方法として高圧
ホモジナイザー処理が用いられる。本発明において用い
られる、高圧ホモジナイザーとは、粒子懸濁液を高圧下
で極めて細いノズルに導入し、該懸濁液が極めて速い
（音速程度の）線速においてノズルを通過する時に生ず
る剪断力によって、懸濁している粒子を粉砕することを
原理とする装置であり、生物細胞の破砕の他に、乳化、
分散あるいは微細粒子製造等の工程において工業的規模
で使用されているものを指す。もちろん、同じ原理を有
し、工業的規模で実施できる機器であれば、今後改良さ
れるものも使用できる。以下に説明するように、高圧ホ
モジナイザー処理を用いることによって、ＰＨＢを含有
する微生物菌体を可溶性菌体構成成分の不溶化を伴うこ
となく、かつ菌体中に存在するＰＨＢ顆粒体が漏出して
ＰＨＢ以外の不溶性菌体構成成分とは独立して分散する
に十分な程度にまで、破砕することが達成される。ＰＨ
Ｂを含有する菌体培養液を、高圧ホモジナイザーで1000
kgf/cm2の圧力で２回処理を行い、この処理液を光学顕
微鏡で観察すると、ＰＨＢ顆粒体および不溶性菌体構成
成分の破片が多く認められ、未破砕と思われる菌体はほ
とんど認められない。この処理液を遠心分離に供すると
白色のＰＨＢ顆粒体が遠心管の底に沈澱する。この白色
沈澱の上層には破砕された菌体に由来する不溶性成分の
沈澱が少量認められ、また液層は細かく破砕された不溶
性成分により濁っている。この液層を除くことで得られ
るＰＨＢ画分は、驚くべきことに85％の純度（乾燥重量
％、以下同様）を有し、処理前の懸濁液に基づくＰＨＢ
の回収率は少なくとも90％以上である。またこのＰＨＢ
画分を乾燥して得られた粉体粒子を走査型電子顕微鏡で
観察すると、ＰＨＢ顆粒体は高圧ホモジナイザー処理に
より粉砕されることなく球形を維持している。

【０００９】高圧ホモジナイザーを用いる方法以外に可
溶性菌体構成成分を不溶化せしめることなく菌体を破砕
できる可能性のある既知の方法としては、超音波処理、
ワーリングブレンダー等のブレンダー、リゾチームの様
な酵素による処理、菌体の凍結融解を繰り返す処理等が
あるが、何れも工業的規模においては実用的ではない。
特開昭57-174094 号には、菌体の水性懸濁液を加圧下で
100℃以上に加熱し、次いでその圧力を開放する事によ
って菌体内の水分を沸騰させ、菌体を破砕しＰＨＢ顆粒
体を分散させる方法が提案されている。しかしながらこ
の方法は菌体を加熱することで可溶性タンパク質の不溶
化を招くことから本発明には用いることはできない。本
発明者らは、菌体懸濁液に加圧下でガスを溶解させ、次
いで急激に圧力を開放することによって菌体内で溶解ガ
スを急激に膨張させることによって菌体をバーストさせ
ることを試みたが、このような方法による菌体からのＰ
ＨＢ顆粒体の漏出はほとんど観察されなかった。本発明
において高圧ホモジナイザー処理を行なう場合には、処
理圧力と処理回数が菌体破砕の程度に大きく影響するの
で、所望の破砕程度に応じて処理圧力と処理回数を設定
することが必要である。本発明における高圧ホモジナイ
ザー処理は、300kgf/cm²以上、好ましくは 500kgf/cm²
以上の処理圧力において行われる。高圧ホモジナイザー
処理による菌体の破砕の程度は、同一圧力においては機
種間の相違はほとんど無く、また処理圧力および処理回
数との間に正の相関を示す。高圧ホモジナイザーによる
処理がたとえば700kgf/cm²の圧力での１回処理である場
合には、破砕液から遠心分離によって得られるＰＨＢ画
分の純度は少なくとも70％程度であるが、３回処理を行
って得られるＰＨＢ画分の純度は80％となる。また、た
とえば1000kgf/cm²程度で１回処理を行った後に処理液
から得られたＰＨＢ画分の純度は75％程度であるが、同
条件で２回処理を行うとＰＨＢ画分の純度は85％程度と
なる。高圧ホモジナイザー処理における処理圧力および
処理回数以外の条件は、以下に示すように菌体の破砕が
可能でかつ可溶性の菌体構成成分の不溶化を招かない範
囲において、自由に設定できる。

【００１０】処理中あるいは処理前後に可溶性菌体構成
成分の不溶化が生じると、不溶化した菌体構成成分とＰ
ＨＢ顆粒体が複合体を形成してしまい、処理液からの顆
粒体の分離に支障をきたすことになる。高圧ホモジナイ
ザー処理に供される菌体の水性懸濁液とは、もちろん菌
体の培養液そのものでも良く、また培養液を遠心分離に
処することによって得られる菌体ペーストをたとえば水
または適当な緩衝液に再懸濁させたものでも問題はな
い。懸濁液中の菌体濃度も、懸濁液が高圧ホモジナイザ
ー処理に支障をきたさない範囲の流動性を保つ限り、破
砕効果にはほとんど影響を及ぼさないので、15重量％以
上の菌体濃度とするのが好都合である。温度は、可溶性
菌体構成成分の不溶化に大きく関わる因子の一つであ
り、高圧ホモジナイザー処理の前後を通じて可溶性菌体
構成成分の不溶化を招かない範囲で設定すれば良い。高
圧ホモジナイザー処理によって処理液の温度は上昇する
が、この温度による可溶性菌体構成成分の不溶化が予想
される場合には、処理に供する菌体懸濁液を予め冷却す
ることで問題なく破砕処理を行うことができる。常温の
菌体懸濁液を用いる場合でも通液部を冷却する装置的措
置を講じることで問題なく破砕処理を行なうことができ
る。ｐＨやイオン強度も可溶性の菌体構成成分の不溶化
に関与する条件である。一般的には極端に酸性側あるい
はアルカリ性側に片寄ったｐＨにおいては可溶性タンパ
ク質が不溶化することが知られており、菌体懸濁液のｐ
Ｈをこの様な不溶化を避け得る範囲、たとえば５〜８に
設定しておけば、問題なく高圧ホモジナイザー処理を行
なうことができる。イオン強度についても、高圧ホモジ
ナイザー処理の結果得られる処理液において可溶性タン
パク質等が塩析により沈澱しない範囲に設定することで
良好な結果が得られる。

【００１１】たとえば得られるＰＨＢ画分の純度が85％
以上である良好な菌体破砕がなされた高圧ホモジナイザ
ー処理液の遠心分離においては、好ましいことに、適当
な遠心分離条件を選択することにより、ＰＨＢ顆粒体の
ほとんど全てが沈澱しかつ不溶性菌体構成成分がほとん
ど沈澱しない分離状態を得ることができる。この様な分
離状態から軽液層を除くことで得られたＰＨＢ画分は、
少なくとも80％、しばしば90％程度のＰＨＢ純度を持
ち、ＰＨＢの回収率は90％以上である。一般的に遠心分
離条件とは遠心力（ｇ）と分離時間からなり、遠心分離
の強さはそれらの積である積算遠心力の値の大きさで表
される。一般的に遠心分離積算遠心力がより大きい条件
ではＰＨＢ顆粒体の回収率が良好である反面で沈澱する
不溶性菌体成分の量が多くなり、結果として得られたＰ
ＨＢ画分の純度が低下する傾向を示す。一方積算遠心力
がより小さい条件では不溶性成分の沈澱が少ない反面Ｐ
ＨＢの沈降も不十分となり、ＰＨＢの回収率が低下する
傾向となる。良好な分離状態を得るための遠心分離条件
は、用いられる遠心分離機によっても若干異なる他、高
圧ホモジナイザー処理前の菌体懸濁液の菌体濃度や菌体
中のＰＨＢ含有量によっても変動するが、それぞれの場
合に応じて適当な条件を設定することができる。例え
ば、一般的な実験室用遠心分離機を使用する場合に用い
られる遠心分離条件は、3,000 〜10,000ｇで 2〜10分で
ある。得られるＰＨＢ画分のＰＨＢ純度や回収率を加味
した経済的事情を考慮して遠心分離条件を決定すれば良
い。

【００１２】高圧ホモジナイザー処理液からのＰＨＢ顆
粒体分離においては、遠心分離以外の方法も用いること
ができ、たとえば微細な細孔を持つ分離膜を用いる濾過
分離が例として挙げられる。ＰＨＢ顆粒体は分離膜の細
孔を通過しない大きさであり、一方大部分の不溶性菌体
構成成分は細孔を通過できる大きさまで破砕されている
ので、ＰＨＢ顆粒体と分離することが可能である。高圧
ホモジナイザー処理液から遠心分離あるいは膜分離等に
よって得られたＰＨＢ画分は、場合によっては乾燥して
そのままプラスチックの成形材料として用いることが可
能であるけれども、本発明において純度の高いＰＨＢを
得るためには、さらなる菌体構成成分の除去を行なわな
ければならない。なぜならこのような菌体構成成分が残
存していると、プラスチックとしてのＰＨＢ本来の性能
が損なわれる可能性があることと、溶融成形のために融
点以上に加熱された場合に成形品が著しい褐変を示し、
結果として該ＰＨＢ粉体の用途が著しく制限されること
になるからである。溶融によって起こる褐変は、無色で
あった菌体構成成分中の窒素成分とＰＨＢを含む炭素化
合物との間で加熱によるメイラード反応が進行し、有色
化合物が生成されるためと考えられる。本発明の方法に
よれば、溶融しても褐変しない高品質のＰＨＢを得るこ
とができる。高圧ホモジナイザー処理液から得られたＰ
ＨＢ画分から除かれるべき成分は、遠心分離あるいは膜
分離等では除かれなかった不溶性の菌体構成成分であ
り、従ってこれの可溶化の操作が必要となる。

【００１３】本発明者等はこの可溶化の手段として酸素
系漂白剤による処理が極めて有効であることを見いだし
た。ここで言う酸素系漂白剤とは、該漂白剤中の有効成
分が媒体中で発生する活性酸素が有機物を酸化分解する
ことを作用の原理とする漂白剤であり、例としてたとえ
ば過酸化水素（H₂O₂）、過酢酸（CH₃C000H）、モノパー
サルフェートカリウム（KHS0₅ ）、過炭酸ナトリウム
（Na₂CO₃・3H₂O₂）、過硫酸ナトリウム（Na₂S₂O₈ ）とい
った化合物を挙げることができる。本発明においてこの
様な酸素系漂白剤処理は、たとえばパルプあるいは繊維
の一般的な漂白工程と同様な条件で行なうことができ
る。すなわち、例えば過酸化水素を用いる場合には高圧
ホモジナイザー処理液から得られたＰＨＢ画分の水性懸
濁液に過酸化水素濃度が0.5 〜10％、好ましくは1 〜5
％になるように過酸化水素を加えて、20℃〜懸濁液の沸
点、好ましくは50℃〜90℃の温度で10分〜24時間、好ま
しくは30分〜12時間処理することにより行なうことがで
きる。高圧ホモジナイザー処理液から得られたＰＨＢ画
分を該酸素系漂白剤で処理することにより、多くの場合
少なくとも98％以上の高純度のＰＨＢ粉体を得ることが
可能であり、得られたＰＨＢ粉体は熱溶融に際してもほ
とんど褐変を示さない。またこの処理の間のＰＨＢの分
子量は低下しても、10％程度である。高圧ホモジナイザ
ー処理の後に行なう酸素系漂白剤以外の不溶性菌体構成
成分の可溶化法、たとえばプロテアーゼ処理、界面活性
剤処理あるいは有機溶媒洗浄等の方法はこれらの処理を
単独で、あるいは併用して行う何れの場合においても、
得られるＰＨＢ粉体の品質は酸素系漂白剤処理に比べて
劣る。また、複数の方法を連続して行なう場合、全体の
工程が複雑となってしまうという問題が生じる。

【００１４】しかしながら、本発明においては、これら
の方法も必要に応じて酸素系漂白剤処理と併用する事が
できる。たとえば、高圧ホモジナイザー処理による菌体
破砕が不十分であるが故に得られたＰＨＢ画分に含まれ
る菌体構成成分の量が多い場合、プロアーゼ処理を予め
行なうことでタンパク性の不溶性菌体構成成分を低減し
た後に、酸素系漂白剤処理を行うことで純度の高いＰＨ
Ｂを得ることができる。また、酸素系漂白剤処理をした
後、たとえばアセトンやメタノ−ルのような有機溶媒で
洗浄することにより脂溶性の菌体構成成分を除くことで
より品質の高いＰＨＢ粉体を得ることができる。

【００１５】

【実施例】次に本発明を実施例によって更に詳しく説明
するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものでは
ない。実施例における菌体のＰＨＢ含有量およびＰＨＢ
粉体の純度（乾燥重量％）の測定は、ＰＨＢを分解、メ
チルエステル化し、これをガスクロマトグラフィーによ
り定量することで行った。ＰＨＢの分子量の測定は、Ｇ
ＰＣ（ゲル濾過クロマトグラフィー）分析によって行っ
た。ＰＨＢの溶融処理は、乾燥したＰＨＢ粉体を180℃
で30分間加熱した後放冷して行った。溶融処理によって
得られたペレットの褐変の度合いの判定は目視で行っ
た。

【００１６】実施例１ 菌株はプロトモナス エクストルクエンス（Protomonas
extorquens）Ｋ（微工研菌寄第8395号）を使用した。
なお、最近の文献によれば本菌は、メチロバクテリウム
（Methylobacterium）属に属するとされている（I.J.Bo
usfield and P.N.Green;Int.J.Syst.Bacteriol.,35,209
(1985)、T.Urakami et al.;Int.J.Syst.Bacteriol.,43,
504-513(1993)）。該菌株をメタノールを唯一の炭素源
とする完全合成培地を用いて、窒素源の供給を生育の律
速因子とした条件下で回分培養を行い、ＰＨＢを含有す
る菌体の培養液を得た。培養液の菌体濃度（菌体乾燥重
量／培養液重量％）は9％、菌体中のＰＨＢ含有量は乾
燥菌体重量に対して50％であった。この培養液に対し
て、種々の高圧ホモジナイザーを用い、種々の菌体濃
度、処理圧力、処理回数のもとに処理を行った。この処
理液を実験用高速冷却遠心機（日立工機製、CR20B2型）
を用いて5000g で10分間遠心分離した。得られた沈澱を
同様の条件での遠心分離で水洗浄し、沈澱を乾燥して粉
体とし、この粉体のＰＨＢ純度を分析した。用いた高圧
ホモジナイザーは、ブレンリューベホモジナイザーＳＨ
Ｌ０５型（ブランリューベ社、ドイツ）、マイクロフル
イダイザーＭ１１０型（マイクロフルイディクス社、ア
メリカ）、ハイパーホモジナイザーミニラボ型（ラニー
社、デンマーク）である。結果を表１に示した。

【００１７】

【表１】

【００１８】実施例２ 実施例１と同様にして菌体濃度12％、菌体中のＰＨＢ含
有量56％の培養液を得た。ＰＨＢの平均分子量は約100
万であった。この培養液をマイクロフルイダイザーＭ６
１０型を用いて処理圧力1050kgf/cm² で２回処理し、処
理液をウエストファリア社（アメリカ）製分離板型連続
遠心機 ＳＣ−３５型を用いて遠心分離（8000g 、分離
時間5分）した。このスラリー（重液）を遠心分離によ
って１回水洗浄した。得られたスラリー（重液）のＰＨ
Ｂ回収率は90％であった。このスラリーから得られる乾
燥粉体のＰＨＢ純度は90％であったが、溶融処理によっ
て褐変した。次いでこのスラリーに35％過酸化水素水を
過酸化水素濃度が3％になるように添加し、80℃で１時
間処理した。その後この処理液を遠心分離により水洗浄
し、乾燥して粉体を得た。この粉体のＰＨＢ純度は99％
であり、溶融処理を行っても褐変しなかった。粉体ＰＨ
Ｂの平均分子量は90万であった。

【００１９】実施例３ 実施例２と同じ培養液を用い、ラニーハイパ−ホモジナ
イザー１２．５１型を用いて処理圧力1000kgf/cm² で２
回処理を行った。次いで実施例２と同様に遠心分離およ
び水洗浄を行ってＰＨＢスラリーを得た。このスラリー
に酸素系漂白剤を添加し、80℃で１時間処理した。酸素
系漂白剤としては、過酸化水素、過酢酸、モノパーサル
フェートカリウム（商品名オキソン、デュポン社製）、
過炭酸ナトリウムおよび過硫酸ナトリウムを用いた。次
いでこのスラリーを遠心分離によって水洗浄し、乾燥し
て粉体を得た。これらの粉体に対してＰＨＢ純度分析お
よび溶融処理を行った結果を表２に示す。

【００２０】

【表２】 表２ 酸素系漂白剤 添加濃度（％） ＰＨＢ純度 溶融後褐変 過酸化水素 ３ ９９％ なし 過酢酸 ５ ９９％ なし オキソン １４ ９９％ なし 過炭酸ナトリウム ２ ９８％ なし 過硫酸ナトリウム ７ ９８％ なし

【００２１】実施例４ 実施例２と同じ培養液を使用し、ラニーハイパ−ホモジ
ナイザー１２．５１型を用いて処理圧力900kgf/cm²で２
回処理を行った。この処理液に対して実施例２と同様の
遠心分離、水洗浄を行い、ＰＨＢスラリー(1) を得た。
このスラリー(1) を乾燥して得られる乾燥粉体のＰＨＢ
純度は80％であり、溶融処理によって褐変した。このス
ラリー(1) にアルカラーゼ２．５Ｌ（ノボノルディスク
バイオインダストリー製細菌プロテアーゼ製剤）を0.1
％の濃度になるように添加し、50℃で１時間処理した。
この処理液に対して前記と同様の遠心分離、水洗浄を行
い、ＰＨＢスラリー(2) を得た。このスラリー(2) から
得られる乾燥粉体はＰＨＢ純度は95％であったが、溶融
処理によって褐変した。このスラリー(2) に過酸化水素
を濃度が3％になるように添加し、80℃にて１時間処理
し、次いで遠心分離による水洗浄を行いＰＨＢスラリー
(3) を得た。このスラリー(3) から得られる粉体のＰＨ
Ｂ純度は98％であったが、溶融処理によって僅かに褐変
した。このＰＨＢスラリー(3) をアセトンで洗浄し乾燥
して粉体とした。得られた粉体のＰＨＢ純度は99％であ
り、溶融処理をしても褐変しなかった。

【００２２】比較例 実施例１と同様にして得た培養液（菌体濃度14％、菌体
ＰＨＢ含有量54％）をマイクロフルイダイザーＭ６１０
型を用いて処理圧力1050kgf/cm² で２回処理を行 っ
た。この処理液に対して実施例３と同様の遠心分離、水
洗浄を行い、ＰＨＢスラリー(1) を得た。このスラリー
(1) にアルカラーゼ２．５Ｌを0.1 ％の濃度になるよう
に添加し、50℃で１時間処理した。この処理液に対して
同様の遠心分離、水洗浄を行い、ＰＨＢスラリー(2) を
得た。このスラリー(2) から得られる乾燥粉体のＰＨＢ
純度は96％であり、溶融処理によって著しく褐変した。
このスラリー(2) にＬＡＳ（直鎖アルキルベンゼンスル
ホン酸ナトリウム、陰イオン性界面活性剤）を7％の濃
度になるように添加し、80℃で１時間処理した。この処
理液に対して同様の遠心分離、水洗浄を行い、ＰＨＢス
ラリー(3) を得た。このスラリー(3) から得られる乾燥
粉体のＰＨＢ純度は98％であり、溶融処理によって褐変
した。このＰＨＢスラリー(3) をアセトンで洗浄し、乾
燥して粉体を得た。得られた粉体のＰＨＢ純度は98％で
あったが、溶融処理によって褐変した。

【００２３】

【発明の効果】本発明によれば、培養液を高圧ホモジナ
イザーで処理し、ＰＨＢ以外の菌体構成成分を除去した
後にＰＨＢ画分を酸素系漂白剤で処理するという、極め
て簡便な分離精製方法によって、少なくとも９８％以上
の純度を持ち、かつ成形の際の熱溶融による褐変もない
ＰＨＢ粉体を、分子量の低下を10％程度に止めつつ得る
ことが可能であり、従って微生物によるＰＨＢの工業的
生産の効率向上およびコストの低減に大きく寄与するこ
ととなる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ポリ−３−ヒドロキシ酪酸を含有する微
   生物菌体からポリ−３−ヒドロキシ酪酸以外の微生物菌
   体構成成分を除くことによって純度の高いポリ−３−ヒ
   ドロキシ酪酸を得るポリ−３−ヒドロキシ酪酸の分離精
   製法であって、 ａ）ポリ−３−ヒドロキシ酪酸を含有する微生物菌体の
   懸濁液を高圧ホモジナイザーで処理することによって該
   微生物菌体を破砕してポリ−３−ヒドロキシ酪酸顆粒体
   を菌体外に漏出せしめ、次いでこの高圧ホモジナイザー
   処理液からポリ−３−ヒドロキシ酪酸以外の菌体構成成
   分を分離し、ポリ−３−ヒドロキシ酪酸画分を得るこ
   と、および ｂ）ａ）により得られたポリ−３−ヒドロキシ酪酸画分
   を酸素系漂白剤で処理すること、を含むポリ−３−ヒド
   ロキシ酪酸の分離精製法。