JPS61286000A - タン白の回収方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酵母細胞からタン白を抽出する方法に関する。

別の面では、本発明は細胞を破壊し酵素のようなタン白
を遊離する方法に関する。さらに別の面では、本発明は
酵母細胞に含まれる酵素金得る方法に関する。

醗酵技術および各種炭素エネルヤー基質および特別の微
生物菌株の組み合せは貴重な細胞内酵素を生産すること
ができる。細胞上破壊し、そこに含まれるタン白、特に
貴重な酵素を破壊せずに得ることは非常に望ましい。

含有タン白、特に酵素全遊離させるため酵母細胞の崩壊
に各種のアプローチが使用された。機械的破壊技術は通
例タン白の破壊全最少にする友め冷却しながらボールミ
ル粉砕、磨砕、音波処理など金含んだ。しかし、機械破
壊は一般にいくらかの酵素の劣化を生じ、細胞断片のき
わめて不均質な生成混合物は可溶性フラクションから■
効に分離することが困難であることが分つ友。細胞壁を
破壊又は崩壊し細胞内容物全遊離させるために添加酵素
が使用され九。しかし、添加酵素は高価であり、異質タ
ン白を導入し、望ましくない分離問題音生じ、又は所望
酵素の使用に望ましくない副効果金生ずる。

自己分解（原形質離解）を起こさせるためにトルエンの
ような各種炭化水素：酢酸エチル、アセトン、他のジア
ルキルケトンを含むカルボニル化合物；およびエチルエ
ーテルおよび０１〜Ｃ４アルカノールのようなアルコー
ルなどの他の化学薬剤を含む化学的方法が使用され友。

これらの化学的アプローチは微生物、その生育条件およ
び溶媒に対する曝露時間および溶媒の濃度により異る結
果を生じた。所望の処理温度で揮発性は引火性、実際上
爆発状態音生ずるので、いくつかのものは危険であった
。あるものは細胞溶解性溶媒の高濃度金製し、これは次
のＮ製工程で分離問題を起こす。

尚、安全な材料、温和な条件および最少量の添加細胞溶
解性成分を使用して、細胞からのタン白遊離に良い結果
を得るために尚新しい処理が要求される。

比較的低濃度の水中のポリクロロ脂肪族処理剤を約室温
で何時間かの温度と組み合せることにより酵母細胞の溶
解（破壊）および、酵素および他のタン白を含む細胞内
生成物の遊離を生ずることが分った。

方法は水性分散体としてごく少量の水中のポリクロロ脂
肪族処理剤を酵母細胞と混合して使用し、生成６−混合
物は所望時間温度する。この方法により実質的にすべて
の細胞、一般には少なくとも約８０数％の細胞が適当に
破壊され、可溶性タン白内容物全水性分散体中に遊離す
る結果となり、次に酵素および他のタン白は通例方法に
より回収することができる。

溶媒−誘発自己分解奮起こすためにポリクロロ脂肪族処
理剤全使用する方法は、温和であり、信頼性があり、能
率的で、酵素の回収が良好で、労働が烈しくない。ごく
少量のポリクロロ脂肪族処理剤が含まれ、これは回収処
理全妨害せず、分離の必要がない。これらは実際に細胞
溶解に続く任意の所望の精製工程中静菌剤として作用す
る。

使用する＆　ＩＪジクロロ肪族処理剤は非ベンゼノイド
炭化水素のポリクロロ誘導体と称することができる。特
に、これらはアルカンのポリクロロ誘導体であり、通常
標準温度および圧で液体である。

使用することができ、通常温度および圧で液体であるア
ルカンのポリクロロ誘導体のうち、次側のものは単独又
は混合して使用することができる。

しかし例示の九めのもので、限定するものではない： メチレンクロリド １．２　ジクロロエチレン（シス又はトランス）エチリ
デンクロリド クロロホルム ２．２−ジクロロプロパン １．１．１−）ジクロロエタン 四塩化炭素 エチレンクロリド トリクロロエチレン プロピレンクロリド １．１．２−）ジクロロエタン テトラクロロエチレン トリメチレンクロリド Ｓ−テトラクロロエタン １．２．３−）ジクロロプロパン、およびペンタクロロ
エタン 現在好ましいものはクロロホルム又はメチレンクロリｒ
である。

本方法によれば、水性、好気性醗酵条件下で炭素含有基
質に発育する酵母細胞を使用する。

適当な酵母はキャンシダ、ハンセヌラ、トルロブ・シス
、サツカロミセス、ぎチア、デバリオミセスおよびプレ
タノミセスのような属からの種を含む。現在好ましい属
はキャンシダ、ハンセヌラ、トルロプシス、ビチアおよ
びサツカロミセスを含む。適当な種の例は次のもの會含
む： Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ　ｐｅｔｒｏｐｈｉｌｉｕ
ｍ　。

Ｃａｎｄｉａａ　ｂｏｌｄＬｉｎｉｉ　。

ＣａｎｃＬｌｄａ　１ｉｐｏｌｙｔｉｃａ　。

（：ａｎｄｉａａ　ｍｙｃｏｄｅｒｍａ　。

ＣａｎｃＬｌａ　ｕｔｉｌｉｓ　。

ＣａｎｃＬｌｄａ　　５ｔｅｌｌａｔｏｌｅｓ　。

Ｃａｎｄｉｄａ　　ｒｏｂｕｓｔａ　。

Ｃａｎｄｉｄａ　　ｃｌａｕｓａｅｎｉｉ　。

Ｃａｎｄｉｃｌａ　　ｒｕｇｏｓａ　。

Ｃａｎｄｉｄａ　ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ　。

Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ　　ｈａｎｓｅｎｉｉ　。

）ｉａｎｓｅｎｕｌａ　　ｍｌｎｕｔａＨａｎ日ｅｎｕ
ｌａ　　５ａｔｕｒｎｕａＨａｎｓｅｎｕｌａ　　ｃａ
ｌ−１ｆｏｒｎｉｃａＨａｎｓｅｎｕ１ａ　　ｅｉｌｖ
ｉｃｏｌａ　。

Ｈａｎｅｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ　。

［ａｎｓｅｎｕｌａ　　ｗｉｃｋｅｒｈａｍｉｉＨａｎ
ｓｅｎｕｌａ　　ｃａｐｓｕｌａｔａ　。

）（ａｎｓｅｎｕｌａ　ｇｌｕｃｏｚｙｍａ　。

Ｈａｎｓｅｎｕｘａ　　ｈｅｎｒｉｃｌｌＨａｎｅｅｎ
ｕｌａ　ｎｏｎｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ　。

１ａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｈｉｌｏｄｅｎｒａ　。

Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　　ｈｏＬｓｔｉｉＰｉｃｈｉａ　
　ｆａｒｉｎｏａａ Ｐｉｃｈｉａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ　。

Ｐｉｃｈｉａ　　ｍｅｍｂｒａｎｅ　　ｆａｃｉｅｎｅ
１’１ｃｈｉａ　ｐｉｎｕｓ　。

Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ　。

Ｆｉｃｈｉａ　　ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ　。

Ｓａａｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ
　。

８ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅａ　　ｆｒａｇｉｌｉｇ　。

Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｒｏａｅｉ　。

８ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ａｃｉｄｉｆａｃｉｅ
ｎｓ　　。

Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　ｅｌｅｇａｎｓ　。

Ｅ３ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅａ　　ｒｏｕｘｉｉ　。

８ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　１ａｃｔｉｓ　。

Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　　５ｏｎｏｒｅｎｓｉｓ　　。

Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　　ｃａｎｄｉｄａ　　。

Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　　ｂｏ：Ｌｍｉｉ　。

Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　　ｖｉｒｓａｔｉｌｌｓ　。

Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　　ｇｌａｂｒａｔａ　。

Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉａ　　ｍｏｌｉｓｈｉａｎａ　　。

Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　　ｎｅｍｏｎｄｅｎｄｒａ　。

Ｔｏｒｕｌｏｐｅｉｓ　　ｎ１ｔｒａｔｏｐｈｉｌａ　
。

Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ　ｐｉｎｕｓ　、　　　およびＴ
ｏｒｕｌ、ｏｐｅｉｓ　　ｂｏｍ’ｂｉｃｏｌａ　　。

所望の場合、２種又はそれ以上の酵母の混合物は使用す
ることができる。使用する特別の酵母は使用する炭素含
有基質に一部依存する。これは異る酵母はしばしばいく
らか異る基質を最善の発育に対し要求し、又は特定の生
化学的変換は特定の酵母風又は種により最善に行なわれ
ることが周知であるからである。例えば、上記記載糧の
いくつかの特別の菌株はメタノール上に十分に発育しな
い、すなわちメタノールを利用しないことが認められる
。

酵母細胞は有利には全細胞規準で約８．５〜１５重量％
、好ましくは１０〜１６重量％の固形含量（乾物規準）
のような、全酵母細胞の実質的濃度を含む細胞クリーム
として処理される。酵母細胞は水およびポリクロロー処
理成分と混合されて１ノにつぎ約８５〜１５０、好まし
くは約１００〜１３０ｇの細胞を含むスラＩＪ−ｔ−形
成する。より低い細胞濃度は使用することができるが、
結果は満足できるものではない。２〜６重量％の細胞濃
度では酵素の遊離は起こら々いことを現在のデータは示
す。

水性クリーム又は細胞スラリーの残余成分は本質的に水
であり、そしてポリクロロ処理剤である。

水成分は純粋な水、稀薄塩金倉む水又は有利であるか、
利用しうるか又は所望するような醗酵容器流出天然液で
ある。

６−成分系の全体を規準にして、ポリクロロ処理剤の量
は選択した剤および時間および使用温度に関し特別の細
胞の自己分解を達成するのに有効な量であるべきである
。約０．８〜６、好ましくは約１．５〜４容量％の範囲
が示唆される。

混合は使用する量および材料により、−緒にそそぐ、撹
拌するなどのような任意の有利な方法による。細胞の物
理的破壊を生ずるような物理的叩解又は烈しい混合の必
要はない。

混合は任意の順序でよい。細胞と水成分、次にポリクロ
ロ処理化合＠全加えるのが現在好ましい。

しかし、ポリクロロ化合物および水成分は最初に混合し
、次にそこに酵母細胞を添加することもできる。醗酵工
程から出る水性醗酵液口体の使用は好ましく有利であり
、これは上澄水性液および懸濁酵母細胞の双方金倉む。

所望の場合、細胞は遠心分離又は濾過などにより分離し
、所望の場合残留黒磯物質金除去するために水洗し、新
鮮水に再懸濁することができる。別法では、水性醗酵液
中の細胞濃度は必要の場合、濾過、遠心分離、溶媒除去
などにより増加させることができる。水性醗酵液が高細
肥密度の酵母醗酵工程からのものである場合、このよう
な水性醗酵液は所望の場合そのまま使用することができ
る。

６−成分系は初期−について、約６．５〜８．５が適す
るが好ましくは少なくとも１ＦＪ７の−に、好ましくは
約７．２５〜８に初期ｐＨｅ調整丁べきであり、水性酵
母分散液のあるもののＦｋｌは経時的に僅かに減少する
傾向がある。酵母細胞製造用の水性醗酵液の−は通例い
くらか酸性側にある。ある場合には、少量の稀水酸化ア
ンモニウム又は苛性ソーダ又は同様のアルカリ、好まし
くは稀薄溶液の添加はＰＨ調整に使用することができる
。

接触温度は実質的に室温、又は水性醗酵液口体が直接使
用される場合、通常醗酵容器から出るときの水性醗酵液
の温度などが有利である。

通例、約２０〜６５℃１さらに好ましくは約２５〜６５
℃の接触温度が使用される。

有利には、そして好ましくは接触温度は保持又は温度に
対し使用されるものである。

「保持」時間又は「温度」時間は少なくとも約１６時間
、さらに通例約１６〜９０時間、現在好ましくは約２４
〜４８時間の時間である。

酵母細胞、水およびポリクロロ処理化合物の混合物であ
る６−成分系は所望時間ステンレス鋼、ガラス−内張、
又は同様の適当な保持容器又はタンクに維持することが
できる。醗酵容器自体は保持容器として使用できる。−
および温度は上記のように維持子べきである。通常、連
続的撹拌は必要ないが、温和な撹拌又は混合は所望の場
合使用できる。

空気又は酸素から内容物全遮蔽する必要性は現在知られ
ていないが、容器からポリクロロ炭化水累溶媒の損失全
最少にするため通例密閉容器が示唆される。

元から内容物全遮蔽する必要性は現在知られていないが
、通常保持容器は暗黒である。

この保持又は湿量時間中酵母細胞の細胞壁は破壊し、破
裂し、崩壊し、そしてこれらのタン白性内容物を水性環
境に遊離する。

その後酵素含有タン白は回収できる。

溶解細胞から含有タン白、特に酵素の回収に各程のアプ
ローチが使用された。処理方法工程からの生成タン白−
含再水性液は所望の場合、細胞ぐずおよび他の懸濁固体
の除去に対し遠心分離することができる。

タン白−含有水性液中の可溶性タン白は溶媒分配、固体
マトリックス上の吸着、限外濾過、遠心分離、および沈
澱により、又はこれらの方法の組み合せにより固相から
回収することができる。本方法における好ましい回収方
法は、特にアルコールオキシダーゼおよびラクターゼ酵
素などの回収に対し、遠心分離および／又は限外濾過で
ある。

本発明は特別の酵素を高生産する微生物からの酵素の回
収に特に適用できる。例えば、ｘｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃ
ｅｓ　−Ｌ毒１去す」−はラクターゼを高生産する。Ｐ
ｉｃｈｉａ　　ｐａ１３ｔｏｒｉＥｌ　　、特に基質と
してメタノール上に生育する場合少なくともある菌株は
大量の非常に望ましいアルコールオキシダーゼ、および
アタラーゼ、蟻敵デヒドロデナーゼなど全生産する。

供試例は当業者が本発明をさらに理解することを助ける
ためのものである。使用する特別の材料は例示として見
做し、限定するものと考えるべきではない。本文、例、
データおよび特許請求の範囲金倉む明細書は本発明の合
理的かつ適当な範囲全考慮するのに全体として判断すべ
きである。

次の醗酵記載は次側で記載のようにさらに処理する細胞
含有流出液金供する友めに行なわれる代表約数醗酵であ
る。

連続的好気醗酵方法において、それぞれ約４０＝６０の
容積比のメタノールと水性無機塩培地全個別に醗酵容器
に供給し、メタノールが発育−限定因子であるような割
合で酵母Ｐｉｃｈｉａ　ｐａａｔｏｒｉｓＮＲＲＬ　Ｙ
　−１１４３０１１１接１１　Ｌ７ｊＯ［ｌ陣容ｉｕ約
６１０１の液体容量含有し、−１温度およびレベルの自
動調整による１５００Ｊの気泡−充満の醗酵容器であっ
た。撹拌は２個の通例のパドル型でタービン駆動で１０
０　Ｏｒ、Ｉ）、ｍで行なった。通気割合は１分間に醗
酵容器の醗酵液につき約４容積の空気〔約３８　ｐｓｉ
ｇ　（２６２ｋＰａ　）および約２５℃で〕であった。

無水アンモニアは醗酵混合物に約６．５のｐＦ（ｔ−維
持するのに十分な割合で添加した。

水性無機塩培地は１１の飲料水に対し、１３．８６−の
７５重量％Ｈ３Ｐ０．．９．５３　、！ｉ’のに２ＳＯ
４，７，８９Ｍｇ５ｏ、　’　７　ＨｚＯ，０４ｇＣａ
Ｃ１２”　２　ＨｚＯおよび２．６１の８５重量％ＫＯ
Ｈを混合して製造した。

水性無機塩培地は１時間当り３１．５１の割合で、メタ
ノールは１時間当り２１Ａ’の割合で供給した。

微量無機物溶液は１！の溶液に対し、６５ｙＦｅＳＯ４
・７　ＨｚＯ，２０ｇＺｎ５ｏ、−７Ｈ２０，６，０９
ＭｎＳＯ４−Ｅ（２０，６，０ｇＣｕＳＯ４−５ＨｚＯ
，５，０１濃硫酸および１１の浴液にするのに十分なイ
オン除去水を混合して製造しに０微量無機物溶液十ビオ
チンは７８０−の微量無機物溶液、２０祷水、２００Ｍ
メタノールおよび０．０３２　ｇビオチンを混合して製
造した。微量無機物溶液＋ビオチンはメタノール１１に
つき１０ｄの害１合でメタノール流を経て別に供給した
。

醗酵はｆＪ３０’ｃおよび約３８　ｐｓｉ圧で、約１１
．６時間の平均保持時間で行なった。細胞密度は代表的
には醗酵流出液１１につき約１２８．４９細胞であつ几
。醗酵液の総固形含：＆ｔは代表的には約１３、！１．
７ｇ／Ａであり友。

産生酵母細胞は遠心分離により醗酵流出欲（水性醗酵液
）から分離し、水にｇ濁して洗滌し、その後、再遠心分
離し、−夜１００℃で乾燥し、秤量した。乾燥規準で酵
母細胞の収量は代表的には供給メタノール１００１につ
きＦＩＡ　０．６　ｊｉであった。

例　　１ １１につき約１６０ｇの全細胞を含み、実質的に上記の
ように基質とし℃メタノールを使用する高細胞密度醗酵
から得りＰｉＱｈｉ＆　−２す３旦ｒｉｇ　ＮＲＲ’Ｌ
Ｙ−１１、ｌ！３０の水性クリーム又はスラリーに十分
な稀苛性ソーダ全添加してＰＩ−１に約７６５に調整し
た。

一調整スラリーのｉ５ｍＪの増加分に０．５−の選択し
ｔ処理剤を添加した。生成処理混合物は瞬時撹拌しなが
ら室温に約２日保持し友。次に各試料は遠心分離し、ア
ルコールオキシダーゼ活性に対し上澄の分析全行なり几
。次の結果を得た二表　　１ 生成アルコール 試験　　　　使　用　溶　媒　　　　　オキシダーゼ活
性（ＩＬ） １　　水　　　　　　　　　　　　　無し２　　０．５
．９酢酸ソーダ　　　　　　無視できる程度６　　テト
ラヒＰロフラン　　　　　無視できる程度４　　ヘキサ
／　　　　　　　　　　無視でざる程度５　　クロロホ
ルム　　　　　　　　６６．９６　　トルエン　　　　
　　　　　　６．４７　　ジエチルエーテル　　　　　
　０．６６８　　ジエチルエーテル（０，１ｄ）　　無
視できる程度９　０．６％アジ化ンーダ　　　　　無視
できる程度１０　　ジメチルスルホキシド　　　　無視
できる程度１１　　アセトン　　　　　　　　　　無視
できる程度１２　１％トリトン　Ｘ　−１ＱＱ　（１）
）　　　無視できる程度１３　　酢酸エチル　　　　　
　　　　無視できる程度（ａ）０−ジアニシジン／パー
オキシダーゼ法により測定した酵素単位／祷。

（１））　　ローム・アンド・ハースの界面活性剤ヘキ
サンおよびジエチルエーテルは既知処理剤であり、比較
のために使用した。本発明の試験５は使用濃度で数段す
ぐれたオーダーであることは明らかである。

例　　■ ＰＨヲ調整した、実質的に上記と同様に製造したＰｉｃ
ｈｉａ　　ｐａｓｔｏｒｉｅ　　水性スラリーの５０ｒ
ＩＬｔ試料に１．５−の選択処理剤全添”加し、混合し
、室温に放置した。２４時間後、追加の１．５ｇ処理剤
全ヘキサン試料に添加し文。６１１Ｌｔのジエチルエー
テルにより製造し友下記試験１７は約４８時間の全温室
時間であった。他の試料も４８時間の全温室時間であり
几。試料は遠心分離し、上記のように分析した。

表１ 生成する上澄の １４　へキサン　　　　　　３．［ｌｄ　　　　　　　
　０．４７１５　クロロホルム　　　　１．５祷　　　
　　１８９．７１６　ジエチルエーテル１．５ｒＩＬｔ
０１７　ジエチルエーテル　　６．０鯰　　　　　２１
．９．６１８　トルエン　　　　　　１．５１１ｊ　　
　　　　　４Ｂ、５（ＩＬ）　　表Ｉ　ｆａｌの脚注参
照 高濃度で、ジエチルエーテルは実質的のアルコールオキ
シダーゼ活性金示す上澄全生成し几。しかし、この先行
技術方法は高引火性の爆発可能性材料を使用しなければ
ならない。クロロホルムによる本発明の試験はより低濃
度で比較的安全な薬剤全使用するがジエチルエーテルに
より生産されたものと同じ非常に高い活性を示す。これ
らの処理細胞混合物は物理的に破壊した細胞（ビードミ
ル又はフレンチプレス）よりもより低いｇ−力で遠心分
離することにより沈澱させ、非常に透明な上澄を得るこ
とができる。

ヘキサンおよびトルエンによる試験は実質的に無効であ
った。

例　　■ ｐｌｃｈｉａ　　ｐａｇｔｏｒｉｓ　　ＮＲＲＬ　　Ｙ
　−１１４３０ｆ再度上記のように実質的に生産し友。

１１につき約１６０１！ｉｌ＋の細胞を含Ｑ　Ｐｉｃｈ
ｉａ　　ｐａｓｔｏｒｉｓ水性スラリーは約０．０１重
量％のアジ化ソーダを含み、上記のようにｐ）ｌｋ７．
５に調整した。各種量のクロロホルム又はメチレンクロ
リドを添加し、生成混合物は室温で約４日（９６時間）
瞬時撹拌しながら放置した。次に各試料は１５分間１３
．００　Ｏｒｐｍで遠心分離し、上澄は４℃で保存し、
その後約２口径アルコールオキシダーゼに対し分析し友
。

表■ ５０ｗＬｌのピチア　アルコール １９　クロロホルム　　　　　　０゜５　　　６６６．
８　　深赤色２０　クロロホルム　　　　　　１．０　
　　　３１Ｂ、５　　赤色２１　クロロホルム　　　　
　　１゜５　　　２３５．７　　赤色２２　メチレンク
ロリド　　　　０．５　　　　３１１．６　　深赤色２
６　メチレンクロリド　　　　１．０　　　　１４９．
５　　赤色２４　メチレンクロリド　　　　１．５　　
　　２０９．３　　赤色ｆａｌ　　表■の脚注（ａ）参
照 上記結果はクロロホルムおよびメチレンクロリドの両者
はアルコールオキシダーゼを含む非常に望ましい上澄を
生成することを示す。より少量のポリクロロカーボンは
比較的長時間の温置時間を使用する場合もつとも多く生
成するらしい。

例　　■ 上記のように再度　Ｐｉｃｈｉａ　　ｐａｓｔｏｒｉｓ
　ｆ使用し、実質的に同じ方法全使用してさらに試験を
行なった。しかし、４８時間温ｔ’を前記例の９６時間
の代りに使用し几。生成上澄は分析前２日間約４℃に維
持した。使用しｆｔ−Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ
　　量はいずれの場合も１１につき約１６０ｇの細胞を
含む５０１の容量であつ次。結果は表■に示ｊ：表ＩＶ
Ａ ５０１のピチア　　アルコール ２５　クロロホルム　　　Ｑ、５Ｈ１１４７鮮明な橙色
２６　メチレンク　　　Ｑ、５ｉｕ　　　　　　１４９
　　　鮮明力橙色ロリド ２７　メチレンク　　　０．２１　　　　無視しうる　
鮮明な橙色ロリド　　　　　　　　　　　宜 ２８　１．１．１ 一トリクロ　　　０．５＋＋ｔｔ１５９　　　鮮明な橙
色ロエタン （ａ）　　表Ｉの脚注（２Ｌ）参照。

いずれのポリ塩素化処理剤も有効であり九。最少量はメ
チレンクロリドによる試験で示され友ように容易に確か
めることができる。

上記試験は上記２日ではなく６日の温ｉｌ全使用するこ
と金除いて反復し九〇得た結果は表ＩＶ　Ｂに示す： ５Ｑｄのビチア　アルコール ２９　メチレンクロリド　　　　　　　ｉ、ＱＩＩ！７
１８６６０　メチレンクロリド　　　　　　　０．５ｄ
　　　　　　　７２６１　　１．１．１−トリクロロエ
タンＧ、５ｒＬｔ２９８６２　ジエチルエーテル　　　
　　　Ｌ５ｄ　　　　　２８９３３無　　　　　　　　
　　２ （ａｌ　　表Ｉの脚注（ａｌ参照。

これらの対比結果はトリクロロエタンおよびメチレンク
ロリドに対し高い有効性を示す。これらの結果全上記表
ＮＡに示したものと比較すると、恐らくより低量の０．
５−のメチレンクロリドでは長時間の温置けあまり好ま
しくないであろうと思われる。

例　　■ 酵母細胞の溶媒−誘発自己分解に対する−の効果全考察
するため試験全行なった。選択した酵母細胞は再び上記
のように炭素エネルギー基質としてメタノール上に生育
する　Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓＮＲＲＬ　Ｙ　
−１１４３０であった。５０祷容量のＰｉｃｈｉａ　ｐ
ａＥｌｔｏｒｉ８酵母細胞は槽水酸化アンモニウムによ
り６．５〜８．０の範囲の−に調整した。各試料は、ｌ
’）１３０９細胞／ｌ’ｃ含んだ。各試料に１．〇−メ
チレンクロリドを添加した。各試料は２日間温室し、そ
の後裔試料は遠心分離し、アルコールオキシダーゼ活性
全上澄に対し測定した。得た結果は次の通りである： 表　　Ｖ 番号　出発時のＰ）ｌ　　温度後の−ダーゼ分析　（ａ
１３４　　６．５　　　　　６．２　　　　　　無視し
うる量３５　　７．０　　　　　６．５　　　　　　　
８０３６　　７．２５　　　　６．６　　　　　　１２
４３７　　７．５　　　　　６．７　　　　　　１６６
３８　　７．７５　　　　６．９　　　　　　１！＋９
３９　　８．０　　　　　７．０　　　　　　１５２ｆ
＆）　　表１の脚注（ａｌ参照。

これらの試験から細胞混合物の調整−は温度の初期に少
なくとも約７、恐らくは好ましくは約７．５であるべき
であると思われる。温直中いくらか−が減少する理由は
未知であるが、恐らくは大気からの僅かな二酸化炭素の
吸収又は細胞の代謝により生産される酸が含まれるため
であろう。

例　　■ Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｆｒａｇｉｌｉｓ　ＮＲ
ＲＬ　Ｙ　−２２６４は６７℃の醗酵温度および炭素エ
ネルギー基質として粗乳糖（チーズホエイ透過？！７）
ｔ−使用する水性好気醗酵条件下で生育させ几。各試料
は約４．５ｇ（９重量％）の酵母細胞を含′０が、この
５〇−容量のに１ｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　　ｆｒａｇ
：Ｌｌ、ｉｓ試料に十分な稀苛性ンーダを添加して約７
．５にＰ）ｌ全調整し九〇各Ｐ）ｌ調整試料に０．５−
のメチレンクロリド又はトリクロロエタンを添加した。

上澄のラフターぜ活性は２４．４８および９６時間の温
度間隔で安定であった。ラクターゼ酵素活性はベーター
ガラクトシダーゼ分析方法により測定し九０光　■ 試験番号　　処理　剤　　温置時間　ラクターゼ活性（
帽４０　　メチレンクロリド　２４時間　　　　　１０
．８４１　　メチレンクロリド　４８時間　　　　　　
８．６４２　　メチレンクロリド　７２時間　　　　　
　５．２４６　　トリクロロエタン　２４時間　　　　
　　４．２４４　　トリクロロエタン　４８時間　　　
　　　８．５７４５　　トリクロロエタン　７２時間　
　　　　　６．９４（ａｌ　　基質とじて０−ニトロフ
ェニルガラクトシダーゼを使用してそのβ−ガラクトシ
ダーゼ活性により測定した酵素単位／ＩＬｔ０各溶媒に
対溶媒理剤の供試濃度に対する最適温置時間があるよう
である。これは上記のように容易に測定することができ
る。

例　　■ 再びＫｌｕｙｖ＠ｒｏｍｙｃｅｓ　　ｆｒａｇｉｌｉ−
ｓ　　Ｙ　−’ｌ　２６４を約４．７の−、醗酵温度６
７℃全使用し、低ビタミン含量會■する水性好気醗酵条
件下で例■記載と一同様に生育させ穴。

酵母細胞の水性スラリーは濃苛性ソーダ全使用し″−１
ニア、５の−に調整し友。各試料が約１１０ｇ細胞／ｌ
の酵母細胞を含む酵母スラＩＪ　−５０ｒＩＬｔに各糧
食のメチレンクロリドか又はトリクロロエタン全添加し
た。６試ｎは室温で約４８時間、ｈ々振盪しながら温度
した。次に各試料は遠心分離し、上澄はベーターガラク
トシダーゼ法によりラクターゼ活性全分析した。温置時
間後の最終−は各試料に対し約７．０であると評価した
。結果は次の通りである： 表■Ａ ４６　　メチレンクロリド　　０．２　　　　　　無４
７　　メチレンクロリド　　０．５　　　　７．８８４
８　　メチレンクロリド　　１．０　　　　４．８８４
９　　メチレンクロリド　　１．５　　　　３−．６８
５０　　トリクロロエタン　　０．２　　　　　　無５
１　　トリクロロエタン　　０−５　　　　４．９７５
２　　トリクロロエタン　　１．０　　　　４．１１５
６　　トリクロロエタン　　１．５　　　　７．１１（
ＩＩＬｊ　　表■の脚注（ａＩ参照。

結果は供試剤に対レポリクロロー処理剤の最適濃度があ
るらしく、これは含まれる特別の酵母菌株により変化し
うろことを示す。

上記のように　ｘｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　　ｆｒａ
ｇｉｌｉａ　　の追加部分全使用した。濃苛性ソーダを
使用して出発Ｆ８を変え友。約１１０ｇ細胞／ｌ’ａ−
含む各５０−酵母細胞試料に１祷の処理剤全添加し九〇
試料は室温で２日間時々振盪しながら温室した。次に各
試料會遠心分離し、上澄はベーターガラクトシダーゼ分
析によりラクターゼ活性を分析し友。結果は次の通りで
ある： 表■Ｂ ５４　　メチレンクロリげ　６．５　　６．４３　　　
　　無５５　　メチレンクロリド　７．０　　６．７２
　　　４．２８５６　　メチレンクロリド　７，２５　
６．７５　　　４．２８５７　　メチレンクロリド　７
．５　　６．８４　　　４．２８５９　　メチレンクロ
リド　８．０６゜９６　　　４．８８６０　　トリクロ
ロエタン　６．５　　６．２３　　　４．９７６１　　
トリクロロエタン　７．０　　６．４０　　　７゜９７
６２　　トリクロロエタン　７，２５６，４５　　　７
．８６６　　トリクロロエタン　７．５　　６．４９　
　　８．８６６４　　トリクロロエタン　７．７５　６
．Ａ９　　　８．９１６５　　トリクロロエタン　８．
０　　６．５０　　　７゜２８（ａ）は表■の脚注（ａ
）参照。

結果は約７〜８の一範囲でポリクロロ脂肪族処理剤によ
る酵素抽出方法は好効果を得られること金示す。

例　　■ 本例のデータは初期細胞密度の意義を例示する。

Ｐｉｃｈｉａ　　ｐａｓｔｏｒｉｓ　　ＮＲＲＬ　　Ｙ
　−１１４３［］　″ｆｔ上記のように本質的に生育さ
せ友。５ｏｒＩＬｔの酵母細胞スラリー全４容量のＰｉ
ｃｈｉａ　　ｐａｓｔｏｒｉａ細胞培地で稀釈し、細胞
密度２．５　重量％を得九。この（稀釈）試料および未
稀釈対照試料を双方共７．９〜８．２の一範囲に調整し
、上記のようにメチレンクロリド１％およびアジ化ソー
ダ０．０１％とした。

両試料は６２〜６５℃で２２時間温湿量、その間両試料
の細胞は沈澱し几。

表　　■ ５４一対照　　　赤色　　　　　　５９８ＥＵ５５−稀
釈　　　黄色　　　　　　　４０１！Ｕ＊　　ＡＢＴ８
　（２−２’　−７シ／　−Ｄ’Ｌ　−（５−Ｚ？ルベ
ンヅテアジッドスルホン酸）〕分析法による。

２〜６重量％のオーダーの試験５５の低細胞密度は上澄
の生成人、０．活性に反対に作用し、単に稀釈要素から
予期される結果以上に利用しうるＡ、Ｏ，活性が減少す
ることが分る。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）酵母全細胞からタン白を回収する方法において、 （ａ）タン白を含む酵母細胞と、主要量の水溶液および
   少量有効量の通常液体のポリクロロ脂肪族炭化水素処理
   剤とｐＨ−調整水性混合物を形成し、この混合物は約０
   ．８〜６容量％の処理剤を含み、（ｂ）約２０〜３５℃
   の温度、約１６〜９０時間の間、約６．５〜８．５のｐ
   Ｈでこの混合物を温置し、それによつて少なくとも一部
   のタン白を細胞から水中に遊離させて、タン白−含有水
   性液を形成し、そして （ｃ）液を固体材料から分離し、この液はタン白を含む
   ことを特徴とする、上記方法。
2. （２）処理剤は メチレンクロリド、 １，２−ジクロロエチレン（シス又はトランス）、エチ
   リデンクロリド、 クロロホルム、 ２，２−ジクロロプロパン、 １，１，１−トリクロロエタン、 四塩化炭素、 エチレンクロリド、 トリクロロエチレン、 プロピレンクロリド、 １，１，２−トリクロロエタン、 テトラクロロエチレン、 トリメチレンクロリド、 ｓ−テトラクロロエタン、 １，２，３−トリクロロプロパン、 ペンタクロロエタン又はこれらの２種又はそれ以上の組
   み合せである、特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）温置温度は約２５〜６５℃であり、その時間は約
   ２４〜４８時間である、特許請求の範囲第１項又は第２
   項記載の方法。
4. （４）タン白は酵素である、特許請求の範囲第１項から
   第３項のいずれか１項に記載の方法。
5. （５）酵母はＣａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｔ
   ｏｒｕｌｏｐｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｅ、Ｐ
   ｉｃｈｉａ、ＤｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓおよびＢｒｅｔ
   ｔａｎｏｍｙｃｅｓ属の１つの種である、特許請求の範
   囲第１項から第４項のいずれか１項に記載の方法。
6. （６）酵母はＰｉｃｈｉａ属のものである、特許請求の
   範囲第５項記載の方法。
7. （７）酵素はアルコールオキシダーゼである、特許請求
   の範囲第６項記載の方法。
8. （８）処理剤はメチレンクロリド、クロロホルムおよび
   １，１，１−トリクロロエタンの少なくとも１種である
   、特許請求の範囲第７項記載の方法。
9. （９）酵母はＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ翼のものであ
   る、特許請求の範囲第５項記載の方法。
10. （１０）酵素はラクターゼである、特許請求の範囲第９
    項記載の方法。
11. （１１）処理剤はメチレンクロリド、クロロホルムおよ
    び１，１，１−トリクロロエタンの少なくとも１種であ
    る、特許請求の範囲第１０項記載の方法。