CN116323643A - 聚羟基丁酸共聚物的制造方法及其利用 - Google Patents

聚羟基丁酸共聚物的制造方法及其利用 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于提供可抑制制造过程中的PHB共聚物粒子的凝聚、且堆积密度高的PHB共聚物及其制造方法。本发明通过提供以下的PHB共聚物的制造方法解决上述课题，该方法包括：(a)将含有具有给定范围的3HB单元/除3HB单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比的PHB共聚物的菌体用特定的酶进行酶处理的工序、(b)添加碱水溶液将pH调整至给定范围后添加表面活性剂的工序、(c)制备pH为7.0以下且剪切粘度为给定范围的水性悬浮液的工序、以及(d)进行喷雾干燥的工序。

Description

聚羟基丁酸共聚物的制造方法及其利用
技术领域
本发明涉及聚羟基丁酸共聚物的制造方法及其利用。
背景技术
已知聚羟基丁酸共聚物(以下，有时称为“PHB共聚物”)具有生物降解性。
由于微生物生成的PHB共聚物蓄积在微生物的菌体内，因此，为了利用PHB共聚物作为塑料，需要从微生物的菌体内分离/纯化PHB共聚物的工序。在分离/纯化PHB共聚物的工序中，将除PHB共聚物以外的生物来源成分增溶后，从得到的水性悬浮液取得PHB共聚物。此时，进行例如离心分离、过滤、干燥等分离操作。作为干燥，可使用例如喷雾干燥机、流化床干燥机、鼓式干燥机等，由于操作简便，因此优选使用喷雾干燥机。
目前为止，为了防止pH7.0以下的水性悬浮液中的PHB共聚物的凝聚，本发明人开发了在将水性悬浮液的pH调整至7.0以下之前添加聚乙烯醇(PVA)作为分散剂，然后喷雾干燥得到的pH7.0以下的水性悬浮液的技术(专利文献1)。另外，作为制造3-羟基己酸酯(以下，有时称为“3HH”)单元的组成比高的PHB共聚物的技术，本发明人开发了包括通过高压破碎将含有上述PHB共聚物的菌体进行破碎的工序的技术(专利文献2及3)。
作为聚羟基丁酸共聚物，已知有聚(3-羟基丁酸酯-共聚-3-羟基己酸酯)(以下，有时称为“PHBH”)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2018/070492号
专利文献2：国际公开第2018/186278号
专利文献3：日本特开2019-97518号公报
发明内容
发明要解决的课题
上述的技术虽然优异，但从制造工序的操作容易性的观点考虑，仍有进一步改进的余地。
因此，本发明的目的在于提供抑制制造过程中的PHB共聚物粒子的凝聚且堆积密度高的PHB共聚物、特别是堆积密度高且具有特定的3-羟基丁酸酯(以下，有时称为“3HB”)单元/除3HB单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比的PHB共聚物、以及其制造方法。
解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果首次发现，通过包括用特定的酶对含有除3HB单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比高且具有特定的3HB单元/除3HB单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比的聚羟基丁酸共聚物的菌体进行酶处理的工序，可以得到抑制制造过程中的PHB共聚物粒子的凝聚、且堆积密度高的PHB共聚物，从而完成了本发明。
因此，本发明的一个方式是制造PHB共聚物的方法，上述PHB共聚物的3HB单元/除3HB单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比为80/20～88/12(mol/mol)，所述PHB共聚物的制造方法包括：(a)在包含含有上述PHB共聚物的菌体的培养液中添加碱性蛋白分解酶而对上述菌体进行酶处理的工序；(b)在通过上述工序(a)得到的培养液中添加碱水溶液，将pH调整为10.0～12.0，在该调整前、或该调整的同时、或该调整后添加表面活性剂的工序；(c)由通过上述工序(b)得到的水性悬浮液制备pH为7.0以下、且剪切粘度为0.005Pa·s以上且0.5Pa·s以下的水性悬浮液的工序；以及(d)将通过上述工序(c)制备的水性悬浮液进行喷雾干燥的工序。
另外，本发明的一个方式为一种PHB共聚物粉体，其包含PHB共聚物、肽聚糖及分散剂，上述PHB共聚物的3HB单元/除3HB单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比为80/20～88/12(mol/mol)，堆积密度为0.45g/mL以上，中值粒径为80～200μm。
此外，本发明的一个方式为一种PHB共聚物粉体，其包含PHB共聚物和氮化合物，上述PHB共聚物的3-羟基丁酸酯单元/3-羟基丁酸酯单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比为80/20～88/12(mol/mol)，堆积密度为0.45g/mL以上，中值粒径为80～200μm。
发明的效果
根据本发明的一个方式，可以提供抑制制造过程中的PHB共聚物粒子的凝聚且堆积密度高的PHB共聚物、特别是堆积密度高且具有特定的3HB单元/除3HB单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比的PHB共聚物。
具体实施方式
在本发明的一个实施方式中，以下详细地进行说明。需要说明的是，在本说明书中，只要没有特别说明，表示数值范围的“A～B”是指“A以上且B以下”。另外，本说明书中记载的全部文献在本说明书中援引作为参考文献。
〔1.本发明内容〕
本发明的一个实施方式的PHB共聚物的制造方法(以下，称为“本制造方法”)的特征在于，上述PHB共聚物的3HB单元/除3HB单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比为80/20～88/12(mol/mol)，所述PHB共聚物的制造方法包括：(a)在包含含有上述PHB共聚物的菌体的培养液中添加碱性蛋白分解酶而对上述菌体进行酶处理的工序；(b)在通过上述工序(a)得到的培养液中添加碱水溶液，将pH调整为10.0～12.0，在该调整前、或该调整的同时、或该调整后添加表面活性剂的工序；(c)由通过上述工序(b)得到的水性悬浮液制备pH为7.0以下、且剪切粘度为0.005Pa·s以上且0.5Pa·s以下的水性悬浮液的工序；以及(d)将通过上述工序(c)制备的水性悬浮液进行喷雾干燥的工序。
本发明人发现了以下的新课题：在现有的方法(专利文献1)中，使用高浓度的浆料(PHB共聚物水性悬浮液)时，特定的3HB单元/除3HB单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比的PHB共聚物粒子发生凝聚，PHB共聚物水性悬浮液的粘度增高，结果是发生送液困难，有时难以进行喷雾干燥。另外已知，如果为了解决上述的问题而降低PHB共聚物水性悬浮液的浓度，则喷雾干燥需要大量的能量，在能量效率方面是不优选的，而且得到的粉体的堆积密度低，会产生粉体运送性变差这样的其它问题。
另一方面，在专利文献2及3所记载的方法中，由于通过高压破碎将菌体进行物理破碎，因此在扩大规模时存在工序变得复杂的问题。此外，在专利文献3所记载的方法中，还存在制造工序本身长的问题。
因此，本发明人为了解决上述问题而进行了深入研究，结果首次发现，通过包括用特定的酶对含有具有特定的3HB单元/除3HB单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比的PHB共聚物的菌体进行酶处理的工序，能够得到即使在进行喷雾干燥的情况下也可抑制制造过程中的PHB共聚物粒子的凝聚、且堆积密度高的PHB共聚物。本发明人推测，这是通过上述工序使PHB共聚物水性悬浮液包含来自于菌体的肽聚糖，从而能够避免PHB共聚物粒子彼此的凝聚的结果。
另外，对于上述得到的PHB共聚物(PHB共聚物粉体(中间体))，本发明人从提高纯度的观点考虑进一步进行了探讨，结果首次发现，通过用特定的酶清洗PHB共聚物(PHB共聚物粉体(中间体))，可以以堆积比重(bulk specific gravity)高的状态得到纯度高的PHB共聚物(这里，纯度高表明作为杂质的氮化合物少)。
因此，根据本制造方法，可以得到堆积密度高、且具有特定的3HB单元/除3HB单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比的PHB共聚物(例如，PHB共聚物粉体)。另外，根据本制造方法，可以得到作为杂质的氮化合物少、堆积密度高、且具有特定的3HB单元/除3HB单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比的PHB共聚物(例如，PHB共聚物粉体)。此外，根据本制造方法，可以不使用物理性破碎(例如，高压破碎)工序而得到上述PHB共聚物，从扩大规模的观点考虑也是有利的。
另外，根据上述的构成，能够减少塑料垃圾的产生量，由此，例如，可以对目标12“确保可持续消费和生产模式”、目标14“保护和可持续利用海洋及海洋资源以促进可持续发展”等可持续发展目标(SDGs)的实现做出贡献。以下，对本制造方法的构成进行详细说明。
〔2.PHB共聚物的制造方法〕
本制造方法是包括下述的工序(a)～工序(d)作为必需工序的方法。另外，本制造方法中的PHB共聚物的3HB单元/除3HB单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比为80/20～88/12(mol/mol)。
·工序(a)：在包含含有PHB共聚物的菌体的培养液中添加碱性蛋白分解酶而对上述菌体进行酶处理的工序
·工序(b)：在通过上述工序(a)得到的培养液中添加碱水溶液，将pH调整为10.0～12.0，在该调整前、或该调整的同时、或该调整后添加表面活性剂的工序
·工序(c)：由通过上述工序(b)得到的水性悬浮液制备pH为7.0以下、且剪切粘度为0.005Pa·s以上且0.5Pa·s以下的水性悬浮液的工序
·工序(d)：将通过上述工序(c)制备的水性悬浮液进行喷雾干燥的工序
在本制造方法中的工序(c)中，由通过工序(b)得到的水性悬浮液制备pH为7.0以下、且剪切粘度为0.005Pa·s以上且0.5Pa·s以下的水性悬浮液。在该水性悬浮液中，PHB共聚物以分散在水性介质中的状态存在。在本说明书中，有时将至少包含PHB共聚物的水性悬浮液简称为“PHB共聚物水性悬浮液”。
＜工序(a)＞
工序(a)为在包含含有PHB共聚物的菌体的培养液中添加碱性蛋白分解酶而对上述菌体进行酶处理的工序。
(PHB共聚物)
本制造方法中的PHB共聚物为3HB与除3HB以外的羟基烷酸酯的共聚物。
作为除3HB以外的羟基烷酸酯，例如，3-羟基己酸酯(3HH)、3-羟基戊酸酯(3HV)、4-羟基丁酸酯(4HB)、3-羟基辛酸酯(3HO)、3-羟基十八烷酸酯(3HOD)、3-羟基癸酸酯(3HD)等。
作为PHB共聚物，例如，可以优选示例出PHBH，但并不限定于此。以下，为了说明方便，主要以PHBH作为代表例进行说明。
对于PHBH而言，通过改变3HB与3HH的重复单元的组成比，使熔点、结晶度发生变化，结果是能够改变杨氏模量、耐热性等物性，能够赋予聚丙烯与聚乙烯之间的物性。
本制造方法中的PHB共聚物的3HB单元/除3HB单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比为80/20～88/12(mol/mol)，优选为81/19～87/13(mo1/mo1)，更优选为82/18～86/14(mo1/mo1)。3HB单元/除3HB单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比为88/12(mol/mol)以下时，能够获得足够的硬度，为80/20(mol/mol)以上时，能够获得足够的柔软性。
在本发明的一个实施方式中，PHB共聚物的重均分子量(以下，有时称为“Mw”)没有特别限定，优选为15万～80万、更优选为20万～70万、进一步优选为25万～60万。重均分子量为15万以上时，能够获得足够的机械物性等，为80万以下时，能够获得足够的结晶化速度，可以实现良好的成形加工性。P3HB类树脂的重均分子量可以通过凝胶渗透色谱仪(GPC)(昭和电工株式会社制“Shodex GPC-101”)在柱中使用聚苯乙烯凝胶(昭和电工株式会社制“Shodex K-804”)并以氯仿作为流动相而以换算为聚苯乙烯时的分子量的形式求出。
(菌体)
在工序(a)中使用的菌体只要是能够在细胞内生成PHB共聚物的微生物即可，没有特别限定。例如，可以使用天然分离出的微生物及保藏于菌株的保藏机构(例如，IFO、ATCC等)的微生物、或者能够由它们制备的突变体及转化体等。例如，作为生成PHB共聚物的一例的P3HB的菌体，最早为1925年发现的巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，其它可以列举：杀虫贪铜菌(Cupriavidus necator)(旧分类：真养产碱杆菌(Alcaligeneseutrophus)、富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha))、广泛产碱菌(Alcaligeneslatus)等天然微生物。在这些微生物中，已知PHB共聚物蓄积在菌体内。
另外，作为生成PHB共聚物的一例、即羟基丁酸酯与其它羟基烷酸酯的共聚物的菌体，可以举出作为P3HB3HV及P3HB3HH生产菌的豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、作为P3HB4HB生产菌的真养产碱杆菌(Alcaligenes eutrophus)等。特别是关于P3HB3HH，为了提高P3HB3HH的生产性，更优选为导入了PHB共聚物合成酶组的基因的真养产碱杆菌AC32株(Alcaligenes eutrophus AC32,FERM BP-6038)(T.Fukui,Y.Doi,J.Bateriol.,179,p4821-4830(1997))等。另外，除上述以外，菌体也可以为根据想要生产的PHB共聚物而导入了各种PHB共聚物合成相关基因的基因重组微生物。
另外，PHB共聚物也可以通过例如国际公开第2010/013483号公报中记载的方法而制造。
(碱性蛋白分解酶)
在本说明书中，“碱性蛋白分解酶”是指具有在碱性环境下(例如pH8.5的溶液中)分解蛋白质的活性的蛋白质分解酶。
在本发明的一个实施方式中，碱性蛋白分解酶只要具有在碱性环境下分解蛋白质的活性即可，没有特别限定，可以列举例如：丝氨酸特异性蛋白质分解酶(例如，枯草杆菌蛋白酶、胰凝乳蛋白酶)、半胱氨酸特异性蛋白质分解酶(例如，木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶)等。从通用性/经济性的观点考虑，优选为包含丝氨酸特异性蛋白质分解酶、特别是枯草杆菌蛋白酶的碱性蛋白酶(alcalase)。可以单独使用它们中的1种，也可以组合使用2种以上。
作为碱性蛋白分解酶，也可以使用市售品，可以列举例如：Novozyme公司制“ALCALASE”及“ESPERASE”；Amano Enzyme公司制“PROTIN SD-AY10”及“蛋白酶P“AMANO”3SD”；Danisco Japan公司制“Multifect PR6L”及“Optimase PR89L”；新日本化学工业株式会社制“SUMIZYME MP”；DSM Japan公司制“DELVOLASE”；Nagase ChemteX公司制“BIOPLASEOP”、“BIOPLASE SP-20FG”及“BIOPLASE SP-4FG”；HBI公司制“ORIENTASE 22BF”；YakultPharmaceutical Industry公司制“AROASE XA-10”等。
在工序(a)中，进行基于碱性蛋白分解酶的菌体的酶处理时，优选根据使用的碱性蛋白分解酶的最适pH及最适温度来调整上述培养液的pH及温度。另外，工序(a)中的pH优选为比工序(b)中通过添加碱水溶液而调整的pH更低的pH。上述培养液的pH及温度的调整方法没有特别限定，可以使用公知的方法。
在本发明的一个实施方式中，碱性蛋白分解酶的最适pH只要使该碱性蛋白分解酶在碱性环境下具有活性即可，没有特别限定，例如为8.0～12.0、优选为8.0～11.0、更优选为8.0～10.0、进一步优选为8.0～9.0、最优选为8.5。
在本发明的一个实施方式中，碱性蛋白分解酶的最适温度没有特别限定，从不需要过度加热、可防止PHB共聚物的热变化(热分解)的观点考虑，优选为70℃以下、进一步优选为60℃以下。最适温度的下限没有特别限定，从不需要过度的冷却操作、经济性的观点考虑，优选为室温(例如，25℃)以上。
在本发明的一个实施方式中，碱性蛋白分解酶的添加量没有特别限定，例如为0.05～1.0phr、优选为0.1～0.5phr、更优选为0.15～0.3phr。碱性蛋白分解酶的添加量为上述范围时，能够将菌体适度分解。
工序(a)优选实质上不与碱性蛋白分解酶同时添加溶菌酶。在本说明书中，“溶菌酶”是指具有将菌体的细胞壁(例如，肽聚糖)分解(溶菌)的活性的酶。另外，在本说明书中，“实质上不添加溶菌酶”是指以0.0005phr以下添加溶菌酶，可以为0phr。作为溶菌酶，只要上述定义的范围内包含的溶菌酶即可，没有特别限定，可以列举例如：溶菌酶、Labiase(ラビアー)、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、内溶素、自溶素等。在工序(a)中，通过实质上不添加溶菌酶，使肽聚糖残留于PHB共聚物水性悬浮液中，可以发挥本发明的效果。
在工序(a)中，含有PHB共聚物的菌体优选被灭活。灭活的方法没有特别限定，例如，可以举出如实施例所记载的那样将包含含有PHB共聚物的菌体的培养液在60～70℃下加热及搅拌处理7小时的方法。加热及搅拌处理后的培养液优选进一步被冷却至适合工序(a)的温度。
＜工序(b)＞
工序(b)是在通过上述工序(a)得到的培养液中添加碱水溶液，将pH调整为10.0～12.0，在该调整前、或该调整的同时、或该调整后添加表面活性剂的工序。
工序(b)包括下述的工序(b1)及工序(b2)。
·工序(b1)：向通过上述工序(a)得到的培养液添加碱水溶液而将pH调整至10.0～12.0的工序
·工序(b2)：添加表面活性剂的工序
(工序(b1))
如上所述，工序(b1)是向通过上述工序(a)得到的培养液添加碱水溶液而将pH调整至10.0～12.0的工序。根据该工序，可以通过将菌体来源的杂质(核酸、蛋白质等)分散及溶解而从菌体中分离高纯度的PHB共聚物。
在本发明的一个实施方式中，碱水溶液为包含碱性化合物的水溶液。作为碱水溶液中包含的碱性化合物，没有特别限定，可以列举例如：氢氧化钠、氢氧化钾等碱金属或碱土金属的氢氧化物；碳酸钠、碳酸钾等金属碳酸盐；磷酸钠、磷酸钾、磷酸氢钠、磷酸氢钾等金属磷酸盐或金属磷酸氢盐等。
在本发明的一个实施方式中，碱水溶液中包含的碱性化合物优选为碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物，更优选为氢氧化钠。碱性化合物可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。
在工序(b1)中，优选通过添加碱水溶液而将pH调整至10.0～12.0，更优选将pH调整至10.2～11.8，进一步优选调整至10.4～11.6。通过将pH调整为10.0以上，具有能够分解及溶解菌体成分的优点。另外，通过将pH调整为12.0以下，可以防止意外的菌体损伤。
工序(b1)中的温度优选低于100℃、更优选低于80℃。下限没有特别限定，例如优选为40℃以上。
(工序(b2))
工序(b2)是向通过上述工序(a)得到的培养液添加表面活性剂的工序。根据该工序，能够特别高效地处理细胞膜，可以更多地去除上述菌体来源的杂质，因此能够从菌体中分离更高纯度的PHB共聚物。
在本发明的一个实施方式中，作为表面活性剂，没有特别限定，可以列举例如：阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、非离子表面活性剂等。其中，从细胞膜的去除能力高的观点考虑，优选为阴离子表面活性剂。可以单独使用它们中的1种，也可以组合使用2种以上。
作为阴离子表面活性剂，可以列举例如：烷基硫酸盐、烷基苯磺酸盐、烷基硫酸酯盐、烯基硫酸酯盐、烷基醚硫酸酯盐、烯基醚硫酸酯盐、α-烯烃磺酸盐、α-磺基脂肪酸盐、α-磺基脂肪酸盐的酯、烷基醚羧酸盐、烯基醚羧酸盐、氨基酸型表面活性剂、N-酰基氨基酸型表面活性剂等。其中，优选为烷基硫酸酯盐，从细胞膜的去除能力高、廉价的观点考虑，特别优选为十二烷基硫酸钠(SDS)。可以单独使用它们中的1种，也可以组合使用2种以上。
在工序(b2)中，添加的表面活性剂的量没有特别限定，相对于上述培养液，例如为0.1～5.0重量％，优选为0.3～2.5重量％。
工序(b2)可以在工序(b1)之前进行，可以同时进行，也可以在之后进行。优选工序(b2)在工序(b1)之后进行。
＜工序(b’)＞
在本发明的一个实施方式中，本制造方法可以进一步包括工序(b’)。
工序(b’)是将上述工序(b)中得到的培养液离心分离并去除上清而得到PHB共聚物被浓缩了的PHB共聚物水性悬浮液的工序。即，是从由菌体分离出的PHB共聚物中去除杂质并进行浓缩及纯化的工序。
在工序(b’)中，将上述培养液离心分离的方法没有特别限定，可以使用公知的方法。
在工序(b’)中，优选在将上述培养液离心分离而去除了上清后，重复进行向沉淀物添加溶液并再次离心分离及去除上清的工序。通过该操作，可以得到经过进一步浓缩及纯化的PHB共聚物水性悬浮液。这里，在去除了上清之后添加的溶液优选为调整至与上述培养液相同的pH的碱水溶液。
由于可通过工序(b’)基本上确定残留于最终产品的杂质量，因此优选尽量减少这些杂质。当然，根据用途，只要不损害最终产品的物性，即使混入杂质也没有关系，但在医疗用途等需要高纯度的PHB共聚物的情况下，优选尽量减少杂质。作为此时的纯化度的指标，例如可以举出PHB共聚物水性悬浮液中的蛋白质量。PHB共聚物水性悬浮液中的蛋白质量只要是能够实现后述的PHB共聚物粉体的残留蛋白质量的量即可，没有特别限定。该蛋白质量优选为PHB共聚物水性悬浮液中的单位PHB共聚物重量10000ppm以下、更优选为5000ppm以下、进一步优选为3000ppm以下。
在工序(b’)中，构成PHB共聚物水性悬浮液的溶剂(“溶剂”也称为“水性介质”)没有特别限定，可以是水、或水与有机溶剂的混合溶剂。另外，在该混合溶剂中，有机溶剂的浓度只要为使用的有机溶剂在水中的溶解度以下即可，没有特别限定。另外，有机溶剂没有特别限定，可以列举例如：甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、戊醇、己醇、庚醇等醇类；丙酮、甲乙酮等酮类；四氢呋喃、二
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烷等醚类；乙腈、丙腈等腈类；二甲基甲酰胺、乙酰胺等酰胺类；二甲基亚砜、吡啶、哌啶等。其中，从易于去除的观点考虑，优选为甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、1-丁醇、2-丁醇、异丁醇、丙酮、甲乙酮、四氢呋喃、二/>
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烷、乙腈、丙腈等。另外，从容易获得的观点考虑，更优选为甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、丁醇、丙酮等。此外，特别优选为甲醇、乙醇、丙酮。
构成PHB共聚物水性悬浮液的水性介质中的水的含量优选为5重量％以上、更优选为10重量％以上、进一步优选为30重量％以上、特别优选为50重量％以上。
需要说明的是，工序(b’)中的PHB共聚物水性悬浮液体只要不损害本发明的本质，也可以包含其它溶剂、来自于菌体的成分、纯化时产生的化合物等。
＜工序(c)＞
在本制造方法中的工序(c)中，由通过工序(b)得到的水性悬浮液制备pH为7.0以下、且剪切粘度为0.005Pa·s以上0.5Pa·s以下的水性悬浮液。
供于本制造方法的工序(c)之前的PHB共聚物水性悬浮液通常经过工序(b)而具有超过7.0的pH。然后，通过本制造方法的工序(c)将上述PHB共聚物水性悬浮液的pH调整为7.0以下。其调整方法没有特别限定，例如可以举出添加酸的方法等。酸没有特别限定，可以为有机酸、无机酸中的任一种，无论有无挥发性。更具体而言，作为酸，可以使用例如硫酸、盐酸、磷酸、乙酸等。
对于上述调整工序中进行调整的PHB共聚物水性悬浮液的pH的上限，从减少将PHB共聚物加热熔融时的着色的观点、以及确保加热时和/或干燥时的分子量的稳定性的观点考虑，为7.0以下，优选为5.0以下，更优选为4.0以下。另外，对于pH的下限，从容器的耐酸性的观点考虑，优选为1以上、更优选为2.0以上、进一步优选为3.0以上。通过使PHB共聚物水性悬浮液的pH为7.0以下，可得到加热熔融时的着色减轻、加热时和/或干燥时的分子量降低受到抑制的PHB共聚物。
通过本制造方法的工序(c)调整的水性悬浮液中的PHB共聚物的浓度优选为30重量％以上、更优选为40重量％以上、进一步优选为50重量％以上。由于PHB共聚物浓度为30重量％以上，从干燥应用的方面考虑在经济上是有利的，生产性提高，通过下一工序(d)得到的粉体堆积密度增高，其结果是运输性提高。另外，PHB共聚物的浓度的上限为最密填充，可能无法确保充分的流动性，因此，优选为65重量％以下、更优选为60重量％以下。调整PHB共聚物的浓度的方法没有特别限定，可以举出添加水性介质、以及去除水性介质的一部分(例如，在进行了离心分离后去除上清等)等的方法。PHB共聚物的浓度的调整可以在工序(c)的阶段实施，也可以在工序(b)的阶段实施。
在本发明的一个实施方式中，通过工序(c)制备的水性悬浮液中的PHB共聚物的浓度优选为30～65重量％。
在工序(c)中，从向喷雾干燥机送液的容易性的观点考虑，PHB共聚物水性悬浮液的剪切粘度为0.005～0.5Pa·s、优选为0.007～0.4Pa·s、更优选为0.009～0.3Pa·s。需要说明的是，PHB共聚物水性悬浮液的剪切粘度是指施加剪切速度10(1/s)时的20℃下的剪切粘度(Pa·s)。PHB共聚物水性悬浮液的剪切粘度可通过实施例中记载的方法测定。
＜分散剂＞
本发明的一个实施方式中的上述水性悬浮液可以含有分散剂。即，本发明的一个实施方式中的上述工序(c)可以是制备除PHB共聚物以外还包含分散剂的水性悬浮液的工序。在本发明的一个实施方式中，在上述使用分散剂的情况下，优选在调整至pH7.0以下之前将上述分散剂添加于上述PHB共聚物水性悬浮液。本发明的一个实施方式中的上述PHB共聚物水性悬浮液通过含有分散剂而可以适于提高PHB共聚物的生产性及热稳定性。
作为分散剂，没有特别限定，例如，可以列举氧化烯类分散剂、纤维素类分散剂、聚乙烯醇(PVA)、山梨糖醇酐烷基酯(sorbitan alkylate)类分散剂等。通过使用这些分散剂，能够以更低的热风温度得到粒径大的PHB共聚物。分散剂可以为1种，也可以为2种以上。
在本发明的一个实施方式中，分散剂为选自氧化烯类分散剂、纤维素类分散剂及聚乙烯醇中的至少1种。
在本发明的一个实施方式中，在将PHB共聚物水性悬浮液的pH调整为7.0以下时，从适于防止PHB共聚物的凝聚、且适于抑制粉体加工时附着于挤出机的轴的观点考虑，分散剂优选为氧化烯类分散剂。另外，在将纤维素类分散剂与氧化烯类分散剂组合使用时，可进一步抑制PHB共聚物的凝聚，还可以期待作为干燥后的粉体不易损坏的粘合剂的效果，因此是更优选的。
在本发明的一个实施方式中，氧化烯类分散剂只要起到上述的效果即可，没有特别限定，优选为由聚(氧化乙烯)(PEO)嵌段和聚(氧化丙烯)(PPO)嵌段构成的PEO-PPO-PEO的形态。
在本说明书中，“聚(氧化乙烯)(PEO)嵌段”是指在氧化烯类分散剂的结构中环氧乙烷(EO)聚合而形成的聚合物部分。
在本说明书中，“聚(氧化丙烯)(PPO)嵌段”是指在氧化烯类分散剂的结构中环氧丙烷(PO)聚合而形成的聚合物部分。
在本发明的一个实施方式中，通过将氧化烯类分散剂中的PEO分子量及PEO分子量/PPO分子量设为特定的范围，将水性悬浮液的粘度保持为低水平，能够以高生产性制造PHB共聚物(例如，PHB共聚物粉体)。
在本发明的一个实施方式中，氧化烯类分散剂中的PEO分子量及PEO分子量/PPO分子量的范围优选为以下的组合。
需要说明的是，在本说明书中，将“PEO分子量”称为“EO量”，将“PPO分子量”称为“PO量”。
即，在本发明的一个实施方式中，氧化烯类分散剂中的PEO分子量可以为1500以上、优选为1750以上、更优选为2000以上。另外，在本发明的一个实施方式中，氧化烯类分散剂中的PEO分子量的上限例如为30000以下、优选为25000以下、更优选为20000以下。
在本发明的一个实施方式中，氧化烯类分散剂中的PEO分子量/PPO分子量优选为0.5以上、更优选为0.6以上、进一步优选为0.7以上。PEO分子量/PPO分子量的上限优选为5.0以下、更优选为4.8以下、进一步优选为4.5以下。
在本发明的一个实施方式中，氧化烯类分散剂中的PEO分子量及PEO分子量/PPO分子量为上述的范围内时，氧化烯类分散剂具有亲水性，且分子数相对于氧化烯类分散剂添加重量增多，因此，易于保持水性悬浮液的分散性。
在本发明的一个实施方式中，氧化烯类分散剂的PEO分子量为1500以上、且PEO分子量/PPO分子量为0.5～5.0。
本制造方法的工序(c)中使用的氧化烯类分散剂没有特别限定，例如，可以使用市售品。作为市售品，可以列举例如：Pluronic(注册商标)10400(BASF公司制)、Pluronic(注册商标)10500(BASF公司制)、Genapol(注册商标)PF80(Clariant公司制)、UNILUBE(注册商标)70DP-600B(日油株式会社制)、UNILUBE(注册商标)70DP-950B(日油株式会社制)、PLONON(注册商标)208(日油株式会社制)、EPAN(注册商标)U105(第一工业制药株式会社制)、EPAN(注册商标)U108(第一工业制药株式会社制)、EPAN(注册商标)750(第一工业制药株式会社制)等。
本制造方法的工序(c)中上述分散剂相对于水性悬浮液的添加量没有特别限定，相对于水性悬浮液中包含的上述PHB共聚物的合计100重量份，优选为0.1～20重量份、更优选为0.5～10重量份、进一步优选为0.75～5重量份。通过将上述分散剂的添加量设为上述的范围，PHB共聚物水性悬浮液中的PHB共聚物的分散稳定性进一步提高，能够高效地实施喷雾干燥，其结果是具有能够更适宜地提高PHB共聚物的生产性及热稳定性的倾向。
在本发明的一个实施方式中，纤维素类分散剂只要能够发挥本发明的效果即可，没有特别限定，可以列举例如：甲基纤维素(MC)、乙基纤维素、丙基纤维素、羟甲基纤维素、羟乙基纤维素(HEC)、羟丙基纤维素、羟乙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羧甲基纤维素(CMC)、羧乙基纤维素、羧丙基纤维素、羧甲基羟乙基纤维素、乙酰纤维素、氰基乙基纤维素、纤维素硫酸钠等。其中，从成为水溶性的取代度范围大的观点考虑，优选为甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素。纤维素类分散剂可以仅使用1种，也可以组合使用多种。
本制造方法的工序(c)中使用的纤维素类分散剂没有特别限定，例如，可以使用市售品。作为纤维素类分散剂的市售品，可以列举例如：MCE-100(信越化学株式会社制)、MCE-400(信越化学株式会社制)、MCE-4000(信越化学株式会社制)、SFE-400(信越化学株式会社制)、SFE-4000(信越化学株式会社制)、SE-50(信越化学株式会社制)、NE-100(信越化学株式会社制)等。
本制造方法的工序(c)中纤维素类分散剂相对于PHB共聚物水性悬浮液的添加量没有特别限定，相对于水性悬浮液中包含的PHB共聚物100重量份，优选为0.01～10重量份、更优选为0.05～5重量份、进一步优选为0.08～3重量份。通过将纤维素类分散剂的添加量设为上述的范围，可以发挥本发明的效果。
在本发明的一个实施方式中，从环境问题的观点考虑，分散剂优选为具有生物降解性的物质。
通过本制造方法的工序(c)得到的PHB共聚物水性悬浮液中的PHB共聚物的体积中值粒径(以下，有时简称为“PHB共聚物的体积中值粒径”)优选为该PHB共聚物的初级粒子的体积中值粒径(以下，成为“初级粒径”)的30倍以下、更优选为20倍以下、进一步优选为10倍以下。由于PHB共聚物的体积中值粒径为初级粒径的30倍以下，PHB共聚物水性悬浮液显示出更优异的流动性，因此，能够以高效率实施随后的工序(d)，具有PHB共聚物的生产性进一步提高的倾向。PHB共聚物的体积中值粒径例如可使用HORIBA制激光衍射/散射式粒径分布测定装置LA-950进行测定。
需要说明的是，上述的PHB共聚物的体积中值粒径可以作为PHB共聚物水性悬浮液中的PHB共聚物的分散状态的指标。调整上述的PHB共聚物的体积中值粒径的方法没有特别限定，可以采用公知的方式(搅拌等)。例如，对于暴露于酸性条件下等而分散状态被破坏的PHB共聚物水性悬浮液实施本领域技术人员所能想到的物理处理、化学处理、生物处理等，也可以使PHB共聚物水性悬浮液中的PHB共聚物再次恢复分散状态(例如，具有上述的PHB共聚物的体积中值粒径的状态)。
＜工序(d)＞
在本制造方法的工序(d)中，将通过工序(c)制备的PHB共聚物水性悬浮液进行喷雾干燥。作为喷雾干燥的方法，可以列举例如，将PHB共聚物水性悬浮液处于微细的液滴的状态而供给至干燥机内，在该干燥机内与热风接触并进行干燥的方法等。将PHB共聚物水性悬浮液以微细的液滴的状态供给至干燥机内的方法(雾化器)没有特别限定，可以列举使用旋转盘方法、使用喷嘴的方法等公知的方法。干燥机内中的液滴与热风的接触方式没有特别限定，可以举出并流式、逆流式、组合使用它们的方式等。
工序(d)中喷雾干燥时的干燥温度只要是能够从PHB共聚物水性悬浮液的液滴中去除大半水性介质的温度即可，可以在能够干燥至目标含水率且尽量不发生品质变差(分子量降低、色调降低等)、熔融等的条件下适当设定。例如，吹入喷雾干燥机的热风的温度可以在100～300℃的范围适当选择。另外，对于干燥机内的热风的风量，例如，也可以根据干燥机的尺寸等而适当设定。
本制造方法可以在工序(d)之后包括使得到的PHB共聚物(PHB共聚物粉体等)进一步干燥的工序(例如，供于减压干燥的工序等)。另外，本制造方法可以包括其它工序(例如，向PHB共聚物水性悬浮液添加各种添加物的工序等)。
本制造方法可以在工序(d)之后进一步包括下述的工序(e)及(f)。根据这些工序，可以降低PHB共聚物中包含的来自于菌体残渣成分的氮含量，能够得到纯度高的PHB共聚物。
＜工序(e)＞
工序(e)是对通过上述工序(d)得到的PHB共聚物粉体进行清洗的工序。工序(e)优选包括下述的工序(e1)及工序(e2)。
·工序(e1)：使通过上述工序(e)得到的PHB共聚物粉体分散于纯水中达到给定的浓度而制备了分散浆料后，加入碱水溶液，调整该分散浆料pH，与清洗液一起进行搅拌的工序
·工序(e2)：向通过上述工序(e1)得到的分散浆料加入碱水溶液，进行离心分离，将上清去除的工序。
(工序(e1))
如上所述，工序(e1)是使通过上述工序(d)得到的PHB共聚物粉体分散于纯水中达到给定的浓度而制备了分散浆料后，加入碱水溶液，调整该分散浆料pH，与清洗液一起进行搅拌的工序。在进行搅拌时，可以将液体升温。
工序(e1)中的分散浆料的给定的浓度没有特别限定，从尽量减小进行分散的容器的尺寸、且浆料具有流动性的范围的观点考虑，优选为20～40％、优选为30～40％。
在工序(e1)中，碱水溶液没有特别限定，可以使用(工序(b1))中说明的碱水溶液。分散浆料的pH例如优选调整为5.0～14.0。
工序(e1)的清洗中的搅拌时间没有特别限定，可以为数小时。从对PHB共聚物充分地进行清洗的观点考虑，搅拌时间可以为1～12小时，也可以为2～10小时。
工序(e1)中的分散浆料可以进一步包含硫酸钠。
工序(e1)中的清洗液可以包含碱性蛋白分解酶和/或溶菌酶。碱性蛋白分解酶的种类没有特别限定，可以使用本说明书的(碱性蛋白分解酶)中记载的酶。另外，本工序中使用的碱性蛋白分解酶可以与工序(a)中使用的碱性蛋白分解酶相同，也可以不同。另外，溶菌酶的种类没有特别限定，可以为对工序(a)的说明中记载的溶菌酶。
(工序(e2))
如上所述，工序(e2)是向上述工序(e1)得到的分散浆料加入碱水溶液，将PHB共聚物粉体分离，去除上清的工序。
在工序(e2)中，碱水溶液没有特别限定，可以与工序(e1)中使用的碱水溶液相同，也可以不同。
在工序(e2)中，将PHB共聚物粉体分离的方法没有特别限定，可以使用公知的方法。例如，可以使用通过离心分离、过滤器脱水、旋液分离器进行的分离。
在工序(e2)中，优选重复进行向上述分散浆料添加碱水溶液，进行离心分离，将上清去除的工序。通过该操作，可以得到进一步浓缩及纯化后的PHB共聚物。
＜工序(f)＞
工序(f)是将上述工序(e)得到的聚羟基烷酸酯粉体脱水和/或干燥的工序。脱水和/或干燥例如可以使用喷雾干燥机、流化床干燥机、鼓式干燥机等，从操作简便的观点考虑，优选使用喷雾干燥机。作为喷雾干燥的方法、干燥温度，例如，可以使用工序(d)中说明的方法、温度。
〔3.PHB共聚物粉体〕
(中间体)
本发明的一个实施方式的PHB共聚物粉体(以下，称为“本第一PHB共聚物粉体”)是包含PHB共聚物、肽聚糖及分散剂的PHB共聚物粉体，上述PHB共聚物的3HB单元/除3HB单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比为80/20～88/12(mol/mol)，所述PHB共聚物粉体的堆积密度为0.45g/mL以上，中值粒径为80～200μm。本第一PHB共聚物粉体为3HB单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比高的PHB共聚物、且堆积密度高，因此在各种领域中极其有用。
在本实施方式中，对于“PHB共聚物”、“肽聚糖”及“分散剂”，援引上述的说明。
本第一PHB共聚物粉体包含PHB共聚物。本第一PHB共聚物粉体中的PHB共聚物的含量没有特别限定，例如为90～99重量％、优选为93～98重量％、更优选为95～97重量％。通过将PHB共聚物的含量设为上述范围，具有不会丧失流动性等PHBH的物理特性的优点。
本第一PHB共聚物粉体包含肽聚糖。本第一PHB共聚物粉体中的肽聚糖的含量没有特别限定，相对于构成PPHB共聚物粉体的PHB共聚物100重量份，优选为0.1～1.5重量份(phr)、更优选为0.3～1.3重量份(phr)。通过将肽聚糖的含量设为上述范围，具有PHB共聚物粉体的堆积密度提高的倾向。本第一PHB共聚物粉体中的肽聚糖的含量可通过实施例中记载的方法测定。
本第一PHB共聚物粉体包含分散剂。分散剂优选为氧化烯类分散剂。PHB共聚物粉体中的分散剂的含量没有特别限定，相对于构成PHB共聚物粉体的PHB共聚物100重量份，优选为0.1～20重量份、更优选为0.5～10重量份、进一步优选为0.75～5重量份。通过将分散剂的添加量设为上述范围，具有PHB共聚物粉体的生产性提高的倾向。
从提高粉体运输性的观点考虑，本第一PHB共聚物粉体的堆积密度为0.45g/mL以上、优选为0.48g/mL以上、更优选为0.50g/mL以上。需要说明的是，上限没有特别限定，从粉体运输性的观点考虑，可以举出例如0.55g/mL。本第一PHB共聚物粉体的堆积密度可通过实施例中记载的方法测定。
从实现优异的流动性的观点考虑，本第一PHB共聚物粉体的中值粒径为80～200μm、优选为100～180μm、更优选为105～160μm。本第一PHB共聚物粉体的中值粒径可通过实施例中记载的方法测定。
本第一PHB共聚物粉体的纯度并没特别限定上限值，低于98％。从不损害PHB共聚物的物理性质的观点考虑，下限为85％以上，优选为90％以上、更优选为92％以上。需要说明的是，PHB共聚物粉体的纯度是指PHB共聚物粉体中的PHB共聚物的含量(重量％)。本第一PHB共聚物粉体的纯度可通过实施例中记载的方法测定。
在本发明的一个实施方式中，从着色的观点考虑，本第一PHB共聚物粉体的残留蛋白质量优选为0.1～1.0phr、更优选为0.12～0.5phr、进一步优选为0.15～0.3phr。需要说明的是，残留蛋白质量是指残留于PHB共聚物粉体的蛋白质的量，以相对于PHB共聚物粉体中的PHB共聚物100重量份的量表示。本第一PHB共聚物粉体的残留蛋白质量可通过实施例中记载的方法测定。
另外，本第一PHB共聚物粉体只要发挥本发明的效果即可，可以包含在制造的过程中产生或未去除的各种成分。
在本发明的一个实施方式中，本第一PHB共聚物粉体为相对于后述的最终产物的中间体，可通过上述的本制造方法(例如，工序(a)～(d))来制造。
(最终产物)
本发明的一个实施方式的PHB共聚物粉体(以下，称为“本第二PHB共聚物粉体”)为包含PHB共聚物和氮化合物的PHB共聚物粉体，上述PHB共聚物的3-羟基丁酸酯单元/除3-羟基丁酸酯单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比为80/20～88/12(mol/mol)，所述PHB共聚物粉体的堆积密度为0.45g/mL以上，中值粒径为80～200μm。本第二PHB共聚物粉体为3-羟基丁酸酯单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比高的PHB共聚物，并且堆积密度高且纯度高，因此在各种领域中极其有用。
在本说明书中，“氮化合物”是指至少含有氮的化合物。氮化合物是PHB共聚物粉体中残留的蛋白质、作为细胞壁的成分的肽聚糖的分解物。
在本实施方式中，对于“PHB共聚物”及“氮化合物”，援引上述的说明。另外，对于“堆积密度”及“中值粒径”，援引上述(中间体)一项中的记载。
本第二PHB共聚物粉体包含氮化合物。本第二PHB共聚物粉体中的总氮量没有特别限定，相对于构成PHB共聚物粉体的PHB共聚物100重量份，优选为0.010～0.075重量份(phr)、更优选为0.01～0.06重量份(phr)。通过将总氮量设为上述范围，具有PHB共聚物粉体的纯度提高的倾向。本第二PHB共聚物粉体中的总氮量可通过实施例中记载的方法测定。
另外，本第二PHB共聚物粉体只要发挥本发明的效果即可，可以包含在制造的过程中产生或未去除的各种成分。
在本发明的一个实施方式中，本第二PHB共聚物粉体为最终产物，可通过上述的本制造方法(例如，工序(a)～(f))来制造。
本PHB共聚物粉体可用于纸、膜、片、管、板、棒、容器(例如，瓶容器等)、袋、构件等各种用途。
本发明并不限定于上述的实施方式，可以在权利要求所表示的范围内进行各种变更，将不同的实施方式中分别公开的技术手段适当组合而得到的实施方式也包含于本发明的技术范围。
即，本发明的一个实施方式如下。
＜1＞一种聚羟基丁酸共聚物的制造方法，上述聚羟基丁酸共聚物的3-羟基丁酸酯单元/除3-羟基丁酸酯单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比为80/20～88/12(mol/mol)，
所述聚羟基丁酸共聚物的制造方法包括：
(a)在包含含有上述聚羟基丁酸共聚物的菌体的培养液中添加碱性蛋白分解酶而对上述菌体进行酶处理的工序；
(b)在通过上述工序(a)得到的培养液中添加碱水溶液，将pH调整为10.0～12.0，在该调整前、或该调整的同时、或该调整后添加表面活性剂的工序；
(c)由通过上述工序(b)得到的水性悬浮液制备pH为7.0以下、且剪切粘度为0.005Pa·s以上且0.5Pa·s以下的水性悬浮液的工序；以及
(d)将通过上述工序(c)制备的水性悬浮液进行喷雾干燥的工序。
＜2＞根据＜1＞所述的聚羟基丁酸共聚物的制造方法，该方法在上述工序(d)之后进一步包括：
(e)对通过上述工序(d)得到的聚羟基丁酸共聚物粉体进行清洗的工序、以及
(f)对通过上述工序(e)得到的聚羟基丁酸共聚物粉体进行脱水和/或干燥的工序。
＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的聚羟基丁酸共聚物的制造方法，其中，上述除3-羟基丁酸酯单元以外的羟基烷酸酯单元为3-羟基己酸酯单元。
＜4＞根据＜1＞～＜3＞中任一项所述的聚羟基丁酸共聚物的制造方法，其中，上述工序(b)的表面活性剂为十二烷基硫酸钠。
＜5＞根据＜1＞～＜4＞中任一项所述的聚羟基丁酸共聚物的制造方法，其中，上述水性悬浮液进一步包含分散剂。
＜6＞根据＜5＞所述的聚羟基丁酸共聚物的制造方法，其中，上述分散剂为选自氧化烯类分散剂、纤维素类分散剂及聚乙烯醇中的至少1种。
＜7＞根据＜1＞～＜6＞中任一项所述的聚羟基丁酸共聚物的制造方法其中，通过上述工序(c)制备的水性悬浮液中的聚羟基丁酸共聚物的浓度为30～65重量％。
＜8＞根据＜2＞所述的聚羟基丁酸共聚物的制造方法，其中，上述工序(e)的清洗液包含碱性蛋白分解酶和/或溶菌酶。
＜9＞一种聚羟基丁酸共聚物粉体，其包含聚羟基丁酸共聚物、肽聚糖及分散剂，
上述聚羟基丁酸共聚物的3-羟基丁酸酯单元/除3-羟基丁酸酯单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比为80/20～88/12(mol/mol)，
上述聚羟基丁酸共聚物粉体的堆积密度为0.45g/mL以上，中值粒径为80～200μm。
＜10＞根据＜9＞所述的聚羟基丁酸共聚物粉体，其中，上述肽聚糖含量为0.1～1.5phr。
＜11＞根据＜8＞或＜9＞所述的聚羟基丁酸共聚物粉体，其中，残留蛋白质量为0.1～1.0phr。
＜12＞一种聚羟基丁酸共聚物粉体，其包含聚羟基丁酸共聚物和氮化合物，
上述聚羟基丁酸共聚物的3-羟基丁酸酯单元/除3-羟基丁酸酯单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比为80/20～88/12(mol/mol)，
上述聚羟基丁酸共聚物粉体的堆积密度为0.45g/mL以上，中值粒径为80～200μm。
＜13＞根据＜12＞所述的聚羟基丁酸共聚物粉体，其中，上述聚羟基丁酸共聚物粉体中的总氮量为0.010～0.075phr。
本发明并不限定于上述的实施方式，可以在权利要求所表示的范围内进行各种变更，将不同的实施方式中分别公开的技术手段适当组合而得到的实施方式也包含于本发明的技术范围。
实施例
以下，基于实施例对本发明详细地进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。需要说明的是，在实施例中，作为“PHB共聚物”，使用了“PHBH”，可以将“PHB共聚物”替换为“PHBH”。
〔测定及评价方法〕
通过以下的方法进行实施例及比较例中的测定及评价。
(体积中值粒径)
PHB共聚物水性悬浮液中的体积中值粒径使用HORIBA制激光衍射/散射式粒径分布测定装置LA-950测定。
(PHB共聚物水性悬浮液的剪切粘度)
PHB共聚物水性悬浮液的剪切粘度通过以下的方法测定。具体而言，使用AntonPaar公司制MCR302通过同轴双重圆筒测定了剪切粘度。将PHB共聚物水性悬浮液投入20mL圆筒，在剪切速度10(1/s)的条件下冷却至液体温度达到15℃。然后，将液体温度升温至20℃，在达到目标液体温度后，测定了扭矩的时间变化小于1％时的粘度。
(肽聚糖量)
PHB共聚物粉体中残留的肽聚糖量通过以下的方法测定。具体而言，首先，将肽聚糖标准品50μL加入微孔板。接着，将SLP-HS Single Reagent Set(Wako LAL System)的试剂50μL加入上述微孔板。以650nm的波长每15秒钟测定吸光度，将从测定开始起3小时后的吸光度作为最终吸光度，测定了吸光度达到最终吸光度的0.4倍的时间。同样地，将肽聚糖标准品用蒸馏水稀释1000～10000倍，进行与上述同样的操作，制作了校准曲线。然后，将通过工序(c)制备的PHB共聚物水性悬浮液用蒸馏水稀释1000～10000倍，将稀释后的液体中的50μL加入微孔板。接着，将SLP-HS Single Reagent Set(Wako LAL System)的试剂50μL加入上述微孔板。以650nm的波长每15秒钟测定吸光度，将从测定开始起3小时后的吸光度作为最终吸光度，根据吸光度达到最终吸光度的0.4倍的时间计算出肽聚糖量。
(残留蛋白质量)
PHB共聚物粉体的残留蛋白质量使用BCA Protein Assay Kit(Thermo FisherScientific公司制)测定。具体而言，将10mg的PHBH粉体投入14mL的离心管，添加上述试剂2mL，在60℃下振荡30分钟。30分钟后进行冷却，测定了562nm波长的吸光度。
(堆积密度)
基于JIS K 7365:1999使用堆积比重测定器(藏持科学器械株式会社制)测定了PHB共聚物粉体的堆积密度。
(中值粒径)
PHB共聚物粉体的中值粒径通过以下的方法测定。具体而言，中值粒径使用激光衍射/散射式粒径分布测定装置LA-950(HORIBA公司)测定。在离子交换水20mL中加入作为表面活性剂的十二烷基硫酸钠0.05g，得到了表面活性剂水溶液。接着，在上述表面活性剂水溶液中加入测定对象的PHB共聚物粉体0.2g，使上述PHB共聚物粉体分散在上述表面活性剂水溶液中，得到了测定用的分散液。将制备的分散液导入上述激光衍射/散射式粒径分布测定装置，进行了测定。
(纯度)
PHB共聚物粉体的纯度通过以下的方法测定。具体而言，通过TG-DTA(2000SENIETZSCHE公司制)，将约10mg(将重量设为W)的PHBH干燥粉体在氮气氛围中以10℃/min从50℃升温至500℃，制成了温度和样品重量的图表。根据图表分别计算出具有280-285℃的重量减少的斜率的一次直线与具有400-450℃的重量减少的斜率的一次直线的交点A、具有280-285℃的重量减少的斜率的一次直线与具有150-200℃的重量减少的斜率的一次直线的交点B的重量。交点A与交点B的重量差作为PHBH量计算出W’，将W’/W作为PHBH的纯度。
(总氮量测定)
PHB共聚物粉体的总氮量使用微量全氮分析装置TN-2100H(NittoseikoAnalytech公司)进行了测定。
〔实施例1〕
(菌体培养液的制备)
将国际公开第WO2019/142717号中记载的富养罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)按照该文献的〔0041〕～〔0048〕段记载的方法进行培养，得到了包含含有PHB共聚物的菌体的菌体培养液。需要说明的是，富养罗尔斯通氏菌目前被分类为杀虫贪铜菌。PHB共聚物的重复单元的组成比(3HB单元/除3HB单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比)为80/20～88/12(mol/mol)。
(灭活)
将上述得到的菌体培养液在内温60～70℃下加热及搅拌处理7小时，进行灭菌处理，然后，冷却至55℃，由此得到了灭活培养液。
(酶处理)
对上述灭活培养液使用30％氢氧化钠，将pH调整为8.5±0.2。然后，添加作为蛋白质分解酶的碱性蛋白酶(Novozymes公司制)0.2phr，在50℃下用30％氢氧化钠控制为pH8.5，并且保持了2小时以上。
(溶菌、浓缩)
对上述得到的酶处理液添加碱水溶液，将pH调整至11.5以上，在45℃以上保持了4小时以上。然后，添加0.6～1.0wt％的十二烷基硫酸钠(花王株式会社制)，且添加30％氢氧化钠使pH达到12左右，并且用碱水溶液(pH10～11.5)稀释2倍。将其离心分离后，去除上清，进行了2倍浓缩。在该浓缩后的PHB共聚物的水性悬浮液中添加与去除后的上清等量的氢氧化钠水溶液(pH11)，进行离心分离，去除上清。重复7次氢氧化钠水溶液的添加、离心分离及上清去除的操作。将该PHB共聚物水性悬浮液浓缩4倍，调整至PHB共聚物浓度达到52重量％以上。使用HORIBA制激光衍射/散射式粒径分布测定装置LA-950测定了该PHB共聚物水性悬浮液中的体积中值粒径，结果为1.9μm。
(造粒)
在上述得到的PHB共聚物水性悬浮液中添加氧化乙烯/氧化丙烯共聚物非离子性分散剂(聚氧化乙烯分子量8000、聚氧化丙烯分子量2000、商品名PLONON208)0.95phr(相对于水性悬浮液中存在的PHB共聚物100重量份为0.95重量份)。接着，添加了甲基纤维素(商品名SM-15)0.3phr。搅拌该液体，使液体温度升高至60℃，添加10％硫酸使pH达到4.0，继续搅拌120分钟，得到了PHB共聚物水性悬浮液。然后，通过加水将上述混合物的固体成分浓度调整至50质量％。使用HORIBA制激光衍射/散射式粒径分布测定装置LA-950测定了该PHB共聚物水性悬浮液中的体积中值粒径，结果为1.9μm。进一步，使用Anton Paar公司制MCR302测定了上述PHB共聚物水性悬浮液的剪切粘度，结果为0.1Pa·s。通过旋转雾化器型喷雾干燥机(OC-16、大川原株式会社制)对得到的PHB共聚物水性悬浮液实施喷雾干燥(热风温度：115℃、排风温度：75℃、旋转雾化器旋转速度：11000rpm)，得到了清洗前PHB共聚物粉体。得到的清洗前PHB共聚物粉体中包含的肽聚糖量为1.04phr，残留蛋白质量为0.18phr，清洗前PHB共聚物粉体的堆积密度为0.51g/mL，中值粒径为110μm，纯度为97％，总氮量为0.099phr。
(清洗1)
使上述得到的清洗前PHB共聚物粉体分散在纯水中，使得PHB共聚物浓度达到37.5％，在该分散浆料中添加了1phr的硫酸钠。然后，用30％氢氧化钠将分散浆料的pH调整为6。将分散浆料升温至50℃，添加蛋清溶菌酶(蛋清溶菌酶FG、长濑产业株式会社制)0.0050phr，搅拌2小时。
(清洗2)
在上述得到的分散浆料中加入30％氢氧化钠，调整至分散浆料的pH达到11。然后，将与分散浆料同样重量的pH11的氢氧化钠水溶液添加于分散浆料，进行离心分离，仅去除上清。重复3次氢氧化钠水溶液的添加、离心分离及上清去除的操作。
(干燥)
在上述得到的分散浆料中加入10％硫酸，调整至分散浆料的pH达到4。然后，加水，使得分散浆料中的PHB共聚物量浓度达到35％。通过旋转雾化器型喷雾干燥机(OC-16、大川原株式会社制)对得到的PHB共聚物水性悬浮液实施喷雾干燥(热风温度：160℃、排风温度：75℃、旋转雾化器旋转速度：11000rpm)，得到了PHB共聚物粉体。得到的PHB共聚物粉体中包含的总氮量为0.059phr，清洗前PHB共聚物粉体的堆积密度为0.50g/mL，中值粒径为102μm。
〔实施例2〕
在(造粒)之前，通过与实施例1相同的方法得到了清洗前PHB共聚物粉体。使清洗前PHB共聚物粉体分散在纯水中，使得PHB共聚物浓度达到37.5％，在该分散浆料中添加硫酸钠1phr。然后，用30％氢氧化钠将分散浆料的pH调整至10.5。添加ESPERASE(Novozyme公司)0.05phr，搅拌了2小时。然后，实施了实施例1中记载的(清洗2)以后的操作，结果是得到的PHB共聚物粉体中包含的总氮量为0.070phr，PHB共聚物粉体的堆积密度为0.50g/mL，中值粒径为108μm。
〔实施例3〕
在(清洗1)之前，通过与实施例1相同的方法得到了清洗前PHB共聚物粉体的分散浆料。在得到的分散浆料中加入30％氢氧化钠，将分散浆料的pH调整至10.5。添加ESPERASE(Novozyme公司)0.05phr，搅拌了2小时。然后，实施了实施例1中记载的(清洗2)以后的操作，结果是得到的PHB共聚物粉体中包含的总氮量为0.033phr，PHB共聚物粉体的堆积密度为0.50g/mL，中值粒径为115μm。
〔实施例4〕
在(造粒)之前，通过与实施例1相同的方法得到了清洗前PHB共聚物粉体。使清洗前PHB共聚物粉体分散在纯水中，使得PHB共聚物浓度达到37.5％，加入30％氢氧化钠，调整至pH达到11，搅拌了2小时。然后，实施了实施例1中记载的(清洗2)以后的操作，结果是得到的PHB共聚物粉体中包含的总氮量为0.098phr，清洗前PHB共聚物粉体的堆积密度为0.51g/mL，中值粒径为110μm。
〔比较例1〕
在(灭活)之前，通过与实施例1同样的方法得到了灭活培养液。
(酶处理)
在上述得到的灭活培养液中添加作为肽聚糖的分解酶的蛋清溶菌酶(蛋清溶菌酶FG、长濑产业株式会社制)0.01phr，在50℃下保持了2小时。接着，使用30％氢氧化钠，将pH调整为8.5±0.2。然后，添加作为蛋白质分解酶的碱性蛋白酶(Novozymes公司制)，在50℃下通过30％氢氧化钠控制为pH8.5，并且保持了2小时以上。
(溶菌、浓缩)
在上述得到的酶处理液中添加碱水溶液，将pH调整为11.5以上，在45℃以上保持了4小时以上。然后，添加0.6～1.0wt％的十二烷基硫酸钠(花王株式会社制)，且添加30％氢氧化钠使pH达到12左右，并且用碱水溶液(pH10～11.5)稀释3倍。将其离心分离后，去除上清，浓缩2倍。在该浓缩后的PHB共聚物的水性悬浮液中添加与去除的上清等量的氢氧化钠水溶液(pH11)，进行离心分离，去除上清。重复氢氧化钠水溶液的添加、离心分离及上清去除的操作。使用HORIBA制激光衍射/散射式粒径分布测定装置LA-950测定了该PHB共聚物水性悬浮液中的体积中值粒径，结果为62μm。然后，通过用布氏漏斗对PHB共聚物水性悬浮液进行过滤，将固体成分浓度浓缩至50％，成为湿润的粉状，没有流动性，处于无法喷雾干燥的状态。
〔比较例2〕
在(溶菌、浓缩)的离心分离操作之前，通过与比较例1同样的方法得到了PHB共聚物的水性悬浮液。使用HORIBA制激光衍射/散射式粒径分布测定装置LA-950测定了该PHB共聚物水性悬浮液中的体积中值粒径，结果为62μm。
(造粒)
在上述得到的PHB共聚物水性悬浮液(固体成分浓度20％)中添加氧化乙烯/氧化丙烯共聚物非离子性分散剂(聚氧化乙烯分子量8000、聚氧化丙烯分子量2000、商品名PLONON208)0.95phr。接着，添加甲基纤维素(商品名SM-15)0.3phr。搅拌该液体，使液体温度升高至60℃，添加10％硫酸，使得pH为4.0，持续搅拌120分钟，得到了PHB共聚物水性悬浮液。然后，通过加水，将上述混合物的固体成分浓度调整为15质量％。使用HORIBA制激光衍射/散射式粒径分布测定装置LA-950测定了该PHB共聚物水性悬浮液中的体积中值粒径，结果为62μm。进一步，使用Anton Paar公司制MCR302测定了上述PHB共聚物水性悬浮液的剪切粘度，结果为0.1Pa·s。通过旋转雾化器型喷雾干燥机(OC-16、大川原株式会社制)对得到的PHB共聚物水性悬浮液实施喷雾干燥(热风温度：115℃、排风温度：75℃、旋转雾化器旋转速度：11000rpm)，得到了PHB共聚物粉体。得到的PHB共聚物粉体中包含的肽聚糖量为0.01phr，残留蛋白质量为0.5phr，PHB共聚物粉体的堆积密度为0.20g/mL，中值粒径为71μm，纯度为98％。
Figure BDA0004129694330000271
〔结果〕
根据表1可知，通过本制造方法，可以制造堆积密度高、且3HB单元以外的羟基烷酸酯单元的比率高的PHB共聚物。
工业实用性
根据本发明，可以制造3HB单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比高的PHB共聚物。另外，由于通过本发明的制造方法得到的PHB共聚物的堆积密度高，因此可以适宜地用于农业、渔业、林业、园艺、医学、卫生用品、衣料、非衣料、包装、汽车、建材、其它领域。

Claims (13)

1.一种聚羟基丁酸共聚物的制造方法，所述聚羟基丁酸共聚物的3-羟基丁酸酯单元/除3-羟基丁酸酯单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比为80/20～88/12(mol/mol)，
所述聚羟基丁酸共聚物的制造方法包括：
(a)在包含含有所述聚羟基丁酸共聚物的菌体的培养液中添加碱性蛋白分解酶而对所述菌体进行酶处理的工序；
(b)在通过所述工序(a)得到的培养液中添加碱水溶液，将pH调整为10.0～12.0，在该调整前、或该调整的同时、或该调整后添加表面活性剂的工序；
(c)由通过所述工序(b)得到的水性悬浮液制备pH为7.0以下、且剪切粘度为0.005Pa·s以上0.5Pa·s以下的水性悬浮液的工序；以及
(d)将通过所述工序(c)制备的水性悬浮液进行喷雾干燥的工序。
2.根据权利要求1所述的聚羟基丁酸共聚物的制造方法，该方法在所述工序(d)之后进一步包括：
(e)对通过所述工序(d)得到的聚羟基丁酸共聚物粉体进行清洗的工序、以及
(f)对通过所述工序(e)得到的聚羟基丁酸共聚物粉体进行脱水和/或干燥的工序。
3.根据权利要求1或2所述的聚羟基丁酸共聚物的制造方法，其中，
所述除3-羟基丁酸酯单元以外的羟基烷酸酯单元为3-羟基己酸酯单元。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的聚羟基丁酸共聚物的制造方法，其中，
所述工序(b)的表面活性剂为十二烷基硫酸钠。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的聚羟基丁酸共聚物的制造方法，其中，
所述水性悬浮液进一步包含分散剂。
6.根据权利要求5所述的聚羟基丁酸共聚物的制造方法，其中，
所述分散剂为选自氧化烯类分散剂、纤维素类分散剂及聚乙烯醇中的至少1种。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的聚羟基丁酸共聚物的制造方法，其中，
通过所述工序(c)制备的水性悬浮液中的聚羟基丁酸共聚物的浓度为30～65重量％。
8.根据权利要求2所述的聚羟基丁酸共聚物的制造方法，其中，
所述工序(e)的清洗液包含碱性蛋白分解酶和/或溶菌酶。
9.一种聚羟基丁酸共聚物粉体，其包含聚羟基丁酸共聚物、肽聚糖及分散剂，
所述聚羟基丁酸共聚物的3-羟基丁酸酯单元/除3-羟基丁酸酯单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比为80/20～88/12(mol/mol)，
所述聚羟基丁酸共聚物粉体的堆积密度为0.45g/mL以上，中值粒径为80～200μm。
10.根据权利要求9所述的聚羟基丁酸共聚物粉体，其中，
所述肽聚糖含量为0.1～1.5phr。
11.根据权利要求9或10所述的聚羟基丁酸共聚物粉体，其中，
残留蛋白质量为0.1～1.0phr。
12.一种聚羟基丁酸共聚物粉体，其包含聚羟基丁酸共聚物和氮化合物，
所述聚羟基丁酸共聚物的3-羟基丁酸酯单元/除3-羟基丁酸酯单元以外的羟基烷酸酯单元的组成比为80/20～88/12(mol/mol)，
所述聚羟基丁酸共聚物粉体的堆积密度为0.45g/mL以上，中值粒径为80～200μm。
13.根据权利要求12所述的聚羟基丁酸共聚物粉体，其中，
所述聚羟基丁酸共聚物粉体中的总氮量为0.010～0.075phr。
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