JP2023178063A - ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法およびその利用 - Google Patents

Abstract

【課題】ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨを低い値に制御することなく、簡便な操作で、かつ、高収率で、ＰＨＡを製造すること。【解決手段】（ａ）菌体残渣タンパク質の含有量が１０００ｐｐｍ以下であるポリヒドロキシアルカン酸水性懸濁液を調製する工程、（ｂ）前記水性懸濁液と、比重が１．０ｇ／ｍＬ超の非水溶性有機溶媒とを混合して混合液を得る工程、および（ｃ）前記混合液に対する遠心分離によりポリヒドロキシアルカン酸を含む非水溶性有機溶媒相を得る工程を含む製造方法。【選択図】なし

Description

本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法およびその利用に関する。

ポリヒドロキシアルカン酸（以後、「ＰＨＡ」と称する場合がある。）は、生分解性を有することが知られている。

微生物が生成するＰＨＡは、微生物の菌体内に蓄積されるため、ＰＨＡをプラスチックとして利用するためには、微生物の菌体内からＰＨＡを分離・精製する工程が必要となる。ＰＨＡを分離・精製する工程では、ＰＨＡ含有微生物の菌体を破砕もしくはＰＨＡ以外の生物由来成分を可溶化した後、得られた水性懸濁液からＰＨＡを取り出す。このとき、例えば、遠心分離、ろ過、乾燥等の分離操作を行う。乾燥操作には、噴霧乾燥機、流動層乾燥機、ドラムドライヤー等が用いられるが、操作が簡便であることから、好ましくは噴霧乾燥機が用いられる（特許文献１）。

また、本発明者らは、以前に、上記噴霧乾燥に代わる、簡便な操作で、かつ、高収率で、ＰＨＡを製造することができる製造方法として、（ａ）ｐＨが５以下であるＰＨＡ水性懸濁液を調製する工程、（ｂ）前記工程（ａ）で得られた水性懸濁液と、比重が１．０ｇ／ｍＬ超の非水溶性有機溶媒とを混合する工程、（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた混合液を遠心分離により非水溶性有機溶媒相と水相とに分離した後、前記水相を除去する工程、および（ｄ）前記工程（ｃ）で得られた前記非水溶性有機溶媒相を加熱し、その後冷却して、ゲル状のＰＨＡを取得する工程を含む製造方法を報告している（特許文献２）。

国際公開公報ＷＯ２０１８／０７０４９２号 国際公開公報ＷＯ２０２１／１６１７３２号

上記の技術は優れたものであるが、なお改善の余地がある。

そこで、本発明の課題は、前記ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨを過度に低い値に制御することなく、簡便な操作で、かつ、高収率で、ＰＨＡを製造することができる製造方法を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、特許文献２に記載の製造方法において、ＰＨＡ水性懸濁液として、菌体残渣タンパク質の濃度が低いＰＨＡ水性懸濁液を使用することにより、当該ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨを低い値に制御しなくとも、簡便な操作で、かつ、高収率で、ＰＨＡを製造することができるとの新規知見を見出し、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明の一態様は、（ａ）菌体残渣タンパク質の含有量が１０００ｐｐｍ以下であるポリヒドロキシアルカン酸水性懸濁液を調製する工程、（ｂ）前記工程（ａ）で得られた水性懸濁液と、比重が１．０ｇ／ｍＬ超の非水溶性有機溶媒とを混合して混合液を得る工程、および（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた混合液を遠心分離により非水溶性有機溶媒相と水相とに分離した後、前記水相を除去して、ポリヒドロキシアルカン酸を含む非水溶性有機溶媒相を得る工程、を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法（以下、「本製造方法」と称する。）に関する。

また、本発明の一態様は、菌体残渣タンパク質の含有量が１０００ｐｐｍ以下であるポリヒドロキシアルカン酸と、比重が１．０ｇ／ｍＬ超の非水溶性有機溶媒とを含む、ポリヒドロキシアルカン酸凝集体（以下、「本ＰＨＡ凝集体」と称する。）に関する。

本発明の一態様によれば、ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨを過度に低い値に制御することなく、簡便な操作で、かつ、高収率で、ＰＨＡを製造することができる。

本発明の一実施形態に係る、遠心分離後の分離した相を示す概略図である。 本発明の実施例１、２及び比較例１のそれぞれにおける、遠心分離後の混合液の態様を示す図である。 本発明の実施例１における、ＰＨＡ含有非水溶性有機溶媒懸濁液を加熱・冷却して得られる、ゲル状のＰＨＡを含むＰＨＡ含有非水溶性有機溶媒懸濁液の態様を示す図である。

本発明の実施の一形態について、以下に詳細に説明する。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。また、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。

〔１．本発明の概要〕
本発明者は、ＰＨＡの製造において噴霧乾燥を行う場合、次の問題点があると考えた。例えば、噴霧乾燥操作では、水性懸濁液中のすべての水を蒸発させる必要があるために、膨大な熱エネルギーが要求される。また、噴霧乾燥操作に用いられる噴霧乾燥機は、巨大になりがちであり、設備設置面積が大きくなるという点でも問題となる。また、ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨを低い値に制御することにより、当該ＰＨＡ水性懸濁液を特定の非水溶性有機溶媒と接触させた際に、当該非水溶性有機溶媒へのＰＨＡの親和性が増加する。特許文献２に記載のＰＨＡの製造方法は、前述の事項を利用して、ｐＨが低い値に制御されたＰＨＡ水性懸濁液からＰＨＡを高収率にて得る方法である。しかしながら、この方法には、ｐＨを過度に低い値に制御したＰＨＡ水性懸濁液中にて、ＰＨＡが加水分解されることにより、ＰＨＡの収率が低下するおそれがあるとの問題点がある。

そこで、本発明者らは、上述の問題点の解決を目指し、鋭意研究を行ったところ、主に以下の知見を得ることに成功した。
・特許文献２に記載の製造方法において、ＰＨＡ水性懸濁液として、菌体残渣タンパク質の濃度が低いＰＨＡ水性懸濁液を使用する場合には、当該ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨを過度に低い値に制御しなくとも、簡便な操作で、かつ、高収率で、ＰＨＡを製造することができる。

これは、ＰＨＡ水性懸濁液における菌体残渣タンパク質の濃度を低濃度に制御することにより、当該ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨを過度に低い値に制御しなくとも、当該ＰＨＡ水性懸濁液を特定の非水溶性有機溶媒と接触させた際に、当該非水溶性有機溶媒へのＰＨＡの親和性が増加したことが要因であると、本発明者らは推測している。

したがって、本製造方法によれば、ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨを低い値に制御することなく、簡便な操作で、かつ、高収率で、ＰＨＡを製造することができるため、ＰＨＡの製造において極めて有利である。以下、本製造方法の構成について詳説する。

〔２．ＰＨＡの製造方法〕
本製造方法は、下記の工程（ａ）～（ｃ）を必須の工程として含む方法である。
・工程（ａ）：菌体残渣タンパク質の含有量が１０００ｐｐｍ以下であるポリヒドロキシアルカン酸水性懸濁液を調製する工程。
・工程（ｂ）：前記工程（ａ）で得られた水性懸濁液と、比重が１．０ｇ／ｍＬ超の非水溶性有機溶媒とを混合して混合液を得る工程。
・工程（ｃ）：前記工程（ｂ）で得られた混合液を遠心分離により非水溶性有機溶媒相と水相とに分離した後、前記水相を除去して、ポリヒドロキシアルカン酸を含む非水溶性有機溶媒相を得る工程。

（工程（ａ））
本製造方法における工程（ａ）では、菌体残渣タンパク質の含有量が１０００ｐｐｍ以下であるＰＨＡ水性懸濁液を調製する。当該水性懸濁液において、ＰＨＡは水性媒体中に分散した状態で存在している。以下では、少なくともＰＨＡを含む水性懸濁液を、「ＰＨＡ水性懸濁液」と略して表記する場合がある。また、本製造方法における菌体残渣タンパク質の含有量（ｐｐｍ）は、前記ＰＨＡ水性懸濁液中における、ＰＨＡの重量に対する菌体残渣タンパク質の重量の割合（ｐｐｍ）を意味する。前記菌体残渣タンパク質の含有量（ｐｐｍ）の測定方法は、特に限定されず、例えば、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）等の市販のタンパク質の含有量の測定キットを用いる方法を採用することができる。

＜ＰＨＡ＞
本明細書において、「ＰＨＡ」とは、ヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとする重合体の総称である。ＰＨＡを構成するヒドロキシアルカン酸としては、特に限定されないが、例えば、乳酸、３－ヒドロキシブタン酸、４－ヒドロキシブタン酸、３－ヒドロキシプロピオン酸、３－ヒドロキシペンタン酸、３－ヒドロキシヘキサン酸、３－ヒドロキシヘプタン酸、３－ヒドロキシオクタン酸等が挙げられる。これらの重合体は、単独重合体でも、２種以上のモノマーユニットを含む共重合体でもよい。

より詳しくは、ＰＨＡとしては、例えば、ポリ乳酸、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）（Ｐ３ＨＢ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシヘキサノエート）（Ｐ３ＨＢ３ＨＨ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシバリレート）（Ｐ３ＨＢ３ＨＶ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－４－ヒドロキシブチレート）（Ｐ３ＨＢ４ＨＢ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシオクタノエート）（Ｐ３ＨＢ３ＨＯ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシオクタデカノエート）（Ｐ３ＨＢ３ＨＯＤ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシデカノエート）（Ｐ３ＨＢ３ＨＤ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシバリレート－コ－３－ヒドロキシヘキサノエート）（Ｐ３ＨＢ３ＨＶ３ＨＨ）等が挙げられる。中でも、工業的に生産が容易であることから、Ｐ３ＨＢ、Ｐ３ＨＢ３ＨＨ、Ｐ３ＨＢ３ＨＶ、Ｐ３ＨＢ４ＨＢが好ましい。

また、繰り返し単位の組成比を変えることで、融点、結晶化度を変化させ、結果として、ヤング率、耐熱性等の物性を変化させることができ、かつ、ポリプロピレンとポリエチレンとの間の物性を付与することが可能であること、および上記したように工業的に生産が容易であり、物性的に有用なプラスチックであるという観点から、３－ヒドロキシ酪酸と３－ヒドロキシヘキサン酸の共重合体であるＰ３ＨＢ３ＨＨがより好ましい。

本発明の一実施形態において、Ｐ３ＨＢ３ＨＨの繰り返し単位の組成比は、柔軟性および強度のバランスの観点から、３－ヒドロキシブチレート単位／３－ヒドロキシヘキサノエート単位の組成比が、８０／２０～９９／１（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であることが好ましく、８５／１５～９７／３（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であることがより好ましい。３－ヒドロキシブチレート単位／３－ヒドロキシヘキサノエート単位の組成比が、９９／１（ｍｏｌ／ｍｏｌ）以下であると、十分な柔軟性が得られ、８０／２０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）以上であると、十分な硬度が得られる。

工程（ａ）において、出発原料として用いるＰＨＡ水性懸濁液は、特に限定されないが、例えば、細胞内にＰＨＡを生成する能力を有する微生物を培養する培養工程、および当該培養工程の後、ＰＨＡ以外の物質を分解および／または除去する精製工程、を含む方法により得ることができる。

本製造方法は、工程（ａ）の前に、ＰＨＡ水性懸濁液を得る工程（例えば、上述の培養工程および精製工程を含む工程）を含んでいてもよい。当該工程において用いられる微生物は、細胞内にＰＨＡを生成し得る微生物である限り、特に限定されない。例えば、天然から単離された微生物や菌株の寄託機関（例えば、ＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されている微生物、またはそれらから調製し得る変異体や形質転換体等を使用できる。より詳しくは、例えば、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、シュウドモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、アゾトバクター（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ）属、ノカルディア（Ｎｏｃａｒｄｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属の菌等が挙げられる。中でも、アエロモナス属、アルカリゲネス属、ラルストニア属、またはカプリアビダス属に属する微生物が好ましい。特に、アルカリゲネス・リポリティカ（Ａ.ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、アルカリゲネス・ラトゥス（Ａ.ｌａｔｕｓ）、アエロモナス・キャビエ（Ａ.ｃａｖｉａｅ）、アエロモナス・ハイドロフィラ（Ａ.ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ）、カプリアビダス・ネカトール（Ｃ.ｎｅｃａｔｏｒ）等の菌株がより好ましく、カプリアビダス・ネカトールが最も好ましい。

また、微生物が、本来ＰＨＡの生産能力を有しないものである場合、またはＰＨＡの生産量が低いものである場合には、当該微生物に目的とするＰＨＡの合成酵素遺伝子および／またはその変異体を導入して得られる形質転換体を用いることもできる。このような形質転換体の作製に用いるＰＨＡの合成酵素遺伝子としては特に限定されないが、アエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素の遺伝子が好ましい。これらの微生物を適切な条件で培養することで、菌体内にＰＨＡを蓄積した微生物菌体を得ることができる。当該微生物菌体の培養方法は特に限定されないが、例えば、特開平０５－９３０４９号公報等に記載された方法が用いられる。

上記の微生物を培養することにより作製されたＰＨＡ含有微生物には、不純物である菌体由来成分が多量に含まれているため、通常、ＰＨＡ以外の不純物を分解および／または除去するための精製工程を実施され得る。この精製工程においては、特に限定されず、当業者が考え得る物理学的処理、化学的処理、生物学的処理等を適用することができ、例えば、国際公開第２０１０／０６７５４３号に記載の精製方法が好ましく適用できる。

上記の精製工程により、最終製品に残留する不純物量が概ね決定されるため、これらの不純物は、できる限り低減させた方が好ましい。当然に、用途によっては、最終製品の物性を損なわない限り不純物が混入しても構わないが、医療用用途等、高純度のＰＨＡが必要とされる場合は、できる限り不純物を低減させることが好ましい。

前記菌体残渣タンパク質は、前記不純物の一種である。よって、上記した公知の生成方法によって、前記菌体残渣タンパク質の含有量を１０００ｐｐｍ以下の好適な範囲に制御することができる。また、前記菌体残渣タンパク質の含有量を好適な範囲に制御する方法としては、例えば、前記ＰＨＡ含有微生物を含む培養液を滅菌処理して得られる不活性化培養液に対して、過酸化水素処理、酵素処理、並びに、アルカリ処理を行う方法を挙げることができる。前記過酸化水素処理は、例えば、不活性化培養液に過酸化水素を添加した後、水酸化ナトリウム水溶液等のアルカリ溶液を添加し続けて、当該不活性化培養液のｐＨを、例えば、１１．０等の高い値に、例えば、１．５時間等の長時間維持する処理である。前記酵素処理は、例えば、前記過酸化水素処理にて得られる過酸化水素処理液を、前記ＰＨＡ含有微生物の細胞壁中の糖鎖を分解する酵素およびタンバク質分解酵素を用いて処理することである。前記アルカリ処理は、例えば、前記酵素処理にて得られる酵素処理液に対して、アルカリ溶液を加え、遠心分離した後、上清を除去するとの操作を複数回繰り返す処理である。前記アルカリ溶液は、例えば、水酸化ナトリウム水溶液等である。

本製造方法は、前記菌体残渣タンパク質の含有量が１０００ｐｐｍであることにより、ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨを低い値に制御することなく、簡便な操作で、かつ、高収率で、ＰＨＡを製造することができるとの課題を解決できる。前記課題を解決できる理由としては、以下に示す理由が推測される。前記工程（ｂ）において、ＰＨＡ水性懸濁液と、非水溶性有機溶媒とを混合する場合に、前記菌体残渣タンパク質は、ＰＨＡの表面の少なくとも一部を被覆することにより、当該ＰＨＡと当該非水溶性有機溶媒との相互作用を阻害すると考えられる。よって、前記菌体残渣タンパク質の含有量を１０００ｐｐｍ以下であることによって、前記混合液中におけるＰＨＡと前記非水溶性有機溶媒との相互作用が強くなる。従って、前記工程（ｃ）における遠心分離の際に、ＰＨＡが非水溶性有機溶媒相の方に移動し易くなる。その結果、前記ＰＨＡは、前記非水溶性有機溶媒相の下部により沈降し易くなり、前記課題を解決することができる。

よって、前記菌体残渣タンパク質の含有量がより少ない場合には、前記混合液中におけるＰＨＡと前記非水溶性有機溶媒との相互作用がより強くなる。従って、本製造方法において、前記工程（ｃ）における遠心分離にて得られる非水溶性有機溶媒相に含まれるＰＨＡの量がより多くなる。その結果、より高収率にてＰＨＡを製造することができる。高収率にてＰＨＡを製造するとの観点から、前記菌体残渣タンパク質の含有量は、９８０ｐｐｍ以下であることが好ましく９６０ｐｐｍ以下であることがより好ましく、９４０ｐｐｍ以下であることがさらに好ましく、９２０ｐｐｍ以下であることが特に好ましい。

なお、本製造方法におけるＰＨＡ水性懸濁液を構成する溶媒（「溶媒」は、「水性媒体」とも称する。）は、水、または水と有機溶媒との混合溶媒であってもよい。また、当該混合溶媒において、水と相溶性のある有機溶媒の濃度としては、使用する有機溶媒の水への溶解度以下であれば特に限定されない。また、水と相溶性のある有機溶媒としては特に限定されないが、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｉｓｏ－ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール等のアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類；アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類；ジメチルホルムアミド、アセトアミド等のアミド類；ジメチルスルホキシド、ピリジン、ピペリジン等が挙げられる。前記水と相溶性のある有機溶媒としては、その中でも、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｉｓｏ－ブタノール、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、プロピオニトリル等が、除去しやすい点から好ましい。また、前記水と相溶性のある有機溶媒としては、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、ブタノール、アセトン等が、入手容易であることからより好ましい。さらに、前記水と相溶性のある有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトンが、特に好ましい。なお、ＰＨＡ水性懸濁液を構成する水性媒体は、本発明の本質を損なわない限り、他の溶媒、菌体由来の成分、精製時に発生する化合物等を含んでいても構わない。

本製造方法におけるＰＨＡ水性懸濁液を構成する水性媒体には、水が含まれていることが好ましい。水性媒体中の水の含有量は、５０重量％以上が好ましく、より好ましくは、６０重量％以上であり、さらに好ましくは、７０重量％以上であり、特に好ましくは、８０重量％以上である。

＜その他＞
本製造方法において、前記工程（ｂ）に供される前記ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨは特に限定されない。なお、本製造方法の工程（ａ）に付される前のＰＨＡ水性懸濁液は、通常、上記の精製工程を経ることにより、７を超えるｐＨを有する。

本製造方法において、前記ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨを低い値に調節することにより、前記工程（ｂ）における非水溶性有機溶媒へのＰＨＡの親和性を向上させることもできる。その場合、工程（ｂ）において、ＰＨＡが非水溶性有機溶媒に十分に溶解し、結果として、ＰＨＡの収率をより向上させることができる。前記ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨを低い値に調節する方法は、特に限定されず、例えば、酸を添加する方法等が挙げられる。酸は、特に限定されず、有機酸、無機酸のいずれでもよく、揮発性の有無は問わない。より具体的には、酸としては、例えば、硫酸、塩酸、リン酸、酢酸等が使用できる。

前記非水溶性有機溶媒へのＰＨＡの親和性を好適に向上させ、得られるＰＨＡの収率をより向上させるとの観点から、前記ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨは、５．０以下であることが好ましく、４．０以下であることがより好ましい。また、前記ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨが低い値である場合には、前記ＰＨＡ水性懸濁液が高酸性溶液となり、反応容器が破損するおそれがある。さらに、前記ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨが過度に低い値である場合には、前記ＰＨＡ水性懸濁液中にてＰＨＡの加水分解が発生し、かえって、得られるＰＨＡの収率が低下するおそれもある。前述の反応容器の破損およびＰＨＡの加水分解の発生を好適に防止するとの観点から、前記ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨは、２．５以上であることが好ましく、２．８以上であることがより好ましく、２．９以上であることがさらに好ましい。

本製造方法の工程（ａ）により得られるＰＨＡ水性懸濁液におけるＰＨＡの濃度は、乾燥ユーティリティーの面から経済的に有利であり、生産性が向上するため、３０重量％以上が好ましく、４０重量％以上がより好ましく、５０重量％以上がさらに好ましい。また、ＰＨＡの濃度の上限は、最密充填となり、十分な流動性が確保できない可能性があるため、６５重量％以下が好ましく、６０重量％以下がより好ましい。ＰＨＡの濃度を調整する方法は、特に限定されず、水性媒体を添加する、および、水性媒体の一部を除去する（例えば、遠心分離した後、上清を取り除く等による）等の方法が挙げられる。ＰＨＡの濃度の調整は、工程（ａ）のいずれの段階で実施してもよいし、工程（ａ）の前の段階で実施してもよい。

（工程（ｂ））
本製造方法における工程（ｂ）では、前記工程（ａ）で得られた水性懸濁液と、比重が１．０ｇ／ｍＬ超の非水溶性有機溶媒とを混合して混合液を得る。

工程（ｂ）において使用される非水溶性有機溶媒は、比重が１．０ｇ／ｍＬ超の非水溶性有機溶媒であれば特に限定されない。非水溶性有機溶媒の比重が１．０ｇ／ｍＬ超であることにより、後述する工程（ｃ）で遠心分離した際に、遠沈管の上相に水相、下相（底部側）に非水溶性有機溶媒相と、分離することができる。

本発明の一実施形態において、比重が１．０ｇ／ｍＬ超の非水溶性有機溶媒としては、例えば、トリアセチン、炭酸ジメチル、トリプロピオニン、プロピレングリコールジアセタート、トリブチリン等が挙げられる。水と比重差があり、遠心分離の容易性の観点から、比重が１．０ｇ／ｍＬ超の非水溶性有機溶媒は、好ましくは、トリアセチン、炭酸ジメチル、トリプロピオニンであり、より好ましくは、炭酸ジメチルである。

本発明の一実施形態において、比重が１．０ｇ／ｍＬ超の非水溶性有機溶媒は、トリアセチン、炭酸ジメチル、トリプロピオニン、プロピレングリコールジアセタートおよびトリブチリンからなる群より選択される少なくとも１種であり得る。

また、本発明の一実施形態において、非水溶性有機溶媒の比重は、ＰＨＡの比重を超えないことが好ましい。これにより、ＰＨＡを含む非水溶性有機溶媒相を最下層とすることができ、容易に回収できる。なお、ＰＨＡの比重は、１．２ｇ／ｍＬである。

本発明の一実施形態において、非水溶性有機溶媒の水への溶解度は、２０～４０℃において、例えば、１８ｇ／１００ｍＬ以下であり、好ましくは、１７ｇ／１００ｍＬ以下であり、より好ましくは、１６ｇ／１００ｍＬ以下であり、特に好ましくは、１５ｇ／１００ｍＬ以下である。非水溶性有機溶媒の水への溶解度が１８ｇ／１００ｍＬ以下であると、後述する工程（ｃ）で遠心分離した際に、非水溶性有機溶媒相と水相とを十分に分離することができる。また、非水溶性有機溶媒の水への溶解度の下限値は、特に限定されないが、例えば、０．１ｇ／１００ｍＬ以上である。

なお、上述した、トリアセチン、炭酸ジメチル、トリプロピオニン、プロピレングリコールジアセタートおよびトリブチリンの比重および水への溶解度は、以下の通りである。
・トリアセチン：１．１６ｇ／ｍＬ（比重）、６．１ｇ／１００ｍＬ（２５℃における水への溶解度）
・炭酸ジメチル：１．０７ｇ／ｍＬ（比重）、１３．９ｇ／１００ｍＬ（２５℃における水への溶解度）
・トリプロピオニン：１．０８ｇ／ｍＬ（比重）、０．３ｇ／１００ｍＬ（３７℃における水への溶解度）
・プロピレングリコールジアセタート：１．０６ｇ／ｍＬ（比重）、９．０ｇ／１００ｍＬ（２５℃における水への溶解度）
・トリブチリン：１．０３ｇ／ｍＬ（比重）、０．１３ｇ／１００ｍＬ（３７℃における水への溶解度）
（工程（ｃ））
本製造方法における工程（ｃ）では、前記工程（ｂ）で得られた混合液を遠心分離により非水溶性有機溶媒相と水相とに分離した後、前記水相を除去して、ポリヒドロキシアルカン酸を含む非水溶性有機溶媒相を得る。

工程（ｃ）において、遠心分離は、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて行うことができる。例えば、後述する実施例で記載した、ベックマンコールター製遠心機Ａｌｌｅｇｒａ^ＴＭ Ｘ－２２Ｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅを用いて行うことができる。遠心分離を行う際の回転速度、時間等は、当業者により適宜設定可能である。

本発明の一実施形態における、工程（ｃ）での遠心分離後の分離状態を、図１を参照して説明する。工程（ｃ）における遠心分離後、下（遠沈管の底部）から順に、ＰＨＡ相Ａ１、非水溶性有機溶媒主成分相２、ＰＨＡ相Ｂ３および水主成分相４に分離する。ＰＨＡ相Ａ１は、主にＰＨＡと非水溶性有機溶媒とを含む混合液であり、ＰＨＡが最も濃縮されている。ＰＨＡ相Ａ１には、一部ＰＨＡ以外の成分が含まれていてもよい。非水溶性有機溶媒主成分相２は、主に非水溶性有機溶媒を含む溶液である。非水溶性有機溶媒主成分相２には、一部ＰＨＡおよびＰＨＡ以外の成分が含まれていてもよい。ＰＨＡ相Ｂ３は、主にＰＨＡと水とを含む混合液である。ＰＨＡ相Ｂ３には、ＰＨＡ相Ａ１および非水溶性有機溶媒主成分相２に沈降しなかったＰＨＡが含まれ得る。ＰＨＡ相Ｂ３には、ＰＨＡ以外の成分が含まれていてもよい。水主成分相４は、主に水を含む相であり、一部ＰＨＡおよびＰＨＡ以外の成分が含まれていてもよい。

なお、本明細書において、ＰＨＡ相Ａおよび非水溶性有機溶媒主成分相を合わせて、単に「非水溶性有機溶媒相」と称することがある。また、本明細書において、ＰＨＡ相Ｂおよび水主成分相を合わせて、単に「水相」と称することがある。

本製造方法を用いることにより、高収率でＰＨＡを製造することができる。ここで、工程（ｃ）におけるＰＨＡの収率は、以下の式（１）で示される値を指標として示すことができる：
ＰＨＡ相Ａの体積／（ＰＨＡ相Ａの体積＋ＰＨＡ相Ｂの体積）×１００・・・（１）
本発明の一実施形態において、上記式（１）で示される値は、例えば、４５％以上であり、好ましくは、５０％以上であり、より好ましくは、６０％以上であり、さらに好ましくは、７０％以上であり、特に好ましくは、８０％以上であり、殊更好ましくは、８３％以上である。なお、上記の「ＰＨＡ相Ａの体積」および「ＰＨＡ相Ｂの体積」は、実施例に記載の方法により測定される。

工程（ｃ）で得られる前記非水溶性有機溶媒相からＰＨＡを回収する方法は、公知の方法を使用することができ、特に限定されない。前記非水溶性有機溶媒相からＰＨＡを回収する方法としては、例えば、工程（ｃ）の後に後述の工程（ｄ）を実施して、あるいは、工程（ｃ）、工程（ｄ）に続いて後述の工程（ｅ）を実施してＰＨＡを凝集させることにより、高収率にて好適にＰＨＡを回収する方法を挙げることができる。一方、前記菌体残渣タンパク質は、ＰＨＡの表面の少なくとも一部を被覆しており、前記非水溶性有機溶媒相において、ＰＨＡの凝集を阻害していると考えられる。本製造方法においては、前記菌体残渣タンパク質の含有量が１０００ｐｐｍ以下の少ない範囲に制御されていることにより、前記非水溶性有機溶媒相において、ＰＨＡは凝集している。よって、本製造方法は、工程（ｄ）等の特殊な操作を実施しない場合であっても、前記非水溶性有機溶媒相から高収率にてＰＨＡを回収することができる。従って、本製造方法は、より簡便な操作で、かつ、高収率で、ＰＨＡを製造することができる。

前記非水溶性有機溶媒相からＰＨＡを回収する方法は特に限定されず、例えば、前記非水溶性有機溶媒相をろ過する方法、前記非水溶性有機溶媒相をさらに遠心分離した後、上澄み液を除去する方法等を挙げることができる。また、本製造方法は、得られたＰＨＡをさらに乾燥させることを含み得る。ＰＨＡの乾燥方法は、特に限定されず、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて行うことができる。前記乾燥方法の一例としては、例えば、熱風乾燥、真空乾燥等が挙げられる。

（その他）
（工程（ｄ））
本製造方法は、前記工程（ｃ）の後に、さらに以下の工程（ｄ）を含むことができる：
（ｄ）前記工程（ｃ）で得られた前記非水溶性有機溶媒相を加熱し、その後冷却して、ゲル状のＰＨＡ（以下、「ゲル化ＰＨＡ」とも称する）を得る。

工程（ｄ）において、前記非水溶性有機溶媒相を加熱すると、前記非水溶性有機溶媒相に含まれるＰＨＡが熱融着し、より凝集したＰＨＡが得られる。

本発明の一実施形態において、工程（ｄ）における加熱温度は、熱融着によりＰＨＡ凝集体が得られる温度であれば特に限定されないが、例えば、５０～１５０℃であり、好ましくは、６０～１３０℃である。

工程（ｄ）における加熱方法は、特に限定されることなく、例えば、オイルバスを用いる方法が挙げられる。また、加熱時間も特に限定されることなく、当業者により適宜設定可能である。

工程（ｄ）において、上記加熱して得られたより凝集したＰＨＡを含む溶液を冷却することにより、ＰＨＡがゲル化し、ゲル化ＰＨＡが得られる。ゲル化ＰＨＡは、ＰＨＡと非水溶性有機溶媒とを含むものといえる。

本発明の一実施形態において、工程（ｄ）における冷却温度は、ゲル化ＰＨＡが得られる温度であれば特に限定されないが、例えば、５０℃未満であり、好ましくは、４０℃以下、３０℃以下、２５℃以下、２０℃以下、１５℃以下である。

工程（ｄ）における冷却方法は、特に限定されることなく、例えば、水冷を用いる方法が挙げられる。また、冷却時間も特に限定されることなく、当業者により適宜設定可能である。

前記ゲル化ＰＨＡは、ＰＨＡがより凝集してなるＰＨＡ凝集体であり、前記非水溶性有機溶媒相からより簡便な操作で、かつ、より高収率で回収することができる。従って、本製造方法において、工程（ｄ）を含む場合には、より簡便な操作で、かつ、より高収率で、ＰＨＡを製造することができる。

工程（ｄ）において、前記非水溶性有機溶媒として、前記加熱する際に前記ＰＨＡの少なくとも一部を溶解させることができる溶媒を使用することにより、続いて前記冷却する際に、溶解していたＰＨＡが析出し、好適に凝集し得る。以上の点から、本製造方法が工程（ｄ）を含む場合、前記非水溶性有機溶媒として、前記加熱する際に前記ＰＨＡの少なくとも一部を溶解させることができる溶媒を使用することがより好ましい。前記加熱する際に前記ＰＨＡの少なくとも一部を溶解させることができる溶媒としては、例えば、炭酸ジメチルを挙げることができる。

（工程（ｅ））
本製造方法は、前記工程（ｄ）の後に、さらに以下の工程（ｅ）を含むことができる：
（ｅ）前記工程（ｄ）により得られたゲル状のポリヒドロキシアルカン酸を乾燥して、ポリヒドロキシアルカン酸凝集体を取得する工程。

工程（ｅ）により、ＰＨＡがより凝集したＰＨＡ凝集体を得ることができる。かかるＰＨＡ凝集体は、塊状のＰＨＡであり、噴霧乾燥工程により得られる粉末状のＰＨＡと比べて、粒径が大きく、取扱いが容易である。

工程（ｅ）において、ゲル状のＰＨＡを乾燥する前に、ゲル状のＰＨＡを有機溶媒により洗浄してもよい。

本発明の一実施形態において、前記洗浄に用いられる有機溶媒としては、特に限定されないが、例えば、イソプロパノール、エタノール、ｔｅｒｔ－ブタノール、メタノール、アセトン、ヘキサン等が挙げられる。また、工程（ｅ）にける有機溶媒を用いた洗浄は、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて行うことができる。

本発明の一実施形態において、乾燥方法としては、特に限定されることなく、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて行うことができる。前記乾燥方法の一例としては、例えば、熱風乾燥、真空乾燥等が挙げられる。

〔３．ＰＨＡ凝集体〕
本ＰＨＡ凝集体は、菌体残渣タンパク質の含有量が１０００ｐｐｍ以下であるＰＨＡと、比重が１．０ｇ／ｍＬ超の非水溶性有機溶媒とを含む。本ＰＨＡ凝集体における菌体残渣タンパク質の含有量（ｐｐｍ）は、本ＰＨＡ凝集体を構成するＰＨＡの重量に対する、本ＰＨＡ凝集体に含まれる菌体残渣タンパク質の重量の割合（ｐｐｍ）である。なお、本ＰＨＡ凝集体における菌体残渣タンパク質の含有量（ｐｐｍ）の測定方法は、特に限定されず、例えば、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）等の市販のタンパク質の含有量の測定キットを用いる方法を採用することができる。

本製造方法にて製造されるＰＨＡ凝集体における菌体残渣タンパク質の含有量（ｐｐｍ）は、本製造方法における菌体残渣タンパク質の含有量（ｐｐｍ）と同一の値となる。従って、本ＰＨＡ凝集体は、本製造方法により製造される。そのために、本ＰＨＡ凝集体は、簡便な操作で、かつ、高収率で得られるという利点を有する。

詳細には、本ＰＨＡ凝集体は、菌体残渣タンパク質の含有量が１０００ｐｐｍ以下と少ない。よって、本ＰＨＡ凝集体を構成するＰＨＡに付着し、その表面を被覆する菌体残渣タンパク質の量が少ないことから、当該ＰＨＡは、凝集し易くなっている。従って、本ＰＨＡ凝集体は、本製造方法により、工程（ｄ）等の特殊な操作を実施しなくとも製造され得る。また、本ＰＨＡ凝集体は、前記ＰＨＡが凝集し易くなっていることから、菌体残渣タンパク質の含有量が１０００ｐｐｍを超えるＰＨＡ凝集体よりも、高収率で製造され得る。それゆえに、本ＰＨＡ凝集体は、簡便な操作で、かつ、高収率で製造され得るとの利点を備える。なお、本ＰＨＡ凝集体は、前記菌体残渣タンパク質の含有量がより少ない方が、より簡便な操作で、かつ、より高収率で製造され得ると考えられる。その観点から、本ＰＨＡ凝集体における菌体残渣タンパク質の含有量は、９８０ｐｐｍ以下であることが好ましく、９６０ｐｐｍ以下であることがより好ましく、９４０ｐｐｍ以下であることがさらに好ましく、９２０ｐｐｍ以下であることが特に好ましい。

本ＰＨＡ凝集体は、比重が１．０ｇ／ｍＬ超の非水溶性有機溶媒を含む。本ＰＨＡ凝集体中の上記非水溶性有機溶媒の含有量は、特に限定されないが、本ＰＨＡ凝集体を構成するＰＨＡ１００重量部に対して、例えば、０．０１～１０重量部であり、０．０１～１重量部が好ましい。非水溶性有機溶媒の含有量が上記範囲であることにより、引火性が抑えられるとの利点を有する。

また、本ＰＨＡ凝集体の大きさは、特に限定されないが、例えば、大きさとしては最大径が０．１ｃｍ～１０ｃｍであることが好ましく、０．５ｃｍ～９．０ｃｍであることがより好ましく、１．０ｃｍ～８．０ｃｍであることがさらに好ましい。本範囲であれば、操作性の観点で優れる。

また、本ＰＨＡ凝集体は、本発明の効果を奏する限り、本製造方法の過程で生じた、または除去されなかった種々の成分を含んでいてもよい。

なお、本実施形態において、特に言及しなかったものについては、上記〔２．ＰＨＡの製造方法〕に記載の内容が援用される。

本ＰＨＡ凝集体は、紙、フィルム、シート、チューブ、板、棒、容器（例えば、ボトル容器等）、袋、部品等、種々の用途に利用できる。

本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

すなわち、本発明の一実施形態は、以下の発明を包含する。
＜１＞（ａ）菌体残渣タンパク質の含有量が１０００ｐｐｍ以下であるポリヒドロキシアルカン酸水性懸濁液を調製する工程、
（ｂ）前記工程（ａ）で得られた水性懸濁液と、比重が１．０ｇ／ｍＬ超の非水溶性有機溶媒とを混合して混合液を得る工程、および
（ｃ）前記工程（ｂ）で得られた混合液を遠心分離により非水溶性有機溶媒相と水相とに分離した後、前記水相を除去して、ポリヒドロキシアルカン酸を含む非水溶性有機溶媒相を得る工程、
を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
＜２＞さらに、（ｄ）前記工程（ｃ）で得られた非水溶性有機溶媒相を加熱し、その後冷却して、ゲル状のポリヒドロキシアルカン酸を取得する工程、
を含む、＜１＞に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
＜３＞さらに加えて、（ｅ）前記工程（ｄ）により得られたゲル状のポリヒドロキシアルカン酸を乾燥して、ポリヒドロキシアルカン酸凝集体を取得する工程、
を含む、＜２＞に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
＜４＞前記工程（ｃ）において、前記混合液を、下から順に、ポリヒドロキシアルカン酸相Ａ、非水溶性有機溶媒主成分相、ポリヒドロキシアルカン酸相Ｂおよび水主成分相に分離させて、前記ポリヒドロキシアルカン酸相Ｂおよび水主成分相を除去する工程を含む、＜１＞～＜３＞の何れか１つに記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
＜５＞前記工程（ｃ）において、以下の式（１）で示される値が４５％以上である、＜４＞に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。

ポリヒドロキシアルカン酸相Ａの体積／（ポリヒドロキシアルカン酸相Ａの体積＋ポリヒドロキシアルカン酸相Ｂの体積）×１００・・・（１）
＜６＞前記ポリヒドロキシアルカン酸水性懸濁液のｐＨが、２．５以上である、＜１＞～５＞の何れか１つに記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
＜７＞前記非水溶性有機溶媒が、トリアセチン、炭酸ジメチル、トリプロピオニン、プロピレングリコールジアセタートおよびトリブチリンからなる群より選択される少なくとも１種である、＜１＞～＜６＞の何れか１つに記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
＜８＞前記工程（ｄ）における加熱温度が、５０～１５０℃である、＜２＞または＜３＞に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
＜９＞前記工程（ｄ）における冷却温度が、５０℃未満である、＜２＞、＜３＞および＜８＞の何れか１つに記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
＜１０＞菌体残渣タンパク質の含有量が１０００ｐｐｍ以下であるポリヒドロキシアルカン酸と、比重が１．０ｇ／ｍＬ超の非水溶性有機溶媒とを含む、ポリヒドロキシアルカン酸凝集体。

以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

［測定方法］
＜ＰＨＡ水性懸濁液における菌体残渣タンパク質の含有量（ｐｐｍ）＞
実施例１、２及び比較例１にて調製されたＰＨＡ水性懸濁液に対して、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、前記ＰＨＡ水性懸濁液における菌体残渣タンパク質の含有量（ｐｐｍ）を測定した。

＜ＰＨＡ凝集体における菌体残渣タンパク質の含有量（ｐｐｍ）＞
実施例１、２及び比較例１にて製造されたＰＨＡ凝集体に対して、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて、前記ＰＨＡ凝集体における菌体残渣タンパク質の含有量（ｐｐｍ）を測定した。

＜ｐＨ＞
実施例１、２及び比較例１にて調製された溶液Ａ、溶液Ｂ、ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨを、ｐＨ計（ＨＯＲＩＢＡ製）を用いて測定した。また、実施例１、２及び比較例１において、水酸化ナトリウム水溶液または硫酸を添加している間、添加対象の溶液のｐＨを、上記ｐＨ計を用いて確認しながら、そのｐＨが特定の値となるように、水酸化ナトリウム水溶液または硫酸の添加量および添加速度を制御した。

［実施例１］
（菌体培養液の調製）
国際公開第ＷＯ２０１９／１４２７１７号に記載のラルストニア・ユートロファを、同文献の段落［００４１］～［００４８］に記載の方法で培養し、ＰＨＡを含有する菌体を含む菌体培養液を得た。なお、ラルストニア・ユートロファは、現在では、カプリアビダス・ネカトールに分類されている。

（不活化）
上記で得られた菌体培養液を、内温６０～７０℃で７時間加熱および攪拌処理することにより滅菌処理を行い、不活化培養液を得た。

（過酸化水素処理）
上記で得られた不活化培養液に過酸化水素（富士フィルム和光純薬製）を添加して、当該過酸化水素の濃度が０．６６重量％であり、前記不活性培養液および前記過酸化水素からなる溶液Ａ１００ｇを得た。次いで、得られた溶液Ａに対して３０％水酸化ナトリウム水溶液を添加して、ｐＨが１１．０に調整された溶液Ｂを得た。さらに、溶液Ｂの温度を６０℃で維持しつつ、溶液Ｂに対して、３０％水酸化ナトリウム水溶液を、１．５時間かけて添加し続けることにより、過酸化水素処理液を得た。前記３０％水酸化ナトリウム水溶液が添加されている間、溶液ＢのｐＨは、１１．０に維持されていた。

（酵素処理）
得られた過酸化水素処理液に対し、１０％硫酸を添加して、ｐＨが７．０±０．２に調整された溶液Ｃを得た。溶液Ｃの固形分濃度を測定したところ、３０重量％であった。その後、溶液Ｃに対して、細胞壁中の糖鎖（ペプチドグリカン）を分解する酵素であるリゾチーム（富士フイルム和光純薬製）を、液中濃度が１０ｐｐｍとなるように添加して溶液Ｄを得、溶液Ｄを、温度を５０℃に維持したまま２時間放置した。続いて、溶液Ｄに対して、タンパク質分解酵素であるアルカラーゼ２．５Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）を、液中濃度が３００ｐｐｍとなるように添加し、次いで、５０℃で１０％水酸化ナトリウム水溶液を２時間かけて添加して、酵素処理液を得た。前記酵素処理液のｐＨは、前記３０％水酸化ナトリウムが添加されている間は、８．５に調整された後、維持されていた。

（アルカリ処理）
前記酵素処理液に対して、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、花王製）を、ＳＤＳの液中濃度が２．０重量％になるように添加して、溶液Ｄを得た。その後、溶液Ｄに対して、１０％水酸化ナトリウム水溶液を添加して、ｐＨが１１．０±０．２に調整された溶液Ｅを得た。次いで、溶液Ｅを遠心分離（４５００ｒｐｍ、１０分間）した後、上清を除去して、溶液Ｅを２倍濃縮した溶液Ｆを得た。溶液Ｆに、除去した上清と同量のｐＨ１１の水酸化ナトリウム水溶液を添加して再度遠心分離（４５００ｒｐｍ、１０分間）して、上清を除去することを５回繰り返し、ＰＨＡ水性懸濁液を得た。得られたＰＨＡ水性懸濁液を、ＰＨＡ水性懸濁液（１）と称する。ＰＨＡ水性懸濁液（１）中の菌体残渣タンパク質の含有量は、４６０ｐｐｍであった。

（遠心分離）
上記で得られたＰＨＡ水性懸濁液（１）に１０％硫酸を添加し、そのｐＨが３．０に安定するまで調整されたＰＨＡ水性懸濁液（以下、「ｐＨ３．０のＰＨＡ水性懸濁液」と称する）を得た。次いで、５０ｍＬ遠沈管に、ジメチルカーボネート（比重：１．０７ｇ／ｍＬ）を７．５ｇ、前記ｐＨ３．０のＰＨＡ水性懸濁液を７．５ｇ添加し、両者を混合し、混合液を得た。得られた混合液を、ベックマンコールター製遠心機Ａｌｌｅｇｒａ^ＴＭ Ｘ－２２Ｒ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅを用いて、回転速度３０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離を行った。遠心分離後に、遠沈管の底部から順に、ＰＨＡ相Ａ、非水溶性有機溶媒主成分相、ＰＨＡ相Ｂおよび水主成分相に相分離した、遠心分離後の混合液（１）を得た。前記遠心分離後の混合液（１）の態様を、図２（ａ）に示す。

前記遠心分離後の混合液（１）における各相の体積を遠沈管の体積目盛を用いて測定し、測定された値を用いて、下記の式（１）により、ＰＨＡ回収率を算出した。算出されたＰＨＡ回収率［％］を表１に示す。
ＰＨＡ回収率［％］＝ＰＨＡ相Ａの体積／（ＰＨＡ相Ａの体積＋ＰＨＡ相Ｂの体積）×１００・・・（１）
前記遠心分離後の混合液（１）から、ＰＨＡ相Ｂおよび水主成分相を除去し、ＰＨＡ含有非水溶性有機溶媒懸濁液（１）を得た。ここで、ＰＨＡ含有非水溶性有機溶媒懸濁液（１）は、本発明の一実施形態における「ＰＨＡを含む非水溶性有機溶媒相」に該当する。次いで、ＰＨＡ含有非水溶性有機溶媒懸濁液（１）を、６０℃で１０分間加熱した後、室温で冷却し、ＰＨＡをゲル化させた。前記冷却後の、ゲル化したＰＨＡ（以下、「ゲル化ＰＨＡ」と称する）を含むＰＨＡ含有非水溶性有機溶媒懸濁液（１）の態様を図３に示す。前記ゲル化ＰＨＡを含むＰＨＡ含有非水溶性有機溶媒懸濁液（１）からスパチュラを用いて、当該ゲル化ＰＨＡを回収した。その後、回収したゲル化ＰＨＡを乾燥させて、ＰＨＡ凝集体（１）を得た。ＰＨＡ凝集体（１）における菌体残渣タンパク質の含有量は、ＰＨＡ水性懸濁液（１）中の菌体残渣タンパク質の含有量と同一であった。

［実施例２］
アルカリ処理工程におけるＳＤＳ添加量を１．０ｗｔ％とした以外は実施例１と同様の方法でＰＨＡ水性懸濁液を得た。得られたＰＨＡ水性懸濁液を、ＰＨＡ水性懸濁液（２）と称する。ＰＨＡ水性懸濁液（２）中の残タンパク質濃度は、９０３ｐｐｍであった。ＰＨＡ水性懸濁液（１）の代わりに、ＰＨＡ水性懸濁液（２）を使用した以外は、実施例１と同様の方法で遠心分離工程を実施し、遠心分離後の混合液（１）と同様に、遠沈管の底部から順に、ＰＨＡ相Ａ、非水溶性有機溶媒主成分相、ＰＨＡ相Ｂおよび水主成分相に相分離した、遠心分離後の混合液（２）を得た。前記遠心分離後の混合液（２）の態様を、図２（ｂ）に示す。また、実施例１と同様の方法にて、前記遠心分離後の混合液（２）におけるＰＨＡ回収率を算出した。算出されたＰＨＡ回収率を表１に示す。

［比較例１］
アルカリ処理工程におけるＳＤＳ添加量を０．６ｗｔ％とし、上清除去のための遠心分離回数を３回とした以外は実施例１と同様の方法でＰＨＡ水性懸濁液を得た。得られたＰＨＡ水性懸濁液を、ＰＨＡ水性懸濁液（３）と称する。ＰＨＡ水性懸濁液（３）中の残タンパク質濃度は、１２１７ｐｐｍであった。ＰＨＡ水性懸濁液（１）の代わりに、ＰＨＡ水性懸濁液（３）を使用した以外は、実施例１と同様の方法で遠心分離工程を実施し、遠心分離後の混合液（１）と同様に、遠沈管の底部から順に、ＰＨＡ相Ａ、非水溶性有機溶媒主成分相、ＰＨＡ相Ｂおよび水主成分相に相分離した、遠心分離後の混合液（３）を得た。前記遠心分離後の混合液（３）の態様を、図２（ｃ）に示す。また、実施例１と同様の方法にて、前記遠心分離後の混合液（３）におけるＰＨＡ回収率を算出した。算出されたＰＨＡ回収率を表１に示す。

［結果］
表１より、実施例１、２に記載の製造方法は、比較例１に記載の製造方法と比較して、ＰＨＡ水性懸濁液中の残タンパク質濃度が１０００ｐｐｍ以下と低く、本製造方法に該当する。また、実施例１、２に記載の製造方法は、比較例１に記載の製造方法と比較して、ＰＨＡ回収率が高い。すなわち、実施例１、２に記載の製造方法では、比較例１に記載の製造方法に対し、ＰＨＡ水性懸濁液中の残タンパク質濃度が１０００ｐｐｍ以下と低く、その結果、ＰＨＡ回収率が高いことが分かった。

図２に示す通り、実施例１、２における遠心分離後の混合液において、比較例１における遠心分離後の混合液と比較して、ＰＨＡが、遠沈管の底部、すなわち非水溶性有機溶媒相の下部により沈降している。従って、実施例１、２に記載の製造方法は、比較例１に記載の製造方法よりも、より簡便な操作で、ＰＨＡを製造することができることが分かった。

以上のことから、本製造方法は、ＰＨＡ水性懸濁液における菌体残渣タンパク質の含有量が１０００ｐｐｍ以下であることにより、ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨをより低い値に制御することなく、より簡便な操作で、かつ、高収率で、ＰＨＡを製造することができるとの効果を奏することが分かった。

さらに、図３より、本製造方法において、工程（ｄ）：前記非水溶性有機溶媒相を加熱し、その後冷却する工程を含む製造方法によって、ＰＨＡ水性懸濁液からゲル化ＰＨＡを回収できることが分かった。ここで、ゲル化ＰＨＡは、ＰＨＡが凝集してなるＰＨＡ凝集体であり、前記非水溶性有機溶媒相からより簡便な操作で、かつ、より高収率で回収することができる。従って、本製造方法において、工程（ｄ）を含むことにより、より簡便な操作で、かつ、より高収率で、ＰＨＡを製造することができることが分かった。

本製造方法は、簡便な操作で、かつ、高収率で、ＰＨＡを製造することができることから、ＰＨＡの製造において有利に使用できる。また、本製造方法により得られたＰＨＡ凝集体等は、農業、漁業、林業、園芸、医学、衛生品、衣料、非衣料、包装、自動車、建材、その他の分野に好適に利用することができる。

１ ポリヒドロキシアルカン酸相Ａ（ＰＨＡ相Ａ）
２ 非水溶性有機溶媒主成分相
３ ポリヒドロキシアルカン酸相Ｂ（ＰＨＡ相Ｂ）
４ 水主成分相

Claims (10)

1. （ａ）菌体残渣タンパク質の含有量が１０００ｐｐｍ以下であるポリヒドロキシアルカン酸水性懸濁液を調製する工程、
   （ｂ）前記工程（ａ）で得られた水性懸濁液と、比重が１．０ｇ／ｍＬ超の非水溶性有機溶媒とを混合して混合液を得る工程、および
   （ｃ）前記工程（ｂ）で得られた混合液を遠心分離により非水溶性有機溶媒相と水相とに分離した後、前記水相を除去して、ポリヒドロキシアルカン酸を含む非水溶性有機溶媒相を得る工程、
   を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
2. さらに、（ｄ）前記工程（ｃ）で得られた非水溶性有機溶媒相を加熱し、その後冷却して、ゲル状のポリヒドロキシアルカン酸を取得する工程、
   を含む、請求項１に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
3. さらに加えて、（ｅ）前記工程（ｄ）により得られたゲル状のポリヒドロキシアルカン酸を乾燥して、ポリヒドロキシアルカン酸凝集体を取得する工程、
   を含む、請求項２に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
4. 前記工程（ｃ）において、前記混合液を、下から順に、ポリヒドロキシアルカン酸相Ａ、非水溶性有機溶媒主成分相、ポリヒドロキシアルカン酸相Ｂおよび水主成分相に分離させて、前記ポリヒドロキシアルカン酸相Ｂおよび水主成分相を除去する工程を含む、請求項１に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
5. 前記工程（ｃ）において、以下の式（１）で示される値が４５％以上である、請求項４に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
   ポリヒドロキシアルカン酸相Ａの体積／（ポリヒドロキシアルカン酸相Ａの体積＋ポリヒドロキシアルカン酸相Ｂの体積）×１００・・・（１）
6. 前記ポリヒドロキシアルカン酸水性懸濁液のｐＨが、２．５以上である、請求項１に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
7. 前記非水溶性有機溶媒が、炭酸ジメチルである、請求項１～６のいずれか１項に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
8. 前記工程（ｄ）における加熱温度が、５０～１５０℃である、請求項２または３に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
9. 前記工程（ｄ）における冷却温度が、５０℃未満である、請求項２または３に記載のポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
10. 菌体残渣タンパク質の含有量が１０００ｐｐｍ以下であるポリヒドロキシアルカン酸と、比重が１．０ｇ／ｍＬ超の非水溶性有機溶媒とを含む、ポリヒドロキシアルカン酸凝集体。

Images