WO2023120193A1 - ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法およびその利用 - Google Patents

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WO2023120193A1
WO2023120193A1 PCT/JP2022/045100 JP2022045100W WO2023120193A1 WO 2023120193 A1 WO2023120193 A1 WO 2023120193A1 JP 2022045100 W JP2022045100 W JP 2022045100W WO 2023120193 A1 WO2023120193 A1 WO 2023120193A1
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WO
WIPO (PCT)
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pha
polyhydroxyalkanoate
aqueous suspension
filtration
production method
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/045100
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English (en)
French (fr)
Inventor
直樹 出口
優 平野
Original Assignee
株式会社カネカ
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Publication date
Application filed by 株式会社カネカ filed Critical 株式会社カネカ
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G63/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic ester link in the main chain of the macromolecule
    • C08G63/02—Polyesters derived from hydroxycarboxylic acids or from polycarboxylic acids and polyhydroxy compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing polyhydroxyalkanoate and its use.
  • PHA Polyhydroxyalkanoate
  • PHA produced by microorganisms accumulates within the cells of the microorganisms, so in order to use PHA as a plastic, it is necessary to separate and purify the PHA from the cells of the microorganisms.
  • the step of separating and purifying PHA the cells of PHA-containing microorganisms are crushed or biological components other than PHA are solubilized, and then PHA is taken out from the resulting aqueous suspension. At this time, for example, separation operations such as centrifugation, filtration, and drying are performed.
  • Patent Document 1 discloses a process of inoculating a PHA fermentation strain into a fermentation medium and fermenting it, separating the fermentation liquid into solid and liquid, and obtaining a fermentation supernatant and a cell precipitate.
  • a method for producing PHA comprising the steps of precipitating cells to crush cell walls and performing plate frame filtration using a filter precoated with cell wall crushed material to obtain PHA.
  • Patent Document 2 discloses a method for recovering and purifying PHA from a cell culture, which includes a step of acid treatment as a pretreatment.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing PHA that can be efficiently filtered.
  • the present inventors have made intensive studies and found that, in the filtration process in the production of PHA, the pH of the PHA aqueous suspension, the air permeability of the filter medium, the amount of protein adhering to the PHA surface, and the PHA aqueous suspension By controlling the liquid density of the turbid liquid, a specific filtrate permeation rate and a specific leakage rate can be achieved (that is, it becomes possible to filter efficiently). rice field.
  • one aspect of the present invention is a step of dead-end filtering an aqueous PHA suspension having a pH of 2.5 to 5.5 using a filter medium having an air flow rate of 0.01 to 5.0 cc/cm 2 /sec. wherein the PHA surface-adhering protein amount in the PHA aqueous suspension is 2000 ppm or less, and the liquid density of the PHA aqueous suspension in the filtration step is 0.50 to 1.08 g / mL. (hereinafter referred to as "this manufacturing method").
  • one aspect of the present invention is a PHA aggregate having a Feret diameter of 1 to 100 mm and a water content of 25.0 to 50.0% (W.B.) (hereinafter referred to as "this PHA aggregate (referred to as "lumps").
  • a method for producing PHA that can be efficiently filtered can be provided.
  • FIG. 10 is a diagram showing an example of Feret diameter measurement of PHA aggregates according to Example 10 of the present invention.
  • PHA produced in the cells has a particle size of about 1 to 2 ⁇ m, so there is a problem that it is difficult to filter.
  • centrifugal separation is mainly used for recovery of PHA, and the form of separation is an aqueous suspension, and PHA is recovered in a state containing a large amount of water.
  • Patent Documents 1 and 2 are known as methods for producing PHA using filtration.
  • the technique of Patent Literature 1 since filtration is performed before purification (in a state in which a large amount of residue of biological origin remains), there is a problem that there are many impurities and the filtration rate is extremely slow.
  • the present inventor conducted a follow-up test on the technique of Patent Document 2 it was found that the pH range was 6 to 7, and if filtration was performed under this condition, a considerable amount of resin would leak. Found a problem. Also, under the same conditions, it was found that if the filter cloth is made finer, the filtration rate becomes extremely slow.
  • the present inventors have made intensive studies on the filtration process in the production of PHA from the viewpoint of improving the filtrate permeation rate and leakage rate. It has been found for the first time that by controlling the amount of protein and the liquid density of the PHA aqueous suspension, a specific filtrate permeation rate and a specific leakage rate can be achieved (that is, efficient filtration is possible).
  • the term "effectively filterable" means that the filtrate permeation rate is 200 L/m 2 /hr or more and the leakage rate is 5% or less.
  • This manufacturing method is a method comprising the following steps: A step of dead-end filtering an aqueous PHA suspension having a pH of 2.5 to 5.5 using a filter medium having an air flow rate of 0.01 to 5.0 cc/cm 2 /sec, wherein the aqueous PHA suspension is The step (hereinafter referred to as step (d) and called.).
  • the production method preferably includes at least one of the following steps in addition to the step (d).
  • Step (a) A step of destroying and solubilizing cell-derived components other than PHA of a bacterial body containing PHA, wherein the volume median diameter of the PHA is 0.5 to 5.0 ⁇ m, a step (“Possible (Also referred to as "solubilization process”.)
  • Step (b) After the step (a), a step of recovering the PHA aqueous suspension by centrifugation (also referred to as a "recovery step").
  • Step (c') a step of adjusting the PHA aqueous suspension obtained in the step (b) to pH 2.5 to 5.5 (also referred to as “preparation step”).
  • - Step (c) A step of heat-treating the PHA aqueous suspension to a temperature of 60 to 120°C (also referred to as “heating step”).
  • - Step (e) A step of drying the PHA obtained in the step (d) at 20 to 160°C (also referred to as a "drying step”).
  • steps (a), (b), (c') and (c) can be performed twice or more depending on the purpose. That is, for example, steps (b), (a), (b) or (c'), (c), (c') can be performed in order.
  • PHA aqueous suspension containing at least PHA
  • PHA aqueous suspension an aqueous suspension containing at least PHA
  • Step (a) In the step (a) in the present production method, cell-derived components other than PHA of the PHA-containing bacterial cells are destroyed and solubilized. By destroying and removing impurities (cell walls, proteins, etc.) derived from the bacterial cells in step (a), PHA having a volume median diameter of 0.5 to 5.0 ⁇ m can be efficiently recovered from the bacterial cells. .
  • PHA is a general term for polymers having hydroxyalkanoic acid as a monomer unit.
  • the hydroxyalkanoic acid constituting PHA is not particularly limited, but examples include 3-hydroxybutanoic acid, 4-hydroxybutanoic acid, 3-hydroxypropionic acid, 3-hydroxypentanoic acid, 3-hydroxyhexanoic acid, 3-hydroxy heptanoic acid, 3-hydroxyoctanoic acid, and the like.
  • These polymers may be homopolymers or copolymers containing two or more monomer units.
  • PHA includes, for example, poly(3-hydroxybutyrate) (P3HB), poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyhexanoate) (P3HB3HH), poly(3-hydroxybutyrate) -co-3-hydroxyvalerate) (P3HB3HV), poly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) (P3HB4HB), poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyoctanoate) (P3HB3HO), Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyoctadecanoate) (P3HB3HOD), Poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxydecanoate) (P3HB3HD), Poly(3 -hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate-co-3-hydroxyhexanoate) (P3HB3HV3HH) and the like.
  • P3HB, P3HB3HH, P3HB3HV, and P3HB4HB are preferable
  • the melting point and degree of crystallinity can be changed, and as a result, physical properties such as Young's modulus and heat resistance can be changed, and the physical properties between polypropylene and polyethylene can be changed.
  • a copolymer of 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyhexanoic acid is used from the viewpoint that it is possible to impart it and that it is a plastic that is easy to produce industrially and has physical properties as described above.
  • Some P3HB3HH are more preferred.
  • the composition ratio of the repeating units of P3HB3HH is 3-hydroxybutyrate unit/3-hydroxyhexanoate unit composition ratio of 80/20 to 80/20 from the viewpoint of balance between flexibility and strength. It is preferably 99.9/0.1 (mol/mol), more preferably 85/15 to 97/3 (mol/mol).
  • the composition ratio of 3-hydroxybutyrate units/3-hydroxyhexanoate units is 99.9/0.01 (mol/mol) or less, sufficient flexibility can be obtained, and 80/20 (mol/ mol) or more, sufficient hardness can be obtained.
  • the volume median diameter of the PHA in step (a) is preferably 50 times or less, more preferably 20 times or less, the volume median diameter of the primary particles of the PHA (hereinafter referred to as "primary particle diameter"). More preferably less than twice.
  • the volume median diameter of the PHA is 50 times or less the primary particle diameter, the PHA aqueous suspension exhibits superior fluidity, which tends to further improve the PHA productivity.
  • the volume median diameter of PHA is preferably 0.5 to 5.0 ⁇ m, more preferably 1.0 to 4.5 ⁇ m, from the viewpoint of achieving excellent fluidity. 1.0 to 4.0 ⁇ m is more preferable.
  • the volume median diameter of PHA is measured using a laser diffraction/scattering particle size distribution analyzer LA-950 manufactured by HORIBA.
  • Microorganisms used in step (a) are not particularly limited as long as they are capable of intracellularly producing PHA.
  • microorganisms that have been deposited in depositories of microorganisms and strains isolated from nature (eg, IFO, ATCC, etc.), or mutants and transformants that can be prepared therefrom can be used.
  • Bacillus megaterium which was discovered in 1925, was the first bacterial cell that produces P3HB, which is an example of PHA.
  • natural microorganisms such as Ralstonia eutropha and Alcaligenes latus. These microorganisms are known to accumulate PHA in their cells.
  • Alcaligenes eutrophus Alcaligenes eutrophus AC32 strain (Alcaligenes eutrophus AC32, FERM BP-6038) (T.Fukui, Y.Doi, J.Bateriol) into which PHA synthase group genes were introduced in order to increase the productivity of P3HB3HH ., 179, p4821-4830 (1997)) and the like are more preferred.
  • the microbial cells may be genetically modified microorganisms into which various PHA-synthesis-related genes have been introduced according to the PHA to be produced.
  • step (a) the method of destroying and solubilizing the cell-derived components other than PHA of the PHA-containing cells is not particularly limited.
  • the disruption and solubilization are performed using, for example, lytic enzymes and protease (eg, alkaline protease).
  • lytic enzymes and protease eg, alkaline protease
  • lytic enzyme refers to an enzyme that has the activity of degrading (bacteriolysing) the cell wall (eg, peptidoglycan) of bacterial cells.
  • the lytic enzyme is not particularly limited, and examples thereof include lysozyme, labyrinthine, ⁇ -N-acetylglucosaminidase, endolysin, autolysin and the like. Lysozyme is preferred from the viewpoint of being economically advantageous. One of these may be used alone, or two or more of them may be used in combination.
  • lytic enzymes Commercially available products can also be used as lytic enzymes, and examples include “lysozyme” and “acromopeptidase” manufactured by Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the optimum pH of the lytic enzyme is not particularly limited as long as the lytic enzyme has cell wall degrading activity, but is, for example, 5.0 to 11.0, preferably 6.0 to 9. .0, more preferably 6.0 to 8.0.
  • the optimum temperature of the lytic enzyme is not particularly limited, but from the viewpoint that it does not require excessive heating and can prevent thermal change (thermal decomposition) of PHA, it is 60 ° C. or less. is preferred, and 50°C or lower is more preferred.
  • the lower limit of the optimum temperature is not particularly limited, it is preferably room temperature (for example, 25° C.) or higher from the viewpoint of economy without excessive cooling operation.
  • alkaline protease means a protease having the activity of degrading proteins in an alkaline environment (for example, in a pH 8.5 solution).
  • the alkaline protease is not particularly limited as long as it has the activity of degrading protein in an alkaline environment.
  • specific protease eg papain, bromelain, cathepsin
  • aspartic acid-specific protease eg pepsin, cathepsin D, HIV protease
  • serine-specific proteolytic enzymes especially subtilisins (eg, Alcalase) are preferred.
  • subtilisins eg, Alcalase
  • alkaline protease commercially available products can be used, for example, Novozyme "Alcalase 2.5L”; Amano Enzyme Co., Ltd. “Protin SD-AY10” and “Protease P “Amano” 3SD”; Japan Co., Ltd. “Multifect PR6L” and “Optimase PR89L”; Shinnihon Chemical Industry Co., Ltd. “Sumiteam MP”; DM Japan Co., Ltd. "Delbolase”; Nagase ChemteX Co., Ltd.
  • Bioprase OP Bioprase SP-20FG
  • Bioprase SP-4FG Orientase 22BF” manufactured by HBI Co., Ltd.
  • Alloase XA-10 manufactured by Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.
  • the optimal pH of the alkaline protease is not particularly limited as long as the alkaline protease has activity in an alkaline environment, for example 8.0 to 14.0, preferably 8.0 to 12.0, more preferably 8.0 to 10.0, still more preferably 8.0 to 9.0, most preferably 8.5.
  • the optimum temperature for alkaline protease is not particularly limited, but from the viewpoint that it does not require excessive heating and can prevent thermal change (thermal decomposition) of PHA, 60° C. or lower is preferable, and 50° C. or lower is more preferable.
  • the lower limit of the optimum temperature is not particularly limited, but it is preferably room temperature (for example, 25° C.) or higher from the viewpoint of economy without excessive cooling operation.
  • the disruption and solubilization of cell-derived components in step (a) can be performed in combination with lysozyme and Alcalase.
  • the enzyme treatment time in step (a) may vary depending on the type of enzyme, pH, temperature and other conditions, but is, for example, 1 to 8 hours, preferably 2 to 6 hours.
  • concentration of the organic solvent compatible with water is not particularly limited as long as it is equal to or less than the solubility of the organic solvent used in water.
  • the organic solvent compatible with water is not particularly limited, but examples include methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, iso-butanol, pentanol, hexanol, heptanol, and the like.
  • ketones such as acetone and methyl ethyl ketone
  • ethers such as tetrahydrofuran and dioxane
  • nitriles such as acetonitrile and propionitrile
  • amides such as dimethylformamide and acetamide
  • methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, iso-butanol, acetone, methyl ethyl ketone, tetrahydrofuran, dioxane, acetonitrile, propionitrile and the like are preferable because they are easy to remove.
  • the aqueous medium constituting the PHA aqueous suspension may contain other solvents, components derived from bacterial cells, compounds generated during purification, etc., as long as they do not impair the essence of the present invention.
  • the aqueous medium that constitutes the PHA aqueous suspension in this production method preferably contains water.
  • the water content in the aqueous medium is preferably 5% by weight or more, more preferably 10% by weight or more, still more preferably 30% by weight or more, and particularly preferably 50% by weight or more.
  • the production method may include the following steps before step (a).
  • Step (a1) is a step of culturing PHA-containing cells.
  • step (a1) for example, the bacterial cells described in the section ⁇ Microorganisms (microorganisms)> above are used.
  • the method for culturing the cells is not particularly limited, but includes, for example, the methods described in paragraphs [0041] to [0048] of International Publication No. WO2019/142717.
  • Step (a2) is a step of inactivating the cells obtained in step (a1).
  • the cells obtained in step (a1) are inactivated to obtain an inactivated culture solution.
  • the method of inactivation is not particularly limited, but for example, a method of heating and stirring the culture medium containing the P3HA-containing cells at an internal temperature of 60-70°C for 7 hours can be mentioned.
  • Step (a3) is a step of adjusting the concentration and pH of the inactivated culture solution obtained in step (a2).
  • the step (a3) is mainly performed when the viscosity of the inactivated culture solution obtained in the step (a2) is high, and the concentration and pH of the inactivated culture solution are adjusted to reduce the viscosity of the inactivated culture solution. lower the Step (a3) facilitates solubilization in step (a).
  • the method for adjusting the concentration and pH of the inactivated culture medium is not particularly limited, and any method used in the art may be used.
  • the concentration of the inactivated culture medium can be adjusted by adding hydrogen peroxide or the like to the inactivated culture medium.
  • a method of adjusting the pH for example, a method of adding a basic compound to the inactivated culture solution can be mentioned.
  • the basic compound is not particularly limited, alkali metal hydroxides or alkaline earth metal hydroxides are preferred, and sodium hydroxide is more preferred.
  • a basic compound may be used individually by 1 type, and may use 2 or more types together.
  • step (b) In step (b) in the present production method, after step (a), the PHA aqueous suspension is recovered by centrifugation. Through step (b), impurities (cell walls, proteins, etc.) derived from the bacterial cells in the PHA aqueous suspension can be removed.
  • step (b) recovery of the PHA aqueous suspension is performed by any centrifugation method known in the art.
  • the method of centrifugation is not particularly limited, but examples thereof include centrifugation using a centrifugal sedimentation machine, a centrifugal dehydrator, and the like.
  • centrifugal sedimentation machines include separation plate type (eg, disk type, self-cleaning type, nozzle type, screw decanter type, skimming type, etc.), cylindrical type, and decanter type centrifuge sedimenters.
  • separation plate type eg, disk type, self-cleaning type, nozzle type, screw decanter type, skimming type, etc.
  • cylindrical type e.g., cylindrical type
  • decanter type centrifuge sedimenters e.g., a centrifugal sedimentation machines, etc.
  • the centrifugal dehydrator there are palindrome type and continuous type.
  • steps (a) and (b) largely determine the amount of impurities remaining in the final product, it is preferable to reduce these impurities as much as possible.
  • impurities may be mixed as long as the physical properties of the final product are not impaired.
  • impurities should be reduced as much as possible. preferable.
  • the amount of protein attached to the PHA surface in the PHA aqueous suspension can be mentioned.
  • the amount of protein is 2000 ppm or less, preferably 1900 ppm or less, more preferably 1800 ppm or less, most preferably 1700 ppm or less, based on PHA weight.
  • step (c′) the PHA aqueous suspension recovered by centrifugation usually has a pH greater than 7. Therefore, in step (c′) in the present production method, the PHA aqueous suspension obtained in step (b) is adjusted to pH 2.5 to 5.5. The pH adjustment of step (c') reduces the leakage rate in the filtration of step (d).
  • the pH of the PHA aqueous suspension is 2.5 to 5.5, preferably 2.5 to 5.0, and preferably 2.5 to 4.5. It is more preferably 2.5 to 4.0, and particularly preferably 2.5 to 3.5.
  • the pH of the PHA aqueous suspension is within the above range, there is an advantage that the filtrate permeation rate can be improved without increasing the leakage rate of PHA into the filtrate in the filtration step. It is speculated that this effect is due to the fact that the PHA does not become too small and easily aggregates.
  • the viewpoint of reducing coloring when PHA is heated and melted, ensuring the stability of the molecular weight during heating and/or drying, and reducing coloring during heating and melting A pH of 5.5 or less is preferable also from the viewpoint that a PHA with reduced molecular weight reduction during drying and/or drying can be obtained.
  • the lower limit of pH from the viewpoint of acid resistance of the container, pH 2.5 or less is preferable.
  • the method for adjusting the pH is not particularly limited, and examples thereof include a method of adding an acid.
  • the acid is not particularly limited, and may be either an organic acid or an inorganic acid, and may or may not be volatile. More specifically, examples of acids that can be used include sulfuric acid, hydrochloric acid, phosphoric acid, and acetic acid.
  • step (c) after the pH adjustment in step (c), it is preferable not to perform additional pH adjustment until step (d) is performed.
  • Step (c) In the step (c) of the present production method, the PHA aqueous suspension is heat-treated so that the temperature reaches 60 to 120°C.
  • the step (c) can increase the filtrate permeation rate during filtration.
  • the temperature of the aqueous PHA suspension is preferably heat-treated to 60-120°C, more preferably 62-118°C, more preferably 65-115°C. It is more preferable to heat-treat so that When the temperature of the PHA aqueous suspension is within the above range, the filtrate permeation rate during filtration can be further increased.
  • the method of heat treatment is not particularly limited. Examples include a method of warming a container containing a liquid, (iii) a method of directly introducing steam into the PHA aqueous suspension, and the like.
  • the temperature of the steam in (i) and (iii) above and the temperature of the oil in (ii) above are such that the temperature of the PHA aqueous suspension in step (c) is 60 to 120°C. It is not particularly limited, and is, for example, 95 to 150°C.
  • Step (d) In the step (d) of the present production method, a PHA aqueous suspension of pH 2.5 to 5.5 is subjected to dead-end filtration using a filter medium having an air flow rate of 0.01 to 5.0 cc/cm 2 /sec. .
  • the amount of PHA surface-attached protein in the PHA aqueous suspension is 2000 ppm or less, and the liquid density of the PHA aqueous suspension in the filtration step is 0.50 to 1.08 g/mL. be.
  • Step (d) yields a PHA with constant Feret diameter and water content.
  • the ventilation rate is 0.01 to 5.0 cc/cm 2 /sec, preferably 0.1 to 4.0 cc/cm 2 /sec, and more preferably 0.2 to 3.5 cc/cm 2 . /sec, more preferably 0.3 to 3.0 cc/cm 2 /sec, and particularly preferably 0.4 to 2.5 cc/cm 2 /sec.
  • the ventilation rate in the filtration step of this production method is measured by the method described in Examples.
  • the PHA aqueous suspension has a liquid density of 0.50 to 1.08 g/mL, preferably 0.55 to 1.08 g/mL, and more preferably 0.60 to 1.05 g/mL. /mL, more preferably 0.65 to 1.03 g/mL.
  • the liquid density of the PHA aqueous suspension is within the above range, there are advantages that the filtrate permeation rate is high and the water content in the PHA aggregates is low. It is speculated that the reason why the filtrate permeation rate decreases when the liquid density is low is that the inclusion of air increases the viscosity of the PHA aqueous suspension, and the interaction between air and PHA increases the viscosity. .
  • the liquid density of the PHA aqueous suspension can be adjusted, for example, by adding air. The liquid density of the turbidity increases.
  • the filter medium used in step (d) is not particularly limited, but various examples include paper, filter cloth (woven fabric, non-woven fabric), screen, sintered plate, bisque, polymer membrane, perforated metal, wedge wire, and the like. material can be selected. Filter cloth is preferably used from the viewpoint of cost and ease of cleaning.
  • the method of filtration in step (d) is not particularly limited as long as it is dead-end filtration, but examples include suction filtration, pressure filtration, centrifugal filtration, gravity filtration, and the like. Among them, suction filtration, pressure filtration, and centrifugal filtration are preferably used from the viewpoint of equipment size. Further, suction filtration and pressure filtration are more preferably used in view of structural easiness.
  • the filtrate permeation rate means the rate at which the filtrate permeates the PHA aggregates and the filter medium.
  • the filtrate permeation rate is preferably 200 L/m 2 /hr or more, more preferably 300 L/m 2 /hr or more, and 400 L/m 2 /hr or more. more preferably 500 L/m 2 /hr or more, more preferably 600 L/m 2 /hr or more, even more preferably 800 L/m 2 /hr or more, and 1000 L /m 2 /hr or more is particularly preferred.
  • the filtrate permeation rate is within the above range, there is an advantage that the working time can be shortened.
  • the higher the filtrate permeation rate, the better, and although the upper limit is not particularly limited, it is, for example, 4000 L/m 2 /hr or less.
  • the filtrate permeation rate is measured by the method described in Examples.
  • the leak rate means the leak rate of PHA into the filtrate after the filtration process.
  • the leakage rate is preferably 5% or less, more preferably 4% or less, more preferably 3% or less, and 2% or less. It is more preferably 1% or less, even more preferably 0.5% or less, and particularly preferably 0.3% or less.
  • the temperature of the aqueous PHA suspension in step (d) is preferably 20 to 95°C, more preferably 20 to 90°C, and even more preferably 20 to 85°C. , 25 to 85° C. is particularly preferred.
  • the temperature of the PHA aqueous suspension is within the above range, there is an advantage that the filtrate permeation rate increases. It is presumed that the increase in the permeation rate of the filtrate is due to the increase in the particle size while the viscosity increases due to the increase in temperature.
  • the temperature of the PHA aqueous suspension during filtration is preferably at least 5°C lower than the temperature after the heat treatment step. C. or more is more preferable, 10.degree. C. or more is more preferable, and 12.degree. C. or more is particularly preferable.
  • the temperature of the aqueous PHA suspension during filtration is within the above range, there is an advantage that PHA can be filtered at a high filtrate permeation rate.
  • the method for lowering the temperature after the heat treatment step is not particularly limited, and examples thereof include cooling with a cooling device, air cooling, and the like.
  • step (d) the description of the above (step (c')) is used for "pH”.
  • step (d) the description of the above (step (b)) is used for the “amount of protein attached to the PHA surface in the aqueous PHA suspension”.
  • step (e) In step (e) in the present production method, the PHA obtained in step (d) is dried at 20-80°C. By step (e), the water content in the PHA aqueous suspension can be evaporated to adjust the water content.
  • the method for drying the PHA in step (e) is not particularly limited, but examples include heating, vacuum drying, normal temperature drying, and the like. Heating is preferably used from the viewpoint of an appropriate drying speed.
  • a heating medium for example, hot air, a jacket, etc.
  • during drying is preferably 20 to 160°C, more preferably 40 to 160°C, still more preferably 40 to 150°C, and particularly preferably 50 to 150°C.
  • Step (f) In the step (f) of the production method, the dried PHA is redispersed in an aqueous solvent to obtain an aqueous PHA suspension containing PHA having a volume median diameter of 0.5 to 5.0 ⁇ m.
  • step (f) By performing step (f) following step (e), a PHA aqueous suspension containing PHA having a particle size substantially the same as the original particle size (primary particle size) is obtained.
  • step (f) the method of redispersion is not particularly limited, and any method used in the art is used.
  • the volume median diameter of PHA is not particularly limited as long as it is substantially the same as the volume median diameter of PHA in step (a). 0 to 4.5 ⁇ m is more preferable, and 1.0 to 3.0 ⁇ m is even more preferable.
  • PHA aggregates The present PHA aggregates have a Feret diameter of 1 to 100 mm and a water content of 25.0 to 50.0% (W.B.).
  • PHA aggregates may be referred to as "PHA cake”, “filter cake” or "PHA filter cake”.
  • the Feret diameter of the present PHA aggregates is 1 to 100 mm, preferably 1 to 70 mm, more preferably 1 to 50 mm, even more preferably 1 to 30 mm, and 1 to 10 mm. is particularly preferred.
  • the PHA agglomerates obtained in step (d) can be granulated within the above range by a mechanical method such as a crusher or screw, or can be granulated within this range by breaking due to the impact of dropping. is.
  • images of 10 PHA aggregates (Fig. 1) are taken, analyzed with ImageJ (ver 1.50), individual Feret diameters are obtained for 10 PHA aggregates, and 10 individual A simple average of the Feret diameters is defined as the Feret diameter.
  • the water content of the present PHA aggregates is 25.0 to 50.0% (W.B.), preferably 25.5 to 49.0% (W.B.), and 26.0 to It is more preferably 48.0% (W.B.), further preferably 26.5 to 47.0% (W.B.), 27.0 to 46.0% (W.B. .) is particularly preferred.
  • the moisture content of the present PHA aggregates is within the above range, the PHA aggregates are not in the form of slurry but in the form of a solid, which has the advantage of being easy to put into a dryer.
  • the water content of the present PHA aggregates is measured by the method described in Examples.
  • the present PHA aggregates are produced by the present production method.
  • the present PHA aggregates may contain various components generated or not removed during the course of the present production method as long as the effects of the present invention are exhibited.
  • This PHA aggregate can be used for various purposes such as paper, film, sheet, tube, plate, rod, container (for example, bottle container, etc.), bag, and parts.
  • one aspect of the present invention includes the following. ⁇ 1> A polyhydroxyalkanoate aqueous suspension having a pH of 2.5 to 5.5 is subjected to dead-end filtration using a filter medium having an air flow rate of 0.01 to 5.0 cc/cm 2 /sec, The polyhydroxyalkanoate surface-adhering protein amount in the polyhydroxyalkanoate aqueous suspension is 2000 ppm or less, A method for producing a polyhydroxyalkanoate, wherein the liquid density of the polyhydroxyalkanoate aqueous suspension in the filtering step is 0.50 to 1.08 g/mL.
  • ⁇ 2> The production method according to ⁇ 1>, wherein in the filtering step, the filtrate permeation rate is 200 L/m 2 /hr or more and the leakage rate is 5% or less.
  • ⁇ 3> The production method according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the temperature of the polyhydroxyalkanoate aqueous suspension in the filtering step is 20 to 95°C.
  • ⁇ 4> Furthermore, (a) comprising the step of destroying and solubilizing cell-derived components other than polyhydroxyalkanoate in the bacterial body containing polyhydroxyalkanoate,
  • ⁇ 6> The production method according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, including a step of drying the polyhydroxyalkanoate obtained in the filtering step at 20 to 80°C.
  • ⁇ 7> A step of redispersing the dried polyhydroxyalkanoate in an aqueous solvent to obtain a polyhydroxyalkanoate aqueous suspension containing a polyhydroxyalkanoate having a volume median diameter of 0.5 to 5.0 ⁇ m.
  • ⁇ 8> Furthermore, before the filtration step, (c) the polyhydroxyalkanoate aqueous suspension is heated to a temperature of 60 to 120 ° C. ⁇ 1> to ⁇ 7> The manufacturing method according to any one of the above.
  • the temperature of the polyhydroxyalkanoate aqueous suspension during filtration is at least 5°C lower than the temperature of the polyhydroxyalkanoate aqueous suspension after the heat treatment step.
  • Method of manufacture as described.
  • a polyhydroxyalkanoate aggregate having a Feret diameter of 1 to 100 mm and a water content of 25.0 to 50.0% (W.B.).
  • P3HB3HH is used as “PHA”
  • P3HB3HH is used as “PHA”
  • P3HB3HH is used as “PHA”
  • P3HB3HH is used as “PHA”
  • P3HB3HH is used as “PHA”
  • P3HB3HH is used as “PHA”
  • P3HB3HH is used as “PHA”
  • P3HB3HH is used as “PHA”
  • P3HB3HH P3HB3HH
  • the ventilation rate was measured by the method described in JISL1096. Specifically, using a Frazier air permeability tester (Permeometer P2, manufactured by Toyo Seiki Seisakusho Co., Ltd.), the amount of air sucked was adjusted so that the tilt barometer indicated 125 Pa, and the air at that time Flow rate was measured.
  • Frazier air permeability tester Permeometer P2, manufactured by Toyo Seiki Seisakusho Co., Ltd.
  • PHA surface-attached protein amount The amount of protein attached to the PHA surface was measured using BCA Protein Assay Kit (manufactured by Thermo Fisher Scientific). Specifically, 20 to 50 mg of the PHA aqueous suspension immediately before step (c′) (an amount containing about 10 mg of P3HB3HH particles in the liquid) was put into a 15 mL falcon tube, and 2 mL of the kit reagent was added. After the addition, it was shaken at 60°C for 30 minutes. After 30 minutes from the end of shaking, the mixture was cooled to 25° C. and the absorbance at a wavelength of 562 nm was measured.
  • Solid content concentration The solid content concentration of the culture solution containing PHA after inactivation and the PHA aqueous suspension after pH adjustment was measured using a heat dry moisture meter ML-50 (manufactured by A&D Co., Ltd.). The culture solution was heated at 130° C. until the weight change rate was less than 0.05%/min, and the solid content concentration was determined from the weight change before and after heating.
  • Heat treatment temperature For the heat treatment temperature, the temperature of the PHA aqueous suspension furthest away from the heat source was measured while the PHA aqueous suspension was fluidized with a stirring blade or the like. For example, when heating from the outside of the vessel, the center of the vessel was measured, and when steam was injected directly into the center of the vessel, the vessel wall temperature was measured. The temperature was measured with a K thermocouple (AD5601A manufactured by AND).
  • pH of PHA aqueous suspension in step (c′) It was measured using a pH meter (9652-10D manufactured by HORIBA). The pH was measured at the position of the PHA aqueous suspension furthest from the acid addition position while the PHA aqueous suspension was in a fluidized state with a stirring blade or the like. For example, when adding acid through the wall of the vessel, the pH at the center of the vessel was measured.
  • the filter cloth was placed on a filter with an inner diameter of 47 mm (manufactured by kst-47 Advantec), and the filter was attached to a suction bell (manufactured by 2L SHIBATA) with the upper cover removed.
  • a glass 50 mL graduated cylinder was placed in the suction bell so that all the filtrate was in the graduated cylinder. Filtration was carried out by putting the PHA aqueous suspension into a filter while sucking up to ⁇ 76 kPa with a vacuum pump. The dropping of the filtrate was filmed with a video camera.
  • the filtrate permeation rate (L/m 2 /hr) was calculated by dividing the amount (L).
  • the cross-sectional area of the filter during suction filtration in this specification was calculated as the area of a circle with a diameter of 47 mm.
  • the weight of the filtrate obtained by the filtration process was measured.
  • the absorbance of the filtrate was measured using a spectrophotometer (Jasco V-770, manufactured by JASCO Corporation), and the absorbance at a wavelength of 600 nm was measured.
  • the PHA concentration in the filtrate was calculated using a calibration curve prepared from PHA aqueous suspensions with known solid concentrations.
  • the leakage rate (%) is calculated by dividing the solid content weight (g) from the PHA concentration in the filtrate and the filtrate weight (g) by the solid content weight (g) of the PHA aqueous suspension before the filtration step. bottom.
  • PHA aggregates obtained after filtration were measured using a heat drying moisture meter ML-50 (manufactured by A&D Co., Ltd.). The PHA agglomerates were heated at 105° C. until the weight change rate was less than 0.05% (W.B.)/min, and the moisture content of the PHA agglomerates was determined from the weight change before and after heating.
  • volume median diameter The volume median diameter of PHA was measured using a laser diffraction/scattering particle size distribution analyzer LA-950 manufactured by HORIBA.
  • Example 1 (Preparation of cell culture solution)
  • Ralstonia eutropha described in International Publication No. WO2019/142717 was cultured by the method described in paragraphs [0041] to [0048] of the same document to obtain a cell culture solution containing cells containing PHA.
  • Ralstonia eutropha is now classified as Capriavidus necator.
  • the cell culture solution obtained above was sterilized by heating and stirring at an internal temperature of 60 to 70° C. for 7 hours to obtain an inactivated culture solution.
  • Alcalase 2.5 L manufactured by Novozyme
  • 30% sodium hydroxide was added at 50°C to adjust the pH to 8.5. maintained for 2 hours.
  • the PHA aqueous suspension was placed in a 63° C. water bath, heated to a liquid temperature of 60° C., and subjected to suction filtration.
  • a filter cloth T7104C manufactured by Yabuta Kikai Co., Ltd.
  • the filtrate permeation rate was 1010 L/m 2 /hr
  • the particle leakage rate was 0.2%.
  • the water content of the resulting PHA aggregates was 40.3% (W.B.).
  • the Feret diameter of the PHA aggregate was 18 mm.
  • Example 2 A PHA aqueous suspension of pH 3.0 was prepared in the same manner as in Example 1, except that Alcalase 2.5 L (manufactured by Novozyme), which is a proteolytic enzyme, was added in the enzymatic treatment so that the concentration in the liquid was 200 ppm. got The PHA surface-adhering protein amount was 1500 ppm, and the liquid density was 0.95 g/mL. The volume median diameter of PHA was 2.3 ⁇ m. Filtration was performed in the same manner as in Example 1, and the filtrate permeation rate was 580 L/m 2 /hr and the leakage rate was 1.0%. The moisture content of the resulting PHA aggregates was 38.9% (W.B.). Moreover, the Feret diameter of the PHA aggregate was 25 mm.
  • Example 1 A PHA aqueous suspension of pH 3.0 was prepared in the same manner as in Example 1, except that Alcalase 2.5 L (manufactured by Novozyme), which is a proteolytic enzyme, was added in the enzymatic treatment so that the concentration in the liquid was 100 ppm. got The amount of protein attached to the PHA surface was 2500 ppm, and the liquid density was 0.95 g/mL. The volume median diameter of PHA was 2.5 ⁇ m. Filtration was performed in the same manner as in Example 1, and the filtrate permeation rate was 2500 L/m 2 /hr and the leakage rate was 10.2%. The moisture content of the resulting PHA aggregates was 40.8% (W.B.). Moreover, the Feret diameter of the PHA aggregate was 38 mm.
  • Alcalase 2.5 L manufactured by Novozyme
  • Example 3 After adjusting the pH to 3.0 in the pH adjustment step, the PHA aqueous suspension was placed in a container and shaken by hand so as to incorporate air. of a PHA aqueous suspension was obtained.
  • the PHA surface-adhering protein amount was 1000 ppm, and the liquid density was 0.7 g/mL.
  • the volume median diameter of PHA was 2.2 ⁇ m. Filtration was performed in the same manner as in Example 1, and the filtrate permeation rate was 450 L/m 2 /hr, and the leakage rate was 0.2%.
  • the water content of the resulting PHA aggregates was 36.8% (W.B.).
  • the Feret diameter of the PHA aggregate was 25 mm.
  • Example 2 Filtration was performed by the same method as in Example 1, except that strong stirring was performed in the pH adjustment step and the liquid density was set to 0.40 g/mL.
  • the filtrate permeation rate was 150 L/m 2 /hr, and the leakage rate was 3.2%.
  • the moisture content of the resulting PHA aggregates was 35.4% (W.B.).
  • the Feret diameter of the PHA aggregate was 34 mm.
  • Example 4 Filtration was performed by the same method as in Example 1, except that the pH was adjusted to 2.0 in the pH adjustment step.
  • the filtrate permeation rate was 9800 L/m 2 /hr, the leakage rate was 95%, and no PHA aggregates were obtained.
  • Example 4 A pH 3.0 aqueous PHA suspension was obtained in the same manner as in Example 1, except that a filter cloth (T7302C, manufactured by Yabuta Kikai Co., Ltd.) with an air permeability of 2.0 cc/cm 2 /sec was used in the filtration step.
  • the PHA surface-adhering protein amount was 1000 ppm, and the liquid density was 1.00 g/mL.
  • the volume median diameter of PHA was 2.2 ⁇ m. Filtration was performed by the same method as in Example 1, and the filtration permeation rate was 1210 L/m 2 /hr, and the leakage rate was 0.2%.
  • the moisture content of the resulting PHA aggregates was 42.3% (W.B.).
  • the Feret diameter of the PHA aggregate was 17 mm.
  • Example 5 Filtration was performed in the same manner as in Example 1, except that a filter cloth (PP26F, manufactured by Nakao Filter Co., Ltd.) having an air flow rate of 12.0 cc/cm 2 /sec was used during filtration.
  • the filtration permeation rate was 9440 L/m 2 /h, and the leakage rate was 73.0%.
  • the water content of the obtained PHA aggregates was 47.0% (W.B.).
  • the Feret diameter of the PHA aggregate was 11 mm.
  • Example 5 A pH 3.0 aqueous PHA suspension was obtained in the same manner as in Example 1, except that in the filtration step the water bath was heated at 78°C until the internal temperature reached 75°C.
  • the PHA surface-adhering protein amount was 1000 ppm, and the liquid density was 1.00 g/mL.
  • the volume median diameter of PHA was 2.2 ⁇ m. Filtration was performed by the same method as in Example 1, and the filtrate permeation rate was 1580 L/m 2 /hr, and the leakage rate was 0.3%.
  • the moisture content of the resulting PHA aggregates was 42.5% (W.B.).
  • the Feret diameter of the PHA aggregate was 18 mm.
  • Example 6 A pH 3.0 aqueous PHA suspension was obtained in the same manner as in Example 1, except that the inside temperature was cooled to 25°C in a 28°C water bath in the filtration step.
  • the PHA surface-adhering protein amount was 1000 ppm, and the liquid density was 1.00 g/mL.
  • the volume median diameter of PHA was 2.2 ⁇ m. Filtration was performed by the same method as in Example 1, and the filtrate permeation rate was 450 L/m 2 /hr, and the leakage rate was 0.1%.
  • the water content of the resulting PHA aggregates was 44.8% (W.B.).
  • the Feret diameter of the PHA aggregate was 26 mm.
  • Example 7 Before the filtration step, the liquid after the pH adjustment step was heated in a 125°C oil bath until the internal temperature reached 75°C, and then cooled in a 63°C water bath until the internal temperature reached 60°C. obtained a PHA aqueous suspension of pH 3.0 by the same method as in Example 1.
  • the PHA surface-adhering protein amount was 1000 ppm, and the liquid density was 1.00 g/mL.
  • the volume median diameter of PHA was 2.2 ⁇ m. Filtration was performed by the same method as in Example 1, and the filtrate permeation rate was 1220 L/m 2 /hr, and the leakage rate was 0.2%.
  • the moisture content of the resulting PHA aggregates was 42.2% (W.B.).
  • the Feret diameter of the PHA aggregate was 28 mm.
  • Example 8 Before the filtration step, the pH-adjusted liquid was heated in an oil bath at 125°C until the internal temperature reached 90°C, and then cooled in a water bath at 63°C until the internal temperature reached 60°C.
  • a pH 3.0 aqueous PHA suspension was obtained by the same method as in Example 1.
  • the PHA surface-adhering protein amount was 1000 ppm, and the liquid density was 1.00 g/mL.
  • the volume median diameter of PHA was 2.2 ⁇ m. Filtration was performed by the same method as in Example 1, and the filtrate permeation rate was 1320 L/m 2 /hr, and the leakage rate was 0.1%.
  • the water content of the obtained PHA aggregates was 44.0% (W.B.).
  • the Feret diameter of the PHA aggregate was 21 mm.
  • Example 9 In the pH adjustment step, the solid content concentration in the PHA aqueous suspension was adjusted to 28% by weight, and the pH-adjusted liquid was placed in an autoclave before the filtration step, 0.3 MPaG steam was introduced, and the liquid temperature was was heated to 110° C., then cooled in a water bath at 63° C. until the internal temperature reached 60° C., and distilled water was added so that the concentration in the PHA aqueous suspension was 25% by weight.
  • a pH 3.0 PHA aqueous suspension was obtained in the same manner as in Example 1, except for this.
  • the amount of protein attached to the PHA surface was 1000 ppm, and the liquid density was 1.00 g/mL.
  • the volume median diameter of PHA was 2.2 ⁇ m. Filtration was performed by the same method as in Example 1, and the filtrate permeation rate was 2840 L/m 2 /hr, and the leakage rate was 0.0%. The moisture content of the resulting PHA aggregates was 44.9% (W.B.). Moreover, the Feret diameter of the PHA aggregate was 15 mm.
  • Example 10 The same operation as in Example 1 was performed up to the pH adjustment step.
  • a filter cloth (T7104C, manufactured by Yabuta Kikai Co., Ltd.) with an air flow rate of 0.5 cc/cm 2 /sec was used, and pressure filtration was performed with a pressure filter (YTO type filter press machine, manufactured by Yabuta Kikai Co., Ltd.).
  • YTO type filter press machine manufactured by Yabuta Kikai Co., Ltd.
  • the filtrate permeation rate was calculated by the method described above, it was 1500 L/m 2 /hr.
  • the water content of the obtained PHA aggregates was 31.9% (W.B.). All filtrates obtained had a leakage rate of 2.6%. Filtration could be carried out regardless of the filtration method.
  • the Feret diameter of the PHA aggregate was 20 mm.
  • Example 11 (dry) The PHA aggregate obtained in Example 1 was placed in a dryer (WFO-700 manufactured by EYELA) and dried at 60° C. for 24 hours. The dried PHA agglomerates were redispersed in water to adjust the solid content concentration to 15% by weight. A 1% NaOH aqueous solution and a 1% H 2 SO 4 aqueous solution were used to adjust the pH to between 7 and 9, and stirring was performed to prepare a PHA aqueous suspension. When the particle diameter of the PHA particles in the PHA aqueous suspension was measured after stirring for 30 minutes, the volume median diameter was 2.8 ⁇ m.
  • the amount of protein attached to the surface of the PHA, the liquid density, the pH of the aqueous PHA suspension, the permeation rate of the filter medium, and the temperature of the aqueous PHA suspension are related to the filtrate permeation rate and leakage during filtration. found to affect the rate. That is, it was found that PHA can be filtered efficiently by controlling at least the amount of protein attached to the surface of PHA, the liquid density, the pH of the aqueous PHA suspension, and the permeation rate of the filter medium. In addition, according to this production method, it was found that PHA can be filtered regardless of the filtration method.
  • this production method can produce PHA with a simple operation, it can be advantageously used in the production of PHA.
  • the PHA obtained by this production method can be suitably used in agriculture, fishery, forestry, gardening, medicine, sanitary goods, clothing, non-clothing, packaging, automobiles, building materials, and other fields.

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Abstract

効率的にろ過可能なＰＨＡの製造方法を提供することを目的とする。ｐＨ２．５～５．５のＰＨＡ水性懸濁液を、通気量が０．０１～５．０ｃｃ／ｃｍ２／ｓｅｃであるろ材を用いてデッドエンドろ過する工程を含み、前記ＰＨＡ水性懸濁液中のＰＨＡ表面付着タンパク質量が、２０００ｐｐｍ以下であり、前記ろ過工程におけるＰＨＡ水性懸濁液の液密度が、０．５０～１．０８ｇ／ｍＬである、ＰＨＡの製造方法を提供することにより、上記課題を解決する。

Description

ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法およびその利用
　本発明は、ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法およびその利用に関する。
　ポリヒドロキシアルカノエート（以後、「ＰＨＡ」と称する場合がある。）は、生分解性を有することが知られている。
　微生物が生成するＰＨＡは、微生物の菌体内に蓄積されるため、ＰＨＡをプラスチックとして利用するためには、微生物の菌体内からＰＨＡを分離・精製する工程が必要となる。ＰＨＡを分離・精製する工程では、ＰＨＡ含有微生物の菌体を破砕もしくはＰＨＡ以外の生物由来成分を可溶化した後、得られた水性懸濁液からＰＨＡを取り出す。このとき、例えば、遠心分離、ろ過、乾燥等の分離操作を行う。
　ろ過を用いたＰＨＡの製造方法として、例えば、特許文献１には、ＰＨＡ発酵菌種を発酵培地に接種して発酵させる工程、発酵液を固液分離し、発酵上澄み液および菌体沈殿を得る工程、菌体を沈殿させて細胞壁を破砕し、かつ、細胞壁破砕物をプレコートしたフィルタを用いてプレートフレーム濾過し、ＰＨＡを得る工程、を含むＰＨＡの製造方法が開示されている。
　また、特許文献２には、前処理として酸処理を行う工程を含む、細胞培養物からＰＨＡを回収し、かつ、精製する方法が開示されている。
中国特許第１１１５００６５０号明細書 国際公開２０１５／０１５３９５号
　しかしながら、上述した技術は、ろ液透過速度および漏洩率の観点で、さらなる改善の余地があった。
　そこで、本発明の目的は、効率的にろ過可能なＰＨＡの製造方法を提供することにある。
　本発明者は、前記課題を解決すべく、鋭意検討を行った結果、ＰＨＡの製造におけるろ過工程において、ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨ、ろ材の通気量、ＰＨＡ表面付着タンパク質量、およびＰＨＡ水性懸濁液の液密度を制御することにより、特定のろ液透過速度および特定の漏洩率を達成できる（すなわち、効率的にろ過可能となる）との新規知見を見出し、本発明を完成するに至った。
　したがって、本発明の一態様は、ｐＨ２．５～５．５のＰＨＡ水性懸濁液を、通気量が０．０１～５．０ｃｃ／ｃｍ２／ｓｅｃであるろ材を用いてデッドエンドろ過する工程を含み、前記ＰＨＡ水性懸濁液中のＰＨＡ表面付着タンパク質量が、２０００ｐｐｍ以下であり、前記ろ過工程におけるＰＨＡ水性懸濁液の液密度が、０．５０～１．０８ｇ／ｍＬである、ＰＨＡの製造方法（以下、「本製造方法」と称する。）である。
　また、本発明の一態様は、Ｆｅｒｅｔ径が１～１００ｍｍであり、かつ、含水率が２５．０～５０．０％（Ｗ．Ｂ．）である、ＰＨＡ凝集塊（以下、「本ＰＨＡ凝集塊」と称する。）である。
　本発明の一態様によれば、効率的にろ過可能なＰＨＡの製造方法を提供できる。
本発明の実施例１０に係るＰＨＡ凝集塊のＦｅｒｅｔ径測定例を示す図である。
　本発明の実施の一形態について、以下に詳細に説明する。なお、本明細書において特記しない限り、数値範囲を表す「Ａ～Ｂ」は、「Ａ以上、Ｂ以下」を意味する。また、本明細書中に記載された文献の全てが、本明細書中において参考文献として援用される。
　〔１．本発明の概要〕
　菌体内で造られるＰＨＡは、粒子径が１～２μｍ程度であるため、ろ過が困難であるとの課題があった。また、ＰＨＡの回収には遠心分離が主に用いられているが、分離形態は水性懸濁液となり、多量の水を含んだ状態でＰＨＡを回収する。水から分離してＰＨＡを回収するためには、水性懸濁液の水分を蒸発させる必要があり、大きなエネルギーが必要となる等、問題があった。
　ろ過を用いたＰＨＡの製造方法として、例えば、上述した特許文献１および２が知られている。特許文献１の技術では、精製前（生物由来の残渣が多く残った状態）にろ過を実施しているため、不純物が多く、ろ過速度が極めて遅いとの問題がある。また、特許文献２の技術について、本発明者が追試を行ったところ、ｐＨの範囲が６～７であることが分かり、この条件でろ過を行うと、かなりの樹脂が漏洩してしまうとの問題があることを見出した。また、同条件下で、ろ布を細かくすると、ろ過速度が極めて遅くなるとの問題があることを見出した。
　そこで、本発明者は、ＰＨＡの製造におけるろ過工程について、ろ液透過速度および漏洩率の改善の観点から鋭意検討を行った結果、ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨ、ろ材の通気量、ＰＨＡ表面付着タンパク質量、およびＰＨＡ水性懸濁液の液密度を制御することにより、特定のろ液透過速度および特定の漏洩率を達成できる（すなわち、効率的にろ過可能となる）ことを初めて見出した。
　本製造方法によれば、効率的にろ過可能なＰＨＡの製造方法を提供することができる。したがって、本製造方法は、ＰＨＡの工業的な製造において極めて有利である。なお、本明細書において、「効率的にろ過可能」とは、ろ液透過速度が２００Ｌ／ｍ２／ｈｒ以上であり、かつ、漏洩率が５％以下であることを意味する。
　また、上述したような構成によれば、ろ過後の乾燥工程において必要な熱量や時間およびコスト、すなわちエネルギーを削減できる。これにより、例えば、目標７「すべての人々に手ごろで信頼でき、持続可能かつ近代的なエネルギーへのアクセスを確保する」等の持続可能な開発目標（ＳＤＧｓ）の達成に貢献できる。以下、本発明について詳説する。
　〔２．ＰＨＡの製造方法〕
　本製造方法は、以下の工程を含む方法である：
・ｐＨ２．５～５．５のＰＨＡ水性懸濁液を、通気量が０．０１～５．０ｃｃ／ｃｍ２／ｓｅｃであるろ材を用いてデッドエンドろ過する工程であり、前記ＰＨＡ水性懸濁液中のＰＨＡ表面付着タンパク質量が、２０００ｐｐｍ以下であり、前記ろ過工程におけるＰＨＡ水性懸濁液の液密度が、０．５０～１．０８ｇ／ｍＬである、工程（以下、工程（ｄ）と称する。）。
　また、本発明の一実施形態において、本製造方法は、上記工程（ｄ）に加えて、以下の工程の少なくとも一つを含むことが好ましい。
・工程（ａ）：ＰＨＡを含む菌体のＰＨＡ以外の細胞由来成分を破壊および可溶化する工程であり、前記ＰＨＡの体積メジアン径が、０．５～５．０μｍである、工程（「可溶化工程」とも称する。）
・工程（ｂ）：前記工程（ａ）の後、遠心分離によりＰＨＡ水性懸濁液を回収する工程（「回収工程」とも称する。）
・工程（ｃ’）：前記工程（ｂ）で得たＰＨＡ水性懸濁液をｐＨ２．５～５．５に調製する工程（「調製工程」とも称する。）。
・工程（ｃ）：ＰＨＡ水性懸濁液の温度が、６０～１２０℃となるように加熱処理する工程（「加熱処理工程」とも称する。）。
・工程（ｅ）：前記工程（ｄ）で得られたＰＨＡを２０～１６０℃で乾燥させる工程（「乾燥工程」とも称する。）。
・工程（ｆ）：前記乾燥させたＰＨＡを水系溶媒に再分散させて、体積メジアン径が０．５～５．０μｍであるＰＨＡを含むＰＨＡ水性懸濁液を得る工程（「再分散工程」とも称する。）。
　本製造方法において、上記の各工程は、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ’）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）の順に行われることが好ましいが、目的に応じて、適宜順番を入れ替えることも可能である。例えば、工程（ａ）、（ｂ）の順番を入れ替えて、工程（ｂ）、（ａ）の順に行うこと、および、工程（ｃ’）、（ｃ）の順番を入れ替えて、工程（ｃ）、（ｃ’）の順に行うことができる。また、目的に応じて、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ’）および（ｃ）を２回以上行うことも可能である。すなわち、例えば、工程（ｂ）、（ａ）、（ｂ）、または、（ｃ’）、（ｃ）、（ｃ’）といった順で行うことも可能である。以下、説明の便宜上、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ’）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）の順に説明する。なお、本明細書では、少なくともＰＨＡを含む水性懸濁液を、「ＰＨＡ水性懸濁液」と略して表記する場合がある。
　（工程（ａ））
　本製造方法における工程（ａ）では、ＰＨＡを含む菌体のＰＨＡ以外の細胞由来成分を破壊および可溶化する。工程（ａ）により、前記菌体由来の不純物（細胞壁、タンパク質等）を破壊および除去することで、前記菌体から体積メジアン径が０．５～５．０μｍであるＰＨＡを効率的に回収できる。
　＜ＰＨＡ＞
　本明細書において、「ＰＨＡ」とは、ヒドロキシアルカン酸をモノマーユニットとする重合体の総称である。ＰＨＡを構成するヒドロキシアルカン酸としては、特に限定されないが、例えば、３－ヒドロキシブタン酸、４－ヒドロキシブタン酸、３－ヒドロキシプロピオン酸、３－ヒドロキシペンタン酸、３－ヒドロキシヘキサン酸、３－ヒドロキシヘプタン酸、３－ヒドロキシオクタン酸等が挙げられる。これらの重合体は、単独重合体でも、２種以上のモノマーユニットを含む共重合体でもよい。
　より詳しくは、ＰＨＡとしては、例えば、ポリ（３－ヒドロキシブチレート）（Ｐ３ＨＢ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシヘキサノエート）（Ｐ３ＨＢ３ＨＨ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシバリレート）（Ｐ３ＨＢ３ＨＶ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－４－ヒドロキシブチレート）（Ｐ３ＨＢ４ＨＢ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシオクタノエート）（Ｐ３ＨＢ３ＨＯ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシオクタデカノエート）（Ｐ３ＨＢ３ＨＯＤ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシデカノエート）（Ｐ３ＨＢ３ＨＤ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－コ－３－ヒドロキシバリレート－コ－３－ヒドロキシヘキサノエート）（Ｐ３ＨＢ３ＨＶ３ＨＨ）等が挙げられる。中でも、工業的に生産が容易であることから、Ｐ３ＨＢ、Ｐ３ＨＢ３ＨＨ、Ｐ３ＨＢ３ＨＶ、Ｐ３ＨＢ４ＨＢが好ましい。
　また、繰り返し単位の組成比を変えることで、融点、結晶化度を変化させ、結果として、ヤング率、耐熱性等の物性を変化させることができ、かつ、ポリプロピレンとポリエチレンとの間の物性を付与することが可能であること、および上記したように工業的に生産が容易であり、物性的に有用なプラスチックであるという観点から、３－ヒドロキシ酪酸と３－ヒドロキシヘキサン酸の共重合体であるＰ３ＨＢ３ＨＨがより好ましい。
　本発明の一実施形態において、Ｐ３ＨＢ３ＨＨの繰り返し単位の組成比は、柔軟性および強度のバランスの観点から、３－ヒドロキシブチレート単位／３－ヒドロキシヘキサノエート単位の組成比が、８０／２０～９９．９／０．１（ｍｏｌ／ｍｏｌ）であることが好ましく、８５／１５～９７／３（ｍｏ１／ｍｏ１）であることがより好ましい。３－ヒドロキシブチレート単位／３－ヒドロキシヘキサノエート単位の組成比が、９９．９／０．０１（ｍｏｌ／ｍｏｌ）以下であると、十分な柔軟性が得られ、８０／２０（ｍｏｌ／ｍｏｌ）以上であると、十分な硬度が得られる。
　工程（ａ）におけるＰＨＡの体積メジアン径は、当該ＰＨＡの１次粒子の体積メジアン径（以下、「１次粒子径」と称する。）の５０倍以下が好ましく、２０倍以下がより好ましく、１０倍以下がさらに好ましい。ＰＨＡの体積メジアン径が１次粒子径の５０倍以下であることにより、ＰＨＡ水性懸濁液がより優れた流動性を示すため、ＰＨＡの生産性が一層向上する傾向がある。
　本発明の一実施形態において、ＰＨＡの体積メジアン径は、例えば、優れた流動性が達成されるという観点から、０．５～５．０μｍが好ましく、１．０～４．５μｍがより好ましく、１．０～４．０μｍがさらに好ましい。ＰＨＡの体積メジアン径は、ＨＯＲＩＢＡ製レーザ回折／散乱式粒子径分布測定装置ＬＡ－９５０を用いて測定される。
　＜菌体（微生物）＞
　工程（ａ）において用いられる微生物は、細胞内にＰＨＡを生成し得る微生物である限り、特に限定されない。例えば、天然から単離された微生物および菌株の寄託機関（例えば、ＩＦＯ、ＡＴＣＣ等）に寄託されている微生物、またはそれらから調製し得る変異体および形質転換体等を使用できる。例えば、ＰＨＡの一例であるＰ３ＨＢを生成する菌体としては、１９２５年に発見されたＢａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍが最初で、他にもカプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ）（旧分類：アルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、ラルストニア・ユートロフア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｅｕｔｒｏｐｈａ））、アルカリゲネス・ラタス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｌａｔｕｓ）等の天然微生物が挙げられる。これらの微生物ではＰＨＡが菌体内に蓄積されることが知られている。
　また、ＰＨＡの一例である、ヒドロキシブチレートとその他のヒドロキシアルカノエートとの共重合体を生成する菌体としては、Ｐ３ＨＢ３ＨＶおよびＰ３ＨＢ３ＨＨ生産菌であるアエロモナス・キヤビエ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ　ｃａｖｉａｅ）、Ｐ３ＨＢ４ＨＢ生産菌であるアルカリゲネス・ユートロファス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）等が挙げられる。特に、Ｐ３ＨＢ３ＨＨに関し、Ｐ３ＨＢ３ＨＨの生産性を上げるために、ＰＨＡ合成酵素群の遺伝子を導入したアルカリゲネス・ユートロファス　ＡＣ３２株（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ　ＡＣ３２，　ＦＥＲＭ　ＢＰ－６０３８）（Ｔ．Ｆｕｋｕｉ，Ｙ．Ｄｏｉ，Ｊ．Ｂａｔｅｒｉｏｌ．，１７９，ｐ４８２１－４８３０（１９９７））等がより好ましい。また、菌体は、上記以外にも、生産したいＰＨＡに合わせて、各種ＰＨＡ合成関連遺伝子を導入した遺伝子組換え微生物であっても良い。
　＜細胞由来成分の破壊および可溶化＞
　工程（ａ）において、ＰＨＡを含む菌体のＰＨＡ以外の細胞由来成分を破壊および可溶化する方法は特に限定されない。
　本発明の一実施形態において、上記破壊および可溶化は、例えば、溶菌酵素、タンパク質分解酵素（例えば、アルカリ性タンパク質分解酵素）を用いて行われる。
　本明細書において、「溶菌酵素」とは、菌体の細胞壁（例えば、ペプチドグリカン）を分解する（溶菌する）活性を有する酵素を意図する。
　本発明の一実施形態において、溶菌酵素は特に限定されず、例えば、リゾチーム、ラビアー、β－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、エンドリシン、オートリシン等が挙げられる。経済的に有利であるとの観点から、リゾチームが好ましい。これらの１種類を単独で使用してもよく、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
　溶菌酵素としては、市販品を用いることもでき、例えば、富士フイルム和光純薬株式会社製「リゾチーム」、「アクロモペプチダーゼ」等が挙げられる。
　本発明の一実施形態において、溶菌酵素の至適ｐＨは、当該溶菌酵素が細胞壁分解活性を有する限り特に限定されないが、例えば、５．０～１１．０であり、好ましくは６．０～９．０であり、より好ましくは６．０～８．０である。
　本発明の一実施形態において、溶菌酵素の至適温度は特に限定されないが、過度の加温を必要とせず、ＰＨＡの熱変化（熱分解）を防ぐことができるとの観点から、６０℃以下が好ましく、５０℃以下がさらに好ましい。至適温度の下限は特に限定されないが、過度の冷却操作が必要なく、経済的であるとの観点から、室温（例えば２５℃）以上であることが好ましい。
　本明細書において、「アルカリ性タンパク質分解酵素」とは、アルカリ環境下（例えばｐＨ８．５の溶液中）でタンパク質を分解する活性を有するタンパク質分解酵素を意図する。
　本発明の一実施形態において、アルカリ性タンパク質分解酵素は、アルカリ環境下でタンパク質を分解する活性を有する限り特に限定されず、例えば、セリン特異的タンパク質分解酵素（例えば、サブチリシン、キモトリプシン、トリプシン）、システイン特異的タンパク質分解酵素（例えばパパイン、プロメライン、カテプシン）、アスパラギン酸特異的タンパク質分解酵素（例えば、ペプシン、カテプシンＤ、ＨＩＶプロテアーゼ）等が挙げられる。経済的に有利であるとの観点から、セリン特異的タンパク質分解酵素、とりわけ、サブチリシン（例えば、アルカラーゼ）が好ましい。これらの１種類を単独で使用してもよく、２種類以上を組み合わせて使用してもよい。
　アルカリ性タンパク質分解酵素としては、市販品を用いることもでき、例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製「アルカラーゼ２．５Ｌ」；天野エンザイム株式会社社製「プロチンＳＤ－ＡＹ１０」および「プロテアーゼＰ「アマノ」３ＳＤ」；ダニスコジャパン株式会社製「マルチフェクトＰＲ６Ｌ」および「オプチマーゼＰＲ８９Ｌ」；新日本化学工業株式会社製「スミチームＭＰ」；ディー・エス・エムジャパン株式会社製「デルボラーゼ」；ナガセケムテックス株式会社製「ビオプラーゼＯＰ」、「ビオプラーゼＳＰ－２０ＦＧ」および「ビオプラーゼＳＰ－４ＦＧ」；ＨＢＩ株式会社製「オリエンターゼ２２ＢＦ」；ヤクルト薬品工業株式会社製「アロアーゼＸＡ－１０」等が挙げられる。
　本発明の一実施形態において、アルカリ性タンパク質分解酵素の至適ｐＨは、当該アルカリ性タンパク質分解酵素がアルカリ環境下で活性を有する限り特に限定されないが、例えば８．０～１４．０であり、好ましくは８．０～１２．０であり、より好ましくは８．０～１０．０であり、さらに好ましくは８．０～９．０であり、最も好ましくは８．５である。
　本発明の一実施形態において、アルカリ性タンパク質分解酵素の至適温度は、特に限定されないが、過度の加温を必要とせず、ＰＨＡの熱変化（熱分解）を防ぐことができるとの観点から、６０℃以下が好ましく、５０℃以下がさらに好ましい。至適温度の下限は、特に限定されないが、過度の冷却操作が必要なく、経済的であるとの観点から、室温（例えば、２５℃）以上であることが好ましい。
　本発明の一実施形態において、工程（ａ）における細胞由来成分の破壊および可溶化は、リゾチームおよびアルカラーゼを組み合わせて行われ得る。
　工程（ａ）における上記酵素処理時間は、酵素の種類、ｐＨ、温度等の条件により変わり得るが、例えば、１時間～８時間であり、２時間～６時間が好ましい。
　なお、本製造方法におけるＰＨＡ水性懸濁液を構成する溶媒（「溶媒」は、「水性媒体」とも称する。）は、水、または水と有機溶媒との混合溶媒であってもよい。また、当該混合溶媒において、水と相溶性のある有機溶媒の濃度としては、使用する有機溶媒の水への溶解度以下であれば特に限定されない。また、水と相溶性のある有機溶媒としては特に限定されないが、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｉｓｏ－ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、ヘプタノール等のアルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類；アセトニトリル、プロピオニトリル等のニトリル類；ジメチルホルムアミド、アセトアミド等のアミド類；ジメチルスルホキシド、ピリジン、ピペリジン等が挙げられる。中でも、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、ｉｓｏ－ブタノール、アセトン、メチルエチルケトン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、アセトニトリル、プロピオニトリル等が、除去しやすい点から好ましい。また、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、ブタノール、アセトン等が、入手容易であることからより好ましい。さらに、メタノール、エタノール、アセトンが、特に好ましい。なお、ＰＨＡ水性懸濁液を構成する水性媒体は、本発明の本質を損なわない限り、他の溶媒、菌体由来の成分、精製時に発生する化合物等を含んでいても構わない。
　本製造方法におけるＰＨＡ水性懸濁液を構成する水性媒体には、水が含まれていることが好ましい。水性媒体中の水の含有量は、５重量％以上が好ましく、より好ましくは、１０重量％以上であり、さらに好ましくは、３０重量％以上であり、特に好ましくは、５０重量％以上である。
　（その他の工程）
　本発明の一実施形態において、本製造方法は、工程（ａ）の前に、以下で示す工程を含んでいてもよい。
　＜工程（ａ１）＞
　工程（ａ１）は、ＰＨＡを含む菌体を培養する工程である。
　工程（ａ１）において、菌体は、例えば、上記＜菌体（微生物）＞の項に記載した菌体が用いられる。
　工程（ａ１）において、菌体の培養方法は特に限定されないが、例えば、国際公開第ＷＯ２０１９／１４２７１７号の段落〔００４１〕～〔００４８〕に記載の方法が挙げられる。
　＜工程（ａ２）＞
　工程（ａ２）は、前記工程（ａ１）で得られた菌体を不活化する工程である。本工程では、前記工程（ａ１）で得られた菌体を不活化し、不活化培養液を得る。
　工程（ａ２）において、不活化の方法は特に限定されないが、例えば、Ｐ３ＨＡを含有する菌体を含む培養液を、内温６０～７０℃で７時間、加熱および攪拌処理する方法が挙げられる。
　＜工程（ａ３）＞
　工程（ａ３）は、前記工程（ａ２）で得られた不活化培養液の濃度およびｐＨを調整する工程である。工程（ａ３）は、主に、前記工程（ａ２）で得られた不活化培養液の粘度が高い場合に行われ、不活化培養液の濃度およびｐＨを調整して、不活化培養液の粘度を低下させる。工程（ａ３）により、工程（ａ）における可溶化を容易にする。
　工程（ａ３）において、不活化培養液の濃度およびｐＨを調整する方法は特に限定されず、当技術分野で用いられる任意の方法により行われる。例えば、不活化培養液に過酸化水素等を添加して、不活化培養液の濃度を調整できる。また、ｐＨを調整する方法としては、例えば、不活化培養液に塩基性化合物を添加する方法が挙げられる。塩基性化合物としては、特に限定されないが、アルカリ金属水酸化物またはアルカリ土類金属水酸化物が好ましく、水酸化ナトリウムがより好ましい。塩基性化合物は、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。
　（工程（ｂ））
　本製造方法における工程（ｂ）では、前記工程（ａ）の後、遠心分離によりＰＨＡ水性懸濁液を回収する。工程（ｂ）により、ＰＨＡ水性懸濁液中の前記菌体由来の不純物（細胞壁、タンパク質等）を除去できる。
　工程（ｂ）において、ＰＨＡ水性懸濁液の回収は、当該技術分野で公知である任意の遠心分離法により行われる。遠心分離の方法は、特に限定されないが、例えば、遠心沈降機、遠心脱水機等を用いた遠心分離が挙げられる。
　遠心沈降機としては、例えば、分離板型（例えば、ディスク型、セルフクリーニング型、ノズル型、スクリューデカンター型、スキミング型等）、円筒型、デカンター型の遠心沈降機が挙げられる。それぞれ沈降成分の排出の方法により、回文式と連続式がある。また遠心脱水機についても回文式と連続式とが挙げられる。これらの機器を用いることにより、比重差により、ＰＨＡを含む沈降物と、培養液成分とを分離することが可能である。
　工程（ａ）および（ｂ）により、最終製品に残留する不純物量が概ね決定されるため、これらの不純物は、できる限り低減させた方が好ましい。当然に、用途によっては、最終製品の物性を損なわない限り不純物が混入しても構わないが、医療用用途等、高純度のＰＨＡが必要とされる場合は、できる限り不純物を低減させることが好ましい。その際の精製度の指標としては、例えば、ＰＨＡ水性懸濁液中のＰＨＡ表面付着タンパク質量が挙げられる。当該タンパク質量は、ＰＨＡ重量当たり２０００ｐｐｍ以下であり、好ましくは、１９００ｐｐｍ以下、さらに好ましくは、１８００ｐｐｍ以下、最も好ましくは、１７００ｐｐｍ以下である。ＰＨＡ水性懸濁液のＰＨＡ表面付着タンパク質量が上記の範囲内であると、漏洩率が高くなりすぎないという利点を有する。当該効果は、ＰＨＡ表面付着タンパク質量が少ないと、ＰＨＡ同士が纏まり易いためであると推察される。
　（工程（ｃ’））
　工程（ｃ’）において、遠心分離により回収されたＰＨＡ水性懸濁液は、通常、７を超えるｐＨを有する。そこで、本製造方法における工程（ｃ’）では、前記工程（ｂ）で得たＰＨＡ水性懸濁液をｐＨ２．５～５．５に調整する。工程（ｃ’）のｐＨ調整を行うことにより、工程（ｄ）のろ過における漏洩率が下がる。
　工程（ｃ’）において、ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨは、２．５～５．５であり、２．５～５．０であることが好ましく、２．５～４．５であることがより好ましく、２．５～４．０であることがさらに好ましく、２．５～３．５であることが特に好ましい。ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨが上記の範囲内であると、ろ過工程において、ろ液へのＰＨＡの漏洩率を高くすることなく、ろ液透過速度を向上させることができるという利点を有する。当該効果は、ＰＨＡが小さくなりすぎず、凝集し易いためであると推察される。また、ｐＨの上限については、ＰＨＡを加熱溶融した時の着色を低減したり、加熱時および／または乾燥時の分子量の安定性を確保する観点、および、加熱溶融時の着色が低減され、加熱時および／または乾燥時の分子量低下が抑制されたＰＨＡが得られるという観点からもｐＨ５．５以下が好ましい。ｐＨの下限については、容器の耐酸性の観点から、ｐＨ２．５以下が好ましい。
　工程（ｃ’）において、ｐＨの調整方法は、特に限定されず、例えば、酸を添加する方法等が挙げられる。酸は、特に限定されず、有機酸、無機酸のいずれでもよく、揮発性の有無は問わない。より具体的には、酸としては、例えば、硫酸、塩酸、リン酸、酢酸等が使用できる。
　本発明の一実施形態において、工程（ｃ）におけるｐＨ調整の後、工程（ｄ）を行うまでの間に、追加のｐＨ調整は実施しないことが好ましい。
　（工程（ｃ））
　本製造方法における工程（ｃ）では、ＰＨＡ水性懸濁液の温度が、６０～１２０℃となるように加熱処理する。工程（ｃ）により、ろ過時のろ液透過速度を高めることができる。
　工程（ｃ）において、ＰＨＡ水性懸濁液の温度が、６０～１２０℃になるように加熱処理することが好ましく、６２～１１８℃になるように加熱処理することがより好ましく、６５～１１５℃になるように加熱処理することがさらに好ましい。ＰＨＡ水性懸濁液の温度が上記の範囲内であると、ろ過時のろ液透過速度をより高めることができる。
　工程（ｃ）において、加熱処理する方法は、特に限定されないが、例えば、（ｉ）蒸気を用いてＰＨＡ水性懸濁液の入った容器を温める方法、（ｉｉ）オイルを用いてＰＨＡ水性懸濁液の入った容器を温める方法、（ｉｉｉ）蒸気をＰＨＡ水性懸濁液に直接投入する方法等が挙げられる。上記（ｉ）および（ｉｉｉ）の蒸気の温度、ならびに上記（ｉｉ）のオイルの温度は、工程（ｃ）におけるＰＨＡ水性懸濁液の温度が、６０～１２０℃になるような温度であれば特に限定されず、例えば、９５～１５０℃である。
　（工程（ｄ））
　本製造方法における工程（ｄ）では、ｐＨ２．５～５．５のＰＨＡ水性懸濁液を、通気量が０．０１～５．０ｃｃ／ｃｍ２／ｓｅｃであるろ材を用いてデッドエンドろ過する。工程（ｄ）では、前記ＰＨＡ水性懸濁液中のＰＨＡ表面付着タンパク質量が、２０００ｐｐｍ以下であり、前記ろ過工程におけるＰＨＡ水性懸濁液の液密度が、０．５０～１．０８ｇ／ｍＬである。工程（ｄ）により、一定のＦｅｒｅｔ径および含水率を有するＰＨＡが得られる。
　本明細書中では、１秒あたりにろ材の単位面積（ｃｍ２）を通過する空気量（ｃｃ）を通気量と称する。工程（ｄ）において、通気量は、０．０１～５．０ｃｃ／ｃｍ２／ｓｅｃであり、０．１～４．０ｃｃ／ｃｍ２／ｓｅｃが好ましく、０．２～３．５ｃｃ／ｃｍ２／ｓｅｃがより好ましく、０．３～３．０ｃｃ／ｃｍ２／ｓｅｃがさらに好ましく、０．４～２．５ｃｃ／ｃｍ２／ｓｅｃが特に好ましい。通気量が上記の範囲内であると、ろ液へのＰＨＡの漏洩率が低いという利点を有する。なお、本製造方法のろ過工程における通気量は、実施例に記載の方法で測定される。
　工程（ｄ）において、ＰＨＡ水性懸濁液の液密度は、０．５０～１．０８ｇ／ｍＬであり、０．５５～１．０８ｇ／ｍＬであることが好ましく、０．６０～１．０５ｇ／ｍＬであることがより好ましく、０．６５～１．０３ｇ／ｍＬであることがさらに好ましい。ＰＨＡ水性懸濁液の液密度が上記の範囲内であると、ろ液透過速度が高く、かつ、ＰＨＡ凝集塊中の含水率が低くなるという利点を有する。液密度が低い場合に、ろ液透過速度が下がるのは、空気を含むことによりＰＨＡ水性懸濁液の粘度が上がり、空気とＰＨＡとが相互作用して粘度が上がるためであると推察される。ＰＨＡ水性懸濁液の液密度は、例えば、空気を含ませることにより調整でき、空気の量を増やすと、ＰＨＡ水性懸濁液の液密度は低下し、空気の量を減らすと、ＰＨＡ水性懸濁液の液密度は増加する。
　工程（ｄ）で使用されるろ材としては、特に限定されないが、例えば、紙、ろ布（織布、不織布）、スクリーン、焼結板、素焼、高分子膜、パンチングメタル、ウェッジワイヤー等、種々の素材から選択可能である。価格、洗浄の容易さの観点から、好ましくは、ろ布が使用される。
　工程（ｄ）におけるろ過の方法は、デッドエンドろ過であればよく、特に限定されないが、例えば、吸引ろ過、加圧ろ過、遠心ろ過、重力式ろ過等が挙げられる。中でも、機器の大きさの観点から、好ましくは、吸引ろ過、加圧ろ過、遠心ろ過が用いられる。更に、構造の容易さから、より好ましくは、吸引ろ過、加圧ろ過が用いられる。
　本明細書において、ろ液透過速度とは、ろ液がＰＨＡ凝集塊とろ材を透過する速度のことを意味する。本製造方法における工程（ｄ）において、ろ液透過速度は、２００Ｌ／ｍ２／ｈｒ以上であることが好ましく、３００Ｌ／ｍ２／ｈｒ以上であることがより好ましく、４００Ｌ／ｍ２／ｈｒ以上であることがより好ましく、５００Ｌ／ｍ２／ｈｒ以上であることがより好ましく、６００Ｌ／ｍ２／ｈｒ以上であることがより好ましく、８００Ｌ／ｍ２／ｈｒ以上であることがさらに好ましく、１０００Ｌ／ｍ２／ｈｒ以上であることが特に好ましい。ろ液透過速度が上記の範囲内であると、作業時間が短縮できるという利点を有する。ろ液透過速度は高い程よく、上限は特に限定されないが、例えば、４０００Ｌ／ｍ２／ｈｒ以下である。なお、ろ液透過速度は、実施例に記載の方法で測定される。
　本明細書において、漏洩率とは、ろ過工程後における、ろ液へのＰＨＡの漏洩率を意味する。本製造方法における工程（ｄ）において、漏洩率は、５％以下であることが好ましく、４％以下であることがより好ましく、３％以下であることがより好ましく、２％以下であることがより好ましく、１％以下であることがより好ましく、０．５％以下であることがさらに好ましく、０．３％以下であることが特に好ましい。漏洩率が上記の範囲内であると、高い分離能でＰＨＡと水とを分離可能であり、高収率でＰＨＡを回収できるという利点を有する。なお、漏洩率は、実施例に記載の方法で測定される。
　工程（ｄ）におけるＰＨＡ水性懸濁液の温度（ろ過時温度）は、２０～９５℃であることが好ましく、２０～９０℃であることがより好ましく、２０～８５℃であることがさらに好ましく、２５～８５℃であることが特に好ましい。ＰＨＡ水性懸濁液の温度が上記の範囲内であると、ろ液透過速度が高くなるという利点を有する。前記ろ液透過速度の増加は、温度上昇により粘度が上がる一方で、粒子径が大きくなるためであると推察される。
　本製造方法において、工程（ｃ）の加熱処理工程を含む場合、ろ過時のＰＨＡ水性懸濁液の温度が、前記加熱処理工程後の温度より、５℃以上低い温度であることが好ましく、８℃以上低い温度であることがより好ましく、１０℃以上低い温度であることがさらに好ましく、１２℃以上低い温度であることが特に好ましい。ろ過時のＰＨＡ水性懸濁液の温度が上記範囲内であると、高いろ液透過速度でＰＨＡのろ過が可能となるという利点を有する。また、前記加熱処理工程後に温度を下げる方法としては、特に限定されず、例えば、冷却装置による冷却、放冷等が挙げられる。
　なお、工程（ｄ）において、「ｐＨ」については、上記（工程（ｃ’））の記載が援用される。また、工程（ｄ）において、「ＰＨＡ水性懸濁液中のＰＨＡ表面付着タンパク質量」については、上記（工程（ｂ））の記載が援用される。
　（工程（ｅ））
　本製造方法における工程（ｅ）では、前記工程（ｄ）で得られたＰＨＡを２０～８０℃で乾燥させる。工程（ｅ）により、ＰＨＡ水性懸濁液中の水分を蒸発させ、含水率を調整できる。
　工程（ｅ）において、ＰＨＡを乾燥させる方法は特に限定されないが、例えば、加熱、真空乾燥、常温乾燥等が挙げられる。好ましくは、適度な乾燥速度の観点から、加熱により行われる。乾燥時の熱媒体（例えば、熱風、ジャケット等）は、２０～１６０℃が好ましく、４０～１６０℃がより好ましく、４０～１５０℃がさらに好ましく、５０℃～１５０℃が特に好ましい。
　（工程（ｆ））
　本製造方法における工程（ｆ）では、前記乾燥させたＰＨＡを水系溶媒に再分散させて、体積メジアン径が０．５～５．０μｍであるＰＨＡを含むＰＨＡ水性懸濁液を得る。工程（ｅ）に続いて、工程（ｆ）を行うことにより、元の粒子径（１次粒子径）と実質的に同一な粒子径を有するＰＨＡを含むＰＨＡ水性懸濁液が得られる。
　工程（ｆ）において、再分散の方法は特に限定されることなく、当技術分野で用いられる任意の方法により行われる。
　工程（ｆ）において、ＰＨＡの体積メジアン径は、工程（ａ）におけるＰＨＡの体積メジアン径と実質的に同一であれば特に限定されないが、例えば、０．５～５．０μｍが好ましく、１．０～４．５μｍがより好ましく、１．０～３．０μｍがさらに好ましい。
　〔３．ＰＨＡ凝集塊〕
　本ＰＨＡ凝集塊は、Ｆｅｒｅｔ径が１～１００ｍｍであり、かつ、含水率が２５．０～５０．０％（Ｗ．Ｂ．）である。なお、ＰＨＡ凝集塊は、「ＰＨＡケーキ」、「ろ過ケーキ」または「ＰＨＡろ過ケーキ」と称することもある。
　本ＰＨＡ凝集塊のＦｅｒｅｔ径は、１～１００ｍｍであり、１～７０ｍｍであることが好ましく、１～５０ｍｍであることがより好ましく、１～３０ｍｍであることがさらに好ましく、１～１０ｍｍであることが特に好ましい。本ＰＨＡ凝集塊のＦｅｒｅｔ径が上記の範囲内であると、次のプロセスへの移送が有利になるという利点を有する。なお、工程（ｄ）で得られたＰＨＡ凝集塊を、破砕機やスクリュー等の機械的な方法で上記範囲に整粒したり、落下の衝撃による破壊等でこの範囲に整粒することも可能である。本ＰＨＡ凝集塊では、ＰＨＡ凝集塊１０個の画像（図１）を取り、ＩｍａｇｅＪ（ｖｅｒ１．５０）で解析し、１０個のＰＨＡ凝集塊に対して、個別Ｆｅｒｅｔ径を出し、１０個の個別Ｆｅｒｅｔ径の単純平均をＦｅｒｅｔ径とする。
　本ＰＨＡ凝集塊の含水率は、２５．０～５０．０％（Ｗ．Ｂ．）であり、２５．５～４９．０％（Ｗ．Ｂ．）であることが好ましく、２６．０～４８．０％（Ｗ．Ｂ．）であることがより好ましく、２６．５～４７．０％（Ｗ．Ｂ．）であることがさらに好ましく、２７．０～４６．０％（Ｗ．Ｂ．）であることが特に好ましい。本ＰＨＡ凝集塊の含水率が上記の範囲内であると、ＰＨＡ凝集塊がスラリー状ではなく、固体状となり、乾燥機に投入しやすいという利点を有する。なお、本ＰＨＡ凝集塊の含水率は、実施例に記載の方法で測定される。
　本発明の一実施形態において、本ＰＨＡ凝集塊は、本製造方法により製造される。
　本ＰＨＡ凝集塊は、本発明の効果を奏する限り、本製造方法の過程で生じた、または除去されなかった種々の成分を含んでいてもよい。
　本ＰＨＡ凝集塊は、紙、フィルム、シート、チューブ、板、棒、容器（例えば、ボトル容器等）、袋、部品等、種々の用途に利用できる。
　本発明は上述した各実施形態に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。
　すなわち、本発明の一態様は、以下を含む。
＜１＞ｐＨ２．５～５．５のポリヒドロキシアルカノエート水性懸濁液を、通気量が０．０１～５．０ｃｃ／ｃｍ２／ｓｅｃであるろ材を用いてデッドエンドろ過する工程を含み、
　前記ポリヒドロキシアルカノエート水性懸濁液中のポリヒドロキシアルカノエート表面付着タンパク質量が、２０００ｐｐｍ以下であり、
　前記ろ過工程におけるポリヒドロキシアルカノエート水性懸濁液の液密度が、０．５０～１．０８ｇ／ｍＬである、ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
＜２＞前記ろ過工程において、ろ液透過速度が２００Ｌ／ｍ２／ｈｒ以上であり、かつ、漏洩率が５％以下である、＜１＞に記載の製造方法。
＜３＞前記ろ過工程におけるポリヒドロキシアルカノエート水性懸濁液の温度が、２０～９５℃である、＜１＞または＜２＞に記載の製造方法。
＜４＞さらに、（ａ）ポリヒドロキシアルカノエートを含む菌体のポリヒドロキシアルカノエート以外の細胞由来成分を破壊および可溶化する工程を含み、
　前記工程（ａ）におけるポリヒドロキシアルカノエートの体積メジアン径が、０．５～５．０μｍである、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の製造方法。
＜５＞さらに、前記工程（ａ）の後、（ｂ）遠心分離によりポリヒドロキシアルカノエート水性懸濁液を回収する工程を含む、＜４＞に記載の製造方法。
＜６＞前記ろ過工程で得られたポリヒドロキシアルカノエートを２０～８０℃で乾燥させる工程を含む、＜１＞～＜５＞のいずれかに記載の製造方法。
＜７＞前記乾燥させたポリヒドロキシアルカノエートを水系溶媒に再分散させて、体積メジアン径が０．５～５．０μｍであるポリヒドロキシアルカノエートを含むポリヒドロキシアルカノエート水性懸濁液を得る工程を含む、＜６＞に記載の製造方法。
＜８＞さらに、前記ろ過工程の前に、（ｃ）ポリヒドロキシアルカノエート水性懸濁液の温度が、６０～１２０℃となるように加熱処理する工程を含む、＜１＞～＜７＞のいずれかに記載の製造方法。
＜９＞さらに、ろ過時のポリヒドロキシアルカノエート水性懸濁液の温度が、前記加熱処理工程後のポリヒドロキシアルカノエート水性懸濁液の温度より、５℃以上低い温度である、＜８＞に記載の製造方法。
＜１０＞前記工程（ｂ）で得たポリヒドロキシアルカノエート水性懸濁液をｐＨ２．５～５．５に調製する工程を含む、＜５＞に記載の製造方法。
＜１１＞Ｆｅｒｅｔ径が１～１００ｍｍであり、かつ、含水率が２５．０～５０．０％（Ｗ．Ｂ．）である、ポリヒドロキシアルカノエート凝集塊。
　以下、本発明を実施例に基づいてより詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお、実施例において、「ＰＨＡ」としては「Ｐ３ＨＢ３ＨＨ」を使用しており、実施例中の記載「ＰＨＡ」は、「Ｐ３ＨＢ３ＨＨ」と読み替えることもできる。
　〔測定方法〕
　実施例および比較例における測定を、以下の方法で行った。
　（通気量）
　通気量はＪＩＳＬ１０９６に記載の方法で測定した。具体的には、フラジール型通気性試験機（パーミヤメーターＰ２　東洋精機製作所株式会社製）を用いて、傾斜型気圧計が１２５Ｐａを示すように、空気の吸い込み量を調節し、そのときの空気流量を測定した。
　（ＰＨＡ表面付着タンパク質量）
　ＰＨＡ表面付着タンパク質量は、ＢＣＡ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて測定した。具体的には、工程（ｃ’）直前のＰＨＡ水性懸濁液を２０～５０ｍｇ（液中に約１０ｍｇのＰ３ＨＢ３ＨＨ粒子を含有する量）を１５ｍＬのファルコンチューブに投入し、前記キットの試薬２ｍＬを添加した後、６０℃で３０分間振とうした。振とう終了から３０分後に２５℃に冷却し、波長５６２ｎｍの吸光度を測定した。
　（固形分濃度）
　不活化後のＰＨＡを含む培養液およびｐＨ調整後のＰＨＡ水性懸濁液の固形分濃度を、加熱乾燥式水分計ＭＬ－５０（株式会社Ａ＆Ｄ製）を用いて測定した。前記培養液を１３０℃で加熱し、重量変化速度が０．０５％／分を下回るまで加熱し、加熱前後の重量変化から固形分濃度を割り出した。
　（液密度）
　ろ過工程直前のＰＨＡ水性懸濁液をろ過時温度まで加温し、予め重量を測定しておいた２０ｍＬプラスチックシリンジ（テルモ製）に２０ｍＬ分吸引した。次いで、プラスチックシリンジと２０ｍＬ分の水性懸濁の重量を測定し、２０ｍＬプラスチックシリンジの重量を差し引いた重量（ｇ）を、液体の体積（２０ｍＬ）で除することにより、ろ過時温度における液密度を計算した。
　（加熱処理温度）
　加熱処理温度は、ＰＨＡ水性懸濁液を撹拌翼などで流動状態にした状態で、熱源から最も離れたＰＨＡ水性懸濁液の温度を測定した。例えば、容器の外側から加熱する場合は容器の中心を測定し、蒸気を容器の中心に直接投入する場合は、容器壁面温度を測定した。温度の測定はＫ熱電対（ＡＤ５６０１Ａ　ＡＮＤ社製）で測定した。
　（ろ過時温度）
　ろ過時の温度は、Ｋ熱電対（ＡＤ５６０１Ａ　ＡＮＤ社製）を用いて、ＰＨＡ水性懸濁液をろ過器に投入する直前の温度を測定した。
　（工程（ｃ’）におけるＰＨＡ水性懸濁液のｐＨ）
　ｐＨ計（９６５２－１０Ｄ　ＨＯＲＩＢＡ製）を用いて測定した。ｐＨの測定位置は、ＰＨＡ水性懸濁液を撹拌翼などで流動状態にした状態で、酸の添加位置から最も離れたＰＨＡ水性懸濁液の位置にした。例えば、容器の壁面から酸を添加する場合は容器の中心のｐＨを測定した。
　（吸引ろ過のろ液透過速度）
　内径４７ｍｍのろ過器（ｋｓｔ－４７　Ａｄｖａｎｔｅｃ製）に濾布を置き、ろ過器の上蓋を取った状態で吸引鐘（２Ｌ　ＳＨＩＢＡＴＡ製）に取り付けた。吸引鐘内に、全てのろ液がメスシリンダー内に入るようにガラス製の５０ｍＬメスシリンダーを設置した。真空ポンプで－７６ｋＰａまで吸引しつつ、ＰＨＡ水性懸濁液をろ過器に投入することにより、ろ過を行った。ろ液の落ちる様子をビデオカメラで撮影した。ろ液が５ｍＬ排出されてから、ろ液が２５ｍＬ排出されるまでに要した時間（ｈｒ）と、ろ過器の断面積（ｍ２）とによって、差分（２５－５＝２０ｍＬ）のろ液の量（Ｌ）を除することにより、ろ液透過速度（Ｌ／ｍ２／ｈｒ）を算出した。本明細書における吸引ろ過時のろ過器の断面積は、直径４７ｍｍの円の面積として計算した。
　（加圧ろ過のろ液透過速度）
　ＰＨＡ水性懸濁液２．０ｋｇをダイアフラムポンプにて０．２ＭＰａになるように送液し、ろ過面積０．０５ｍ２の加圧ろ過機（ＹＴＯ型フィルタープレス機、薮田機械製）にてろ過を行った。ろ液が１００ｍＬ排出された時間から、１０００ｍＬ排出された時間までに要した時間から、ろ液透過速度（Ｌ／ｍ２／ｈｒ）を計算した。
　（漏洩率）
　ろ過工程により得られた、ろ液の重量を測定した。ろ液の吸光度を分光光度計（Ｊａｓｃｏ　Ｖ－７７０　日本分光製）を用いて測定し、波長６００ｎｍの吸光度を測定した。固形分濃度が既知であるＰＨＡ水性懸濁液から作成した検量線を用いることにより、ろ液中のＰＨＡ濃度を算出した。ろ液中のＰＨＡ濃度とろ液重量（ｇ）から固形分重量（ｇ）を、ろ過工程前のＰＨＡ水性懸濁液の固形分重量（ｇ）で除することにより、漏洩率（％）を算出した。
　（ＰＨＡ凝集塊の含水率）
　ろ過後に得られるＰＨＡ凝集塊を、加熱乾燥式水分計ＭＬ－５０（株式会社Ａ＆Ｄ製）を用いて測定した。ＰＨＡ凝集塊を１０５℃で加熱し、重量変化速度が０．０５％（Ｗ．Ｂ．）／分を下回るまで加熱し、加熱前後の重量変化からＰＨＡ凝集塊の含水率を割り出した。
　（体積メジアン径）
　ＰＨＡの体積メジアン径は、ＨＯＲＩＢＡ製レーザ回折／散乱式粒子径分布測定装置ＬＡ－９５０を用いて測定した。
　（Ｆｅｒｅｔ径）
　ＰＨＡ凝集塊１０個の画像（図１）を取り、ＩｍａｇｅＪ（ｖｅｒ１．５０）で解析し、１０個のＰＨＡ凝集塊に対して、個別Ｆｅｒｅｔ径を出し、１０個の個別Ｆｅｒｅｔ径の単純平均をＦｅｒｅｔ径とした。
　〔実施例１〕
　（菌体培養液の調製）
　国際公開第ＷＯ２０１９／１４２７１７号に記載のラルストニア・ユートロファを、同文献の段落〔００４１〕～〔００４８〕に記載の方法で培養し、ＰＨＡを含有する菌体を含む菌体培養液を得た。なお、ラルストニア・ユートロファは、現在では、カプリアビダス・ネカトールに分類されている。
　（不活化）
　前記で得られた菌体培養液を、内温６０～７０℃で７時間加熱および攪拌処理することにより滅菌処理を行い、不活化培養液を得た。
　（粘度低下処理）
　前記で得られた不活化培養液に対して、１重量％となるように、３５重量％過酸化水素（富士フイルム和光純薬製）を添加した。次いで、３０％水酸化ナトリウム水溶液を添加して、ｐＨを１１．０に調整した。溶液を６０℃で維持しつつ、３０％水酸化ナトリウム水溶液を添加し続けることにより、ｐＨを１１．０で１８０分間維持し、ＰＨＡ水性懸濁液を得た。
　（酵素処理）
　前記で得られたＰＨＡ水性懸濁液に対し、９５％硫酸を添加してｐＨを７．０±０．２に調整した。硫酸を添加したＰＨＡ水性懸濁液の固形分濃度を測定したところ、３０重量％であった。硫酸添加後、細胞壁中の糖鎖（ペプチドグリカン）を分解する酵素であるリゾチーム（富士フイルム和光純薬製）を、液中濃度が１０ｐｐｍとなるように添加して、５０℃で２時間保持した。その後、タンパク質分解酵素であるアルカラーゼ２．５Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）を、液中濃度が３００ｐｐｍとなるように添加し、次いで、５０℃で３０％水酸化ナトリウムを添加して、ｐＨ８．５に調整しながら２時間維持した。
　（アルカリ処理）
　前記酵素処理液に対して、０．３重量％になるようにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、花王製）を添加した。その後、水酸化ナトリウム水溶液を用いて、ｐＨが１１．０±０．２となるように調整した。次いで、前記酵素処理液を遠心分離（４０００Ｇ、１０分間）した後、上清を除去して２倍濃縮したＰＨＡ水性懸濁液を得た。前記濃縮ＰＨＡ水性懸濁液に、除去した上清と同量の水酸化ナトリウムを添加して再度遠心分離（４０００Ｇ、１０分間）して、上清を除去することを４回繰り返した。得られたＰＨＡ水性懸濁液中のＰＨＡ表面付着タンパク質量は、１０００ｐｐｍであった。ＰＨＡの体積メジアン径は、２．２μｍであった。
　（ｐＨ調整）
　前記で得られたＰＨＡ水性懸濁液中の固形分濃度を２５重量％に調整し、６０℃で保持した。次いで、１０％硫酸を添加してｐＨを３．０に調整した。液密度は１．００ｇ／ｍＬであった。
　（ろ過）
　前記ＰＨＡ水性懸濁液を６３℃のウォーターバスに入れ、液温が６０℃になるように加温し、吸引ろ過を行った。通気量０．５ｃｃ／ｃｍ２／ｓｅｃの濾布（Ｔ７１０４Ｃ　薮田機械製）を使用したところ、ろ液透過速度は１０１０Ｌ／ｍ２／ｈｒを示し、粒子漏洩率は０．２％であった。得られたＰＨＡ凝集塊の含水率は４０．３％（Ｗ．Ｂ．）であった。また、ＰＨＡ凝集塊のＦｅｒｅｔ径は、１８ｍｍであった。
　〔実施例２〕
　酵素処理においてタンパク質分解酵素であるアルカラーゼ２．５Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）を、液中濃度が２００ｐｐｍとなるように添加した以外は、実施例１と同じ手法により、ｐＨ３．０のＰＨＡ水性懸濁液を得た。ＰＨＡ表面付着タンパク質量は、１５００ｐｐｍで、液密度は０．９５ｇ／ｍＬであった。ＰＨＡの体積メジアン径は、２．３μｍであった。実施例１と同じ手法でろ過を実施したところ、ろ液透過速度は５８０Ｌ／ｍ２／ｈｒを示し、漏洩率は１．０％であった。得られたＰＨＡ凝集塊の含水率は３８．９％（Ｗ．Ｂ．）であった。また、ＰＨＡ凝集塊のＦｅｒｅｔ径は、２５ｍｍであった。
　〔比較例１〕
　酵素処理においてタンパク質分解酵素であるアルカラーゼ２．５Ｌ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅ社製）を、液中濃度が１００ｐｐｍとなるように添加した以外は、実施例１と同じ手法により、ｐＨ３．０のＰＨＡ水性懸濁液を得た。ＰＨＡ表面付着タンパク質量は、２５００ｐｐｍで、液密度は０．９５ｇ／ｍＬであった。ＰＨＡの体積メジアン径は、２．５μｍであった。実施例１と同じ手法でろ過を実施したところ、ろ液透過速度は２５００Ｌ／ｍ２／ｈｒを示し、漏洩率は１０．２％であった。得られたＰＨＡ凝集塊の含水率は４０．８％（Ｗ．Ｂ．）であった。また、ＰＨＡ凝集塊のＦｅｒｅｔ径は、３８ｍｍであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　表１より、ＰＨＡ表面付着タンパク質量が高いほど粒子漏洩率が高いことがわかった。
　〔実施例３〕
　ｐＨ調整工程でｐＨを３．０に調整した後で、ＰＨＡ水性懸濁液を容器に入れ、空気を含有させるように手振動を行った以外は、実施例１と同じ手法により、ｐＨ３．０のＰＨＡ水性懸濁液を得た。ＰＨＡ表面付着タンパク質量は１０００ｐｐｍで、液密度は０．７ｇ／ｍＬであった。ＰＨＡの体積メジアン径は、２．２μｍであった。実施例１と同じ手法でろ過を実施したところ、ろ液透過速度は４５０Ｌ／ｍ２／ｈｒを示し、漏洩率は０．２％であった。得られたＰＨＡ凝集塊の含水率は３６．８％（Ｗ．Ｂ．）であった。また、ＰＨＡ凝集塊のＦｅｒｅｔ径は、２５ｍｍであった。
　〔比較例２〕
　ｐＨ調整工程で強攪拌を実施し、液密度を０．４０ｇ／ｍＬとした以外は、実施例１と同じ手法により、ろ過を実施した。ろ液透過速度は１５０Ｌ／ｍ２／ｈｒを示し、漏洩率は３．２％であった。得られたＰＨＡ凝集塊の含水率は３５．４％（Ｗ．Ｂ．）であった。また、ＰＨＡ凝集塊のＦｅｒｅｔ径は、３４ｍｍであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 　表２より、液密度が高いほど、ろ液透過速度は上昇するが、含水率は高いことがわかった。
　〔比較例３〕
　ｐＨ調整工程でｐＨを６．０に調整した以外は、実施例１と同じ手法により、ろ過を実施した。ろ過透過速度は１１８００Ｌ／ｍ２／ｈを示し、漏洩率は９９％であり、ＰＨＡ凝集塊は得られなかった。
　〔比較例４〕
　ｐＨ調整工程でｐＨを２．０に調整した以外は、実施例１と同じ手法により、ろ過を実施した。ろ液透過速度は９８００Ｌ／ｍ２／ｈｒを示し、漏洩率は９５％であり、ＰＨＡ凝集塊は得られなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 　表３より、ｐＨにより漏洩率が変化し、ｐＨが低い方がＰＨＡ凝集塊回収に適していることがわかった。
　〔実施例４〕
　ろ過工程において、通気量２．０ｃｃ／ｃｍ２／ｓｅｃの濾布（Ｔ７３０２Ｃ　薮田機械製）を使用した以外は、実施例１と同じ手法により、ｐＨ３．０のＰＨＡ水性懸濁液を得た。ＰＨＡ表面付着タンパク質量は１０００ｐｐｍであり、液密度は１．００ｇ／ｍＬであった。ＰＨＡの体積メジアン径は、２．２μｍであった。実施例１と同じ手法により、ろ過を実施したところ、ろ過透過速度は１２１０Ｌ／ｍ２／ｈｒを示し、漏洩率は０．２％であった。得られたＰＨＡ凝集塊の含水率は４２．３％（Ｗ．Ｂ．）であった。また、ＰＨＡ凝集塊のＦｅｒｅｔ径は、１７ｍｍであった。
　〔比較例５〕
　ろ過時に通気量１２．０ｃｃ／ｃｍ２／ｓｅｃの濾布（ＰＰ２６Ｆ　中尾フィルター製）を用いた以外は、実施例１と同じ手法により、ろ過を実施した。ろ過透過速度は９４４０Ｌ／ｍ２／ｈを示し、漏洩率は７３．０％であった。得られたＰＨＡ凝集塊の含水率は４７．０％（Ｗ．Ｂ．）であった。また、ＰＨＡ凝集塊のＦｅｒｅｔ径は、１１ｍｍであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 　表４より、通気量の高いろ材を用いると、ろ液透過速度は上昇するが、漏洩率も上昇することがわかった。
　〔実施例５〕
　ろ過工程において７８℃のウォーターバスで内温が７５℃になるまで加温した以外は、実施例１と同じ手法により、ｐＨ３．０のＰＨＡ水性懸濁液を得た。ＰＨＡ表面付着タンパク質量は１０００ｐｐｍであり、液密度は１．００ｇ／ｍＬであった。ＰＨＡの体積メジアン径は、２．２μｍであった。実施例１と同じ手法によりろ過を実施したところ、ろ液透過速度は１５８０Ｌ／ｍ２／ｈｒを示し、漏洩率は０．３％であった。得られたＰＨＡ凝集塊の含水率は４２．５％（Ｗ．Ｂ．）であった。また、ＰＨＡ凝集塊のＦｅｒｅｔ径は、１８ｍｍであった。
　〔実施例６〕
　ろ過工程において２８℃のウォーターバスで内温が２５℃になるまで冷却した以外は、実施例１と同じ手法により、ｐＨ３．０のＰＨＡ水性懸濁液を得た。ＰＨＡ表面付着タンパク質量は１０００ｐｐｍであり、液密度は１．００ｇ／ｍＬであった。ＰＨＡの体積メジアン径は、２．２μｍであった。実施例１と同じ手法により、ろ過を実施したところ、ろ液透過速度は４５０Ｌ／ｍ２／ｈｒを示し、漏洩率は０．１％であった。得られたＰＨＡ凝集塊の含水率は４４．８％（Ｗ．Ｂ．）であった。また、ＰＨＡ凝集塊のＦｅｒｅｔ径は、２６ｍｍであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　表５より、ＰＨＡ水性懸濁液の温度がろ液透過速度に影響を及ぼすことがわかり、温度が高いほど、ろ液透過速度が上昇した。
　〔実施例７〕
　ろ過工程の前に、ｐＨ調整工程後の液を１２５℃のオイルバスで内温が７５℃になるまで加温し、その後、６３℃のウォーターバスで内温が６０℃になるまで冷却した以外は、実施例１と同じ手法により、ｐＨ３．０のＰＨＡ水性懸濁液を得た。ＰＨＡ表面付着タンパク質量は１０００ｐｐｍであり、液密度は１．００ｇ／ｍＬであった。ＰＨＡの体積メジアン径は、２．２μｍであった。実施例１と同じ手法によりろ過を実施したところ、ろ液透過速度は１２２０Ｌ／ｍ２／ｈｒを示し、漏洩率は０．２％であった。得られたＰＨＡ凝集塊の含水率は４２．２％（Ｗ．Ｂ．）であった。また、ＰＨＡ凝集塊のＦｅｒｅｔ径は、２８ｍｍであった。
　〔実施例８〕
　ろ過工程の前にｐＨ調整後の液を１２５℃のオイルバスで内温が９０℃になるまで加温し、その後、６３℃のウォーターバスで内温が６０℃になるまで冷却した以外は、実施例１と同じ手法により、ｐＨ３．０のＰＨＡ水性懸濁液を得た。ＰＨＡ表面付着タンパク質量は１０００ｐｐｍであり、液密度は１．００ｇ／ｍＬであった。ＰＨＡの体積メジアン径は、２．２μｍであった。実施例１と同じ手法によりろ過を実施したところ、ろ液透過速度は１３２０Ｌ／ｍ２／ｈｒを示し、漏洩率は０．１％であった。得られたＰＨＡ凝集塊の含水率は４４．０％（Ｗ．Ｂ．）であった。また、ＰＨＡ凝集塊のＦｅｒｅｔ径は、２１ｍｍであった。
　〔実施例９〕
　ｐＨ調整工程において、ＰＨＡ水性懸濁液中の固形分濃度を２８重量％に調整し、ろ過工程の前にｐＨ調整後の液を耐圧釜に入れ、０．３ＭＰａＧの蒸気を投入し、液温が１１０℃になるまで昇温し、その後、６３℃のウォーターバスで内温が６０℃になるまで冷却し、ＰＨＡ水性懸濁液中の濃度が２５重量％になるように蒸留水を添加した以外は、実施例１と同じ手法により、ｐＨ３．０のＰＨＡ水性懸濁液を得た。ＰＨＡ表面付着タンパク質量は、１０００ｐｐｍであり、液密度は１．００ｇ／ｍＬであった。ＰＨＡの体積メジアン径は、２．２μｍであった。実施例１と同じ手法により、ろ過を実施したところ、ろ液透過速度は２８４０Ｌ／ｍ２／ｈｒを示し、漏洩率は０．０％であった。得られたＰＨＡ凝集塊の含水率は４４．９％（Ｗ．Ｂ．）であった。また、ＰＨＡ凝集塊のＦｅｒｅｔ径は、１５ｍｍであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 　表６より、ＰＨＡ水性懸濁液を一旦高温に加熱するとろ液透過速度が上昇し、その速度は加熱温度が高いほど上昇することがわかった。
　〔実施例１０〕
　ｐＨ調整工程までは実施例１と同じ操作を行った。通気量０．５ｃｃ／ｃｍ２／秒の濾布（Ｔ７１０４Ｃ　薮田機械製）を使用し、加圧ろ過機（ＹＴＯ型フィルタープレス機、薮田機械製）によって加圧ろ過をおこなった。前述した方法により、ろ液透過速度を計算すると、１５００Ｌ／ｍ２／ｈｒであった。更に、０．５ＭＰａ圧力で圧搾脱水を行うと、得られたＰＨＡ凝集塊の含水率は３１．９％（Ｗ．Ｂ．）であった。得られた全てのろ液の、漏洩率は２．６％であった。ろ過方式によらず、ろ過を実施することができた。また、ＰＨＡ凝集塊のＦｅｒｅｔ径は、２０ｍｍであった。
　〔実施例１１〕 
　（乾燥）
　実施例１で得られたＰＨＡ凝集塊を乾燥機（ＥＹＥＬＡ製、ＷＦＯ－７００）に入れ、６０℃で２４時間乾燥させた。乾燥させたＰＨＡ凝集塊を水に再分散させ、固形分濃度を１５重量％に調整した。１％ＮａＯＨ水溶液および１％Ｈ２ＳＯ４水溶液を用いてｐＨを７～９の間に調整し、攪拌を行い、ＰＨＡ水性懸濁液を作製した。３０分攪拌後にＰＨＡ水性懸濁液中のＰＨＡ粒子の粒子径を測定すると、体積メジアン径は２．８μｍであった。
　〔まとめ〕
　以上より、本製造方法によると、ＰＨＡ表面付着タンパク質量、液密度、ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨ、ろ材の通気量、およびＰＨＡ水性懸濁液の温度が、ろ過時のろ液透過速度および漏洩率に影響を及ぼすことがわかった。すなわち、少なくとも、ＰＨＡ表面付着タンパク質量、液密度、ＰＨＡ水性懸濁液のｐＨ、およびろ材の通気量を制御することにより、ＰＨＡが効率的にろ過可能となることがわかった。また、本製造方法によれば、ろ過方法によらず、ＰＨＡのろ過が可能であることが明らかとなった。
　本製造方法は、簡便な操作でＰＨＡを製造することができることから、ＰＨＡの製造において有利に使用できる。また、本製造方法により得られたＰＨＡは、農業、漁業、林業、園芸、医学、衛生品、衣料、非衣料、包装、自動車、建材、その他の分野に好適に利用することができる。

 

Claims (11)

  1. 　ｐＨ２．５～５．５のポリヒドロキシアルカノエート水性懸濁液を、通気量が０．０１～５．０ｃｃ／ｃｍ２／ｓｅｃであるろ材を用いてデッドエンドろ過する工程を含み、
    　前記ポリヒドロキシアルカノエート水性懸濁液中のポリヒドロキシアルカノエート表面付着タンパク質量が、２０００ｐｐｍ以下であり、
    　前記ろ過工程におけるポリヒドロキシアルカノエート水性懸濁液の液密度が、０．５０～１．０８ｇ／ｍＬである、ポリヒドロキシアルカノエートの製造方法。
  2. 　前記ろ過工程において、ろ液透過速度が２００Ｌ／ｍ２／ｈｒ以上であり、かつ、漏洩率が５％以下である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記ろ過工程におけるポリヒドロキシアルカノエート水性懸濁液の温度が、２０～９５℃である、請求項１または２に記載の製造方法。
  4. 　さらに、（ａ）ポリヒドロキシアルカノエートを含む菌体のポリヒドロキシアルカノエート以外の細胞由来成分を破壊および可溶化する工程を含み、
    　前記工程（ａ）におけるポリヒドロキシアルカノエートの体積メジアン径が、０．５～５．０μｍである、請求項１または２に記載の製造方法。
  5. 　さらに、前記工程（ａ）の後、（ｂ）遠心分離によりポリヒドロキシアルカノエート水性懸濁液を回収する工程を含む、請求項４に記載の製造方法。
  6. 　前記ろ過工程で得られたポリヒドロキシアルカノエートを２０～８０℃で乾燥させる工程を含む、請求項１または２に記載の製造方法。
  7. 　前記乾燥させたポリヒドロキシアルカノエートを水系溶媒に再分散させて、体積メジアン径が０．５～５．０μｍであるポリヒドロキシアルカノエートを含むポリヒドロキシアルカノエート水性懸濁液を得る工程を含む、請求項６に記載の製造方法。
  8. 　さらに、前記ろ過工程の前に、（ｃ）ポリヒドロキシアルカノエート水性懸濁液の温度が、６０～１２０℃となるように加熱処理する工程を含む、請求項１または２に記載の製造方法。
  9. 　さらに、ろ過時のポリヒドロキシアルカノエート水性懸濁液の温度が、前記加熱処理工程後のポリヒドロキシアルカノエート水性懸濁液の温度より、５℃以上低い温度である、請求項８に記載の製造方法。
  10. 　前記工程（ｂ）で得たポリヒドロキシアルカノエート水性懸濁液をｐＨ２．５～５．５に調製する工程を含む、請求項５に記載の製造方法。
  11. 　Ｆｅｒｅｔ径が１～１００ｍｍであり、かつ、含水率が２５．０～５０．０％（Ｗ．Ｂ．）である、ポリヒドロキシアルカノエート凝集塊。

     
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