WO2021059762A1 - ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法 - Google Patents

ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法 Download PDF

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WO2021059762A1
WO2021059762A1 PCT/JP2020/029960 JP2020029960W WO2021059762A1 WO 2021059762 A1 WO2021059762 A1 WO 2021059762A1 JP 2020029960 W JP2020029960 W JP 2020029960W WO 2021059762 A1 WO2021059762 A1 WO 2021059762A1
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pha
heat treatment
cells
particles
particle size
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PCT/JP2020/029960
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尚志 有川
俊輔 佐藤
佳弘 毛利
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株式会社カネカ
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters
    • C12P7/625—Polyesters of hydroxy carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing polyhydroxyalkanoic acid by culturing a polyhydroxyalkanoic acid-producing microorganism.
  • microorganisms The significance and importance of substance production using microorganisms (fermentation production, bioconversion, etc.) is increasing against the background of environmental problems, food problems, heightened awareness of health and safety, and growing nature or nature orientation.
  • Material production by microorganisms is also applied to the production of protein drugs and nucleic acids for gene therapy. For example, the production of ethanol, acetic acid, and medical proteins using microorganisms such as yeast and bacteria is actively applied industrially.
  • PHA polyhydroxyalkanoic acid
  • bacterial cells microbial species
  • PHA is a thermoplastic polyester produced and accumulated as an energy storage substance in cells of many microbial species (hereinafter, also referred to as bacterial cells), and has biodegradability.
  • non-petroleum-derived plastics are attracting attention due to heightened environmental awareness, and in particular, PHA, which is produced and accumulated in cells by microorganisms, is taken up by the carbon cycle process in the natural world, which has an adverse effect on the ecosystem. It is expected to be small, and its practical application is eagerly desired.
  • Non-Patent Document 2 In PHA production using microorganisms, for example, it is known that PHA is produced by giving sugar, vegetable oil or fatty acid as a carbon source to a bacterium of the genus Cupriavidus and accumulating PHA in cells (Non-Patent Document 2). And 3).
  • Non-Patent Document 4 reports that by disrupting the gene phaP1 encoding a facin protein in Cupriavidus bacteria, PHA having a larger particle size than in the non-destructive case was accumulated. However, the phaP1 disrupted strain has been shown to significantly reduce the amount of PHA accumulated, and was not suitable for industrial production.
  • Non-Patent Document 5 describes that PHA inside cells aggregates by applying stress such as temperature and pH to cells that have accumulated PHA.
  • stress such as temperature and pH
  • PHA particles are observed to be attached to each other in the cell, and it is not possible to read up to the change in the average particle size of the PHA particles.
  • the effect of PHA particles on the average particle size is considered to be limited.
  • PHA is accumulated in the form of particles in microbial cells.
  • the separation and recovery method can be roughly divided into an organic solvent-based method and an aqueous-based method.
  • the aqueous-based method is industrially preferable.
  • PHA particles can be separated from a cell disruption solution containing PHA particles by a centrifuge, a separation membrane, or the like.
  • the efficiency of separation and recovery will depend on the size of the PHA particles. That is, the larger the PHA particles before the separation step, the easier it is to separate and recover using a centrifuge, a separation membrane, or the like, leading to a reduction in production costs.
  • an object of the present invention is to provide a method for agglutinating PHA particles in a microbial cell to obtain PHA particles having a large average particle size.
  • the present inventors obtained cells having an average cell diameter of 2 ⁇ m or more in which PHA particles were accumulated by culturing PHA-producing microorganisms, and heat-treated the cells to obtain the above-mentioned bacteria.
  • PHA particles having an average particle size of 1.8 ⁇ m or more are formed in the body, leading to the present invention.
  • the present invention is a step of culturing a polyhydroxyalkanoic acid-producing microorganism to obtain a cell having an average cell diameter of 2 ⁇ m or more in which polyhydroxyalkanoic acid particles are accumulated.
  • the present invention relates to a method for producing polyhydroxyalkanoic acid, which comprises a step of heat-treating at a temperature to bring the average particle size of polyhydroxyalkanoic acid particles to 1.8 ⁇ m or more and the average cell size or less in the cells.
  • the ratio of the average particle size of the polyhydroxyalkanoic acid particles after the heat treatment to the average particle size of the polyhydroxyalkanoic acid particles before the heat treatment is 1.1 or more.
  • the ratio of the weight of polyhydroxyalkanoic acid to the dry weight of the cells after culturing is 80% or more.
  • the proportion of the polyhydroxyalkanoic acid particles having a particle diameter of 1 ⁇ m or less is 2.0% by volume or less.
  • the average cell diameter of the cells accumulating the polyhydroxyalkanoic acid particles is 2.2 ⁇ m or more.
  • the heat treatment is carried out at a temperature of 40 to 100 ° C. for 5 minutes or longer.
  • the heat treatment is carried out under the condition of pH 7.0 or higher.
  • the heat treatment is carried out on the culture solution containing the cells after the culture.
  • the production method further comprises a step of crushing the cells after the heat treatment to obtain a cell crushed solution, and a step of separating polyhydroxyalkanoic acid particles from the aqueous phase of the cell crushed solution.
  • the polyhydroxyalkanoic acid is a copolymer of two or more kinds of hydroxyalkanoic acid, more preferably a copolymer containing 3-hydroxyhexanoic acid as a monomer unit, and further preferably 3 -A copolymer of hydroxybutyric acid and 3-hydroxyhexanoic acid.
  • the polyhydroxyalkanoic acid-producing microorganism belongs to the genus Cupriavidus, and more preferably, the polyhydroxyalkanoic acid-producing microorganism is a transformed microorganism of Cupriavidus necator.
  • PHA particles having a large average particle size can be formed in microbial cells before the cells are crushed, so that the PHA particles entrain contaminants such as cell components fragmented by crushing. It is possible to avoid agglomeration. Further, since the PHA particles having a large average particle size can be efficiently separated and recovered from the cell components, the production cost can be reduced.
  • Photomicrograph of cells after culturing in Example 1 and before heat treatment (left side) or after heat treatment (right side) Photomicrograph of cells after culturing in Example 2 and before heat treatment (left side) or after heat treatment (right side)
  • a step of culturing a PHA-producing microorganism to obtain a cell having an average cell diameter of 2 ⁇ m or more in which PHA particles are accumulated and a heat treatment of the cell have an average particle size of 1 in the cell. Includes the step of forming PHA particles of .8 ⁇ m or larger.
  • the average particle size in the present application means the volume average particle size.
  • the PHA-producing microorganism is not particularly limited as long as it has a PHA-accumulating ability and the average cell diameter after PHA accumulation can be 2 ⁇ m or more.
  • the average cell diameter of the microorganism does not have to be 2 ⁇ m or more at all times during culturing, and may be 2 ⁇ m or more at the stage where PHA is accumulated before the microorganism is subjected to the heat treatment step. If the average cell diameter after PHA accumulation is less than 2 ⁇ m, it becomes difficult to form PHA particles having an average particle size of 1.8 ⁇ m or more even if the heat treatment described later is performed.
  • the average cell diameter is more preferably 2.2 ⁇ m or more, further preferably 2.4 ⁇ m or more, further preferably 2.6 ⁇ m or more, and particularly preferably 2.8 ⁇ m or more.
  • the upper limit of the average cell diameter is not particularly limited, but may be, for example, 10 ⁇ m or less, or 5 ⁇ m or less.
  • the amount of PHA accumulated by the PHA-producing microorganisms is not particularly limited, but it is preferable that the ratio of the PHA weight to the dry weight of the cells is 80% or more at the stage where the PHA is accumulated before the heat treatment step. , 85% or more is more preferable.
  • the upper limit of the ratio is not particularly limited as long as it is less than 100%, but may be, for example, 98% or less, or 95% or less.
  • the PHA-producing bacterium is not particularly limited as long as it is a bacterium having a PHA synthase gene and accumulating PHA, and for example, Ralstonia, Cupriavidus, Watersia, Aeromonas, etc. Bacteria belonging to the genus, Escherichia, Alcaligenes, Pseudomonas and the like are preferred examples.
  • a bacterium belonging to the genus Larstonia the genus Cupriavidus, the genus Aeromonas, the genus Woutersia, still more preferably a bacterium belonging to the genus Capriavidus or the genus Aeromonas, and even more preferably the genus Cupriavidus. It is a bacterium belonging to the above, and particularly preferably Cupriavidus necator.
  • the PHA-producing microorganism may be a wild strain that originally accumulates PHA, a mutant strain obtained by artificially mutating such a wild strain, or a foreign strain obtained by a genetic engineering technique. By introducing the PHA synthase gene of the above, the strain may be endowed with PHA accumulating ability.
  • Examples of the PHA-producing microorganism include, but are not limited to, a minCD-expressing A2405-disrupted strain and an A1386 deletion-disrupted strain, which are transformants of cupriavidus necator, which will be described later.
  • the type of PHA produced by the PHA-producing microorganism is not particularly limited as long as it is a PHA that can be produced by the microorganism, but is a copolymer of one kind of monomer selected from 3-hydroxyalkanoic acid having 4 to 16 carbon atoms.
  • One monomer selected from 3-hydroxy alkanoic acid having 4 to 16 carbon atoms and other hydroxy alkanoic acid for example, 2-hydroxy alkanoic acid having 4 to 16 carbon atoms, 4-hydroxy alkanoic acid, 5-hydroxy A copolymer of alkanoic acid, 6-hydroxy alkanoic acid, etc.
  • a copolymer of two or more kinds of monomers selected from 3-hydroxy alkanoic acid having 4 to 16 carbon atoms are preferable.
  • P (3HB) which is a homopolymer of 3-hydroxybutyric acid (abbreviation: 3HB), and P (3HB-co-3HV), a copolymer of 3HB and 3-hydroxyvaleric acid (abbreviation: 3HV), 3HB and 3- Copolymer P (3HB-co-3HH) of hydroxyhexanoic acid (abbreviation: 3HH) (abbreviation: PHBH), copolymer P (3HB-co-4HB) of 3HB and 4-hydroxybutyric acid (abbreviation: 4HB),
  • Examples include, but are not limited to, PHA containing lactic acid (abbreviation: LA) as a constituent component, for example, a copolymer P (LA-co-3HB) of 3HB and LA.
  • PHBH is preferable from the viewpoint of having a wide range of applications as a polymer.
  • the type of PHA produced depends on the type of PHA synthase gene possessed or separately introduced by the microorganism to be used, the type of metabolic gene involved in the synthesis, the culture conditions, etc., depending on the purpose. It can be selected as appropriate.
  • PHA particles By culturing the PHA-producing microorganism, PHA particles can be accumulated in the cells.
  • a conventional microbial culturing method can be followed, and culturing may be performed in a medium in which an appropriate carbon source is present.
  • the medium composition, carbon source addition method, culture scale, aeration and stirring conditions, culture temperature, culture time, etc. are not particularly limited, but considering the accumulation of a sufficient amount of PHA, the carbon source is continuously or intermittently used.
  • the culture method of adding to the medium is preferable.
  • any carbon source can be used as long as the PHA-producing microorganism can be assimilated.
  • sugars such as glucose, fructose, and shoe cloth
  • palm oil and palm kernel oil including palm olein, palm double olein, palm kernel oil olein, etc., which are fractionated low melting point fractions
  • Oils and fats such as coconut oil, palm oil, olive oil, soybean oil, rapeseed oil, yatrofa oil and their fractionated oils, or refined by-products thereof
  • fatty acids such as lauric acid, oleic acid, stearic acid, palmitic acid, myrinstinic acid and them.
  • the PHA-producing microorganism can use gases such as carbon dioxide, carbon monoxide, methane, methanol, and ethanol and alcohols, these can also be used as a carbon source.
  • a medium containing the carbon source a nitrogen source which is a nutrient source other than the carbon source, inorganic salts, and other organic nutrient sources.
  • the nitrogen source include, but are not limited to, ammonia; ammonium salts such as ammonium chloride, ammonium sulfate and ammonium phosphate; peptone, meat extract, yeast extract and the like.
  • the inorganic salts include potassium dihydrogen phosphate, disodium hydrogen phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride and the like.
  • examples of other organic nutrient sources include amino acids such as glycine, alanine, serine, threonine and proline, and vitamins such as vitamin B1, vitamin B12 and vitamin C.
  • Heat treatment By heat-treating a microbial cell having an average cell size of 2 ⁇ m or more in which PHA particles are accumulated at a temperature higher than the temperature at which the microbial cell is cultured, the average particle size of the PHA particle can be increased in the microbial cell. it can.
  • the heat treatment may be performed before crushing the microbial cells, may be performed on a culture solution containing cells after culturing PHA-producing microorganisms, or the cells may be recovered from the culture solution. Then, it may be carried out for a suspension resuspended in water, a buffer solution or the like. Since it can be easily carried out, it is preferable to heat-treat the culture solution after culturing.
  • the conditions of the heat treatment are not particularly limited as long as the average particle size of the PHA particles can be 1.8 ⁇ m or more in the cells, but it is desirable that the cytoskeleton is destroyed and the PHA does not leak out of the cells. ..
  • the temperature of the heat treatment is higher than the temperature at the time of culturing the microbial cells, preferably 40 ° C. or higher, more preferably 50 ° C. or higher, further preferably 60 ° C. or higher, and 70 ° C. or higher. Is even more preferable.
  • the upper limit of the heat treatment temperature is not particularly limited, but may be, for example, 100 ° C. or lower, preferably 90 ° C. or lower.
  • the heat treatment time is preferably 5 minutes or longer, more preferably 30 minutes or longer, further preferably 180 minutes or longer, and even more preferably 360 minutes or longer.
  • the upper limit of the heat treatment temperature is not particularly limited, but may be, for example, one day or less, preferably 720 minutes or less.
  • the pH indicated by the solution containing the cells is not particularly limited and may be less than 7.0. , 7.0 or more. However, since the average particle size of the PHA particles becomes larger due to the heat treatment, 7.0 or more is preferable, 7.5 or more is more preferable, 8.0 or more is further preferable, and 8.5 or more is even more preferable.
  • the pH may be in a range in which the cells are not crushed, and the upper limit thereof is not particularly limited, but may be, for example, 12 or less, preferably 11 or less.
  • the pH can be controlled by adding an appropriate amount of acid, alkali or the like to the liquid containing the cells.
  • the average particle size of PHA particles in the cells after the heat treatment is not particularly limited as long as it is 1.8 ⁇ m or more and equal to or less than the average cell size.
  • the average particle size is preferably 1.9 ⁇ m or more, more preferably 2.0 ⁇ m or more, and even more preferably 2.1 ⁇ m or more.
  • the heat treatment increases the average particle size of PHA particles in the cells.
  • the ratio of the average particle size of the PHA particles in the cells after the heat treatment to the average particle size of the PHA particles in the cells before the heat treatment Is a value exceeding 1.0, preferably 1.1 or more, more preferably 1.2 or more, further preferably 1.3 or more, even more preferably 1.4 or more, and most preferably 1.5 or more.
  • the ratio of the PHA particles having a small particle size to the whole PHA particles becomes a small value.
  • the ratio of PHA particles having a particle diameter of 1 ⁇ m or less to the entire PHA particles is preferably 2.5% by volume or less. It is more preferably 0% by volume or less, further preferably 1.5% by volume or less, further preferably 1.0% by volume or less, and particularly preferably 0.5% by volume or less. ..
  • the average cell diameter of the cells accumulating PHA particles is as large as 2 ⁇ m or more, but in the cells having such a large cell diameter, the proportion of PHA particles having a small particle size increases before the heat treatment.
  • the heat treatment can be performed as described above. It can be reduced to a small value such as.
  • the proportion of PHA particles having a small particle size is reduced, it is possible to obtain an advantage that the PHA particles can be efficiently separated and recovered from the cell components.
  • the method for crushing the cells is not particularly limited, and a known method can be applied. For example, by applying a mechanical shearing force or crushing the cells using a surfactant, an alkali, an enzyme, or the like. , A cell crushed solution in which cell components other than PHA are dissolved in water can be obtained.
  • the method for separating and recovering PHA is not particularly limited, and a known method can be applied.
  • PHA particles are separated from the aqueous phase by filtration or centrifugation of the cell disruption solution, and then dried to obtain PHA.
  • PHA particles having a large average particle diameter produced by the present embodiment are preferable because they can be efficiently separated and recovered by such an aqueous system.
  • the overall genetic manipulation can be performed as described in, for example, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).
  • enzymes used for genetic manipulation, cloning hosts, etc. can be purchased from market suppliers and used according to the explanation.
  • the enzyme is not particularly limited as long as it can be used for genetic manipulation.
  • a plasmid for gene deletion was prepared. The production was carried out as follows. By PCR using synthetic oligo DNA, DNA fragments (SEQ ID NO: 1) having base sequences upstream and downstream from the A2405 structural gene were obtained. This DNA fragment was digested with the limiting enzyme SwaI, and the obtained DNA fragment was digested with SwaI using the vector pNS2X-sacB and DNA ligase (Ligation High (manufactured by Toyo Spinning Co., Ltd.)) described in JP-A-2007-259708. By ligation, a gene deletion plasmid vector pNS2X-sacB + A2405UD having base sequences upstream and downstream from the A2405 structural gene was prepared.
  • an A2405 deletion disrupted strain was prepared as follows. Escherichia coli S17-1 strain (ATCC47055) was transformed with the gene deletion plasmid vector pNS2X-sacB + A2405UD, and the transformed microorganisms obtained thereby were mixed and cultured on KNK-005 strain and Nutrient Agar medium (manufactured by Difco). Joint transmission was performed.
  • the KNK-005 strain is a transformant in which a PHA synthase gene derived from Aeromonas cavier (a gene encoding a PHA synthase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2) is introduced on the chromosome of the Cupriavidus necator H16 strain. It can be produced according to the method described in US Pat. No. 7,384,766.
  • the obtained cultured cells were subjected to Simmons agar medium (sodium citrate 2 g / L, sodium chloride 5 g / L, magnesium sulfate 7 hydroxide 0.2 g / L, ammonium dihydrogen phosphate 1 g) containing 250 mg / L of canamycin.
  • / L, dipotassium hydrogen phosphate 1 g / L, agar 15 g / L, pH 6.8 was inoculated, and a strain that had grown on an agar medium was selected, and the plasmid was integrated onto the chromosome of the KNK-005 strain. Acquired the stock.
  • a plasmid vector for minCD gene expression pNS2X-sacB-PA-minCD
  • the production was carried out as follows.
  • a DNA fragment (SEQ ID NO: 3) having a promoter sequence, a minCD gene sequence, and a base sequence of an integration region on the genome was obtained.
  • This DNA fragment was digested with the restriction enzyme SwaI, and the obtained DNA fragment was digested with SwaI using the vector pNS2X-sacB and DNA ligase (Ligation High (manufactured by Toyo Boseki Co., Ltd.)) described in JP-A-2007-259708. It was ligated to prepare a plasmid vector pNS2X-PA-minCD for expressing the minCD gene.
  • the prepared plasmid vector for expressing the minCD gene, pNS2X-sacB-PA-minCD was introduced into the A2405 deletion disrupted strain by a method using the same conjugation transmission as described above. Furthermore, one strain in which the promoter sequence and the minCD gene sequence were inserted on the chromosome was isolated by the same culture as above and selection using Nutrient Agar medium containing 15% sucrose. The obtained strain was named a minCD-expressing A2405-disrupted strain.
  • a plasmid for gene deletion was prepared. The production was carried out as follows. By PCR using synthetic oligo DNA, DNA fragments (SEQ ID NO: 4) having base sequences upstream and downstream from the A1386 structural gene were obtained. This DNA fragment was digested with the restriction enzyme SwaI, and the obtained DNA fragment was digested with SwaI using the vector pNS2X-sacB and DNA ligase (Ligation High (manufactured by Toyo Boseki Co., Ltd.)) described in JP-A-2007-259708. By ligating, a plasmid vector pNS2X-sacB + A1386UD for gene deletion having base sequences upstream and downstream from the A1386 structural gene was prepared.
  • the plasmid vector pNS2X-sacB + A1386UD for deleting the A1386 gene was introduced into the KNK-005 strain by the same method as in Production Example 1. Furthermore, one strain lacking from the start codon to the stop codon of the A1386 structural gene on the chromosome was isolated by the same method as in Production Example 1. This A1386 gene deletion strain was named A1386 deletion disruption strain.
  • Tanehaha medium 1w / v% Meat-extract, 1w / v% Bacto-Tryptone, 0.2w / v% Yeast-extract, 0.9w / v% Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O, 0.15w / V% KH 2 PO 4 , (pH 6.8).
  • the composition of the preculture medium 1.1w / v% Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O, 0.19w / v% KH 2 PO 4, 1.29 w / v% (NH 4) 2 SO 4, 0.1w / v% MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 2.5w / v% palm olein oil, 0.5 v / v% trace metal salt solution (1.6 w in 0.1N HCl / v% FeCl 3 ⁇ 6H 2 O, 1w dissolved / v% CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, 0.02w / v% CoCl 2 ⁇ 6H 2 O, 0.016w / v% CuSO 4 ⁇ 5H 2 O, the 0.012w / v% NiCl 2 ⁇ 6H 2 O Calcium chloride). Palm olein oil was added all at once as a carbon source at a concentration of 10 g / L.
  • composition of the PHA production medium 0.385w / v% Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O, 0.067w / v% KH 2 PO 4, 0.291w / v% (NH 4) 2 SO 4, 0.1w / v% MgSO 4 ⁇ 7H 2 O , 0.5v / v% trace metal salt solution (1.6 w in 0.1N HCl / v% FeCl 3 ⁇ 6H 2 O, 1w / v% CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, 0 .02w / v% CoCl 2 ⁇ 6H 2 O, 0.016w / v% CuSO 4 ⁇ 5H 2 O, 0.012w / v% NiCl 2 ⁇ 6H 2 O those dissolved) and the.
  • the ratio of the amount of PHA accumulated to the dried cells was measured as follows. The cells were recovered from the culture solution by centrifugation, washed with ethanol, lyophilized to obtain dried cells, and weighed. 100 ml of chloroform was added to 1 g of the obtained dried cells, and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours to extract PHA in the cells. The cell residue was filtered off, concentrated with an evaporator until the total volume reached 30 ml, 90 ml of hexane was gradually added, and the mixture was allowed to stand for 1 hour with gentle stirring. The precipitated PHA was filtered off and then vacuum dried at 50 ° C. for 3 hours. The weight of the dried PHA was measured, and the ratio of the accumulated amount of PHA to the amount of dried cells was calculated.
  • the average cell size was measured as follows. After culturing, the culture broth was treated at 60 ° C. for 10 minutes to inactivate somatic cells, and then analyzed with a laser diffraction / scattering particle size distribution measuring device (Microtrac MT3300EXII) to measure the volume average particles of PHA-accumulated cells. The diameter (MV) was measured. The measurement was performed with standard settings (particle permeability: transmission, particle refractive index: 1.81, particle shape: non-spherical, solvent refractive index: 1.333).
  • the PHA average particle size was measured as follows. After completion of the culture, 0.2 ml of the culture solution before or after the heat treatment was separated and suspended in 20 ml of a 0.02 w / v% benzalkonium chloride aqueous solution. Further, 10 ml of 10 w / v% sodium dodecyl sulfate aqueous solution was added and mixed, and PHA extract was obtained by ultrasonic crushing.
  • the obtained PHA extract was analyzed by a laser diffraction / scattering type particle size distribution measuring device (Microtrac MT3300EXII), and the volume average particle size (MV) of the PHA particles and the PHA particles having a particle size of 1 ⁇ m or less with respect to the entire PHA particles were analyzed.
  • the proportion (% by volume) was measured. The measurement was performed with standard settings (particle permeability: transmission, particle refractive index: 1.81, particle shape: non-spherical, solvent refractive index: 1.333).
  • PHA production culture The PHA production culture was carried out as follows. First, a glycerol stock (50 ⁇ l) of the KNK-005 strain was inoculated into a seed medium (10 ml) and cultured for 24 hours to perform seed mother culture. Next, the seed mother culture solution was inoculated at 1.0 v / v% into a 3 L jar fermenter (MDL-300 type manufactured by Maruhishi Bioengineer) containing 1.8 L of preculture medium. The operating conditions were a culture temperature of 33 ° C., a stirring speed of 500 rpm, an aeration rate of 1.8 L / min, and the pH was controlled between 6.7 and 6.8 for 28 hours, and pre-culture was performed. A 14% aqueous solution of ammonium hydroxide was used for pH control.
  • the preculture solution was inoculated at 5.0 v / v% into a 5 L jar fermenter (MDS-U50 type manufactured by Maruhishi Bioengine) containing 2.5 L of PHA production medium.
  • the operating conditions were a culture temperature of 33 ° C., a stirring speed of 420 rpm, an aeration rate of 2.1 L / min, and a pH controlled between 6.7 and 6.8.
  • a 25% aqueous solution of ammonium hydroxide was used for pH control.
  • the carbon source was added intermittently. Palm olein oil was used as the carbon source. Culturing was carried out until the ratio of the amount of PHA accumulated to the dried cells reached 80% or more.
  • the obtained culture broth was heat-treated at the time and temperature shown in Table 1-1.
  • the ratio of the amount of PHA accumulated to the dried cells, the average cell size, the average particle size of PHA before and after the heat treatment, and the ratio of the PHA particles of 1 ⁇ m or less before and after the heat treatment were measured as described above.
  • the rate of increase in the PHA average particle size due to the heat treatment was calculated. The results are shown in Table 1-1.
  • the average cell size of the KNK-005 strain after culturing was 1.89 ⁇ m, the ratio of PHA accumulated to dried cells was 89%, the average PHA particle size before heat treatment was 1.72 ⁇ m, and the PHA particles of 1 ⁇ m or less before heat treatment. The proportion was 2.45% by volume.
  • the average cell size of the PHA-producing microorganisms after culturing was 1.89 ⁇ m. Therefore, even if the heat treatment was performed, the average PHA particle size did not increase as shown in Table 1-1, and the PHA particles of 1 ⁇ m or less did not increase. There was almost no decrease in the proportion of.
  • Example 1 PHA production by minCD-expressing A2405-disrupted strain
  • the minCD-expressing A2405-disrupted strain was cultured under the same conditions as in Comparative Example 1.
  • the obtained culture broth was heat-treated at the time and temperature shown in Table 1-1.
  • the cells before and after the heat treatment were placed on a slide glass and dried, stained with fuchsin, and observed with an optical microscope. A photograph taken during microscopic observation is shown in FIG. The cells maintained their shape before and after the heat treatment.
  • the average cell size of the minCD-expressing A2405-disrupted strain after culturing was 2.95 ⁇ m, the ratio of PHA accumulation to dried cells was 86%, the average PHA particle size before heat treatment was 1.62 ⁇ m, and PHA particles of 1 ⁇ m or less before heat treatment.
  • the average cell size of the minCD-expressing A2405-disrupted strain after culturing was 2.95 ⁇ m, the ratio of PHA accumulation to dried cells was 86%, the average PHA particle size before heat treatment was 1.62 ⁇ m, and PHA particles of 1 ⁇ m or less before heat treatment.
  • the proportion of PHA particles of 1 ⁇ m or less was significantly reduced from 5.08% by volume before the heat treatment to 0.00% by volume at the minimum.
  • Example 2 PHA production by A1386 deletion-disrupted strain
  • the A1386 deletion-disrupted strain was cultured under the same conditions as in Comparative Example 1.
  • the obtained culture broth was heat-treated at the time and temperature shown in Table 1-2.
  • Table shows the ratio of PHA accumulation amount to dried cells, average cell diameter, PHA average particle size before and after heat treatment, ratio of PHA particles of 1 ⁇ m or less before and after heat treatment, and increase rate of PHA average particle size due to heat treatment. Shown in 1-2.
  • the cells before and after the heat treatment were placed on a slide glass and dried, stained with fuchsin, and observed with an optical microscope. A photograph taken during microscopic observation is shown in FIG. The cells maintained their shape before and after the heat treatment.
  • the average cell size of the A1386 deletion disrupted strain after culturing was 2.48 ⁇ m, the ratio of PHA accumulation to dried cells was 88%, the average PHA particle size before heat treatment was 1.48 ⁇ m, and PHA particles of 1 ⁇ m or less before heat treatment.
  • the heat treatment increased the average PHA particle size as shown in Table 1-2, and the maximum increase rate was 1.59.
  • the proportion of PHA particles of 1 ⁇ m or less was significantly reduced from 10.86% by volume before the heat treatment to a minimum of 0.00% by volume.
  • Example 3 pH conditions at the time of heat treatment
  • the A1386 deletion-disrupted strain was cultured in the same manner as in Example 2, and the obtained culture solution was separated.
  • the heat treatment was performed at the time and temperature shown in the table while controlling the pH of the collected culture solution to the value shown in Table 2 (within +0.1).
  • a 10% aqueous sodium hydroxide solution was used for pH control.
  • Table 2 shows the average cell size, the PHA average particle size before and after the heat treatment, the ratio of PHA particles of 1 ⁇ m or less before and after the heat treatment, and the increase rate of the PHA average particle size by the heat treatment.
  • the average cell size of the A1386 deletion disrupted strain after culturing was 2.60 ⁇ m, the ratio of PHA accumulation to dried cells was 89%, the average PHA particle size before heat treatment was 1.55 ⁇ m, and PHA particles of 1 ⁇ m or less before heat treatment. The ratio of was 7.08% by volume.
  • the PHA average particle size was efficiently increased as shown in Table 2.
  • the rate of change in PHA average particle size was within 5%.
  • the increase rate was 1.58 after 30 minutes of treatment at 70 ° C.
  • the proportion of PHA particles of 1 ⁇ m or less decreased significantly from 7.08% by volume before the heat treatment to 0.02% by volume.

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Abstract

ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物を培養して、ポリヒドロキシアルカン酸粒子を蓄積した平均細胞径が２μｍ以上の菌体を得、前記菌体を熱処理して、前記菌体内で、ポリヒドロキシアルカン酸粒子の平均粒子径を１．８μｍ以上かつ平均細胞径以下にする。さらに、前記熱処理後の菌体を破砕し、得られた細胞破砕液の水相からＰＨＡ粒子を分離することができる。

Description

ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法
　本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物を培養することによるポリヒドロキシアルカン酸の製造方法に関する。
　環境問題、食糧問題、健康及び安全に対する意識の高まり、天然又は自然志向の高まりなどを背景に、微生物を利用した物質製造（発酵生産、バイオ変換など）の意義及び重要性が益々高まっており、タンパク質医薬品や遺伝子治療用の核酸などの製造にも、微生物による物質生産が応用されている。例えば、酵母やバクテリアなどの微生物を利用したエタノール、酢酸、医療用タンパク質の生産などが活発に産業応用されている。
　その一例として、生分解性プラスチックとしての産業利用が期待されているポリヒドロキシアルカン酸（以下、ＰＨＡともいう）の微生物による生産が挙げられる（非特許文献１を参照）。ＰＨＡは、多くの微生物種の細胞（以下、菌体ともいう）にエネルギー蓄積物質として産生、蓄積される熱可塑性ポリエステルであり、生分解性を有している。現在、環境への意識の高まりから非石油由来のプラスチックが注目されるなか、特に、微生物が菌体内に産生、蓄積するＰＨＡは、自然界の炭素循環プロセスに取り込まれることから生態系への悪影響が小さいと予想されており、その実用化が切望されている。微生物を利用したＰＨＡ生産では、例えば、カプリアビダス属細菌に炭素源として糖、植物油脂や脂肪酸を与え、細胞内にＰＨＡを蓄積させることでＰＨＡを生産することが知られている（非特許文献２及び３を参照）。
　しかしながら、微生物を利用した物質生産においては、目的生産物の分離回収工程が煩雑となり、生産コストが高くなることが問題になるケースがある。従って、目的生産物の分離回収効率を向上させることは、生産コストの低減のための大きな課題である。
　非特許文献４には、カプリアビダス属細菌においてフェイシンタンパク質をコードする遺伝子ｐｈａＰ１を破壊することで、非破壊の場合より大粒子径のＰＨＡを蓄積したことが報告されている。しかし、該ｐｈａＰ１破壊株はＰＨＡ蓄積量が著しく減少することが示されており、工業生産に適したものではなかった。
　また、非特許文献５には、ＰＨＡを蓄積した菌体に温度やｐＨなどのストレスを与えることで、細胞内部のＰＨＡが凝集したとの記載がある。しかし、顕微鏡写真からはごく一部のＰＨＡ粒子が細胞内で互いに付着している様子が観察されるに留まっており、ＰＨＡ粒子の平均粒子径の変化までを読み取ることはできない。さらに、本文献では全体として細胞自体が小さいため、ＰＨＡ粒子の平均粒子径に対する影響は限定的と考えられる。
Ａｎｄｅｒｓｏｎ　ＡＪ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．，１２，１０２－１０５（１９９０） Ｓａｔｏ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１２０（３），２４６－２５１（２０１５） Ｉｎｓｏｍｐｈｕｎ　Ｃ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，２７，３８－４５（２０１５） Ｐoｔｔｅｒ　Ｍ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１５１（Ｐｔ ３），８２５－８３３（２００５） Ｓｅｄｌａｃｅｋ　Ｐ．，ｅｔ　ａｌ．，Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１０３（４），１９０５－１９１７（２０１９）
　ＰＨＡは微生物細胞内において粒子状に蓄積される。微生物細胞内に蓄積されたＰＨＡを生分解性プラスチックとして利用するためには、細胞を破砕してＰＨＡ粒子を取り出し、他の細胞成分から分離し、回収する必要がある。分離回収の手法は、大きくは有機溶媒系による方法と水系による方法に分けられるが、有機溶媒の使用は高環境負荷、高コストとなるため、工業的には水系による方法が好ましい。水系による方法では、例えば、ＰＨＡ粒子を含む細胞破砕液から、遠心分離機や分離膜等によってＰＨＡ粒子を分離することができる。このような場合、分離回収の効率はＰＨＡ粒子の大きさに依存することになる。即ち、分離工程前のＰＨＡ粒子が大きいほど、遠心分離機や分離膜等を用いた分離回収を容易に実施でき、生産コストの低減につながる。
　ＰＨＡ粒子を蓄積した微生物細胞を破砕した後、細胞破砕液中のＰＨＡ粒子を分離前に凝集させて該粒子を大きくする試みが行われている。しかし、凝集度の制御が難しく、また、破砕によって断片化された細胞成分などの夾雑物を巻き込みながらＰＨＡ粒子が凝集し、その後の不純物除去が困難となることから、細胞破砕液中のＰＨＡ粒子を凝集させる方法は工業生産には適していない。
　本発明は、上記現状に鑑み、微生物細胞内でＰＨＡ粒子を凝集させて、平均粒子径が大きなＰＨＡ粒子を得る方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは鋭意検討した結果、ＰＨＡ生産微生物を培養して、ＰＨＡ粒子を蓄積した平均細胞径が２μｍ以上の菌体を取得し、当該菌体に対して熱処理を行うことで、前記菌体内で、平均粒子径が１．８μｍ以上のＰＨＡ粒子が形成されることを見出し、本発明に至った。
　すなわち本発明は、ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物を培養して、ポリヒドロキシアルカン酸粒子を蓄積した平均細胞径が２μｍ以上の菌体を得る工程、前記菌体を、前記培養時の温度よりも高い温度で熱処理して、前記菌体内で、ポリヒドロキシアルカン酸粒子の平均粒子径を１．８μｍ以上かつ平均細胞径以下にする工程、を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法に関する。
　好ましくは、前記熱処理前のポリヒドロキシアルカン酸粒子の平均粒子径に対する前記熱処理後のポリヒドロキシアルカン酸粒子の平均粒子径の比率が、１．１以上である。
　好ましくは、前記培養後の菌体の乾燥重量に対してポリヒドロキシアルカン酸重量が占める割合が８０％以上である。
　好ましくは、前記熱処理後のポリヒドロキシアルカン酸粒子の粒度分布において、粒子径１μｍ以下のポリヒドロキシアルカン酸粒子の割合が２．０体積％以下である。
　好ましくは、前記ポリヒドロキシアルカン酸粒子を蓄積した前記菌体の平均細胞径が、２．２μｍ以上である。
　好ましくは、前記熱処理を、４０～１００℃の温度で５分間以上実施する。
　好ましくは、前記熱処理を、ｐＨ７．０以上の条件で実施する。
　好ましくは、前記熱処理を、前記培養後の菌体を含む培養液に対して実施する。
　好ましくは、前記製造方法は、前記熱処理後の菌体を破砕して細胞破砕液を得る工程と、前記細胞破砕液の水相からポリヒドロキシアルカン酸粒子を分離する工程をさらに含む。
　好ましくは、前記ポリヒドロキシアルカン酸が、２種以上のヒドロキシアルカン酸の共重合体であり、より好ましくは、３－ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含有する共重合体であり、さらに好ましくは、３－ヒドロキシ酪酸と３－ヒドロキシヘキサン酸との共重合体である。
　好ましくは、前記ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物がカプリアビダス属に属し、より好ましくは、前記ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物がカプリアビダス・ネカトールの形質転換微生物である。
　本発明によれば、微生物細胞内でＰＨＡ粒子を凝集させて、平均粒子径が大きなＰＨＡ粒子を得る方法を提供することができる。本発明によると、菌体を破砕する前に、微生物細胞内において平均粒子径が大きなＰＨＡ粒子を形成することができるため、破砕によって断片化された細胞成分などの夾雑物を巻き込みながらＰＨＡ粒子が凝集するのを回避できる。更に、平均粒子径が大きなＰＨＡ粒子は、細胞成分からの分離回収を効率的に実施できるため、生産コストの低減を実現することができる。
実施例１の培養後、熱処理前（左側）又は熱処理後（右側）の細胞を撮影した顕微鏡写真 実施例２の培養後、熱処理前（左側）又は熱処理後（右側）の細胞を撮影した顕微鏡写真
　以下、本発明の実施形態を詳細に説明する。
　本実施形態は、ＰＨＡ生産微生物を培養して、ＰＨＡ粒子を蓄積した平均細胞径が２μｍ以上の菌体を得る工程と、前記菌体を熱処理して、前記菌体内で、平均粒子径が１．８μｍ以上のＰＨＡ粒子を形成する工程を含む。尚、本願における平均粒子径は、すべて体積平均粒子径を意味する。
　（ＰＨＡ生産微生物）
　ＰＨＡ生産微生物は、ＰＨＡ蓄積能を有し、ＰＨＡ蓄積後の平均細胞径が２μｍ以上となり得る微生物であれば良く、特に限定されない。当該微生物の平均細胞径は、培養中、常に２μｍ以上である必要はなく、当該微生物を熱処理工程に付す前のＰＨＡを蓄積した段階で、２μｍ以上となっていれば良い。ＰＨＡ蓄積後の平均細胞径が２μｍ未満であると、後述する熱処理を行っても、平均粒子径が１．８μｍ以上のＰＨＡ粒子を形成することが困難となる。前記平均細胞径は２．２μｍ以上がより好ましく、２．４μｍ以上がさらに好ましく、２．６μｍ以上がより更に好ましく、２．８μｍ以上が特に好ましい。前記平均細胞径の上限は特に限定されないが、例えば、１０μｍ以下であってよく、また、５μｍ以下であってもよい。
　前記ＰＨＡ生産微生物が蓄積するＰＨＡの量は特に限定されないが、熱処理工程に付す前のＰＨＡを蓄積した段階で、菌体乾燥重量に対してＰＨＡ重量が占める割合が８０％以上であることが好ましく、８５％以上がさらに好ましい。前記割合の上限値は１００％未満であれば特に限定されないが、例えば、９８％以下であってよく、また、９５％以下であってもよい。
　前記ＰＨＡ生産微生物は、ＰＨＡ合成酵素遺伝子を有しＰＨＡを蓄積する微生物であれば特に限定されないが、例えば、ラルストニア（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ）属、カプリアビダス（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ）属、ワウテルシア（Ｗａｕｔｅｒｓｉａ）属、アエロモナス（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属等に属する細菌類が好ましい例として挙げられる。安全性及びＰＨＡ生産性の観点から、より好ましくはラルストニア属、カプリアビダス属、アエロモナス属、ワウテルシア属に属する細菌であり、さらに好ましくはカプリアビダス属又はアエロモナス属に属する細菌であり、さらにより好ましくはカプリアビダス属に属する細菌であり、特に好ましくはカプリアビダス・ネカトール（Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ　ｎｅｃａｔｏｒ）である。
　前記ＰＨＡ生産微生物は、ＰＨＡを本来的に蓄積する野生株であってもよいし、そのような野生株を人工的に突然変異処理して得られる変異株や、あるいは、遺伝子工学的手法により外来のＰＨＡ合成酵素遺伝子を導入することで、ＰＨＡ蓄積能が付与された菌株であってもよい。
　前記ＰＨＡ生産微生物としては、例えば、後述するカプリアビダス・ネカトールの形質転換体であるｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５破壊株やＡ１３８６欠失破壊株などが挙げられるが、これらに限定されない。
　前記ＰＨＡ生産微生物が生産するＰＨＡの種類としては、微生物が生産し得るＰＨＡである限り特に限定されないが、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される１種のモノマーの単独重合体、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される１種のモノマーとその他のヒドロキシアルカン酸（例えば、炭素数４～１６の２－ヒドロキシアルカン酸、４－ヒドロキシアルカン酸、５－ヒドロキシアルカン酸、６－ヒドロキシアルカン酸など）の共重合体、及び、炭素数４～１６の３－ヒドロキシアルカン酸から選択される２種以上のモノマーの共重合体が好ましい。例えば、３－ヒドロキシ酪酸（略称：３ＨＢ）のホモポリマーであるＰ（３ＨＢ）、３ＨＢと３－ヒドロキシ吉草酸（略称：３ＨＶ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＶ）、３ＨＢと３－ヒドロキシヘキサン酸（略称：３ＨＨ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－３ＨＨ）（略称：ＰＨＢＨ）、３ＨＢと４－ヒドロキシ酪酸（略称：４ＨＢ）の共重合体Ｐ（３ＨＢ－ｃｏ－４ＨＢ）、乳酸（略称：ＬＡ）を構成成分として含むＰＨＡ、例えば３ＨＢとＬＡの共重合体Ｐ（ＬＡ－ｃｏ－３ＨＢ）などが挙げられるが、これらに限定されない。この中でも、ポリマーとしての応用範囲が広いという観点から、ＰＨＢＨが好ましい。なお、生産されるＰＨＡの種類は、目的に応じて、使用する微生物の保有するあるいは別途導入されたＰＨＡ合成酵素遺伝子の種類や、その合成に関与する代謝系の遺伝子の種類、培養条件などによって適宜選択しうる。
　（ＰＨＡ生産微生物の培養）
　前記ＰＨＡ生産微生物を培養することで、菌体内にＰＨＡ粒子を蓄積させることができる。培養する方法としては、常法の微生物培養法に従うことができ、適切な炭素源が存在する培地中で培養を行なえばよい。培地組成、炭素源の添加方法、培養スケール、通気攪拌条件や、培養温度、培養時間などは特に限定されないが、十分な量のＰＨＡを蓄積させることを考慮すると、炭素源を連続的または間欠的に培地に添加する培養方法が好ましい。
　培養時の炭素源としては、ＰＨＡ生産微生物が資化可能であればどのような炭素源でも使用可能である。特に限定されないが、例えば、グルコース、フルクトース、シュークロースなどの糖類；パーム油やパーム核油（これらを分別した低融点分画であるパームオレイン、パームダブルオレイン、パーム核油オレインなども含む）、コーン油、やし油、オリーブ油、大豆油、菜種油、ヤトロファ油などの油脂やその分画油類、あるいはその精製副産物；ラウリン酸、オレイン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、ミリンスチン酸などの脂肪酸やそれらの誘導体、あるいはグリセロール等が挙げられる。また、前記ＰＨＡ生産微生物が二酸化炭素、一酸化炭素、メタン、メタノール、エタノールなどのガスやアルコール類を利用可能である場合、これらを炭素源として使用することもできる。
　前記ＰＨＡ生産微生物の培養では、上記炭素源、炭素源以外の栄養源である窒素源、無機塩類、その他の有機栄養源を含む培地を用いて、前記微生物を培養することが好ましい。下記に限定されないが、窒素源としては、例えば、アンモニア；塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム等のアンモニウム塩；ペプトン、肉エキス、酵母エキス等が挙げられる。無機塩類としては、例えば、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２ナトリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。その他の有機栄養源としては、例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン等のアミノ酸、ビタミンＢ１、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ等のビタミン等が挙げられる。
　（熱処理）
　ＰＨＡ粒子を蓄積した平均細胞径が２μｍ以上の微生物細胞を、当該微生物細胞の培養時の温度よりも高い温度で熱処理することで、前記微生物細胞内においてＰＨＡ粒子の平均粒子径を大きくすることができる。前記熱処理は、前記微生物細胞を破砕する前に行えばよく、ＰＨＡ生産微生物の培養を行った後の、菌体を含む培養液に対して行ってもよいし、当該培養液から菌体を回収して、水や緩衝液などに再懸濁した懸濁液に対して行ってもよい。容易に実施できることから、培養後の培養液に対して熱処理を行うことが好ましい。
　前記熱処理の条件は、菌体内でＰＨＡ粒子の平均粒子径を１．８μｍ以上とすることができる条件であれば特に限定されないが、細胞骨格が破壊されてＰＨＡが細胞外に漏出しない条件が望ましい。具体的には、前記熱処理の温度は、前記微生物細胞の培養時の温度よりも高い温度であって、４０℃以上が好ましく、５０℃以上がより好ましく、６０℃以上がさらに好ましく、７０℃以上がさらにより好ましい。前記熱処理の温度の上限値は、特に限定されないが、例えば１００℃以下であってよく、９０℃以下が好ましい。
　前記熱処理の時間としては、５分以上が好ましく、３０分以上がより好ましく、１８０分以上がさらに好ましく、３６０分以上がさらにより好ましい。前記熱処理の温度の上限値は、特に限定されないが、例えば、１日以下であって良く、７２０分以下が好ましい。
　前記熱処理を行う際、菌体を含む液（例えば、菌体を含む培養液、又は、菌体を含む懸濁液）が示すｐＨは特に限定されず、７．０未満であってもよいし、７．０以上であってもよい。しかし、熱処理によってＰＨＡ粒子の平均粒子径がより大きくなることから、７．０以上が好ましく、７．５以上がより好ましく、８．０以上がさらに好ましく、８．５以上がさらにより好ましい。前記ｐＨは菌体が破砕されない範囲にあればよく、その上限値は特に限定されないが、例えば、１２以下であって良く、１１以下が好ましい。尚、ｐＨは、菌体を含む液に酸やアルカリなどを適切な量添加することで制御できる。
　前記熱処理後の菌体内のＰＨＡ粒子の平均粒子径は、１．８μｍ以上で、かつ平均細胞径以下であれば特に限定されない。前記平均粒子径は１．９μｍ以上が好ましく、２．０μｍ以上がより好ましく、２．１μｍ以上がさらに好ましい。
　前記熱処理によって、前記菌体内のＰＨＡ粒子の平均粒子径を大きくする。具体的に述べると、前記熱処理前の菌体内のＰＨＡ粒子の平均粒子径に対する前記熱処理後の菌体内のＰＨＡ粒子の平均粒子径の比率（熱処理後の平均粒子径／熱処理前の平均粒子径）は、１．０を超える数値となり、１．１以上が好ましく、１．２以上がより好ましく、１．３以上がさらに好ましく、１．４以上がさらにより好ましく、１．５以上が最も好ましい。
　前記熱処理によって前記菌体内でＰＨＡ粒子が凝集するため、ＰＨＡ粒子全体に対して、粒子径が小さなＰＨＡ粒子が占める割合が小さい値となる。具体的に述べると、前記熱処理後の菌体内のＰＨＡ粒子について測定した粒度分布において、ＰＨＡ粒子全体に対する粒子径１μｍ以下のＰＨＡ粒子の割合が２．５体積％以下であることが好ましく、２．０体積％以下であることがより好ましく、１．５体積％以下であることがさらに好ましく、１．０体積％以下であることが更により好ましく、０．５体積％以下であることが特に好ましい。
　本実施形態では、ＰＨＡ粒子を蓄積した菌体の平均細胞径が２μｍ以上と大きいが、このように細胞径が大きい菌体では、熱処理前に、粒子径が小さなＰＨＡ粒子が占める割合が大きくなる傾向がある。このように、粒子径が小さなＰＨＡ粒子が占める割合が熱処理前に大きな数値（例えば、３．０体積％以上、あるいは、４．０体積％以上）であっても、熱処理を行うことで、前述のような小さい値まで低下させることができる。このように、本実施形態によると粒子径が小さなＰＨＡ粒子の割合が少なくなるため、ＰＨＡ粒子の、細胞成分からの分離回収が効率的になる利点を得ることができる。
　（細胞の破砕及びＰＨＡの分離回収）
　以上のとおりＰＨＡ粒子を蓄積した菌体の熱処理を行って当該菌体内でＰＨＡ粒子の平均粒子径を大きくした後、周知の方法を用いて当該菌体を破砕し、得られた細胞破砕液の水相からＰＨＡ粒子を分離回収することができる。
　菌体の破砕方法としては特に限定されず、公知の方法を適用することができ、例えば、機械的なせん断力を加えたり、界面活性剤やアルカリ、酵素などを用いて細胞を破砕することで、ＰＨＡ以外の細胞成分が水に溶解した細胞破砕液を得ることができる。
　ＰＨＡの分離回収方法としても特に限定されず、公知の方法を適用することができ、例えば、前記細胞破砕液の濾過や遠心分離によってＰＨＡ粒子を水相から分離した後、乾燥させることで、ＰＨＡを回収することができる。本実施形態により製造される平均粒子径が大きいＰＨＡ粒子は、このような水系による分離回収を効率的に実施できるため好ましい。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明は、これら実施例に限定されるものではない。なお全体的な遺伝子操作は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８９））に記載されているように行うことができる。また、遺伝子操作に使用する酵素、クローニング宿主等は、市場の供給者から購入し、その説明に従い使用することができる。なお、酵素としては、遺伝子操作に使用できるものであれば特に限定されない。
　（製造例１）ｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５破壊株の作製
　まず、遺伝子欠失用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、Ａ２４０５構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号１）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、Ａ２４０５構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有する遺伝子欠失用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ２４０５ＵＤを作製した。
　次に、遺伝子欠失用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ２４０５ＵＤを用いて、以下のようにしてＡ２４０５欠失破壊株の作製を行った。
　遺伝子欠失用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ２４０５ＵＤで大腸菌Ｓ１７－１株（ＡＴＣＣ４７０５５）を形質転換し、それによって得た形質転換微生物を、ＫＮＫ－００５株とＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）上で混合培養して接合伝達を行った。ＫＮＫ－００５株は、カプリアビダス・ネカトールＨ１６株の染色体上にアエロモナス・キャビエ由来のＰＨＡ合成酵素遺伝子（配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するＰＨＡ合成酵素をコードする遺伝子）が導入された形質転換体であり、米国特許第７３８４７６６号明細書に記載の方法に準じて作製することができる。
　得られた培養菌体を、２５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むシモンズ寒天培地（クエン酸ナトリウム２ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、硫酸マグネシウム・７水塩０．２ｇ／Ｌ、りん酸二水素アンモニウム１ｇ／Ｌ、りん酸水素二カリウム１ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ、ｐＨ６．８）に播種し、寒天培地上で生育してきた菌株を選択して、プラスミドがＫＮＫ－００５株の染色体上に組み込まれた株を取得した。この株をＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ｂｒｏｔｈ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で２世代培養した後、１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地上に希釈して塗布し、生育してきた菌株をプラスミドが脱落した株として取得した。さらにＰＣＲおよびＤＮＡシーケンサーによる解析により染色体上のＡ２４０５構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株１株を単離した。このＡ２４０５遺伝子欠失株をＡ２４０５欠失破壊株と命名した。
　次に、ｍｉｎＣＤ遺伝子発現用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－ＰＡ－ｍｉｎＣＤの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、プロモーター配列とｍｉｎＣＤ遺伝子配列およびゲノム上の組込み領域の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号３）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、ｍｉｎＣＤ遺伝子発現用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ＰＡ－ｍｉｎＣＤを作製した。
　作製したｍｉｎＣＤ遺伝子発現用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ－ＰＡ－ｍｉｎＣＤを、上記と同様の接合伝達を用いた方法によって、Ａ２４０５欠失破壊株に導入した。さらに上記と同様の培養及び１５％のシュークロースを含むＮｕｔｒｉｅｎｔ　Ａｇａｒ培地による選抜で、染色体上にプロモーター配列とｍｉｎＣＤ遺伝子配列が挿入された菌株１株を単離した。得られた菌株をｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５破壊株と命名した。
　（製造例２）Ａ１３８６欠失破壊株の作製
　まず、遺伝子欠失用プラスミドの作製を行った。作製は以下のように行った。合成オリゴＤＮＡを用いたＰＣＲにより、Ａ１３８６構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有するＤＮＡ断片（配列番号４）を得た。このＤＮＡ断片を制限酵素ＳｗａＩで消化し、得られたＤＮＡ断片を、同じくＳｗａＩ消化した特開２００７－２５９７０８号公報に記載のベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢとＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｈｉｇｈ（東洋紡社製））にて連結し、Ａ１３８６構造遺伝子より上流および下流の塩基配列を有する遺伝子欠失用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ１３８６ＵＤを作製した。
　次に、Ａ１３８６遺伝子欠失用プラスミドベクターｐＮＳ２Ｘ－ｓａｃＢ＋Ａ１３８６ＵＤを、製造例１と同様の方法でＫＮＫ－００５株に導入した。さらに、製造例１と同様の方法で、染色体上のＡ１３８６構造遺伝子の開始コドンから終止コドンまでを欠失した菌株１株を単離した。このＡ１３８６遺伝子欠失株をＡ１３８６欠失破壊株と命名した。
　（比較例１）ＫＮＫ－００５株によるＰＨＡ生産
　下記の条件でＫＮＫ－００５株の培養を行なった。
　（培地）
　種母培地の組成は１ｗ／ｖ％　Ｍｅａｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、１ｗ／ｖ％　Ｂａｃｔｏ－Ｔｒｙｐｔｏｎｅ、０．２ｗ／ｖ％　Ｙｅａｓｔ－ｅｘｔｒａｃｔ、０．９ｗ／ｖ％　Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ　、０．１５ｗ／ｖ％　ＫＨ２ＰＯ４、（ｐＨ６．８）とした。
　前培養培地の組成は１．１ｗ／ｖ％　Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．１９ｗ／ｖ％ＫＨ２ＰＯ４、１．２９　ｗ／ｖ％（ＮＨ４）２ＳＯ４　、０．１ｗ／ｖ％　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２．５ｗ／ｖ％　パームオレインオイル、０．５ｖ／ｖ％　微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％　ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％　ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％　ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）とした。炭素源としてパームオレインオイルを１０ｇ／Ｌの濃度で一括添加した。
　ＰＨＡ生産培地の組成は０．３８５ｗ／ｖ％　Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、０．０６７ｗ／ｖ％　ＫＨ２ＰＯ４、０．２９１ｗ／ｖ％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．１ｗ／ｖ％　ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｖ／ｖ％　微量金属塩溶液（０．１Ｎ塩酸に１．６ｗ／ｖ％　ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、１ｗ／ｖ％　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０２ｗ／ｖ％　ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．０１６ｗ／ｖ％　ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１２ｗ／ｖ％　ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏを溶かしたもの）とした。
　（乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合の測定方法）
　乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合は次のように測定した。遠心分離によって培養液から菌体を回収、エタノールで洗浄、凍結乾燥し、乾燥菌体を取得し、重量を測定した。得られた乾燥菌体１ｇに１００ｍｌのクロロホルムを加え、室温で一昼夜攪拌して、菌体内のＰＨＡを抽出した。菌体残渣をろ別後、エバポレーターで総容量が３０ｍｌになるまで濃縮後、９０ｍｌのヘキサンを徐々に加え、ゆっくり攪拌しながら、１時間放置した。析出したＰＨＡをろ別後、５０℃で３時間真空乾燥した。乾燥ＰＨＡの重量を測定し、乾燥菌体量に対してＰＨＡ蓄積量が占める割合を算出した。
　（平均細胞径の測定方法）
　平均細胞径は次のように測定した。培養終了後の培養液を６０℃で１０分処理し、菌体細胞不活化を行った後、レーザー回折・散乱式粒子径分布測定装置（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ　ＭＴ３３００ＥＸII）により解析し、ＰＨＡ蓄積細胞の体積平均粒子径（ＭＶ）を測定した。測定は標準的な設定（粒子透過性：透過、粒子屈折率：１．８１、粒子形状：非球形、溶媒屈折率：１．３３３）で行った。
　（ＰＨＡ平均粒子径の測定方法）
　ＰＨＡ平均粒子径は次のように測定した。培養終了後で熱処理前又は熱処理後の培養液０．２ｍｌを分取し、２０ｍｌの０．０２ｗ／ｖ％　塩化ベンザルコニウム水溶液に懸濁した。さらに１０ｍｌの１０ｗ／ｖ％　ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を加え混合し、超音波破砕によりＰＨＡ抽出液を得た。得られたＰＨＡ抽出液をレーザー回折・散乱式粒子径分布測定装置（Ｍｉｃｒｏｔｒａｃ　ＭＴ３３００ＥＸII）により解析し、ＰＨＡ粒子の体積平均粒子径（ＭＶ）、及び、ＰＨＡ粒子全体に対する粒子径１μｍ以下のＰＨＡ粒子の割合（体積％）を測定した。測定は標準的な設定（粒子透過性：透過、粒子屈折率：１．８１、粒子形状：非球形、溶媒屈折率：１．３３３）で行った。
　（ＰＨＡ生産培養）
　ＰＨＡ生産培養は次のように行った。まず、ＫＮＫ－００５株のグリセロールストック（５０μｌ）を種母培地（１０ｍｌ）に接種して２４時間培養し種母培養を行なった。次に種母培養液を、１．８Ｌの前培養培地を入れた３Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＬ－３００型）に１．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度５００ｒｐｍ、通気量１．８Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７～６．８の間でコントロールしながら２８時間培養し、前培養を行なった。ｐＨコントロールには１４％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。
　次に、前培養液を、２．５ＬのＰＨＡ生産培地を入れた５Ｌジャーファーメンター（丸菱バイオエンジ製ＭＤＳ－Ｕ５０型）に５．０ｖ／ｖ％接種した。運転条件は、培養温度３３℃、攪拌速度４２０ｒｐｍ、通気量２．１Ｌ／ｍｉｎとし、ｐＨは６．７～６．８の間でコントロールした。ｐＨコントロールには２５％水酸化アンモニウム水溶液を使用した。炭素源は断続的に添加した。炭素源としてはパームオレインオイルを使用した。培養は、乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合が８０％以上に達するまで行った。得られた培養液に対して、表１－１に記載の時間及び温度で熱処理を行った。
　乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合、平均細胞径、熱処理前及び熱処理後のＰＨＡ平均粒子径、及び、熱処理前及び熱処理後の１μｍ以下のＰＨＡ粒子の割合を前述のように測定した。また、熱処理によるＰＨＡ平均粒子径の増大率（熱処理後のＰＨＡ平均粒子径／熱処理前のＰＨＡ平均粒子径）を計算した。結果を表１－１に示す。
　培養後のＫＮＫ－００５株の平均細胞径は１．８９μｍ、乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合は８９％、熱処理前のＰＨＡ平均粒子径は１．７２μｍ、熱処理前の１μｍ以下のＰＨＡ粒子の割合は２．４５体積％であった。本比較例では培養後のＰＨＡ産生微生物の平均細胞径が１．８９μｍであったため、熱処理を行っても、表１－１に示すようにＰＨＡ平均粒子径は増大せず、１μｍ以下のＰＨＡ粒子の割合もほとんど減少しなかった。
　（実施例１）ｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５破壊株によるＰＨＡ生産
　比較例１と同様の条件でｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５破壊株の培養を行なった。得られた培養液に対して、表１－１に記載の時間及び温度で熱処理を行った。乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合、平均細胞径、熱処理前及び熱処理後のＰＨＡ平均粒子径、熱処理前及び熱処理後の１μｍ以下のＰＨＡ粒子の割合、及び、熱処理によるＰＨＡ平均粒子径の増大率を表１－１に示す。また、熱処理前後の細胞をスライドガラスにのせて乾燥させた後、フクシンによって染色し、光学顕微鏡によって観察した。顕微鏡観察時に撮影した写真を図１に示す。熱処理前後で細胞は形状を保っていた。
　培養後のｍｉｎＣＤ発現Ａ２４０５破壊株の平均細胞径は２．９５μｍ、乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合は８６％、熱処理前のＰＨＡ平均粒子径は１．６２μｍ、熱処理前の１μｍ以下のＰＨＡ粒子の割合は５．０８体積％であった。本実施例では、熱処理を行うことで、表１－１に示すようにＰＨＡ平均粒子径は増大し、増大率は最大で１．７２となった。また、１μｍ以下のＰＨＡ粒子の割合は熱処理前の５．０８体積％から大きく減少し、最少で０．００体積％となった。
　（実施例２）Ａ１３８６欠失破壊株によるＰＨＡ生産
　比較例１と同様の条件でＡ１３８６欠失破壊株の培養を行なった。得られた培養液に対して、表１－２に記載の時間及び温度で熱処理を行った。乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合、平均細胞径、熱処理前及び熱処理後のＰＨＡ平均粒子径、熱処理前及び熱処理後の１μｍ以下のＰＨＡ粒子の割合、熱処理によるＰＨＡ平均粒子径の増大率を表１－２に示す。また、熱処理前後の細胞をスライドガラスにのせて乾燥させた後、フクシンによって染色し、光学顕微鏡によって観察した。顕微鏡観察時に撮影した写真を図２に示す。熱処理前後で細胞は形状を保っていた。
　培養後のＡ１３８６欠失破壊株の平均細胞径は２．４８μｍ、乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合は８８％、熱処理前のＰＨＡ平均粒子径は１．４８μｍ、熱処理前の１μｍ以下のＰＨＡ粒子の割合は１０．８６体積％であった。本実施例では、熱処理を行うことで、表１－２に示すようにＰＨＡ平均粒子径は増大し、増大率は最大で１．５９となった。また、１μｍ以下のＰＨＡ粒子の割合は熱処理前の１０．８６体積％から大きく減少し、最少で０．００体積％となった。
　なお、比較例１並びに実施例１及び２によって生産されたＰＨＡはＰＨＢＨであることをＨＰＬＣ分析にて確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　（実施例３）熱処理時のｐＨ条件
　実施例２と同様にＡ１３８６欠失破壊株の培養を行い、得られた培養液を分取した。分取した培養液のｐＨを表２に記載の値（＋０．１以内）にコントロールしながら、同表に記載の時間及び温度で熱処理を行った。ｐＨコントロールには１０％水酸化ナトリウム水溶液を使用した。平均細胞径、熱処理前及び熱処理後のＰＨＡ平均粒子径、熱処理前及び熱処理後の１μｍ以下のＰＨＡ粒子の割合、熱処理によるＰＨＡ平均粒子径の増大率を表２に示す。
　培養後のＡ１３８６欠失破壊株の平均細胞径は２．６０μｍ、乾燥菌体に対するＰＨＡ蓄積量の割合は８９％、熱処理前のＰＨＡ平均粒子径は１．５５μｍ、熱処理前の１μｍ以下のＰＨＡ粒子の割合は７．０８体積％であった。本実施例では、ｐＨを７．０以上にコントロールしながら熱処理を行うことで、表２に示すようにＰＨＡ平均粒子径は効率的に増大した。なお、ｐＨコントロール後、熱処理前の状態で、ＰＨＡ平均粒子径の変化率は５％以内であった。熱処理時ｐＨ８．５では７０℃、３０分の処理で増大率１．５８となった。また、１μｍ以下のＰＨＡ粒子の割合は熱処理前の７．０８体積％から大きく減少し、０．０２体積％となった。
　なお、実施例３によって生産されたＰＨＡはＰＨＢＨであることをＨＰＬＣ分析にて確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  

Claims (14)

  1. 　ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物を培養して、ポリヒドロキシアルカン酸粒子を蓄積した平均細胞径が２μｍ以上の菌体を得る工程、
    　前記菌体を、前記培養時の温度よりも高い温度で熱処理して、前記菌体内で、ポリヒドロキシアルカン酸粒子の平均粒子径を１．８μｍ以上かつ平均細胞径以下にする工程、を含む、ポリヒドロキシアルカン酸の製造方法。
  2. 　前記熱処理前のポリヒドロキシアルカン酸粒子の平均粒子径に対する前記熱処理後のポリヒドロキシアルカン酸粒子の平均粒子径の比率が、１．１以上である、請求項１に記載の製造方法。
  3. 　前記培養後の菌体の乾燥重量に対してポリヒドロキシアルカン酸重量が占める割合が８０％以上である、請求項１又は２に記載の製造方法。
  4. 　前記熱処理後のポリヒドロキシアルカン酸粒子の粒度分布において、粒子径１μｍ以下のポリヒドロキシアルカン酸粒子の割合が２．０体積％以下である、請求項１～３のいずれか１項に記載の製造方法。
  5. 　前記ポリヒドロキシアルカン酸粒子を蓄積した前記菌体の平均細胞径が、２．２μｍ以上である、請求項１～４のいずれか１項に記載の製造方法。
  6. 　前記熱処理を、４０～１００℃の温度で５分間以上実施する、請求項１～５のいずれか１項に記載の製造方法。
  7. 　前記熱処理を、ｐＨ７．０以上の条件で実施する、請求項１～６のいずれか１項に記載の製造方法。
  8. 　前記熱処理を、前記培養後の菌体を含む培養液に対して実施する、請求項１～７のいずれかに記載の製造方法。
  9. 　前記熱処理後の菌体を破砕して細胞破砕液を得る工程と、前記細胞破砕液の水相からポリヒドロキシアルカン酸粒子を分離する工程をさらに含む、請求項１～８のいずれかに記載の製造方法。
  10. 　前記ポリヒドロキシアルカン酸が、２種以上のヒドロキシアルカン酸の共重合体である、請求項１～９のいずれか１項に記載の製造方法。
  11. 　前記ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシヘキサン酸をモノマーユニットとして含有する共重合体である、請求項１０に記載の製造方法。
  12. 　前記ポリヒドロキシアルカン酸が、３－ヒドロキシ酪酸と３－ヒドロキシヘキサン酸との共重合体である、請求項１１に記載の製造方法。
  13. 　前記ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物がカプリアビダス属に属する、請求項１～１２のいずれか１項に記載の製造方法。
  14. 　前記ポリヒドロキシアルカン酸生産微生物がカプリアビダス・ネカトールの形質転換微生物である、請求項１～１３のいずれか１項に記載の製造方法。
     
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