WO2005085461A1 - 核酸の分解方法及びその用途 - Google Patents

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WO2005085461A1
WO2005085461A1 PCT/JP2005/003590 JP2005003590W WO2005085461A1 WO 2005085461 A1 WO2005085461 A1 WO 2005085461A1 JP 2005003590 W JP2005003590 W JP 2005003590W WO 2005085461 A1 WO2005085461 A1 WO 2005085461A1
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recovering
polyhydroxyalkanoate
microorganism
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product according
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PCT/JP2005/003590
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English (en)
French (fr)
Inventor
Fumio Osakada
Yoshifumi Yanagida
Yasuyoshi Ueda
Original Assignee
Kaneka Corporation
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/62—Carboxylic acid esters

Definitions

  • the present invention relates to a method for effectively decomposing a nucleic acid of a microorganism and facilitating recovery of a useful substance produced by the microorganism, and a use thereof.
  • Patent Document 1 discloses a method of chemically treating microbial cells (hereinafter, sometimes referred to as bacteria or cells) with a large amount of hypochlorous acid to treat a cell suspension.
  • a method for obtaining a product by chemically decomposing and solubilizing the bacterial cell constituents is disclosed.
  • the hypochlorous acid treatment is not performed at a microorganism concentration of only 1%. It is suitable for practical use because it requires an acid, and it is not preferable that the product has a chlorine odor remaining in the product or a decrease in the molecular weight of the product as a product.
  • Patent Document 2 introduces sodium hypochlorite as a substance that induces autolysis of a cell wall instead of a nucleic acid.
  • the invention which is based on the detailed description of the invention or the embodiment, is completed.
  • Patent Document 3 discloses that a cell is treated with a surfactant and the released nucleic acid is decomposed by peroxide. A method is disclosed. Using hydrogen peroxide as a peroxide, it takes 16 hours at room temperature to chemically decompose nucleic acids. In addition, the use of surfactants and hydrogen peroxide is relatively large, so this method is disadvantageous for industrial production.
  • Patent Document 4 discloses a recovery method using a heat treatment in combination with an enzyme and a surfactant.
  • a microorganism suspension is heated at 100 ° C. or higher in advance to decompose nucleic acids, and then various enzymes are used to decompose cell components other than polyhydroxyalkanoate (hereinafter abbreviated as PHA). Later, it is a method to collect PHA.
  • PHA polyhydroxyalkanoate
  • a method for disrupting cells a method of heating a PHA-containing microbial suspension to 50 ° C or more under strong acidity of less than pH 2 and then separating PHA (Patent Document 5), After adding alkali to the body, it is heated to 80 ° C, stirred for 1 hour, and the polymer is recovered by centrifugation (Patent Document 6), high-pressure crushing at 70 ° C (Patent Document 7), alkali is added A method of performing high-pressure crushing at 70 ° C. or higher later (Patent Document 8) is disclosed. In these methods, nucleic acid is also crushed, but there is a concern that decomposition of the product may proceed due to severe conditions such as acid, alkali and temperature.
  • Patent Document 1 US Pat. No. 5,110,980
  • Patent Document 2 JP-A-58-212792
  • Patent Document 3 Japanese Patent Publication No. Hei 8-502415
  • Patent Document 4 Japanese Patent Publication No. 04-61638
  • Patent Document 5 JP-A-11-266891
  • Patent Document 6 JP-A-07-31487
  • Patent Document 7 JP-A-07-31488
  • Patent Document 8 JP-A-07-31489 Disclosure of the invention
  • an object of the present invention is to recover various useful substances produced by a microorganism using a microorganism, and to easily and efficiently remove a nucleic acid that causes an increase in the viscosity of a solution when the microorganism cells are decomposed or dissolved.
  • An object of the present invention is to provide a method of decomposing well and a use thereof.
  • the inventors of the present invention have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, surprisingly, by bringing a living microorganism after culturing into contact with a small amount of hypochlorous acid or a salt thereof, nucleic acid can be reduced. It was discovered for the first time that self-digestion and subsequent increase or decrease in the viscosity of the solution during the decomposition or lysis of cells facilitated the recovery of intracellular products under relatively mild conditions. Was.
  • the living microorganism in the step of recovering the product of the microorganism from the cells of the microorganism, is contacted with hypochlorous acid or a salt thereof in an amount suitable for inducing the autolysis of the nucleic acid.
  • This is a product recovery method characterized by performing a product recovery step afterwards.
  • the present invention preferably comprises autolyzing the nucleic acid by contacting a living microorganism with hypochlorous acid or a salt thereof having an effective chlorine concentration of 0.3 to 14% by weight per dry microorganism for 10 minutes to 5 hours.
  • the microorganisms are decomposed or dissolved to recover the product. It is particularly preferable to use the method of the present invention for recovering polyhydroxyalkanoate, which is a biodegradable polymer, from microbial cells.
  • hypochlorous acid or a salt thereof used in the present invention can be obtained industrially as sodium hypochlorite or calcium hypochlorite (bleach powder). Of these, use of sodium hypochlorite is preferred in terms of low cost and stability when dissolved in water.
  • the assay of whether or not the nucleic acid in the cells is decomposed may be simply carried out by lysing the microorganisms with alkali and examining the viscosity. If the nucleic acid has not been decomposed, the nucleic acid is liberated by lysis with alkali, and the cell suspension becomes gel-like and loses fluidity. Has fluidity and can be easily distinguished from each other. In the case of a large-scale experiment, the viscosity may be measured using, for example, a viscometer. [0014] After being cultured, alive bacteria are contacted with hypochlorous acid or a salt thereof in an amount suitable for inducing autolysis of nucleic acids.
  • nucleic acid After treatment and addition of alkali, it can be seen that the nucleic acid is decomposed due to the fluidity of the bacterial cell suspension, but the live bacteria are heat-sterilized and then treated with hypochlorous acid or a salt thereof similarly. When the alkali is removed, it becomes a highly viscous gel. This indicates that treatment with hypochlorous acid or a salt thereof is effective against viable bacteria.
  • hypochlorous acid or a salt thereof in a viable state without subjecting the cells to heat treatment, sterilization treatment such as alkali treatment or acid treatment.
  • Hypochlorous acid or a salt thereof may be added directly to the culture solution after culturing the microorganism, or may be added after the cells are collected by a method such as centrifugation or membrane separation.
  • the concentration of hypochlorous acid or a salt thereof is not limited as long as it is an amount suitable for inducing autolysis of the nucleic acid.
  • the concentration of hypochlorous acid or a salt thereof is represented by a value converted to an effective chlorine concentration.
  • the available chlorine concentration is the concentration of chlorine (C12) generated by adding acid to hypochlorous acid or a salt thereof.
  • the concentration of hypochlorous acid or a salt thereof is expressed in terms of% by weight per dry cell weight (g) in terms of available chlorine concentration.
  • the concentration may vary depending on the type of microorganism, and the concentration should be determined according to the microorganism used.
  • the concentration of commonly used hypochlorous acid or a salt thereof is preferably at least 0.3% by weight, more preferably at least 0.4% by weight, and further more reliably induces nucleic acid degradation. In this respect, 0.5% by weight or more is particularly preferable.
  • the upper limit of the concentration of hypochlorous acid or a salt thereof is preferably 14% by weight or less, more preferably 10% by weight or less, and 8% by weight considering that it is economically inexpensive because bacteria are killed if the concentration is too high.
  • sodium hypochlorite is available as an aqueous solution and is industrially available as a solution with an effective chlorine concentration of 12% by weight. It is supplied as a liquid.
  • the concentration of hypochlorous acid or its salt is specified with respect to the amount of microorganisms, it is not limited to the concentration of microorganisms in a solution.
  • the method of the present invention is not a method for chemically lysing or decomposing microbial cells (US Pat. No. 5,110,980, JP-A-58-212792, and JP-T-Hei 8-502415). It can be performed at a high concentration of microorganisms. Considering the effect of treatment with hypochlorous acid or a salt thereof, the microorganism concentration is preferably 3% by weight or more, more preferably 5% by weight or more, and particularly preferably 8% by weight or more in terms of dry cells. . The upper limit is preferably 50% by weight or less, more preferably 40% by weight or less, and particularly preferably 30% by weight or less, as long as viable bacteria can be sufficiently stirred.
  • the contact time between the microorganism and hypochlorous acid or a salt thereof is preferably 10 minutes or more, more preferably 20 minutes or more, and still more preferably, for effective induction of nuclease and autolysis of nucleic acid. Or more than 30 minutes.
  • the upper limit of the treatment time is preferably within 5 hours, more preferably within 3 hours, and even more preferably within 2 hours, in consideration of the possibility that the degradation enzyme of the product is induced and decomposed.
  • the temperature for inducing autolysis is preferably a suitable growth (culture) temperature of the microorganism used.
  • the preferred growth temperature varies depending on the microorganism. Generally speaking, a force in the range of approximately 15 ° C and a force of 40 ° C is preferable.
  • the temperature is preferably from 20 ° C. to 35 ° C. in the case of Alkagenes' Ueto mouth fuzz, from 20 ° C. to 37 ° C. in the case of Escherichia coli, and about 25 ° C. to 37 ° C. in the case of yeast.
  • the pH at which autologous digestion is induced by contact of the microorganism with hypochlorous acid or a salt thereof is preferably a suitable growth (culture) pH of the microorganism to be used.
  • pH 4 to pH 8 are preferred, but for example, pH 5 to pH 7 in the case of Escherichia coli, pH 5 to pH 7 in the case of Alcaligenes eutophagus, and pH 7 in the case of yeast.
  • hypochlorous acid or a salt thereof is disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 8-502415, and should not be applied to peroxides.
  • products produced by microorganisms are not particularly limited, and include, for example, polyhydroxyalkanoate (PHA), proteins, antibiotics, lipids, carbohydrates, and the like. It has particular use when the product is a biodegradable polymer, PHA.
  • PHA polyhydroxyalkanoate
  • the component of the hydroxyalkanoate of PHA is not particularly limited, but specifically, 3-hydroxybutyrate (3HB), 3-hydroxyvalerate (3HV), —Hydroxypropionate, 4-hydroxybutyrate, 4-hydroxyvalerate, 5-hydroxyvalerate, 3-hydroxyhexanoate (3HH), 3-hydroxyheptanoate, 3-hydroxyoctanoate, 3-hydroxy Nonanoate and 3-hydroxydecanoate are examples.
  • the polyhydroxyalkanoate in the present invention may be a homopolymer of these hydroxyalkanoates or a copolymer obtained by copolymerizing two or more types, but two or more types may be copolymerized.
  • the copolymer is
  • PHA examples include PHB which is a homopolymer of 3HB, PHBV which is a two-component copolymer of 3HB and 3HV, and PHBH which is a two-component copolymer of 3HB and 3HH (Patent No. 2777 No. 757) or PHBHV (see Patent No. 2777757) which is a three-component copolymer of 3HB, 3HV and 3HH.
  • a copolymer having 3HH as a monomer component is more preferable, and PHBH is more preferable, in view of degradability, softness, and properties as a biodegradable polymer.
  • the composition ratio of each constituting monomer unit is not particularly limited, but preferably 3HH units are 40 mol% or less, more preferably 30 mol% or less, and particularly preferably 20 mol% or less. preferable.
  • the composition ratio of each monomer unit is not particularly limited.For example, the content of the 3HB unit is 1 to 95 mol%, the content of the 3HV unit is 1 to 96 mol%, and the content of the 3HH unit is 1 to 95 mol%. The content is preferably in the range of 110 to 30 mol%.
  • the PHA In order to put PHA into practical use, the PHA must have a weight average molecular weight of 10,000 or more using polystyrene as a molecular weight standard by gel chromatography. It is natural that the appropriate molecular weight varies depending on various applications.In consideration of the low molecular weight due to heat in the pellet pellet and the subsequent processing stage, the weight average molecular weight of the PHA recovered and dried according to the present invention is preferably It is at least 200,000, more preferably at least 300,000, especially at least 400,000.
  • the microorganism used in the present invention is preferably an organism capable of containing PHA in a cell, for example, Alcaligenes lipolytica, Alcalige genus Alcaligenes such as nes latus, Ralstonia eutropha and the like (Raistoniano J3 ⁇ 4, Psuedomonas oleovorance, Psuedomonas resmov orans and the like Pseudomonas genus, Bacillus, Azotobacter, Azotobacter) Nocardia genus such as Nocardia salmonicolur, genus Rhodospirillium such as Aeromonas Je, Rhodospirillum rubru m such as Aeromonas caviae, Rhodospirillum genus such as Rhodospirillum rubrum; Zoogloea genus such as Zoogloea ramigera; Microorganisms such
  • the microorganism used in the present invention may be a transformant into which a group of genes involved in PHA synthesis of these microorganisms has been introduced.
  • the host is not particularly limited, and includes microorganisms such as Escherichia coli and yeast (see WO01Z88144) in addition to the above microorganisms.
  • microorganisms such as Escherichia coli and yeast (see WO01Z88144) in addition to the above microorganisms.
  • A. caviae of the genus Aeromonas and transformed cells into which genes of the PHA synthase group of A. caviae are introduced have the ability to synthesize PHBH, which is an excellent biodegradable polymer. preferable.
  • Ralstonia eutropha into which a gene of the PHA synthase group of A.
  • caviae is introduced, is one example of such microorganisms, which is more preferably Alcaligenes eutrophus AC32 (acceptance date: August 7, 1997, accession number: FERM BP-6038) has been deposited internationally under the Budapest Treaty at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Organism Depositary, located at 1-1, Tsukuba-Higashi, Ibaraki, Japan, Japan.
  • the method for culturing the PHA-containing microorganism mentioned above is not particularly limited, and for example, a method well-known to those skilled in the art described in JP-A-2001-340078 is used.
  • the product of the microorganism is PHA
  • the living microorganism is contacted with hypochlorous acid or a salt thereof in an amount suitable for inducing autolysis of nucleic acid.
  • the product recovery step performed later also has the following process power (a) and (b).
  • the polymer when recovering the PHA-containing microbial cell, may be treated with hypochlorous acid or a salt thereof to autolyze the nucleic acid, and then proceed to step (a). it can.
  • step (a) of the present invention it is important to add an alkali to the aqueous suspension of the PHA-containing microbial cells while stirring and physically disrupting the aqueous suspension. That is, actually, (l) an aqueous suspension of PHA-containing microbial cells is prepared, (2) physical disruption is first started while stirring the aqueous suspension, and (3) The alkali is added while continuing the stirring and the physical crushing process.
  • the method of stirring the aqueous suspension at the time of adding alkali is not particularly limited, but emulsification is performed in order to efficiently diffuse the alkali and efficiently crush insoluble substances other than the polymer that flows out of the cell. It is preferable to stir using a disperser, an ultrasonic crusher or the like. More preferably, it is an emulsifying and dispersing machine, for example, a force that can be used by a Silverson mixer manufactured by Silverson UK, a clear mix manufactured by Emtech Japan, and Ebara Milda-1 manufactured by Ebara Japan.
  • the apparatus for performing the physical crushing treatment is not particularly limited, but examples thereof include a high-pressure homogenizer, an ultrasonic crusher, an emulsifying and dispersing machine, and a bead mill.
  • a high-pressure homogenizer for example, a high-pressure homogenizer made of Inokuchi-Souvine clay is preferably used.
  • a Bran-Lube continuous cell disrupter manufactured by Bran + Luebbe, Germany
  • a microfluidizer manufactured by Microfluidics, USA
  • the present inventors set the pH of the suspension to 10 or more by adding alkali to the suspension, and then physically disrupted (eg, disrupted and emulsified the cells using a high-pressure homogenizer).
  • alkali e.g, disrupted and emulsified the cells using a high-pressure homogenizer.
  • PHA is easily decomposed, and conversely, if physical crushing is performed before adding alkali, PHA is hardly decomposed unexpectedly.
  • the presence of undigested nucleic acid increases the viscosity due to the undigested nucleic acid, so that alkali is gradually added to facilitate the recovery of PHA, and the viscosity sharply increases.
  • the nucleic acid had to be crushed many times over a long period of time while avoiding the nucleation.
  • step (a) it is preferable to perform physical crushing while controlling the pH of the aqueous suspension between 9 and 13.5.
  • Insolubles (cellular substances) derived from cells other than PH A can be more effectively solubilized or emulsified, and the PHA itself has almost no adverse effect.
  • the lower limit is pH10
  • the more preferable upper limit is pH13. If the pH is higher than 13.5, the molecular weight of PHA tends to decrease, and if the pH is lower than 9, the crushing effect is insufficient.
  • step (a) after treatment with hypochlorous acid or a salt thereof, alkali is added gradually or stepwise to a predetermined pH while physically disrupting the cells. In particular, it is preferable to continue physical disruption.After at least one physical disruption of the whole cells, add PH9 to the aqueous suspension while adding alkali while stirring the aqueous suspension. More preferably, the method is adjusted to an arbitrary pH of 5 and the physical crushing is continued while controlling the pH. This As a result, it becomes possible to dissolve or emulsify insoluble substances (cell substances) other than PHA in a short period of time, and to easily separate and recover PHA with an aqueous suspension power without PHA decomposition. .
  • the temperature at the time of performing the step (a) is preferably 10 to 45 ° C, more preferably 20 to 40 ° C, from the viewpoint of more effectively preventing the molecular weight of PHA from decreasing.
  • the pH at the time of performing the step (a) is preferably 10 to 45 ° C, more preferably 20 to 40 ° C, from the viewpoint of more effectively preventing the molecular weight of PHA from decreasing.
  • by controlling the pH it is possible to prevent the pH from becoming too high, and to maintain the insoluble protein in a soluble state by always maintaining an arbitrary pH between pH 9-13.5.
  • the suspension does not need to be heated to a high temperature, and as a result, the decrease in the molecular weight of PHA can be prevented to 15% or less of that obtained after culturing.
  • the cell suspension When a high-pressure homogenizer is used for the physical crushing treatment, the cell suspension may be cooled by the low-temperature constant-temperature circulation tank as described above. When the microbial cells are crushed in such a suitable alkaline environment, results with higher reproducibility can be obtained.
  • the aqueous suspension is prepared by suspending the PHA-containing microbial cells in an aqueous medium after contact with hypochlorous acid or a salt thereof.
  • the culture solution after contacting the microorganism with hypochlorous acid or a salt thereof may be used as it is, or may be further concentrated or diluted.
  • the concentration of the cells in the aqueous suspension is preferably not more than 30 Og, since the stirring of the aqueous suspension is preferably 500 g or less in terms of dry cells in 1 L of the aqueous suspension.
  • the lower limit is preferably 80 g or more.
  • the alkali used in step (a) is not particularly limited as long as it can break the cell wall of the PHA-containing microorganism and allow PHA in the cells to flow out of the cells.
  • Examples of the above alkali are sodium hydroxide, potassium hydroxide, alkali hydroxide such as lithium hydroxide; sodium carbonate, alkali metal carbonate such as potassium carbonate; sodium hydrogen carbonate, Alkali metal bicarbonates such as potassium bicarbonate; alkali metal salts of organic acids such as sodium acetate and potassium acetate; borate salts of alkali metals such as borax; sodium sodium phosphate, disodium hydrogen phosphate; Phosphates of alkali metals such as potassium tribasic phosphate and potassium dihydrogen phosphate; hydroxides of alkaline earth metals such as barium hydroxide; aqueous ammonia; etc.
  • Powers not limited to these may be used alone or in combination of two or more.
  • alkalis are suitable for industrial production, and Metal hydroxides and alkali metal carbonates are preferred, and sodium hydroxide, potassium hydroxide, lithium hydroxide and sodium carbonate are more preferred.
  • the PHA can be separated from the aqueous suspension by, for example, centrifugation, membrane separation, or filtration with a filter.
  • the obtained PHA is recovered as an emulsion.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a preferable apparatus for performing the step (a).
  • the present invention is not limited to these device examples.
  • Reference numeral 1 in FIG. 1 indicates the whole cell disrupting apparatus of the present invention.
  • Reference numeral 6 denotes a pH adjusting agent storage tank for storing the alkaline drug, which is supplied to the bacterial cell crushing tank 11 via the pipe line 5 by the chemical power pump 4 in the pH adjusting agent storage tank 6, Adjust the pH of the aqueous suspension of microbial cells in the cell disruption tank 11 as needed.
  • a stirring device 2 for uniformly stirring and mixing the pH adjusting agent supplied from the pH adjusting agent storage tank 6 with the aqueous suspension of the microbial cells in the cell crushing tank 11 is provided in the cell crushing tank 11. It is attached.
  • a pH meter is provided in the cell crushing tank 11 in order to detect the pH of the microorganism cell suspension in the cell crushing tank 11 and to control the supply amount of the pump 4 so as to reach a predetermined pH.
  • a pH detection control means composed of 7 and a pH detection control device 3 is additionally provided.
  • the cell crushing tank 11 also serves as a low-temperature constant-temperature circulating tank, and can keep the aqueous suspension of microbial cells at a desired temperature.
  • the aqueous suspension of the microbial cells in the cell crushing tank 11 is supplied to a crushing device 9 via a pump 10, and the undigested nucleic acid causing an increase in viscosity by the crushing device 9. Is efficiently crushed and supplied into the cell crushing tank 11 via the pipe 8.
  • the added alkali is rapidly diffused by the stirring device 2, the aqueous suspension of the microbial cells becomes uniform, and the pH of the aqueous suspension of the microbial cells can be strictly adjusted.
  • the upper and lower ranges of the pH to be controlled are preferably within 1 above and below the set value, and more preferably within 0.5 and below, respectively. 13.5 control Is preferred.
  • the crushing device 9 devices such as a high-pressure homogenizer, an ultrasonic crusher, an emulsifying and dispersing machine, and a bead mill as described above can be used. Further, two or more crushers of the same type or different types may be installed in parallel or in series. The above-mentioned emulsifying disperser or ultrasonic crusher is used to disperse the added alkali efficiently in the stirrer 2 and efficiently crush the undigested nucleic acids, cell walls, and other insoluble substances that have flowed out. Use of a machine or the like is preferred. These devices are also manufactured in-line mixer type. For example, they can also serve as the pump 10 and the stirring device 2 in FIG. 1, and in this case, there is an advantage that the structure is simplified. In addition, general-purpose devices may be used for the pH meter 7 and the pH detection control device 3.
  • step (b) in the present invention can be performed for the purpose of removing at least some of the attached components and increasing the purity of PHA.
  • step (b) is a method for purifying PHA in which either or both of an enzyme and a surfactant are used to solubilize impurities adhering to the PHA and then subject to solubilization after decomposition.
  • the PHA separated in step (a) is not used after drying the PHA separated in step (a). It is preferably used in the next step (b) while being suspended in water or in a state of being wetted with water after being separated and recovered by, for example, centrifugation or membrane separation.
  • examples of the enzyme to be used include a protease, a fatty acid-degrading enzyme, a cell wall-degrading enzyme, and a nuclease. These may be used alone or in combination of two or more. The following are specific examples of these enzymes.
  • proteolytic enzymes include alcalase, pepsin, trypsin, papain, chymotrypsin, aminopeptidase, and canoleboxypeptidase.
  • Fatty acids degrading enzymes include lipases and phospholipases. Examples include zeses, cholinesterases, and phosphatases.
  • cell wall degrading enzymes include lysozyme, amylase, senorylase, manolase, saccharase, ⁇ and j8-glycosinase.
  • nucleases include ribonucleases. These may be used alone or in combination of two or more.
  • the enzyme used in this step is not limited to the above, and may be any enzyme as long as it can be used for industrial products.
  • generally available enzyme detergents for laundry containing enzymes can also be used.
  • the present invention is not limited to an enzyme which may be an enzyme composition containing, for example, an enzyme and an enzyme stabilizing agent or an anti-redeposition agent.
  • proteolytic enzymes which are preferably at least one selected from proteolytic enzymes and cell wall degrading enzymes are more preferable.
  • Preferred proteolytic enzymes include, among those included in the above examples, Protease Eight, Protease! 3 , Protease N (all, trade names, all manufactured by Amano Enzym), Alcalase, Zapinase, Evalase (all, And the like (trade names, all manufactured by Novozim Co., Ltd.) are industrially usable, and can be suitably used from the viewpoint of decomposition activity.
  • Preferred examples of the cell wall degrading enzyme include lysozyme among the above examples. And are not limited to these.
  • the temperature at which the enzyme treatment is performed is, of course, preferably the optimum temperature of the selected enzyme.
  • the upper limit is more preferably 50 ° C or lower.
  • the lower limit is preferably 20 ° C or higher.
  • the enzyme treatment time is usually 0.5 to 2 hours, which is preferably performed until the required degree of treatment is achieved.
  • the amount of the enzyme used depends on the type and activity of the enzyme and is not particularly limited, but is preferably 0.001 to 10% by weight based on the weight of the polymer, and 0.00001 to 5%. % By weight is more preferred.
  • the method of the present invention is characterized in that PHA-containing cells themselves are enzymatically treated and the cells are crushed, compared to a conventional method (Japanese Patent Publication No. 04-61638).
  • Japanese Patent Publication No. 04-61638 Japanese Patent Publication No. 04-61638.
  • it is sufficient to add an enzyme amount sufficient to dissolve the insoluble matter, there is an advantage that it can be produced economically and inexpensively.
  • the enzyme treatment is performed in several stages, for example, the first stage.
  • one enzyme may be used, followed by treatment with the same or different enzyme.
  • two or more enzymes it is convenient to treat PHA in a single step using an enzyme that mixes them unless they digest each other.
  • a surfactant can be used as a soluble dandruff to remove impurities attached to the PHA particles.
  • the surfactant used in the present invention include an anionic surfactant, a cationic surfactant, an amphoteric surfactant, and a nonionic surfactant. These may be used alone or in combination of two or more.
  • anionic surfactant examples include an alkyl sulfate, an alkylbenzene sulfonate, an alkyl or alkyl sulfate ester salt, an alkyl or alkenyl ether sulfate ester salt, an ⁇ -olefin sulfonic acid salt, a fatty acid salt or an ester thereof. And ⁇ -sulfofatty acid salts or esters thereof, alkyl or alkyl ether carboxylate salts, amino acid type surfactants, and phenyl amino acid type surfactants.
  • alkyl sulfates having 12 to 14 carbon atoms in the alkyl group straight-chain alkylbenzene sulfonates having 12 to 16 carbon atoms in the alkyl group, alkyl sulfate esters having 10 to 18 carbon atoms in the alkyl group, Alkyl ether sulfates are preferred.
  • the counter ion is preferably an alkali metal such as sodium or potassium, an alkaline earth metal such as magnesium, or an alkanolamine such as monoethanolamine, diethanolamine or triethanolamine, but is not limited thereto. Not necessarily.
  • Examples of the cationic surfactant include an alkyltrimethylammonium salt, a dialkyldimethylammonium salt and the like.
  • amphoteric surfactant examples include carbobetaine-type and sulfobetaine-type surfactants.
  • nonionic surfactant examples include polyoxyalkylene (preferably oxyethylene) alkyl or alkenyl ether, polyoxyalkylene (preferably oxyethylene) alkyl or alkenyl phenyl ether, polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl or Alkenyl ether, polyoxyethylene polyoxypropylene glycol, polyoxyethylene glycol, polyoxyethylene alkylamine, higher fatty acid alcohol Force amide, alkyl darcoside, alkyl glucose amide, alkyl amine oxide and the like.
  • those having high hydrophilicity those having low ability to form liquid crystals produced when mixed with water, and those which do not produce liquid crystals are preferred, and those having relatively good biodegradability are preferred.
  • C10-14 polyoxyalkylene alkyl ethers polyoxyethylene glycols, etc. is preferred.
  • C10-14 polyoxyalkylene alkyl ethers C10-14 polyoxyethylene alkyl ethers are preferred. Preferred, but not limited to! /.
  • the surfactant include anionic surfactants such as sodium dodecyl sulfate, sodium dodecylbenzene sulfonate, sodium cholate, sodium deoxycholate, and sodium oleate; polyoxyethylene glycol, carbon
  • anionic surfactants such as sodium dodecyl sulfate, sodium dodecylbenzene sulfonate, sodium cholate, sodium deoxycholate, and sodium oleate
  • polyoxyethylene glycol carbon
  • Nonionic surfactants such as polyoxyethylene alkyl ether of number 10-14 are preferred in terms of price, amount used, and effect of addition. It is also preferable to use two or more of these.
  • the surfactants described above are also used in laundry detergents that are generally commercially available, and a suitable laundry detergent can be used as the surfactant.
  • an anionic surfactant and a nonionic surfactant are preferred.
  • an anionic surfactant For the purpose of washing and removing proteins and the like, it is preferable to use an anionic surfactant.
  • nonionic surfactants are preferably used. It is preferable to use an agent.
  • the amount of the surfactant to be added is not particularly limited, but is preferably 0.001 to 10% by weight based on the weight of the polymer, and more preferably 0.001 to 5% by weight from the viewpoint of cost.
  • the treatment temperature in the surfactant treatment is not particularly limited, but is preferably in the range of 20 to 50 ° C. from the viewpoint of promoting the solubilization of bacterial cell components other than PHA.
  • the processing time is usually preferably 0.5 to 2 hours.
  • an enzyme and an interface Use of an activator in combination may be mentioned.
  • the amount of the enzyme used and the amount of the surfactant used are the same as those described above.
  • the treatment temperature is preferably 20 to 50 ° C, and the treatment time is preferably 0.5 to 2 hours. It is preferable to perform both the enzyme treatment and the surfactant treatment while stirring.
  • the present inventors have recognized a remarkable effect of the combination of two drugs.
  • the reason for this is that the surfactant effectively removes the degraded product that has become insoluble due to the enzymatic degradation, or because the surfactant changes the protein structure and makes it more susceptible to enzymatic degradation. Conceivable.
  • the surfactant and the enzyme can be prepared separately and used by mixing as appropriate. Power Since commercially available enzyme-containing laundry detergent is a mixture of a surfactant and an enzyme, it can be used as it is. it can.
  • step (b) of the present invention which treatment of an enzyme or a surfactant is performed depends on the reason and purpose such as the type of impurities to be removed, cost, other process restrictions, and the purity of the target PHA. It can be freely selected as appropriate.
  • the PHA particles obtained by the treatment with the enzyme and Z or a surfactant are subjected to hydrophilic treatment for further removal of impurities such as degreasing, deodorization and decolorization. It is preferable to perform washing with a neutral solvent and Z or water. By this step, it is possible to isolate PHA with higher purity.
  • the hydrophilic solvent used in this step is not particularly limited, but specific examples include methanol, ethanol, propanol, isopropanol, acetone, acetonitrile, tetrahydrofuran and the like. Among these hydrophilic solvents, methanol and ethanol, which are economically inexpensive and have a cleaning effect, are particularly preferred.
  • the above-mentioned hydrophilic solvent can be used by mixing with water.
  • the mixing volume ratio water Z hydrophilic solvent
  • the amount of the solvent used for washing is not particularly limited, but is preferably equal to or more than the volume of the polymer.
  • the temperature at the time of washing is preferably 20 ° C. or more and less than 60 ° C. Further, the main cleaning may be performed only with water.
  • high-purity PHA can be recovered and used as a molding material or the like.
  • the PHA forms an emulsion consisting of fine particles having an average particle diameter of 0.7 micron, so that it can be applied to paper, for example.
  • a coating material For use as a coating material.
  • it is not limited to this.
  • the PHA obtained in the step (b) is fine particles having a particle size of about several microns, and therefore, from the viewpoints of separability, handleability, etc., the following step ( In c), the PHA may be aggregated to an appropriate particle size.
  • the PHA purified in the step (b) is suspended in a hydrophilic solvent and Z or water, and the suspension is stirred at a temperature not higher than its boiling point by a simple operation, This is a step of aggregating PHA particles to increase the particle size.
  • the hydrophilic solvent used in step (c) is not particularly limited, but may be, for example, methanolic ethanol, ethanolanol, 1-propanol, 2-propanol, butanol, and the like; acetone, methyle, and the like. Ketones such as tyl ketone; ethers such as tetrahydrofuran and dioxane; -tolyls such as acetonitrile and propio-tolyl; amides such as dimethylformamide and acetate amide; dimethylsulfoxide, pyridine and piperidine.
  • methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, butanol, acetone, methylethylketone, tetrahydrofuran, dioxane, acetonitrile, propionitrile and the like are preferred because of good solvent removability. Further, methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, butanol, acetone, tetrahydrofuran, and acetonitrile are more preferable. More preferably, the solvent used for the PHA cleaning in step (b) is used, whereby the process can be continuously shifted to the flocculation operation, and equipment cost can be reduced because one solvent tank can be used. it can.
  • methanol, ethanol, propanol, isopropanol, acetone, acetonitrile, and tetrahydrofuran are mentioned as more preferred solvents.
  • methanol and ethanol which are economically inexpensive and have a cleaning effect, are particularly preferred.
  • the hydrophilic solvent can be used by mixing with water.
  • a suspension can be prepared by using only a hydrophilic solvent, water alone, or a mixed solvent of a hydrophilic solvent and water as a dispersion medium.
  • a mixed solvent of a hydrophilic solvent and water is preferred.
  • the concentration of the hydrophilic solvent in the mixed solvent is preferably 10% by weight or more, more preferably 20% by weight or more, in order to obtain a more sufficient coagulation effect.
  • the upper limit of the hydrophilic solvent is preferably 99% by weight or less, more preferably 98% by weight or less, and further preferably 97% by weight or less.
  • the concentration of PHA in the suspension in step (c) is not particularly limited, but is preferably lgZL or more, more preferably 10gZL or more, and further preferably 30gZL or more.
  • the upper limit is preferably 500 gZL or less, more preferably 300 gZL or less, and further preferably 200 gZL or less, from the viewpoint of ensuring the fluidity of the PHA suspension.
  • a means for stirring such as a stirring tank, may be mentioned, but it is not particularly limited.
  • the temperature at the time of aggregation in the step (c) of the present invention is preferably room temperature (about 24 ° C) or more, more preferably 40 ° C or more, and still more preferably 60 ° C or more.
  • the upper limit is not particularly limited, and any temperature up to the boiling point of the suspension can be selected.
  • the step (c) can be performed under normal pressure, high pressure, and deviation conditions.
  • step (c) of the present invention aggregation can be caused in a very short time, usually about several minutes. Therefore, if PHA is isolated by filtration or the like immediately after aggregation, the molecular weight of the PHA depends on the temperature. You don't have to worry!
  • the aggregation method of step (c) of the present invention makes it possible to increase the particle size of PHA.
  • an aggregate having a weight average diameter of 10 ⁇ m or more, preferably 50 ⁇ m or more, more preferably 100 ⁇ m or more can be obtained.
  • the upper limit is not particularly limited, but is an aggregate having a weight average diameter of 5,000 ⁇ m or less, preferably 3000 ⁇ m or less.
  • the method of filtration is not particularly limited, and for example, filtration can be performed using a filter filter, a basket type separator, or the like.
  • a more preferable recovery method is a method in which the aggregated PH A is directly recovered as a dry powder by spray drying, which can reduce equipment costs as compared with a method of drying after filtration.
  • the PHA obtained by the present invention may contain, as necessary, a coloring agent such as a pigment or a dye; a filler such as inorganic or organic particles, glass fiber, whiskers, and mica; an antioxidant; Stabilizers; lubricants, release agents, water repellents, antibacterial agents and other secondary additives. Can be blended to prepare a composition.
  • a coloring agent such as a pigment or a dye
  • a filler such as inorganic or organic particles, glass fiber, whiskers, and mica
  • an antioxidant such as inorganic or organic particles, glass fiber, whiskers, and mica
  • Stabilizers such as lubricants, release agents, water repellents, antibacterial agents and other secondary additives.
  • PHA and its composition obtained by the method of the present invention include various fibers, yarns, ropes, woven fabrics, knitted fabrics, nonwoven fabrics, papers, films, sheets, tubes, plates, rods, containers, bags, parts, foams It can be formed into any shape. It can also be processed into biaxially stretched films.
  • the molded article can be suitably used in agriculture, fishing, forestry, horticulture, medicine, sanitary goods, clothing, non-clothing, packaging, and other fields.
  • the PHA obtained by the method of the present invention has high purity, it can be suitably used in fields requiring powerful high purity that cannot be used in conventional methods, such as films, medicine, and sanitary goods. Excellent in terms of quality.
  • the method of the present invention makes it possible to industrially produce and provide products of microorganisms at low cost, and efficiently recovers highly purified PHA from PHA-containing microbial cells, which has been extremely difficult until now. It can be industrially produced and provided at low cost.
  • the viscosity of the aqueous suspension after treatment with hypochlorite was visually determined and evaluated in the following four stages.
  • the viscosity of the cell suspension was measured with a B-type viscometer manufactured by Tokimec Co., Ltd. according to the attached instruction manual.
  • the PHA (PHBH) in the microbial cells after the completion of the culture was recovered by extraction with black-mouthed form and hexane crystallization, and then subjected to analysis.
  • 3HHmol% was measured by the method described in Example 1 of JP-A-2001-340078. That is, 20 mg of PHBH was suspended in 2 ml of a mixture of sulfuric acid and methanol (15:85), 2 ml of chloroform was added, and the mixture was heated at 100 ° C. for 140 minutes. After cooling, 1 ml of distilled water was added, and the mixture was stirred. This was subjected to composition analysis using a gas chromatograph GC-17A (manufactured by Shimadzu Corporation, NEUTRA BOND column manufactured by GL Sciences). Similarly, the total purity of PHBH was measured using this method.
  • the collected PHA (PHBH) was dried under reduced pressure at 50 ° C. for 5 hours immediately before measurement, and the total amount of nitrogen was measured using a trace nitrogen analyzer TN-10 manufactured by Diamond Instruments. In the present invention, the measured nitrogen concentration was multiplied by 6.38 to obtain the protein-converted purity.
  • the average particle size of the PHA particles was determined using a Microtrac particle sizer (Nikkiso FRA) to adjust the aqueous suspension of PHA to a predetermined concentration, and the particle size corresponding to the 50% accumulation of all particles as the average particle size. did.
  • R. eutropha was internationally deposited on August 7, 1997 as Alcaligenes e utrophus AC32 (Accession number: FERM BP-6038) into which a PHA synthase group gene derived from Aeromonas biebie was introduced.
  • Culture was performed by the method described in Example 1 of JP-A-340078 to produce PHBH. After completion of the culture, the microbial cells were collected by centrifugation, and used as an aqueous suspension of 100 gZL by dry cell weight. Recovery in aqueous suspension Microorganisms were 10% by dry weight and PHBH content in cells was 60% by weight.
  • nucleic acid As a result, the decomposition of nucleic acid was already observed at an effective chlorine concentration of 0.3% by weight per dry cell weight, and the viscosity at 0.7% by weight was almost eliminated. 2. At 8% by weight, the nucleic acid was almost decomposed, and the concentration was sufficient for the decomposition of the nucleic acid. When hypochlorous acid was not treated or the cells were sterilized, the solution became a gel and the effect of hypochlorous acid was not observed.
  • Example 1 800 ml of the aqueous suspension of cultured cells used in Example 1 was centrifuged, and 400 ml of the supernatant was discarded to obtain 400 ml of a 2-fold concentrated cell suspension (dry cell concentration: 20% by weight). 8 ml of sodium hypochlorite was added to the aqueous suspension of the cultured cells to obtain a solution with an effective chlorine concentration of 1.4% by weight. pH was 6.5. Stir at room temperature for 2 hours, and adjust the pH to 8.2 with 5N NaOH after the reaction It was adjusted. This aqueous suspension is put into the cell crushing tank 11 shown in FIG.
  • the suspensions could be passed through the crusher without any problem after the crushing with low viscosity.
  • the viscosity was 18.2 mPa.s, which was almost the same as before crushing.
  • Comparative Example 1 the cells were crushed under alkaline conditions without sodium hypochlorite treatment, and the viscosity was examined.
  • Example 1 800 ml of the suspension having a dry cell concentration of 10% by weight used in Example 1 was placed in the cell crushing tank 11 shown in FIG. 1, and the pH was adjusted to 9.1 with 10% NaOH.
  • the reaction tank was connected to a high-pressure homogenizer model PA2K (crusher 9) manufactured by Inokuchi-Soavi Co., Ltd., and crushed once at a pressure of 400 to 500 kgfZcm 2 .
  • the viscosity after the completion of the crushing was 123 mPa.s.
  • the pH was adjusted to 11.0 and crushed, the viscosity increased sharply to 1325 mPa.s, and a part of the gel was entangled with the stirring shaft and there was a problem in introducing it to the crusher. Eleven crushings were required until the viscosity reached 30 mPa.s.
  • Example 3 In Example 3, after the hypochlorous acid treatment, the pH was made alkaline at an early stage, and the degree of decrease in the molecular weight of PHBH was examined. In addition, enzyme Z surfactant treatment was performed, and the quality after washing with water was evaluated.
  • R. eutropha was internationally deposited on August 7, 1997 as Alcaligenes e utrophus AC32 (Accession number: FERM BP-6038) into which a PHA synthase group gene derived from Aeromonas biebie was introduced. Culture was performed by the method described in Example 1 of JP-A-340078 to produce PHBH.
  • the bacterial cell content was 9.9% by weight, the weight average molecular weight was 2.07 million, the polymer content was 62% by weight, and 3HH was 4.5 mol%.
  • 12 ml of sodium hypochlorite solution (1.4% by weight in effective chlorine concentration) was added, and the mixture was stirred at 30 ° C for 2 hours. pH was 6.5. After the completion of the reaction, the mixture was centrifuged (800 rpm, 20 minutes) to remove 0.6 L of the supernatant. It was adjusted to pH 8.
  • PHBH was aggregated to increase the particle size, and PHBH was recovered.
  • the polymer after washing with ethanol obtained in the same manner as in Example 3 was used as an aqueous suspension of 200 gZL. 280 ml of 95% ethanol was added to the suspension and suspended, and then PHBH was precipitated by centrifugation. 280 ml of the supernatant was removed, and 280 ml of 95% ethanol was added to the polymer fraction to suspend PHBH. After this ethanol washing was performed twice in total, a suspension obtained by kneading 280 ml of 95% ethanol was prepared. The PHBH suspension was gradually added to 290 ml of 95% ethanol at 70 ° C over 15 minutes, and the mixture was stirred for another 10 minutes from the end of the addition to aggregate the PHBH.
  • Aggregated PHBH was recovered by filtration.
  • the PHBH was washed twice with 120 ml of 95% ethanol (equivalent to the PHBH capacity) using a filter.
  • the obtained aggregated PHBH was vacuum dried at 50 ° C. 65 g (93% recovery) of PHBH having a protein-equivalent purity of 99.9% and a total purity of 99% were obtained.
  • the particle size of the agglomerated polymer was 50 / zm.
  • the weight-average molecular weight was 1.97 million, only a 5% decrease in force after the end of the culture. Industrial applicability
  • the induction of autologous digestion of nucleic acids by treatment of microorganisms with hypochlorous acid suppresses an increase in the viscosity of the solution during the subsequent decomposition or lysis of the cells, so that the production of the cells under relatively mild conditions is suppressed. Since the recovery of the material is facilitated, the product of the microorganism can be industrially produced and provided at low cost.
  • FIG. 1 is an explanatory diagram of a cell crushing apparatus for separating and purifying PHA in the method of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing an analysis of the particle size of PHA particles obtained in Example 3.

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Abstract

本発明は、微生物の生産する各種有用物質を回収するうえで 、微生物細胞を分解または溶解した時に溶液の粘度上昇の原因となる核酸を簡便に効率よく分解する方法及びその用途を提供することにある。 本発明の生産物の回収方法は、生菌を少量の次亜塩素酸又はその塩と接触させることにより、核酸の自己消化が誘導され、続く菌体の分解または溶解時に溶液の粘度上昇が抑制されるため、比較的穏和な条件で菌体内生産物の回収が容易になる方法である。本発明の方法は、微生物細胞中より生分解性ポリマーであるポリヒドロキシアルカノエートを回収する場合に特に好ましい。

Description

明 細 書
核酸の分解方法及びその用途
技術分野
[0001] 本発明は、微生物の核酸を効果的に分解し、該微生物の生産する有用物質の回収 を容易にする方法及びその用途に関する。
背景技術
[0002] 近年、微生物あるいは組換え微生物を用いて、様々な種類の重要な製品が商業的 規模で生産されている。これらの生産物は微生物細胞内で生産'蓄積される場合が 多ぐそれらを取り出すためには、微生物細胞を分解又は溶解する工程が一般に必 要である。この工程に関する問題の 1つは、細胞を分解又は溶解した時に細胞外に 遊離してくる核酸による溶液の粘度の上昇である。核酸は、溶液中に放出されるとほ どけて網状組織を形成する。これにより細胞溶解物の粘度が著しく上昇し、例えば溶 液全体がゲルになり固体 Z液体分離が極めて困難になる。そのため、核酸による粘 度上昇は生産物の回収工程の大きな問題となり得る。
[0003] 先行技術では、化学的あるいは物理的に核酸を分解する試みが今までになされてき た。
微生物細胞（以下、菌あるいは菌体と!/、うこともある）を化学的処理する方法としては 、特許文献 1に菌体懸濁液を大量の次亜塩素酸で処理して生産物以外の菌体構成 成分を化学的に分解'可溶化し、生産物を得る方法が開示されている。この方法で は、核酸の効率的な分解がなされるけれど、わずか 1%の微生物濃度で次亜塩素酸 処理を行わな 、と純度の高 、生産物が得られず、従って大量の次亜塩素酸を必要と すること、また、生産物内に残留する塩素臭や生産物の分子量低下が引き起こされ ることが製品として好ましくな 、などの理由で実用には適して!/ヽな 、。
[0004] 特許文献 2には、核酸ではなく細胞壁の自己消化を誘導する物質として次亜塩素酸 ナトリウムが紹介されている。しかし、発明の詳細な説明あるいは実施例がなぐ発明 が完成されて 、るとは言 、難 、。
[0005] 特許文献 3には、細胞を界面活性剤で処理し遊離した核酸を過酸化物により分解す る方法が開示されている。過酸化物として過酸化水素を使用し、核酸を化学的に分 解するため室温では 16時間を要している。また、界面活性剤や過酸化水素の使用 量も比較的多いため、本法は工業的生産には不利である。
[0006] 特許文献 4には、熱処理と酵素、界面活性剤を併用した回収法が示されている。この 方法では、予め微生物の懸濁液を 100°C以上で加熱し核酸を分解したのち、各種 酵素を用いてポリヒドロキシアルカノエート（以下、 PHAと略す。）以外の菌体構成物 を分解した後 PHAを回収する方法である。ところが、 100°C以上での加熱により PH Aは著しく低分子量ィ匕してしまい、製品への応用ができなくなる。
[0007] その他にも、菌体の破砕法として、 PHA含有微生物懸濁液を pH2未満の強酸性下 50°C以上に熱した後 PHAを分離する方法 (特許文献 5)、さらには、菌体にアルカリ を添加後 80°Cに加熱し、 1時間攪拌後ポリマーを遠心分離で回収する方法 (特許文 献 6)、 70°Cで高圧破砕を行う方法 (特許文献 7)、アルカリを添加後に 70°C以上で 高圧破砕を行う方法 (特許文献 8)が開示されている。これらの方法では核酸の破砕 も行われるが、酸、アルカリ、温度などの条件が厳しいため、生産物の分解が進むこ とが懸念される。
[0008] このように、培養後の菌体から生産物を回収する上で、生産物の分解を引き起こすこ となく微生物細胞中の核酸を効率的に破砕することは極めて困難であることが分力る 。従って、細胞分解あるいは溶解を含むプロセスは、その後の生産物の回収段階を 効果的に又は実際に完全に実施しうるために、効果的な核酸の分解方法を必要とす る。
[0009] 特許文献 1 :米国特許第 5110980号明細書
特許文献 2 :特開昭 58— 212792号公報
特許文献 3：特表平 8- 502415号公報
特許文献 4:特公平 04 - 61638号公報
特許文献 5：特開平 11 266891号公報
特許文献 6：特開平 07— 31487号公報
特許文献 7：特開平 07- 31488号公報
特許文献 8：特開平 07— 31489号公報 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 従って本発明の課題は、微生物を用いて該微生物の生産する各種有用物質を回収 するうえで、微生物細胞を分解または溶解した時に溶液の粘度上昇の原因となる核 酸を簡便に効率よく分解する方法及びその用途を提供することにある。
課題を解決するための手段
[0011] 本発明者等は、上記課題を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、意外にも培養終了 後の生きた微生物を少量の次亜塩素酸又はその塩と接触させることにより、核酸が 自己消化され、続く菌体の分解または溶解時に溶液の粘度上昇が抑制されるため、 比較的穏和な条件で菌体内生産物の回収が容易になることを初めて発見し、ここに 発明を完成させた。
すなわち、本発明は、微生物による生産物を微生物細胞内より回収する工程におい て、生きている微生物を、核酸の自己消化を誘導するのに適した量の次亜塩素酸又 はその塩と接触させ、その後生産物回収工程を行うことを特徴とする生産物の回収 方法である。本発明は、好ましくは、生きている微生物を乾燥微生物当たり有効塩素 濃度 0. 3— 14重量％の次亜塩素酸又はその塩と 10分一 5時間接触させることにより 核酸を自己消化させ、続いて微生物を分解あるいは溶解し生産物を回収する方法で ある。また、本発明の方法は、微生物細胞中より生分解性ポリマーであるポリヒドロキ シアルカノエートの回収に用いることが特に好ましい。
以下、本発明について詳細に説明する。
[0012] 本発明に用いる次亜塩素酸又はその塩は、工業的には次亜塩素酸ナトリウムあるい は次亜塩素酸カルシウム（さらし粉）として手に入れることができる。これらの内、次亜 塩素酸ナトリウムの使用が安価な点、及び水への溶解時の安定性の点で好ましい。
[0013] 本発明において菌体中の核酸が分解した力どうかの検定は、簡便には微生物をアル カリにより溶菌させ粘性を調べればよい。核酸が分解していないと、アルカリによる溶 菌により核酸が遊離し、菌体懸濁液がゲル状になり流動性がなくなるが、核酸が分解 していると、アルカリ添加後も該懸濁液は流動性があり、両者は容易に判別できる。ま た、大量実験の場合には、例えば粘度計などを用いて粘度を測定すればよい。 [0014] 培養後の生きて!/、る菌（以下、生菌と 、うこともある）を核酸の自己消化を誘導するの に適した量の次亜塩素酸又はその塩と接触させて処理し、アルカリを加えると、菌体 懸濁液に流動性があるため核酸が分解して 、ることがわかるが、生菌を加熱滅菌し たのち同様に次亜塩素酸又はその塩で処理し、アルカリをカ卩えると粘性の高いゲル になる。このことから、次亜塩素酸又はその塩での処理は生菌に対して有効であるこ と力示される。
また、生菌への次亜塩素酸又はその塩での処理終了後の菌体を顕微鏡により観察 しても溶菌は見られず、菌体は生菌と同じ形態を保っているので、次亜塩素酸又は その塩との接触により、細胞壁、細胞膜、不溶性蛋白質等は分解されていないと考え られ、これより次亜塩素酸又はその塩は、直接核酸に作用して化学的に分解してい るのではなぐ間接的に核酸の分解（自己消化）を誘導していることが示唆される。
[0015] 本発明においては、菌体を熱処理やアルカリ、酸処理などの殺菌処理をすることなく 、生菌の状態で次亜塩素酸又はその塩で処理をする必要がある。次亜塩素酸又は その塩は、微生物を培養後に直接該培養液に添加しても良いし、遠心分離や膜分 離などの方法により菌体を回収した後に添加しても良い。
[0016] 本発明の実施態様によれば、次亜塩素酸又はその塩の濃度は、核酸の自己消化を 誘導するのに適した量であれば制限はない。本発明では、次亜塩素酸又はその塩 の濃度は有効塩素濃度に換算した値で示している。有効塩素濃度とは、次亜塩素酸 又はその塩に酸を加えて発生する塩素（C12)の濃度である。以下、次亜塩素酸又は その塩の濃度は、有効塩素濃度に換算した乾燥菌体重量 (g)当たりの重量％で表 示する。微生物の種類によりその濃度は異なると考えられ、使用する微生物に合わ せて濃度を決定すればょ 、。
[0017] 一般的に使用する次亜塩素酸又はその塩の濃度としては、好ましくは 0. 3重量％以 上、より好ましくは 0. 4重量％以上、さらにはより確実に核酸分解を誘導する点で 0. 5重量％以上が特に好ましい。次亜塩素酸又はその塩の濃度の上限は、濃すぎると 菌が死滅するため好ましくは 14重量％以下、より好ましくは 10重量％以下、さらには 経済的に安価なことを考慮すると 8重量％以下が特に好ましい。例えば、次亜塩素酸 ナトリウムは水溶液として入手可能であり、工業的には有効塩素濃度 12重量％の溶 液として供給されている。
次亜塩素酸又はその塩の濃度は、微生物量に対して規定されるため、微生物の溶 液中の濃度には制限されない。
[0018] 本発明の方法は、微生物細胞の化学的な溶解や分解 (米国特許第 5110980号明 細書、特開昭 58— 212792号公報、特表平 8— 502415号公報）ではないため、比較 的高 、微生物濃度で行うことができる。次亜塩素酸又はその塩での処理の効果を考 慮すると、微生物濃度は、乾燥菌体換算で好ましくは 3重量％以上、より好ましくは 5 重量％以上、さらには 8重量％以上が特に好ましい。また、上限は生菌が十分攪拌 できればよぐ好ましくは 50重量％以下、より好ましくは 40重量％以下、特に 30重量 %以下が好ましい。
[0019] 微生物と次亜塩素酸又はその塩との接触時間は、効果的な核酸分解酵素誘導と核 酸の自己消化のために好ましくは 10分以上、より好ましくは 20分以上、さらに好まし くは 30分以上である。処理時間の上限は、生産物の分解酵素が誘導され分解され てしまう可能性を考慮し、好ましくは 5時間以内、より好ましくは 3時間以内、さらには 2 時間以内が特に好ましい。
自己消化を誘導する温度は、使用する微生物の好適生育 (培養)温度が好ましい。 微生物により好適生育温度は異なる力 一般的に述べると、およそ 15°C力 40°Cの 範囲が好ましい。例えばアルカリゲネス'ユート口ファスの場合 20°Cから 35°Cであり、 大腸菌の場合 20°Cから 37°C、酵母の場合 25°Cから 37°C前後の温度が好ま 、。
[0020] 微生物と次亜塩素酸又はその塩との接触により自己消化を誘導する pHは、使用す る微生物の好適生育 (培養) pHが好まし 、。一般的には pH4から pH8が好ま 、が 、例えば、大腸菌の場合 pH5から pH7、アルカリゲネス ·ユート口ファスの場合には p H5から pH7、酵母の場合 pH4力も pH7が好ましい。尚、次亜塩素酸又はその塩は 特表平 8— 502415号公報に開示されて 、る過酸化物には当たらな!/、。
[0021] 本発明の方法において、微生物による生産物としては特に限定されず、例えば、ポリ ヒドロキシアルカノエート (PHA)、蛋白質、抗生物質、脂質、炭水化物等が挙げられ る力 本発明は、微生物による生産物が特に生分解性ポリマーである PHAである場 合に特別の用途を有する。 [0022] 本発明の好ましい実施態様によれば、 PHAのヒドロキシアルカノエートの成分として は特に限定されないが、具体的には、 3—ヒドロキシブチレート（3HB)、 3—ヒドロキシ バレレート（3HV)、 3—ヒドロキシプロピオネート、 4ーヒドロキシブチレート、 4ーヒドロキ シバレレート、 5—ヒドロキシバレレート、 3—ヒドロキシへキサノエート（3HH)、 3—ヒドロ キシヘプタノエート、 3—ヒドロキシォクタノエート、 3—ヒドロキシノナノエート、 3—ヒドロ キシデカノエートなどが挙げられる。本発明におけるポリヒドロキシアルカノエートは、 これらヒドロキシアルカノエートの単独重合体であってもよ 、し、 2種以上が共重合し た共重合体であってもよ 、が、 2種以上が共重合した共重合体であることが好ま 、
[0023] PHAの具体例としては、 3HBの単独重合体である PHBや、 3HBと 3HVの 2成分共 重合体である PHBV、 3HBと 3HHとの 2成分共重合体である PHBH (特許第 2777 757号公報参照）または、 3HBと 3HVと 3HHとの 3成分共重合体である PHBHV( 特許第 2777757号公報参照）などが例示できる。特に、生分解性ポリマーとしての 分解性と柔らか 、性質を持つ点で、モノマー成分として 3HHを有する共重合体が好 ましぐより好ましくは PHBHである。
[0024] PHBHの場合、構成する各モノマーユニットの組成比については特に限定されるも のではないが、好ましくは 3HHユニットが 40mol%以下であり、より好ましくは 30mol %以下、とりわけ 20mol%以下が好ましい。 PHBHVの場合、構成する各モノマーュ ニットの糸且成比については特に限定されるものではないが、例えば、 3HBユニットの 含量は 1一 95mol%、 3HVユニットの含量は 1一 96mol%、 3HHユニットの含量は 1 一 30mol%といった範囲のものが好適である。
[0025] PHAを実用化するためには、 PHAはゲルクロマトグラフィー法でポリスチレンを分子 量標準とした重量平均分子量 1万以上を有しなければならない。種々の用途により適 切な分子量が異なるのは当然である力 ペレットィヒやその後の加工段階での熱によ る低分子量化を考慮すると、本発明により回収し乾燥した PHAの重量平均分子量は 、好ましくは 20万以上、より好ましくは 30万以上、特に 40万以上である。
[0026] 好ましい実施態様によれば、本発明に用いられる微生物としては、細胞内に PHAを 含有することが可能な生物が好ましぐ例えば、 Alcaligenes lipolytica、 Alcalige nes latus等のァノレカリゲネス（Alcaligenes)属、 Ralstonia eutrophaなどのラノレ スト-フ (Raistoniaノ J¾、 Psuedomonas oleovorance、 Psuedomonas resmov orans等のシユウドモナス（Pseudomonas)属、バチルス（Bacillus)属、ァゾトバクタ 一 (Azotobacter)腐、 Nocardia salmonicolur等のノカノレティア (Nocardia)属、 Aeromonas caviae等の エロモナス (Aeromonas) J¾、 Rhodospirillum rubru m等のロドスピリリウム（Rhodospirillum)属、 Zoogloea ramigera等のズーグロェ ァ (Zoogloea)属、メチロノくクテリゥム (Methylobacterium)属、ノ ラコッカス (Parac occus)属、クロストリジゥム（Clostridium)属、ハロバクテリゥム（Halobacterium)属 、キャンディダ (Candida)属、サッカロマイセス (Saccharomyces)属、ャロウィァ (Y arrowia)属などの微生物は、培養条件を調整することによって PHAを細胞内に蓄 積することが可能である。上記微生物としては、ァエロモナス 'キヤビエ (Aeromonas caviae)力ヌ子 ¾;し！ヽ^
[0027] また、本発明に用いられる微生物としては、これら微生物の PHA合成に関与する遺 伝子群を導入した形質転換体であっても良い。その場合、宿主としては特に限定さ れず、上記微生物の他、大腸菌や酵母 (WO01Z88144参照)などの微生物が挙 げられる。このなかで、ァエロモナス属の A. caviaeや、該 A. caviaeの PHA合成酵 素群の遺伝子を導入した形質転換菌体が、生分解性ポリマーとして優れた PHBHを 合成できる能力があるという点で好ましい。特に、 A. caviaeの PHA合成酵素群の遺 伝子を導入した Ralstonia eutrophaがより好ましぐ該微生物の 1例は、 Alcaligen es eutrophus AC32 (受託日：平成 9年 8月 7日、受託番号： FERM BP - 6038) として、日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6にある独立行政法人産業技 術総合研究所特許生物寄託センターに、ブダペスト条約に基づいて国際寄託されて いる。
ここに挙げた PHA含有微生物の培養方法については特に限定されないが、例えば 特開 2001— 340078号公報に示した当業者に周知の方法が用いられる。
[0028] 本発明の方法は、微生物による生産物が PHAである場合、生きている微生物を、核 酸の自己消化を誘導するのに適した量の次亜塩素酸又はその塩と接触させた後に 行う生産物回収工程が、下記 (a)及び (b)の工程力もなるものであることが好ま 、。 (a) PHA含有微生物細胞の水性懸濁液に、攪拌と物理的破砕処理を行!ヽながらァ ルカリを添加し、該細胞を破砕すると共に、該細胞中の PHA以外の細胞物質を可溶 化又は乳化させ、次いで PHAを懸濁液から分離する工程；
(b)分離された PHAを、酵素及び Z又は界面活性剤で処理し、 PHAに付着した不 純物を可溶化又は分解後可溶化し、続ヽて親水性溶媒及び Z又は水で PHAを洗 浄する工程。
すなわち、本発明の好ましい実施態様によれば、 PHA含有微生物細胞力 当該ポリ マーを回収する時、次亜塩素酸又はその塩で処理し核酸を自己消化した後、工程（ a)に進むことができる。本発明における工程 (a)では、 PHA含有微生物細胞の水性 懸濁液の撹拌と物理的破砕処理を行 、ながら、該水性懸濁液にアルカリを添加する ことが重要である。すなわち、実際には、（l) PHA含有微生物細胞の水性懸濁液を 調製し、（2)該水性懸濁液を攪拌しつつ、物理的破砕処理をまず開始し、（3)次に、 攪拌と物理的破砕処理を継続しながらアルカリを添加する、 t ヽぅプロセスカゝらなる。
[0029] アルカリ添カ卩時の水性懸濁液の攪拌方法としては、特に限定されないが、アルカリを 効率よく拡散し、且つ細胞力 流出するポリマー以外の不溶物質を効率よく破砕する ために、乳化分散機や超音波破砕機等を使用して攪拌することが好ましい。より好ま しくは乳化分散機であり、例えば英国シルバーソン社製シルバーソンミキサー、 日本 国ェムテック社製クリアミックス、日本国エバラ社製エバラマイルダ一等が使用できる 力 これらに限定されるわけではない。
[0030] 工程 (a)にお 、て、物理的破砕処理を行う装置としては、特に限定されな!、が、高圧 ホモジナイザー、超音波破砕機、乳化分散機、ビーズミル等が挙げられる。中でも高 圧ホモジナイザーが好ましぐ微生物細胞の水性懸濁液が、微小開口部を有する耐 圧性容器に導入され、高圧をかけられることにより開口部力 押し出されるタイプがよ り好ましい。このような耐圧性容器と加圧機構力もなる装置は、例えば、伊国-口ソァ ビネ土製高圧ホモジナイザーが好ましく用いられる。また、ブランリューべ連続式細胞 破砕機（独国 Bran+Luebbe社製）、マイクロフルイダィザー（米国 Microfluidics社 製)等も用いることができる力 これらに限定されるわけではない。
[0031] このような高圧ホモジナイザーでは、微生物細胞が大きな剪断力を受けるため効率 的に破壊され、 PHAの分離が促進される。また、当該装置では開口部で高圧がかか り、瞬間的に高温になる。ポリマーは高温では分解し易いため、必要に応じて一般の 低温恒温循環槽により水性懸濁液を冷却して、温度の上昇を防ぎ処理を行うのが好 ましい。好ましい破砕圧力は 300kgfZcm2以上であり、より好ましくは 400kgfZcm2 以上である。
[0032] 本発明者らは、 PHA回収時に、先にアルカリを添カ卩して懸濁液の pHを 10以上にし た後、物理的破砕 (例えば高圧ホモジナイザーによる菌体破砕と乳化)をすると、 PH Aの分解が生じやすいこと、逆に、アルカリ添加よりも物理的破砕を先に行うと、意外 にも PHAの分解が生じにくいことを見いだした。しかし、この場合でも、未消化の核 酸が存在すると、その未消化の核酸により粘度が高くなるため、 PHAを回収し易くす るためには徐々にアルカリを添加し、粘度が急激に上昇するのを避けながら核酸を 時間をかけて何回も破砕する必要があった。このため、工業規模での生産の場合、 ポリマー回収工程が長時間となるため、生産量を上げるには破砕機の台数を多くす る必要があった。しかし、本発明の核酸自己消化法を用いることにより、物理的破砕 の時間が大幅に短縮でき、従って破砕機の台数が削減でき、結果的に製造コストの 削減に繋がることが明らかである。
[0033] 工程（a)では、水性懸濁液の pHを 9から 13. 5の間にコントロールしながら物理的破 砕を行うことが好ましぐアルカリ添カ卩時に pHをコントロールすることが好ましい。 PH A以外の菌体由来の不溶物 (細胞物質)をより効果的に可溶ィ匕又は乳化することが でき、かつ PHA自体には悪影響をほとんど与えな 、好まし 、pHの範囲は pH9— 13 . 5であり、より好ましい下限は pH10、より好ましい上限は pH13である。 pHが 13. 5 より上では PHAの分子量が低下し易くなり、 pHが 9未満では破砕効果が不十分とな る。
[0034] 工程 (a)にお 、ては、次亜塩素酸又はその塩で処理後、菌体の物理的破砕を行 ヽ ながら、徐々にあるいは段階的にアルカリを添加し所定の pHに調整し物理的破砕を 継続するのが好ましぐ特に、菌体全量の物理的破砕を少なくとも 1回行った後で、 水性懸濁液の攪拌を行いながらアルカリを添カ卩して PH9— 13. 5の任意の pHに調 整し、且つ pHをコントロールしながら物理的破砕を継続する方法がより好ましい。こ れにより、 PHA以外の不溶物質 (細胞物質)の可溶ィヒあるいは乳化が短時間で実施 でき、 PHAが分解されることなぐ水性懸濁液力も PHAを容易に分離 ·回収できるよ うになる。
[0035] 工程 (a)を行う際の温度は、 PHAの分子量低下をより効果的に防ぐ点から、好ましく は 10— 45°C、より好ましくは 20— 40°Cである。本発明において、 pHをコントロール することによって、 pHが高くなりすぎるのを防ぐと同時に、常に pH9— 13. 5の間の 任意の pHを維持することで不溶性蛋白質を可溶ィ匕状態に保てるため、懸濁液を高 温にする必要がなくなり、結果として、 PHAの分子量低下を、培養後に得られるもの と比較して 15%以下に防ぐことができる。物理的破砕処理に高圧ホモジナイザーを 使用する場合、前記したように低温恒温循環槽により菌体懸濁液を冷却して行えば よい。このような好適なアルカリ環境下で微生物細胞を破砕すると、再現性のより高い 結果を得ることができる。
[0036] 工程 (a)にお 、て、水性懸濁液は、次亜塩素酸又はその塩との接触を行った後の P HA含有微生物細胞を水性媒体に懸濁することにより調製することができる。また、微 生物と次亜塩素酸又はその塩との接触を行った後の培養液をそのまま用いてもよい し、更に濃縮や希釈を行ってもよい。水性懸濁液中の菌体の濃度は、水性懸濁液 1 L中の乾燥菌体換算で 500g以下が好ましぐ水性懸濁液の攪拌のしゃすさから、 30 Og以下がより好ましい。下限としては、 80g以上が好ましい。
[0037] 工程 (a)で使用するアルカリは、 PHA含有微生物の細胞壁を破壊して、該細胞中の PHAを細胞外に流出できるものであれば特に限定されるものではな 、。上記アル力 リとしては、例えば、水酸化ナトリウム、水酸ィ匕カリウム、水酸化リチウム等のアルカリ 金属の水酸ィ匕物;炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等のアルカリ金属の炭酸塩;炭酸水素 ナトリウム、炭酸水素カリウム等のアルカリ金属の炭酸水素塩;酢酸ナトリウム、酢酸力 リウム等の有機酸のアルカリ金属塩；ホウ砂等のアルカリ金属のホウ酸塩；リン酸 3ナト リウム、リン酸水素 2ナトリウム、リン酸 3カリウム、リン酸水素 2カリウム等のアルカリ金 属のリン酸塩；水酸化バリウム等のアルカリ土類金属の水酸化物；アンモニア水等が 挙げられる力 これらに制限されるものではない。これらは、単独で用いてもよいし、 2 種以上を併用してもよい。この中でも、工業生産に適し、また価格の点から、アルカリ 金属の水酸ィ匕物やアルカリ金属の炭酸塩が好ましぐより好ましくは水酸ィ匕ナトリウム 、水酸ィ匕カリウム、水酸化リチウム、炭酸ナトリウムである。
[0038] 工程 (a)において、 PHAの水性懸濁液からの分離は、例えば、遠心分離、膜分離、 フィルター濾過等により行うことができる。
なお、本発明においては、工程 (a)の後、得られた PHAをェマルジヨンとして回収す ることちでさる。
[0039] 以下、工程 (a)を行うための好ましい装置の概略図である図 1を用いて、工程 (a)をよ り詳細に説明する。勿論、本発明はこれら装置例に限定されるものではない。
図 1における符号 1は、全体で本発明の菌体破砕装置を示している。符号 6はアル力 リの薬剤を貯留するための pH調整剤貯留槽であり、該 pH調整剤貯留槽 6内の薬剤 力 ポンプ 4によって管路 5を介して菌体破砕槽 11に供給され、菌体破砕槽 11内の 微生物細胞の水性懸濁液の pHを必要に応じて調整する。さらに、菌体破砕槽 11に は pH調整剤貯留槽 6より供給された pH調整剤を、菌体破砕槽 11内の微生物細胞 の水性懸濁液に均一に攪拌混合するための撹拌装置 2が付設されている。また、菌 体破砕槽 11には、菌体破砕槽 11内の微生物細胞懸濁液の pHを検知して、所定の pHとなるように、ポンプ 4の供給量を制御するために、 pH計 7と pH検知制御装置 3 から構成される pH検知制御手段が付設されて ヽる。ここで菌体破砕槽 11は低温恒 温循環槽を兼ねており、微生物細胞の水性懸濁液を所望の温度に一定に保つこと ができる。
[0040] 図 1において、菌体破砕槽 11内の微生物細胞の水性懸濁液は、ポンプ 10を介して 破砕装置 9に供給され、該破砕装置 9により粘度上昇の原因となる未消化の核酸を 効率よく破砕し、管路 8を介して菌体破砕槽 11内へ供給するようになっている。撹拌 装置 2によって、添加されたアルカリは速やかに拡散し、微生物細胞の水性懸濁液 が均一となり、微生物細胞の水性懸濁液の pHを厳密に調整できるようになつている。 ここで、アルカリ濃度が部分的に高濃度となりポリマーが加水分解を受けないように、 攪拌を十分に行うことが好ましい。なお、コントロールする pHの上下幅としては、設定 値の上下それぞれ 1以内が好ましぐより好ましくは上下それぞれ 0. 5以内であり、当 該上下幅を見込んだ pHが、上記好ましい pH範囲 9一 13. 5となるように制御すること が好ましい。
[0041] 破砕装置 9には、上述したような高圧ホモジナイザー、超音波破砕機、乳化分散機、 ビーズミル等の装置を使用できる。また、同種あるいは異種の破砕機を 2基以上、並 列或いは直列に設置しても良い。撹拌装置 2には、添加したアルカリを効率よく拡散 し、且つ細胞力 流出した未消化の核酸や細胞壁、その他の不溶性物質なども効率 よく破砕するため、上述したような乳化分散機や超音波破砕機等の使用が好ましい。 これら機器にはインラインミキサータイプのものも製造されており、例えば、これらは図 1のポンプ 10と撹拌装置 2を兼用することもでき、この場合には構造が簡便になる利 点がある。また、 pH計 7や pH検知制御装置 3は汎用機器を使用すればよい。
[0042] 本発明にお ヽては、工程 (a)で得られた比較的純度の低!ヽ PHAに対して、工程 (b) の処理を行うことにより、後述するようなより顕著な効果が得られる。
工程 (a)で得られる PHA粒子には、蛋白質類、菌体細胞壁成分であるペプチドダリ カン、脂質類、多糖類、核酸類、その他の炭水化物類が少量付着していると考えられ る。本発明における工程 (b)では、上記付着成分の少なくとも幾つかを除去し、 PHA の純度を高めることを目的として行うことができる。
すなわち工程 (b)は、酵素及び界面活性剤のいずれか、あるいはこれらを併用して、 PHAに付着した不純物を可溶化又は分解後可溶化処理する PHAの精製法である
[0043] 本発明においては、工程 (b)での処理効果をより高めるために、工程 (a)で分離され た PHAを乾燥させて用いるのではなぐ工程 (a)で分離された PHAを水に懸濁した まま、あるいは、例えば遠心分離や膜分離により分離回収した後の水に湿潤した状 態のまま、次の工程 (b)に用いるのが好ましい。
[0044] 工程 (b)において酵素による処理を行う場合、使用される酵素としては、蛋白質分解 酵素、脂肪酸類分解酵素、細胞壁分解酵素、核酸分解酵素等が挙げられる。これら は、単独で用いてもよいし、 2種以上を併用してもよい。これらの酵素の具体例として は下記のものが挙げられる。蛋白質分解酵素（プロテアーゼ）としては、アルカラーゼ 、ペプシン、トリプシン、パパイン、キモトリブシン、アミノぺプチダーゼ、カノレボキシぺ プチダーゼ等が挙げられる。脂肪酸類分解酵素としては、リパーゼ類、ホスホリパー ゼ類、コリンエステラーゼ類、ホスファターゼ類等が挙げられる。細胞壁分解酵素とし ては、リゾチーム、アミラーゼ、セノレラーゼ、マノレターゼ、サッカラーゼ、 α及び j8—グ リコシナーゼ等が挙げられる。核酸分解酵素としては、リボヌクレアーゼ類等が挙げら れる。これらは、単独で用いてもよいし、 2種以上を併用してもよい。
[0045] 本工程で用いられる酵素は、上記のものに限定されるわけではなぐ工業的な製品 に用いられ得るものであれば、任意の酵素であってよい。また、一般に巿販されてい る酵素入り洗濯用酵素洗剤等も用いることができる。さらには、例えば酵素と、酵素の 安定化剤や再汚染防止剤等を含有する酵素組成物であってもよぐ酵素のみには限 定されない。
[0046] 酵素として、特に PHAに付着した不溶性蛋白質や不溶性の細胞壁を分解除去する 目的においては、蛋白質分解酵素及び細胞壁分解酵素から選ばれる少なくとも 1種 が好ましぐ蛋白質分解酵素がより好ましい。好ましい蛋白質分解酵素としては、上 記例示に含まれるもののうち、プロテア一ゼ八、プロテア一ゼ!3、プロテアーゼ N (以上 、商品名、全て天野ェンザィム社製）、アルカラーゼ、ザピナーゼ、エバラーゼ (以上 、商品名、全てノボザィム社製)等が工業的に使用可能なものとして挙げられ、分解 活性の点からも好適に使用できる。また、好ましい細胞壁分解酵素としては、上記例 示のうちリゾチームが挙げられる。し力し、これらに限られるものではない。
[0047] 酵素処理を行う場合の温度は、当然のごとく選択した酵素の至適温度が好ましい。し かし、高温では PHAの分子量低下が生じるため、上限は 50°C以下がより好ましい。 下限は一般的には 20°C以上が好ましい。酵素処理時間は、所要の処理度を達成す るまで行うのが好ましぐ通常 0. 5— 2時間である。酵素の使用量は、酵素の種類及 び活性に依存し、特に制限はされないが、ポリマー重量に対して、 0. 001— 10重量 %が好ましぐさらにはコストの点力も 0. 001— 5重量％がより好ましい。
[0048] 本発明の方法は、 PHAを含有する菌体そのものを酵素処理して、菌体を破砕する 従来の方法 (特公平 04— 61638号公報）に比較して、 PHA中にわずかに残った不 溶物を可溶ィ匕するに足る酵素量を添加すれば良いため、経済的に安価に製造でき る利点がある。
[0049] 工程 (b)において、酵素処理はいくつかの段階に分けて実施してよぐ例えば最初の 段階では 1つの酵素を用い、次いで同一又は異なる酵素を用いて処理を行ってもよ い。また二種以上の酵素を使用する場合には、互いに消化し合わなければそれらを 混合した酵素を用いて 1段階で PHAを処理するのが便利である。
[0050] 本発明における工程 (b)では、 PHA粒子に付着した不純物を除去するために、可溶 ィ匕剤として界面活性剤を使用することも可能である。本発明で使用する界面活性剤と しては、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン界 面活性剤等が挙げられる。これらは、単独で用いてもよいし、 2種以上を併用してもよ い。
陰イオン界面活性剤としては、アルキル硫酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、ァ ルキル又はアルケ-ル硫酸エステル塩、アルキル又はアルケニルエーテル硫酸エス テル塩、 α—才レフインスルホン酸塩、脂肪酸塩又はこのエステル、 α—スルホ脂肪酸 塩又はこのエステル、アルキル又はァルケ-ルエーテルカルボン酸塩、アミノ酸型界 面活性剤、 Ν—ァシルアミノ酸型界面活性剤等が挙げられる。中でも、アルキル基の 炭素数が 12— 14のアルキル硫酸塩、アルキル基の炭素数が 12— 16の直鎖アルキ ルベンゼンスルホン酸塩、アルキル基の炭素数が 10— 18のアルキル硫酸エステル 塩、アルキルエーテル硫酸エステル塩が好ましい。また、対イオンとしては、ナトリウム 、カリウム等のアルカリ金属、マグネシウム等のアルカリ土類金属、モノエタノールアミ ン、ジエタノールァミン、トリエタノールァミン等のアルカノールァミンが好ましいが、こ れらに限られるわけではない。
[0051] 陽イオン界面活性剤としては、アルキルトリメチルアンモ -ゥム塩、ジアルキルジメチ ルアンモ-ゥム塩等が挙げられる。
両性界面活性剤としては、カルボべタイン型、スルホベタイン型の界面活性剤等が挙 げられる。
[0052] 非イオン界面活性剤としては、ポリオキシアルキレン (好ましくはォキシエチレン)アル キル又はアルケニルエーテル、ポリオキシアルキレン（好ましくはォキシエチレン）ァ ルキル又はアルケユルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンァ ルキル又はアルケニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール 、ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシエチレンアルキルァミン、高級脂肪酸アル 力ノールアミド、アルキルダルコシド、アルキルグルコースアミド、アルキルアミンォキ サイド等が挙げられる。中でも、親水性の高いもの、及び、水と混和した際に生じる液 晶の形成能の低いもの若しくは液晶を生じないものが好ましぐまた、生分解性が比 較的良好である点で、炭素数 10— 14のポリオキシアルキレンアルキルエーテル、ポ リオキシエチレングリコール等の使用が好ましぐ炭素数 10— 14のポリオキシアルキ レンアルキルエーテルとしては炭素数 10— 14のポリオキシエチレンアルキルエーテ ルが好まし 、が、これに限られるわけではな！/、。
[0053] 上記界面活性剤において、具体的には、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルベンゼン スルホン酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デォキシコール酸ナトリウム、ォレイン酸ナ トリウム等の陰イオン界面活性剤；ポリオキシエチレングリコール、炭素数 10— 14の ポリオキシエチレンアルキルエーテル等の非イオン界面活性剤力 価格、使用量、添 加効果の点で好まし 、。またこれらを 2種以上併用することも好ま 、。
[0054] 以上挙げた界面活性剤は、一般に市販されている洗濯用洗剤にも使用されているも のであり、適当な洗濯用洗剤を界面活性剤として使用することができる。
なお、洗浄性の点では、陰イオン界面活性剤、非イオン界面活性剤が好ましい。蛋 白質等を洗浄'除去する目的においては、陰イオン界面活性剤を用いることが好まし ぐまた、脂肪酸や油脂を洗浄'除去する目的、あるいは、酵素を併用する場合には 、非イオン界面活性剤を用いることが好ましい。また、陰イオン界面活性剤及び非ィ オン界面活性剤の両方を含有してもカゝまわない。両方を含有する場合、陰イオン界 面活性剤 Z非イオン界面活性剤の重量比は、 1Z100— 100Z10が好ましぐ 5/1 00— 100/20力 Sより好まし <、 5/100— 100/100力 Sさらに好まし <、 5/100— 50 Z100が特に好ましい。
[0055] 界面活性剤の添加量は、特に制限されないが、ポリマー重量に対して、 0. 001— 10 重量％が好ましぐさらにはコストの点から、 0. 001— 5重量％が好ましい。
また、界面活性剤処理における処理温度は特に限定されないが、 PHA以外の菌体 構成成分の可溶化を促進させる観点から、 20— 50°Cの範囲が好ましい。また、処理 時間は通常 0. 5— 2時間が好ましい。
[0056] 本発明の好ましい実施態様として、より高い精製効果が得られる点から、酵素と界面 活性剤を併用することが挙げられる。酵素と界面活性剤を併用する場合、酵素の使 用量及び界面活性剤の使用量は、それぞれ上記と同じである。また、当該併用の場 合、処理温度は、好ましくは 20— 50°Cであり、処理時間は、好ましくは 0. 5— 2時間 である。酵素処理、界面活性剤処理ともに、攪拌しながら行うことが好ましい。
本発明者らは、 2剤併用の顕著な効果を認めている。その理由は、酵素分解により遊 離し不溶性となった分解物を、界面活性剤が効果的に除去するため、あるいは、界 面活性剤により蛋白質の構造が変化して酵素分解を受けやすくなるためと考えられ る。この場合、界面活性剤と酵素を別々に調製し、適宜混合して用いることができる 力 市販の酵素配合洗濯用洗剤は界面活性剤と酵素の混合物であることから、これ をそのまま使用することもできる。
本発明の（b)工程において、酵素、界面活性剤のどの処理を行うかは、特に除去し たい不純物の種類、コスト、その他プロセス上の制約、目的とする PHAの純度等の 理由や目的によって適宜自由に選択できる。
[0057] 本発明では、工程 (b)にお 、て、上記酵素及び Z又は界面活性剤処理により得られ た PHA粒子は、脱脂'脱臭 ·脱色など夾雑物の更なる除去のために、親水性溶媒及 び Z又は水による洗浄を行うことが好ましい。本工程により、より純度の向上した PH Aを単離することができる。本工程で用いられる親水性溶媒としては特に限定されな いが、具体的にはメタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、アセトン、 ァセトニトリル、テトラヒドロフラン等が挙げられる。これら親水性溶媒の中では、経済 的に安価で洗浄効果のあるメタノールとエタノールが特に好ましい。また、上記親水 性溶媒は、水と混合して使用することもできる。水と親水性溶媒の混合溶媒を用いる 場合、その混合体積比 (水 Z親水性溶媒)は 9. 5/0. 5-0. 5/9. 5程度が好まし い。洗浄に用いる上記溶媒の量としては、特に限定されないが、好ましくはポリマー 体積と等量以上の量である。洗浄時の温度は、好ましくは 20°C以上 60°C未満である 。さらに、本洗浄は水のみで行っても良い。
[0058] 本発明においては、この工程 (b)が終了した段階で、高純度の PHAを回収すること ができ、成形材料等として使用することが可能である。特に、この時点での PHAは平 均粒径 0. 7ミクロンの微粒子カゝらなるェマルジヨンを形成するため、例えば紙などへ のコーティング材としての用途に好適に使用できる。しかし、これに限られるわけでは ない。
[0059] 本発明の好ましい実施態様によれば、工程 (b)で得られた PHAは粒径が数ミクロン 程度という微粒子であるため、分離性、取り扱い性等の点から、さらに以下の工程 (c) にお 、て、 PHAを適当な粒径にまで凝集させてもょ 、。
(c)洗浄された PHAを親水性溶媒及び Z又は水に懸濁し、該懸濁液の沸点以下の 温度で攪拌することにより、 PHAを凝集させて粒度を大きくし、次いで凝集した PHA を懸濁液力 分離する工程。
本発明の工程 (c)は、工程 (b)によって精製された PHAを、親水性溶媒及び Z又は 水に懸濁し、該懸濁液をその沸点以下の温度で撹拌するという簡便な操作によって 、 PHA粒子を凝集させ、その粒径を大きくする工程である。
[0060] 工程 (c)で使用する親水性溶媒としては、特に限定されるものではないが、例えばメ タノ一ノレ、エタノーノレ、 1 プロパノーノレ、 2—プロパノーノレ、ブタノーノレ等のァノレコーノレ 類;アセトン、メチルェチルケトン等のケトン類;テトラヒドロフラン、ジォキサン等のェ 一テル類；ァセトニトリル、プロピオ-トリル等の-トリル類；ジメチルホルムアミド、ァセ トアミド等のアミド類;ジメチルスルホキシド、ピリジン、ピぺリジン等が挙げられる。中 でも、メタノール、エタノール、 1 プロパノール、 2—プロパノール、ブタノール、ァセト ン、メチルェチルケトン、テトラヒドロフラン、ジォキサン、ァセトニトリル、プロピオ二トリ ル等が、溶媒の除去性が良好である点力 好ましい。また、メタノール、エタノール、 1 プロパノール、 2—プロパノール、ブタノール、アセトン、テトラヒドロフラン、ァセトニト リル力 入手が容易である点力もより好ましい。さらに好ましくは、工程 (b)の PHA洗 浄に用いた溶媒を使用することであり、これにより連続的に凝集操作に移れること、溶 媒槽が 1種類で賄えることから設備費の削減等ができる。従って、メタノール、ェタノ ール、プロパノール、イソプロパノール、アセトン、ァセトニトリル、テトラヒドロフランがさ らに好ましい溶媒として挙げられる。これらの中でも、経済的に安価でかつ洗浄効果 のあるメタノールとエタノールが特に好まし 、。
[0061] また、上記親水性溶媒は、水と混合して使用することもできる。つまり、懸濁液は、そ の分散媒として、親水性溶媒のみ、水のみ、親水性溶媒と水との混合溶媒、のいず れであってもよぐ好ましくは親水性溶媒と水との混合溶媒である。混合溶媒中の親 水性溶媒の濃度は、より十分な凝集効果を得るために、好ましくは 10重量％以上、よ り好ましくは 20重量％以上である。また、親水性溶媒の上限は、好ましくは 99重量％ 以下、より好ましくは 98重量％以下、更に好ましくは 97重量％以下である。
[0062] 工程 (c)の懸濁液中の PHAの濃度は特に限定されないが、好ましくは lgZL以上、 より好ましくは lOgZL以上、さらに好ましくは 30gZL以上である。また、上限は PHA 懸濁液の流動性を確保する点から、好ましくは 500gZL以下、より好ましくは 300g ZL以下、さらに好ましくは 200gZL以下である。本発明の工程 (c)において、攪拌 する手段としては、攪拌槽等、乱流を生じさせるものが挙げられるが、特に限定される ものではない。本発明の工程 (c)における凝集時の温度としては、室温 (約 24°C)以 上が好ましぐ 40°C以上がより好ましぐ 60°C以上がさらに好ましい。上限は特に限 定されず、該懸濁液の沸点までの任意の温度を選択できる。また、工程 (c)は、常圧 あるいは高圧 、ずれの条件でも行うことができる。
[0063] 本発明の工程 (c)では、通常、数分程度の極めて短時間で凝集を起こさせることが できるため、凝集後すぐに濾過等により PHAを単離すれば、温度による PHAの分子 量低下にっ 、ては心配する必要がな!、。
本発明の工程 (c)の凝集方法によって、 PHAの粒径を大きくすることが可能となる。 例えば、重量平均直径が 10 μ m以上、好ましくは 50 μ m以上、より好ましくは 100 μ m以上の凝集体を得ることができる。上限は特に限定されないが、重量平均直径が 5 000 μ m以下、好ましくは 3000 μ m以下の凝集体である。粒径の増大に伴い、濾過 による回収が容易になり、工業生産において設備費が軽減できることになる。ここで、 濾過の方法については特に限定はないが、例えば、フィルター濾過機、バスケット型 分離機等を用いて行うことができる。また、回収方法としてより好ましいのは、凝集 PH Aを噴霧乾燥により直接乾燥粉体として回収する方法であり、濾過後に乾燥する方 法と比較して設備費が軽減できる。
[0064] 本発明によって得られる PHAには、必要に応じて、顔料、染料などの着色剤；無機 系または有機系粒子、ガラス繊維、ゥイスカー、雲母などの充填剤;酸化防止剤、紫 外線吸収剤などの安定剤;滑剤、離型剤、撥水剤、抗菌剤その他の副次的添加剤を 配合し、組成物を調製することができる。
[0065] 本発明の方法によって得られる PHAやその組成物は、各種繊維、糸、ロープ、織物 、編物、不織布、紙、フィルム、シート、チューブ、板、棒、容器、袋、部品、発泡体な どの形状に成形できる。また、 2軸延伸フィルムにも加工できる。成形品は、農業、漁 業、林業、園芸、医学、衛生品、衣料、非衣料、包装、その他の分野に好適に用いる ことができる。特に、本発明の方法によって得られる PHAは高純度であることから、今 までの方法では使用できな力つた高い純度を要求される分野、例えばフィルム、医学 、衛生品などに好適に利用できると 、う点で優れて 、る。
発明の効果
[0066] 本発明の方法により、微生物による生産物を工業的に安価に生産、提供できるように なり、特に今まで非常に困難であった PHA含有微生物細胞中より、高純度 PHAを 効率よく回収することができ、工業的に安価に生産、提供できるようになる。
発明を実施するための最良の形態
[0067] 生産物として PHBHを用い、以下の実施例で本発明の生産物の回収'精製方法を 更に説明するが、これらは本発明をなんら限定するものではない。
(次亜塩素酸塩での処理後の粘性の評価）
次亜塩素酸塩での処理後の水性懸濁液の粘性を目視で判定し、以下の 4段階で評 価し 7こ。
大:全体がゲル化
中：部分的にゲル有り
小：ゲル少量有り
なし：ゲノレなし
(粘度の測定）
菌体懸濁液の粘度は株式会社トキメック社製の B型粘度計により、添付の使用説明 書に従って測定した。
[0068] (PHAの重量平均分子量の測定方法）
回収した乾燥 PHAlOmgを、クロ口ホルム 5mlに溶解したのち、不溶物を濾過により 除いた。この溶液を Shodex K806L (300 X 8mm、 2本連結）（昭和電工社製）を 装着した島津製作所製 GPCシステムを用いクロ口ホルムを移動相として分析した。分 子量標準サンプルには市販の標準ポリスチレンを用いた。培養終了後の微生物細胞 中の PHAの重量平均分子量については、後述の 3HHmol%の測定と同じぐ PHA 含有微生物細胞力 クロ口ホルム抽出とへキサン晶析により PHAを回収して、同様 に測定した。
(3HHmol%及び PHBH純度の測定方法）
培養終了後の微生物細胞中の PHA (PHBH)を、クロ口ホルム抽出とへキサン晶析 により回収後、解析に供した。 3HHmol%の測定は特開 2001— 340078号公報の 実施例 1に記載の方法で行った。すなわち、 PHBH20mgを 2mlの硫酸 メタノール 混合液（15 : 85)に懸濁させ、クロ口ホルム 2mlを加え、 100°C、 140分間加熱した。 冷却後、 1mlの蒸留水を添加し、攪拌後クロ口ホルム層を回収した。これを島津製作 所製ガスクロマトグラフ GC— 17A(GLサイエンス社製 NEUTRA BONDカラム）を 用いて組成分析を行った。同様に本法を用い PHBHの総純度を測定した。
[0069] (PHA中の蛋白質換算純度の測定方法）
回収した PHA (PHBH)を測定直前に 50°Cで 5時間減圧乾燥し、ダイヤインスツルメ ンッ社製の微量窒素分析装置 TN— 10を用いて全窒素量を測定した。本発明では、 測定した窒素濃度に 6. 38を乗じて蛋白質換算純度とした。
(粒度の測定）
PHA粒子の平均粒径は、マイクロトラック粒度計（日機装製 FRA)を用い、 PHAの 水懸濁液を所定濃度に調整し、全粒子の 50%蓄積量に対応する粒径を平均粒径と した。
[0070] (実施例 1)次亜塩素酸塩処理 1
ァエロモナス ·キヤビエ由来の PHA合成酵素群遺伝子を導入した、 Alcaligenes e utrophus AC32 (受託番号： FERM BP— 6038)として平成 9年 8月 7日付で国際 寄託されて 、る R. eutrophaを特開 2001—340078号公報の実施例 1に記載した 方法で培養を行い、 PHBHの生産を行った。培養終了後、遠心分離により微生物細 胞を回収し、乾燥菌体重量で lOOgZLの水性懸濁液とした。水性懸濁液中の回収 微生物は乾燥重量で 10重量％、細胞中の PHBH含量は 60重量％であった。この 細胞懸濁液 50mlに、表 1に示すように有効塩素濃度 12%の次亜塩素酸ナトリウム 溶液 0. 1— 5ml (乾燥菌体重量に対して 0. 3— 14重量％)を加え、室温で 2時間攪 拌した。反応終了後、 5N— NaOHを加え pHを 11. 7にした。また、対照として、次亜 塩素酸未処理でアルカリ処理のみ実施した。また、別の対照として、細胞懸濁液を 6 0°Cで 20分滅菌処理した後、水性懸濁液中で有効塩素濃度が 1. 4重量％となるよう に次亜塩素酸ナトリウムを加え室温で 2時間攪拌し、アルカリ添加後粘性をみた。溶 液の粘性は目視で見計らった。結果を表 1に示した。
[0071] [表 1]
Figure imgf000022_0001
[0072] この結果から、乾燥菌体重量当たり有効塩素濃度 0. 3重量％で核酸の分解が既に 認められ、 0. 7重量％力 粘性がほとんどなくなった。 2. 8重量％であればほとんど 核酸は分解しており、核酸の分解には十分な濃度であった。また、次亜塩素酸未処 理あるいは菌体を滅菌した場合には、溶液はゲル状になり次亜塩素酸の効果はみら れなかった。
[0073] (実施例 2)次亜塩素酸塩処理 2
実施例 1で用レ、た培養細胞の水性懸濁液 800mlを遠心し、上清 400mlを捨て菌体 の 2倍濃縮懸濁液 (乾燥菌体濃度 20重量％) 400mlとした。この培養細胞の水性懸 濁液に次亜塩素酸ナトリウムを 8ml加え、有効塩素濃度 1. 4重量％溶液とした。 pH は、 6. 5であった。室温で 2時間攪拌し、反応終了後 5N— NaOHにより pH8. 2に調 整した。この水性懸濁液を図 1の菌体破砕槽 11に入れ、反応槽を伊国-口ソアビ社 製高圧ホモジナイザーモデル PA2K型 (破砕装置 9)と連結し 400— 500kgfZcm2 の圧力でホモジナイズを 1回行った。続いて、 400ml全量を通すたびに 10%の水酸 ィ匕ナ卜リウムを添カロし、懸淘液の pHを 10. 0、 11. 0、 12. 5、 12. 5、 12. 5に調整し 、 pHを調整するごとに破砕を 1回ずつ実施した。破砕ごとに水性懸濁液の粘度を測 定した。結果を表 2に示した。
[0074] [表 2]
Figure imgf000023_0001
[0075] 破砕後の各粘度は低ぐ破砕機に懸濁液を問題なく通すことができた。 pH12. 5で の 3回目の破砕により粘度は 18. 2mPa. sと、破砕前と殆ど変わらなくなった。
[0076] (比較例 1)
比較例 1では、次亜塩素酸ナトリウム処理をすることなくアルカリ条件での菌体の破砕 を行い、粘度を調べた。
実施例 1で用いた乾燥菌体濃度 10重量％の懸濁液 800mlを図 1の菌体破砕槽 11 に入れ 10%NaOHにより pHを 9. 1に調整した。反応槽を伊国-口ソアビ社製高圧 ホモジナイザーモデル PA2K型（破砕装置 9)と連結し 400— 500kgfZcm2の圧力 で破砕を 1回行った。この破砕終了後の粘度は 123mPa. sであった。さらに pHを 11 . 0に調整し破砕したところ粘度は 1325mPa. sと急激に上昇し、ゲルの一部が攪拌 軸に絡みつき破砕機への導入に問題があった。粘度が 30mPa. sになるまでに 11回 の破碎を要した。
[0077] (実施例 3) 実施例 3では、次亜塩素酸処理後、早期に pHをアルカリにし、 PHBHの分子量低下 度を調べた。また、酵素 Z界面活性剤処理を行い、水洗後の品質を評価した。 ァエロモナス ·キヤビエ由来の PHA合成酵素群遺伝子を導入した、 Alcaligenes e utrophus AC32 (受託番号： FERM BP— 6038)として平成 9年 8月 7日付で国際 寄託されて 、る R. eutrophaを特開 2001—340078号公報の実施例 1に記載した 方法で培養を行い、 PHBHの生産を行った。培養終了後の菌体含量は 9. 9重量％ 、重量平均分子量 207万、ポリマー含量 62重量％、 3HHは 4. 5mol%であった。こ の培養ブロス 1. 2Lに次亜塩素酸ナトリウム溶液 12ml (有効塩素濃度で 1. 4重量％ )を加え、 30°C、 2時間撹拌した。 pHは 6. 5であった。反応終了後、遠心分離 (800 0rpm、 20分)を行い上清 0. 6Lを除去した。残りの菌体懸濁液 (乾燥菌体換算で 20 重量0 /0)の pHを 10%水酸ィ匕ナ卜リウムにより pH8. 0に調整し、 400— 500kg/cm2 で高圧破砕を 1回行った。続いて pHを一段階で 12. 5に調整し、この pHに維持しな 力 Sら高圧破砕を 5回実施した。各破砕後に粘度、蛋白質換算純度、 PHBHの総純度 及び重量平均分子量の測定を行った。粘度は、 pH12. 5に調整した直後に上昇し たが、破砕は問題なく続けることができた。破砕ごとにサンプリングし遠心によりポリマ 一を回収し、新たに水を加え、攪拌と遠心により水洗を行った。洗浄ポリマーに水 15 . 8gを加え懸濁させた。これらサンプルについてエスペラーゼ（Esperase、ノボザィ ムス社製アルカラーゼ） 0. 02gと界面活性剤（AC3S、 Stepan Company社） 0. 1 25gを加え、酵素 Z界面活性剤処理を 40°Cで 1時間行った。サンプルを水で 4回洗 浄した。この時点でのポリマーの粒度を測定したところ、平均粒径 0. 7ミクロンの微細 な粒子（図 2)力もなるェマルジヨンであることがわかった。このェマルジヨンをエタノー ルで 2回洗浄し、遠心分離により回収した後、 50°Cで 6時間減圧乾燥した。得られた ポリマーの窒素量を測定した。結果を表 3に示した。
[表 3] 重量平均 純度％ サンプル
分子量 (蛋白質換算） 原料 (培養終了後） 9 2, 074, 830 ―
次亜塩素酸添加
9 2, 1 26, 1 90
2時間撹拌後 一
破砕前 9 ― ―
pH8 1回破砕後 1 03 2, 1 77, 580 96. 1 pH 1 2. 5に調整後 1 23 2, 206, 980 - pH1 2. 5 1回破碎後 76
Figure imgf000025_0001
98. 0 pH1 2. 5 2回破砕後 50 2, 1 91 , 850 98. 1 pH1 2. 5 3回破砕後 45 2, 75, 270 98. 5 pH 1 2. 5 4回破砕後 28 2, 208, 770 99. 1 pH1 2. 5 5回破砕後 28 2, 207 , 250
[0079] その結果、各 pHでの分子量低下はなぐ純度も蛋白質換算で 99. 3%、総純度が 9 8%と十分なものが得られた。以上の結果から、生菌の次亜塩素酸ナトリウム処理は、 破砕時の粘度低減効果があり、得られる PHAの分子量の低下も見られないこと、品 質も概ね良好であることが確認できた。
施例 D C
[0080] (実 4)
CO
PHBHを凝集させて粒度を大きくし、 PHBHを回収した。
実施例 3と同様にして得られた、エタノール洗浄後のポリマーを 200gZLの水性懸 濁液とした。当該懸濁液に 95%エタノール 280mlをカ卩えて懸濁させ、続いて遠心分 離により PHBHを沈殿させた。上清 280mlを除去し、ポリマー画分に再度 95%エタ ノール 280mlをカ卩えて PHBHを懸濁させた。このエタノール洗浄を計 2回行った後、 95%エタノール 280mlをカ卩えた懸濁液とした。該 PHBH懸濁液を 70°Cの 95%エタ ノール 290mlに 15分間で徐々に加え、添加終了時からさらに 10分攪拌を行い PHB Hを凝集させた。凝集 PHBHを濾過により回収した。濾過器で PHBHを 95%ェタノ ール 120ml (PHBH容量と等量)で 2回洗浄した。得られた凝集 PHBHを 50°Cで真 空乾燥した。蛋白質換算純度 99. 9%、総純度 99%の PHBHが 65g (回収率 93%) 得られた。凝集ポリマーの粒度は 50 /z mであった。また、重量平均分子量は 197万 と、培養終了後からわず力 5%減少したのみであった。 産業上の利用可能性
[0081] 本発明の、微生物の次亜塩素酸処理による核酸の自己消化の誘導により、続く菌体 の分解または溶解時に溶液の粘度上昇が抑制されるため、比較的穏和な条件で菌 体内生産物の回収が容易になるため、微生物による生産物を工業的に安価に生産 、提供できるようになる。
特に、微生物により生産された有用物質が生分解性ポリマーであるポリヒドロキシァ ルカノエートである場合に効果があり、当該物質を工業的に安価に生産、提供できる ようになる。
図面の簡単な説明
[0082] [図 1]本発明の方法において、 PHAの分離精製を実施するための菌体破砕装置の 説明図である。
[図 2]実施例 3で得られた PHA粒子の粒度を分析したグラフである。
符号の説明
[0083] 1 菌体破砕装置
2 撹拌装置
3 pH検知制御装置
4 ポンプ
5 管路
6 PH調整剤貯留槽
7 pH計
8 管路
9 破砕装置
10 ポンプ
11 菌体破砕槽 (低温恒温循環槽）

Claims

請求の範囲
[1] 微生物による生産物を微生物細胞内より回収する工程において、生きている微生物 を、核酸の自己消化を誘導するのに適した量の次亜塩素酸又はその塩と接触させ、 その後生産物回収工程を行うことを特徴とする生産物の回収方法。
[2] 微生物細胞中の核酸の自己消化を誘導する次亜塩素酸又はその塩の濃度が、有効 塩素濃度換算にして菌体乾燥重量あたり 0. 3重量％— 14重量％であることを特徴と する請求項 1に記載の生産物の回収方法。
[3] 微生物と次亜塩素酸又はその塩との接触が 15— 40°Cの温度において実施されるこ とを特徴とする請求項 1又は 2に記載の生産物の回収方法。
[4] 微生物と次亜塩素酸又はその塩との接触が pH4— 8で行われることを特徴とする請 求項 1から 3のいずれか 1項に記載の生産物の回収方法。
[5] 微生物による生産物が生分解性ポリマーのポリヒドロキシアルカノエートであることを 特徴とする請求項 1から 4のいずれか 1項に記載の生産物の回収方法。
[6] ポリヒドロキシアルカノエートカ 3—ヒドロキシブチレート、 3—ヒドロキシバレレート、 3- ヒドロキシプロピオネート、 4ーヒドロキシブチレート、 4ーヒドロキシバレレート、 5—ヒドロ キシバレレート、 3—ヒドロキシへキサノエート、 3—ヒドロキシヘプタノエート、 3—ヒドロキ シォクタノエート、 3—ヒドロキシノナノエート及び 3—ヒドロキシデカノエートからなる群 力 選択されるモノマーのうち少なくとも 2種が共重合した共重合体であることを特徴 とする請求項 5に記載の生産物の回収方法。
[7] ポリヒドロキシアルカノエートカ 3—ヒドロキシへキサノエートと、他のヒドロキシアル力 ノエートの少なくとも 1種との共重合体であることを特徴とする請求項 5又は 6に記載 の生産物の回収方法。
[8] ポリヒドロキシアルカノエートカ 3—ヒドロキシへキサノエートと 3—ヒドロキシブチレート との共重合体であることを特徴とする請求項 5から 7のいずれか 1項に記載の生産物 の回収方法。
[9] 微生物が、ァエロモナス（Aeromonas)属、アルカリゲネス（Alcaligenes)属、ァゾト パクター（Azotobacter)属、バチルス（Bacillus)属、キャンディダ（Candida)属、ク ロストリジゥム（Clostridium)属、ハロバクテリゥム（Halobacterium)属、ノカルディ ァ（Nocardia)属、ロドスピリリウム（Rhodospirillum)属、シユウドモナス（Psuedom onas)属、ラノレストニア (Ralstonia)属、サッカロマイセス (Saccharomyces)属、ャ ロウィァ（Yarrowia)属、ズーグロエア（Zoogloea)属、メチロバクテリウム（Methylob acterium)属及びパラコッカス（Paracoccus)属からなる群より選択されるポリヒドロ キシアルカノエートを含有する微生物であることを特徴とする請求項 1から 8のいずれ 力 1項に記載の生産物の回収方法。
[10] 微生物が、ァエロモナス 'キヤビエ（Aeromonas caviae)である請求項 1から 9のい ずれか 1項に記載の生産物の回収方法。
[11] 微生物が、ァエロモナス'キヤビエ由来のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素群遺 伝子を導入された形質転換体である請求項 1から 10のいずれか 1項に記載の生産 物の回収方法。
[12] 微生物が、ァエロモナス'キヤビエ由来のポリヒドロキシアルカノエート合成酵素群遺 伝子を導入されたラルストニア ·ユートロファ（Ralstonia eutropha)である請求項 1 1に記載の生産物の回収方法。
[13] 生きて 、る微生物を、核酸の自己消化を誘導するのに適した量の次亜塩素酸又は その塩と接触させた後に行う生産物回収工程が、下記 (a)及び (b)の工程力もなるこ とを特徴とする請求項 5から 12の 、ずれか 1項に記載の生産物の回収方法。
(a)ポリヒドロキシアルカノエートを含有する微生物細胞の水性懸濁液に、攪拌と物理 的破砕処理を行いながらアルカリを添加し、該細胞を破砕すると共に、該細胞中のポ リヒドロキシアルカノエート以外の細胞物質を可溶ィ匕又は乳化させ、次 、でポリヒドロ キシアルカノエートを懸濁液力 分離する工程；
(b)分離されたポリヒドロキシアルカノエートを、酵素及び Z又は界面活性剤で処理し 、ポリヒドロキシアルカノエートに付着した不純物を可溶ィ匕又は分解後可溶ィ匕し、続い て親水性溶媒及び/又は水でポリヒドロキシアルカノエートを洗浄する工程。
[14] さらに下記 (c)の工程を有してなる、請求項 13記載の生産物の回収方法。
(c)洗浄されたポリヒドロキシアルカノエートを親水性溶媒及び Z又は水に懸濁し、該 懸濁液の沸点以下の温度で攪拌することにより、ポリヒドロキシアルカノエートを凝集 させて粒度を大きくし、次 、で凝集したポリヒドロキシアルカノエートを懸濁液力も分 離する工程。
[15] 工程 (a)にお 、て、物理的破砕処理を高圧ホモジナイザーで行うことを特徴とする請 求項 13又は 14に記載の生産物の回収方法。
[16] 工程（a)において、水性懸濁液の pHを 9から 13. 5の間にコントロールしながら物理 的破砕を行うことを特徴とする請求項 13から 15のいずれ力 1項に記載の生産物の回 収方法。
[17] 工程 (a)において使用するアルカリが、水酸化ナトリウム、水酸ィ匕カリウム、水酸化リ チウム及び炭酸ナトリウム力 なる群より選択される少なくとも 1種であることを特徴と する請求項 13から 16のいずれか 1項に記載の生産物の回収方法。
[18] 工程 (b)において使用する酵素が、蛋白質分解酵素、脂肪酸類分解酵素、細胞壁 分解酵素及び核酸分解酵素からなる群より選択される少なくとも 1種であることを特徴 とする請求項 13から 17のいずれか 1項に記載の生産物の回収方法。
[19] 工程 (b)にお ヽて使用する界面活性剤が、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性 剤、両性界面活性剤及び非イオン界面活性剤カゝらなる群より選択される少なくとも 1 種であることを特徴とする請求項 13から 18のいずれか 1項に記載の生産物の回収方 法。
[20] 工程 (b)にお 、て、洗浄に用いる親水性溶媒力 メタノール、エタノール、プロパノー ル、イソプロパノール、アセトン、ァセトニトリル及びテトラヒドロフランカ なる群より選 択される少なくとも 1種であることを特徴とする請求項 13から 19のいずれか 1項に記 載の生産物の回収方法。
[21] 工程 (c)にお 、て使用する親水性溶媒が、メタノール、エタノール、プロパノール、ィ ソプロパノール、アセトン、ァセトニトリル及びテトラヒドロフランカ なる群より選択され る少なくとも 1種であることを特徴とする請求項 14から 20のいずれか 1項に記載の生 産物の回収方法。
[22] 工程 (a)又は工程 (b)の後、得られたポリヒドロキシアルカノエートをェマルジヨンとし て回収することを特徴とする請求項 13から 20のいずれか 1項に記載の生産物の回 収方法。
[23] 工程 (c)の後、ポリヒドロキシアルカノエートを噴霧乾燥により乾燥粉体として回収す ることを特徴とする請求項 13から 21のいずれ力 1項に記載の生産物の回収方法。 次亜塩素酸の塩が次亜塩素酸ナトリウムであることを特徴する請求項 1から 23のいず れか 1項に記載の生産物の回収方法。
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