JPS62190088A - グラム陰性菌の増殖培地に遺伝子生成物を輸送する方法 - Google Patents

グラム陰性菌の増殖培地に遺伝子生成物を輸送する方法

Info

Publication number
JPS62190088A
JPS62190088A JP61296510A JP29651086A JPS62190088A JP S62190088 A JPS62190088 A JP S62190088A JP 61296510 A JP61296510 A JP 61296510A JP 29651086 A JP29651086 A JP 29651086A JP S62190088 A JPS62190088 A JP S62190088A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
recombinant dna
gram
dna structure
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP61296510A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH082314B2 (ja
Inventor
ラース・アブラハムゼン
トーマス・モックス
ベルン・ニルソン
マジアス・ウーレン
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kabigen AB
Original Assignee
Kabigen AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kabigen AB filed Critical Kabigen AB
Publication of JPS62190088A publication Critical patent/JPS62190088A/ja
Publication of JPH082314B2 publication Critical patent/JPH082314B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
    • C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/705—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a protein-A fusion

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の目的〕 産業上の利用分野 本発明は組換体ＤＮＡ技術の使用に及び大腸菌（Ｅａｃ
ｈｅｒｉｅｈｌａ　　ｃａｌ（、略称Ｅ、ｃｏｌ［）の
ようなグラム陰性菌を用いてこのような微生物の増殖培
地に遺伝子生成物を発現輸送することに関する。
かくして、本発明は七の細胞外分泌をもたらすため蛋白
質をグラム陰性ｌ中に発現させる方法を提供する。本発
明は更に組換体ＤＮＡ構造とプラスミド媒介体とこのよ
うな組換体ＤＮＡ構造を含むグラム陰性菌を提供する。
本発明はまた本発明方法により得られた蛋白質にも及ぶ
。
従来の技術 それにより新規な組換体ＤＮＡＷＩｇ造が構成され原子
核ないし成熟核宿主細胞中に導入されうる比較的新しい
組換体ＤＮＡ技術は非常に多数の蛋白質の製造を論理的
に可能にした。異型遺伝子生成物を製造するための細菌
の使用はさもなければ天然源からかなりの費用で得るこ
としかできない蛋白質の取得を可能にした。細菌中で製
造されたヒトに由来するポリペプチド類のよく知られた
例はヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、インシュリン、α−
インターフェロン、γ−インターフェロン、ンマトスタ
テン及びソマトメジン類（インシュリン様発育因子）で
ある。
外来遺伝子を発現きせるための細菌の使用は蛋白質分解
によるポリペプチドの安定性、発現の程度、誤った折重
ね（ｆｏｔｄｔｎｇ）に相関する蛋白質生成物の精製及
びｆｆ製後の蛋白質の生物学的活性の欠除も含めた多く
の実際的及び生物学的問題に直面した。これらの問題を
解くため、任意の遺伝子生成物を発現きせるため充分特
徴付けられている腸細菌である大腸菌（Ｆ、ｅｏｌｔ）
を使用できるよう各種の技術が開発された。これらの方
法には発現の程度を調整できる様々なプロモーターの使
用、細胞内では通常不安定な蛋白質を安定化するための
遺伝子融合、及び還元性環境がその形成を困難にしてい
る細胞質とは対照的に二硫化物橋が形成されうる細胞質
周囲空間へ細胞質から蛋白質を転座させるためのシグナ
ルペプチド類の使用が含まれる。大腸菌の細胞質中に発
現された構造中のシスティン橋を有する蛋白質はこれら
の橋が形成されにくいために量適正確な三次構造を有さ
ない。
このことは潜在的に生産過剰時のポリペプチドの沈殿、
もし細胞中に沈殿しなかった場合の急速な蛋白質分解劣
化及び発現され精製されたポリペプチドの生物学的活性
の不在に至りうる。このことハフロインシュリン、イン
シュリン人鎖、インンユリンＢ鎖、インシュリン様発育
因子及び組織特異性プラスミノゲン活性化因子（ｔ−Ｐ
Ａ）を発現させる場合の大腸菌中に観察されてきた。こ
の問題を克服するため、ポリペプチドは精製後再生させ
るか正確な折重ねが潜在的に達成きれうる大腸菌の細胞
質周囲空間へ分泌させる必要があった。
折重ね及び安定性について言及したものとは別の細菌遺
伝子発現及び分泌の一つの他の観点はグラム陽性菌の使
用である。とれらの微生物はグラム陰性対応体と比較し
て細胞の細胞質を取り囲む膜構造の異なる機構を有する
。グラム陽性原子核細胞は単に−りの細胞膜を有するの
みでｓｂ、分泌された蛋白質は増殖培地へ輸送されるが
、グラム陰性大腸菌における分泌は細胞の細胞質を取り
囲む二重膜屡のため蛋白質を細胞質周囲空間に位置させ
る。グラム陽性菌を使用することにより、分泌された遺
伝子生成物は生成物のダウンストリームプロセッシング
を促進するでおろう増殖培地から集められうる。かぐし
て、工業的プロセスにおけるグラム陽性函の使用の重要
性はこの分泌プロセスに相関しているが、他の観点から
、発現系が大腸菌についてより開発されているという単
なる理由から充分特徴付けられた大腸菌を大規模遺伝子
生成物生産において使用することが優先するであろう。
発明が解決しようとする問題点 本発明は工業的プロセスにおける大腸菌の使用の適用に
おける制限に対する解決を提供する。本発明は遺伝子生
成物が大腸菌から増Ｎｆ＠地に定量的に分泌されること
を可能にする。グラム陰性菌における蛋白質の輸送を得
るためのこの遺伝学的手段は所望の遺伝子生成物の発現
が熱衝撃応答による繊維状増殖の誘発及びこの応答が細
胞質周囲に位置する蛋白質の増進培地への定量的な漏出
を与えることに基ずいている。本発明の基礎につき以下
説明する。
シグナルペプチド類が原子核細胞及び成熟核細胞いずれ
においても膜を通して分泌されるはずの発現された蛋白
質のＮ末端中に存在することがよく知られて−る。この
シグナルペプチドは２０〜４０個のアミノ酸からなり、
転座プロセス中に開裂づれる。多くの蛋白質因子はこの
分泌プロセスに相関しているが、分子機構は完全な詳細
まで分っていない。良好なモデルが無理なく現実に近づ
いて提供されてはいる。
本発明をブドウ球菌性蛋白質Ａを引用して以下に説明す
る。この蛋白質は病原性細菌黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏ　ｅｏｅｅｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　、略称Ｓ、　
ａｕｒｅｕｓ）の細胞壁成分として知られており、ヒト
も含めたほとんどの唾乳動物からの特定な群の抗体の一
定領域とそれが特異的に結合することによりよく知られ
ている。蛋白質Ａはまたその構造において非常に反復性
があることが知られており、連結した反復中に位置する
各領域中に約５８個のアミノ酸からなる５個の領域は全
て個別に免疫グロブリン＠（？ｌｌえばヒトｌ１ｒＧ）
と結合する機能を有する。
ＤＮＡ水準において、蛋白質Ａの細胞質からの転座を行
なう役割のおるシグナル配列はこれら５種のＩｇＧ結合
領域の前に存在することが示された。
このシグナル配列はまた大腸菌中でも機能することが見
出されており、かくして蛋白質Ａは蛋白質Ａの遺伝子の
導入後細胞質周囲窒間中に見出される。
本発明の基礎をなす研究において、蛋白質Ａのフラグメ
ントＢを遮断された分泌をもたらすシグナル配列のすぐ
後に置いた。明白な結論はフラグメントＢ及び８間のア
ミノ酸配列における差異は分泌プロセスに１幾であるこ
とである。蛋白質ＡのこのフラグメントＢを発現させる
大腸菌は不完全な細胞分裂のため繊維状に増殖する。こ
のことは以前細胞内に沈殿する、大腸菌で発現された蛋
白質について観察された。本発明において、本発明者ら
はβ−ラクタマーゼのように細胞質周囲空間に位置した
蛋白質が増殖培地に漏出しているこトラ見出した。フラ
グメン）ＳＥを発現させる場合、このＥフラグメントが
ほぼ全量大陽画の増殖培地へ輸送されることが鴬〈べき
ことに発見された。このことはまた細胞の繊維状増殖に
も相関性がある。（程度に差はあるが）＊錐状増殖を誘
発することが見出された他のフラグメントはフラグメン
）　ＳＥＥ及びＳＥＢ　　である。蛋白質入の全てのこ
れらのより小さなフラグメントは細胞質周囲蛋白質の増
殖培地への輸送に至る細胞分裂の欠陥を力ぜか誘発する
。
ヒトインシュリン様発育因子１　（ＩＧＦ−１）、すな
わち、７０種のアミノ酸からなる発育因子をコード化す
る遺伝子［ＳＥＥを融合させて５ＥＥ−ＩＧＦ−１を生
じさせる際、遺伝子生成物を増殖培地から回収させうろ
ことが見出された。またこの実験において、細胞の繊維
状形態が観察できた。
全ての上述の実験は第９図に示したようｌＡｌ１才 媒介体！で行なった。Ａ型媒介体はβ−ラクタ！−ゼ（
ｂｌｍ）遺伝子に対向する蛋白質Ａ誘導遺伝子転写を有
するｐＲＩＴ４に基ずく。５ＥＥ−ＩＧＦ−１をＢ型媒
介体中に入れる際、発現水準はＡ型配向に比較して２０
〜４０倍高い。Ｂ型媒介体はβ−ラクタマーゼ遺伝子（
ｂｌａ）と同一方向において蛋白質Ａ誘導遺伝子転写を
有するｐＥＭＢＬに基ずく。これらの細胞における繊維
状増殖は非常に縮今回の結果は本発明の遺伝子生成物の
増殖培地への輸送は大腸菌細胞の繊維状増殖に相関し％
また発現水準はとの誘発に相関させうることを示してい
る。
Ａ型媒介体中の５ＥＤＡＢＣからなる蛋白質Ａ遺伝子は
３０〜４２℃で増殖させた０熱衝撃応答を得るのに充分
高い。より高温では、発現水準は２０〜４０倍高く、増
殖培地への輸送は効率的である。
本発明に至る研究から引き出された結論は大腸菌の繊維
状増殖は増殖培地への細胞質周囲蛋白質の輸送を与える
ことである。繊維状増殖が蛋白質Ａプロモーター及びシ
グナル配列を保持する大腸菌細胞中で誘発され、プラス
ミド媒介体中のフラグメントの配向により、あるいは発
現された蛋白質入部分の大きさにより、本発明では細胞
質周囲蛋白質の増殖培地への様々異なる水準の輸送が得
られる。
本発明の基本的概念はこの分野において１賛な繊維状増
殖の誘発は蛋白質入シグナル配列及びプロモーターの後
に置かれたとき高い発現及び効率的な分泌を持たらすか
らである。
本発明はこの発現−分泌系の挙動における観察に関する
生助学的説明に基ずくわけではないことに留意おりたい
。
本発明は何ら特定の理論に制約烙れるわけではないが、
本発明者らはなされた観察に関する合理的な説明を有す
る。
蛋白質Ａ遺伝子は大腸菌においてそれ自体熱衝撃遺伝子
である。このことは蛋白質Ａは発育性非熱衝撃応答中よ
りも熱衝撃応答中により転写されることを意味する。こ
の現象の理由はシグマ３２様グロモーターが見出される
蛋白質人遺伝子中の先に報告した大腸菌様プロモーター
の上流で見出される。このことはシグマ３２プロモータ
ー配列は熱衝撃遺伝子について示唆された意見一致配列
と相同であることを示唆した。熱衝撃応答を引受けるシ
グマ３２因子は一緒に通常大腸菌中で１７個の遺伝子を
転写している。
熱衝撃応答は大腸菌細胞がストレスを受けるとき誘引さ
れる。誤って折重りれた蛋白質が主要誘引作用でありか
つこの誘発は熱、　　４　％　ＥｔＯＨ，酸化性剤、解
読誤りまたは適切な三次構造を得ることができない外来
蛋白質の生産を持たらす化学薬品により行ないうること
か示唆される。
本発明の場合において、蛋白質Ａの小さなフラグメント
または最初からの大量生産は熱衝撃応答を誘引している
。この応答が誘引されるとき、蛋白質入遺伝子は更に転
写され、より顕著な誘引となる。この熱衝撃応答はまた
細胞分裂の欠陥、すなわちいわゆる繊維状増殖も与えて
いる。この開示において％またこのタイプの増殖も増殖
場地への細胞質周囲生成物の輸送を与えることが示され
、ている。
３０℃または４２℃でＡ型媒介体中で蛋白質Ａ遺伝子を
有する大腸菌株を増殖させることにより、本明細書中で
はこの温度の誘発が高い発現と輸送を与えることが示さ
れており、このことは生岐字的説明を支持し、優れた誘
発系を与えている。このことは菌株は低温で増殖させる
ことができ低水準で生産し、そして細胞塊が生成されて
しまった後で温度を４２’Ｃに移し、七の後生成物の生
産が起き、そして生成物もまた分泌されることを意味し
ている。
熱衝撃はまたＬ＆と命名したＡ’ｌ”Ｐ依存性グロテア
ーゼも誘引している。従って、生産はその遺伝子中の突
然変異とし゛でＬａプロテアーゼに欠けた菌株中で優先
的に起きるであろう。
〔発明の構成〕
問題を解決するための手段 従って、本発明はグラム陰性菌中に蛋白質を発現させ、
その細胞外分泌を与える方法を提供し。
該方法は りプロモーター、転座及びグロセッシングを可能とする
シグナル配列及び発現させるべき所望の蛋白質をコード
化する構造遺伝子を含む組換体ＤＮＡ構造をグラム（→
菌中に導入。
ｂ）細胞を繊維状増殖が生じるような条件下で培誉し、 そして Ｃ）細胞外分泌された蛋白質を回収する工程を含む。こ
のような方法において、所望の蛋白質の発現は好ましく
は繊維状増殖のものと同一の転写調節下にある。本発明
方法の一つの実施態様において、転写調節はシグマ−３
２蛋白質因子を発現させるｈｔｐＲの誘発に基づく。
作用効果 先に指摘した通り、本発明の概念は繊維状増殖をもたら
す条件下でグラム陰性菌を増殖させることに基ずく。こ
のような繊維状増殖は組換体ＤＮＡ構造の性質及びそれ
から発現される蛋白質による。繊維状増殖はまた外部誘
発にもまたは両者の組合せによってもよい。かくして、
繊維状増殖は熱衝撃応答を誘発する培養における温度上
昇により起とされうるが、これはまたエタノールのよう
な培養培地変性剤中に導入することによっても起こされ
る。
宿主細胞中で上で定義したように組換体ＤＮＡ構造によ
り発現された蛋白質は外来または駒つて折重ちれたと細
胞により認められるという事実により、これは細菌中で
Ｊｏｎ反応を誘発できる。
組換体ＤＮＡ構造は様々な方法で細菌中に導入されうる
。かくしで、それは細菌の染色体ＤＮＡ中に導入されう
る。おるいはプラスミド媒介体中に導入されうる。
本発明方法の好ましい実施態様において、組換体ＤＮＡ
構造は単一配列として蛋白質のものを含有している。シ
グナル配列に隣接して構造遺伝子は回収されるべき成熟
蛋白質のＮ末端アミノ酸残基をコード化する開裂領域を
含有している。このような開裂領域は少なくとも６個の
アミノ酸残基をコード化するよう構成されうる。骸残基
は好ましくはＡｌａ　Ｇｉｎ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ
　Ａｌｍである。
本発明方法において、構造遺伝子は蛋白質ＡのＥ、ＥＥ
及びＥＢ領領域ら選択はれた遺伝子を含むことができる
。構造遺伝子はまた生産遺伝子、例えばイン／ユリ／様
発育因子１　（ＩＧＦ−１）をコード化するものも含む
ことができる〇 本発明はまたプロモーター、シグナル配列及び開裂領域
を含有する構造遺伝子を含む組換体ＤＮ人構造であって
、該構造遺伝子が式 ％式％） （式中、ｎは１以上の整数であり％ｍは整数であり、Ｙ
は所望の蛋白質をコード化するＤＮＡ配列であり、そし
てＥ及びＢは蛋白質Ａ領域大領域Ｅ及びＢに対応する遺
伝子である）で表わされ、但し天然蛋白質Ａをコード化
するものから構造遺伝子を除外する組換体ＤＮＡ構造を
提供する。このような構造において、ｎは１であってよ
く、ｍは０であってよく、あるいはｎが２でろってｍが
０であってもよい。特定な実施態様において、ｎ及びｍ
はいずれも１でおってよい。
本発明の好ましい実施態様において、組換体ＤＮＡ構造
はｎが２であり、ｍが０であり、そしてＹがＩＧＦ−１
またはＩＧＦ−２をコード化する遺伝子であるものであ
る。
本発明はまた上と同一の意義を有する組換体ＤＮＡ構造
を含むプラスミド媒介体も包含する。
このようなプラスミド媒介体はｐＥＭＢＬ９から発生す
るものであってもよい。
本発明の他の観点によると、それは七のような構造をそ
の染色体中に保持するかまたは同じものを含有するプラ
スミド媒介体を保持するこのような組換体ＤＮＡ構造を
含有するグラム陰性菌を包含する。この発明を使用する
好ましい細菌は大腸菌、例えば大腸菌ＨＢ　１０１であ
る。
本発明の更に別の観点によれば、本発明の概念を用いて
製造された蛋白質が提供される。
本発明を飽性図面を参照にして特定な実施例によね更に
例示する。
第１図はその異なるコード化領域を示す蛋白質Ａ遺伝子
の模式図である。゛・、Ｓはシグナル配列であり、Ａ−
ＥはＩｇＧ結合領域であり、そしてＸはＩｇＧ結合活性
に欠けるＣ末端部である。
第２図は蛋白質Ａ遺伝子を含有するプラスミド媒介体ｐ
ＲＩＴ４を例示している。ｍｐ９多重制限酵素リンカ−
が遺伝子融合に関連した七の実際的解読ワクと共に示さ
れている。ＣＭＬはクロルアンフエニコールアシルトラ
ンスフエ：７−　セミ伝子であり、Ｓａは黄色ブドウ球
菌を複製する原型であり、Ｅｅは大腸菌を複製する原型
であり、ＡＭＰはβ−ラクタマーゼ遺伝子であり、そし
てＰｒｏｔ人は蛋白質入遺伝子のＩｇＧ結合部分を示す
。
第３図は第１部にて記載したように構成した異な３ｐＡ
Ｓ及びｐＡＳＥ媒介体である。ＣＭＬはクロＡ／　７ン
フエニコールアシルトランスフエラーセ遺伝子であり、
ｏｒｉＢａは枯草Ｍ（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｉ）及び黄色
ブドウ球菌を複製する原型であり、ｏｒｆＥｅは大腸菌
を複製する原型であり、ＡＭＰはβ−ラクタマーゼ遺伝
子であり、Ｓはシグナル配列であり、そしてＥは蛋白質
入からのＥ領域である。
第４図は蛋白質人遺伝子続いて多重制限酵素リンカ−を
保持するプラスミド媒介体を示す。Ｐｒｏｔ人は蛋白質
入のＩｇＧ結合領域をコード化する遺伝子である。ＴＣ
はテトラサイクリン抵抗性をコード化する遺伝子でらυ
、そしてｏｒｉは大腸菌を複製する原型である。
第５図は蛋白質ＡのＢ領域をコード化する異なる遺伝子
フラグメントを示している。左への矢印は得られた異な
るＢａｔ３１　　クローンを示している。
異なるＢａｔ３１構成体に結合されたＥｃ　ｏＲＩ　！
Ｊンカーが示されている。Ｂ−０，Ｂ−１及びＢ−２構
成体としてＥｃ　ｏＲＩ領域を超えてＢ領域に入ったア
ミノ酸配列が示されている。右側はＢフラグメントの３
′末端におけるＢｉｍＨＩの位置が示されている。また
２種の可能な配向におけるストップリンカ−（第６図）
の翻訳停止も示されている。
第６図はストップリンカ−の配向とは独立して即時の翻
訳停止を生じさせるストップリンカ−を示している。各
配向に応じた３種の異なる解読ワクが示されている。
第７図は天然蛋白質入における結合と比較したシグナル
ベプテド及び異なるｐＡｓＢ構成体間の結合のアミノ酸
配列を示している。各アミノ酸配列上の矢印は大腸菌Ｈ
ＢＩＯＩから発現されたフラグメントのアミノ酸配列化
により分析されたプロセッシングの位置を示している。
第８図は合成ＩＧＦ−１遺伝子のスクレオテド配列を示
している。合成フラグメントのｆｌＩＩ面を固めるＥｃ
　ｏＲＩ部位及びＨｊｎｄｌ［［部位が推論されたアミ
ノ酸配列と共に示されている。
第９図は異なる蛋白質Ａ誘導構成体を発現させるのに用
いられた２ｍのタイプのプラスミド媒介体ｔ　示してい
る。ＣＭＬはクロルアンフェニコールアシルトランスフ
ェラーゼ遺伝子であり、Ｓ、ａ。
は黄色ブドウ球萌を複製する原型であり、Ｅｃは大腸菌
を複製する原型であり、ＡＭＰはβ−ラクタマーゼ遺伝
子であり、そしてＰｒｏｔＡは紺状図に示したように異
なる蛋白質Ａ構成体を示す。
実施例 以下１本発明を特定な実施例により更に例示す、るが、
これら実施例は本発明を限定するものではない。実施例
はヒトインシュリン様発育因子１（ＩＧＦ−１）をコー
ド化する合成遺伝子に適用されかつＳＥＸに融合されて
５ＥＥ−ＩＧＦ−１を形成する系の適用を示す。この蛋
白質はまた蛋白質Ａ遺伝子の少部分と同じ方法により分
泌されかつＢ型媒介体において、発現水準が非常に高い
ことが見出された。
媒介体ｐＡｓＥＥはドイツ連邦共和国、ケツチンゲン（
Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ）のＤｃｕｔｔｃｈｅ　Ｓａｍｍｌ
ｕｎｇ　ｖｏｎＭｉＲｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳ
Ｍ）　　に寄託番号大腸菌ＲＲＩΔＭ１５において３５
９３番として寄託された。
出発物質 細菌宿主　大腸菌に１２の２種の異なる菌株を実施例中
で用いた。
ＨＢＩＯＩ　（Ｂｏｙ＠ｒ、　ａ　Ｗ、　５ｔａ４　Ｊ
、　ＭｏＬＢｉｏＬ、　４１．４５９−４７２（１９６
９））及び ＪＭ１０３　（Ｍｅａｎｉｎｇ、　Ｊ、　Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、１（υ、２〇−（これらの菌株は
スウェーデン、ストックホルムのｔｈｅ　Ｄｅｐａｒｔ
ｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈ＠ｍ１ｓｔｒｙ　ａｎｄ　
Ｂｉｏｔｅ−ｃｈｎｏｌｏｇｙ、　Ｒｏｙａｌ　Ｉｎ＠
ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙで入手でき
る。
クローン 実施例中で使用したクローン化媒介体はｐＢＲ３２２（
Ｂｏｌｉｖａｌ、Ｆ、　ｅｔａｌ、　Ｇａｎｇ　２．９
３−１１３（１９７７）。
ｐＥＭＢＬ８（Ｄｅｎｔｅ　ａｔａｌ　、、　Ｎｕｃｌ
、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅａ、　１１゜１６４５（１９３３
））、　ｐＥＭＢＬ９（Ｄｅｎｔｓ　　ｅｔａｌ、Ｎｕ
ｃｌ。
Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５−　１１．　１６４５（１９８３）
）、　　ｐＲＩＴ４（ＮｉｌｓｓｏｑＢ、ｅｔａｌ、Ｅ
ＭＢＯＪ、４．１０７５（１９８５））、ｐＳＰＡ　１
１（Ｕｈｌｅｎ　Ｍ、　＠ｔａｌ、Ｇｏｎｅ　２３．３
６９．　（１９８３））、及びｐｓＰＡ１６（Ｕｈｌｅ
ｎ、　Ｍ、　ｅｔａｌ、　Ｊ、　Ｂａｅｔｅｒｉｏｌ　
、　。
１５９、７１３（１９８４））であった。ＩＧＦ−１を
コード化する合成遺伝子は別の個所（Ｅｌｍｂｌａｄ、
　Ａ、　ｅｔａｌ。
Ｔｈ１ｒｄ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏｎｇｒｅｓｓ　ｏ
ｎ　Ｂｉｏｔｅｅｈｎｏｌｏｇｙ［Ｉ。
２８７−２９６．　　Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｓｍｉｅ、Ｗ
ｅｉｎｈａｉｍ（１９８４））に記載されている。実施
中で構成されるプラスミド媒介体ｐＡｓＥＥはドイツ連
邦共和国。
ゲッティンゲンのＤｅｕｔｃｈｅ　　Ｓａｍｍｌｕｎｇ
　ｖｏｎＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）に
寄託番号ＤＳＭとして寄託された。
ｇのＮａＨＣＯａ及び０．２ｇのＮａＮ３を蒸留水で１
ｔに調製。
ＰＢＳＴ：８．ＯｆのＮａＣ４０，２ｒのＫＨｔ　ＰＯ
４，２，９２のＮａｐ　ＨＰＯ４Ｘ　１２Ｈ１０，０，
２ｔのＫ（Ｊ、０．２−の■ Ｔｗｅｅｎ　２０及び０．２　ｆ　ＮａＮ、を蒸留水で
１ｔに調製（ｐＨ７，４）。
ＴＢＳ：３０Ｆのトリズシン系大豆汁を１ｔに調製し、
オートクレーブにかけた。
ＴＢＡＢ：３０　Ｆのトリプンン系血液寒天基質を１ｔ
ｖｃ調製し、オートクレーブにかけた。
０ＮＰＧ緩衝液：１５ｍＭ２−メルカプトエタノール及
び１　ｍＭＭ？ＣＬ２を含有する０、　１　Ｍ燐酸カリ
ウム緩衝液、ｐ　Ｈ７，３中の２　ｍ　Ｍ　ｏ−ニトロ
フェニル−β−ｐ−ガラクトシド（ＯＮＰＧ、シグマ製
品Ｎｏ、Ｎ−１１２７）。
通常方法 操作方法のうちあるものは実施例中で繰返し行なった。
他に特記しない限り、それらはそれらを行なう毎に全く
下記と同じように行なった。
分子生物学において通常用いられる方法は記載されてい
ない（例えば、市販の制限酵素、ＤＮＡ結’ｔ、Ｂａｔ
３１エキソヌクレアーゼ、Ｓｌヌクレアーゼ及びＫｌｅ
ｎｏｗポリメラーゼの使用）。
転換二　プラスミドＤＮＡによる大腸菌に１２の転換は
記載の通りに行なった（　Ｍｏｒｒｉａｍ、　５　Ａ、
。
Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｌｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａ
ｃ’ａｄ＠ｍ１ｅＰｒｅｓｓ　　６８，３２６−３３１
（１９７１））。転換体は７０岬／ｌアンビシリ／を含
有するプレー）（ＴＢＡＢ）上で常法により選択した。
プラスミドＤＮＡの単離；　プラスミドＤＮＡをＢｉｒ
ｎｂｃｉｍ、　Ｈ，Ｃ，ｅｔａｌ、　Ｎｕｅｌ、　Ａｃ
１ｄｓ　Ｒｓａ。
７．１５１３（１９７３）に記載されたように単離した
。
多数の転換体をスクリーニングするため小規模製剤をＫ
１５ｍ５ｒ、Ｔｏ、　Ｐｌａｓ、ｍ１ｄ１２．１９−３
６（１９８４）により記載されたのと全く同じように作
成した。
セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）６Ｂクロマトグラ
フィー：Ｂ息１３１または８１処理のため使用すべきプ
ラスミドＤＮＡを１０ｍＭＴｒｉｇ、１ｍＭＥＤＴＡ及
び５００ｍＭＮａｕ４ｉ衝液中のセファロー２ＧＢゲル
濾過にかけた。この方法によυ、ＤＮＡはＲＮＡから分
離される。
ＤＮ人フラグメントの溶離：　ＤＮ人フラグメントの７
ガロースまたはポリアクリルアミドゲル片からの溶離ｔ
−Ｍａｘａｍ　＠ｔａｌ　、　Ｐ、　Ｎ、　Ａ、　５ｏ
（ＵＳＡ）。
７４．５６０−５６４（１９７７）によシ記載されたの
と全く同じように行なった。
ＤＮＡ配列化：　　ＤＮＡ配列分析をＳａｎｇｅｒ、　
Ｆ。
ｅｔａｌ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　１４３．
１６１（１９８０）により記載されたのと全く同じよう
に行なった。
蛋白質Ａの検出及び定量：　蛋白質Ａを定量するためＥ
ＬＩＳＡ試験（すなわち酵素結合免疫吸着剤分析）を用
いた。この試験は正味電荷（ｎｅｔｃｈａｒｇｅ）を有
さない特別ミクロ滴定グレート（Ｔｉ　ｔｅｒｔｓｋ、
オランダ、アムステルスタツド）を使用する。溜めをコ
ーテング緩衝液中のヒトＩｇＧ（Ｋａｈ、　ＡＢ、スウ
ェーデン）でコーテングする。
試料を添加し、蛋白質入を溜め中に吸着されたＩｇＧの
Ｆｅ部分に結合させる。次いで、蛋白質Ａを、β−ガラ
クトシダーゼ（ＰｈａｒｍａｓｉａＡＢ、スウェーデン
、ウプサラから）に接合された抗蛋白質入（ラビットか
ら）により分析する。
分析：　ミクロ滴定グレートの溜めをコーテング緩衝液
中１６ｎｇ／−のヒ）ＩｇＧ溶液７５μｔで満たし、プ
レートを室温で少なくとも１時間培養する。
溜めを１００μｔのＰＢＳＴで３回洗浄し％　５０μｔ
の試料を各溜めに添加する。定量のため、２倍希釈液を
調製する。１時間温室後、溜めを１００μｔのＰＢＳＴ
で３回洗浄し、次いで５０μｔの抗蛋白質Ａ−β−ガラ
クトシダーゼを添加する（各溜めに添加された蛋白質入
結合能力の量は過剰の蛋白質Ａによる滴定により検出さ
れた各溜めに添加されたＩｇＧのモル量に対応する）。
４５分間温直置た後、溜めを１００μｔのＰＢＳＴで３
回洗浄し、次いで１２５μｔの０ＮＰＧ　緩衝液を添加
する。２０〜３０分間温置した装置１５０μｔの０．１
　Ｍ　Ｎ　ａ　ＯＲを添加して反応を停止させる。定量
は既知濃度の蛋白質入標準溶液の２倍希釈液を試料の２
倍希釈液と平行して流すことにより行なう。４０５ｎｍ
ｌＣおける吸収を光度計により各溜めについて測定する
。
β−ガラクトシダーゼ分析：　β−ガラクトシダーゼの
定量をＭｉｌｌｅｒ、　Ｊ、　Ｈ，（Ｅｘｐｅｒｉｍｅ
ｎｔａｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、
　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　Ｎｅｖｒ　
Ｙｏｒｋ：Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９７２）により記載されたよう
に基質トしてＯ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシ
ド（０ＮＰＧ、　Ｓｉｇｍａ製品Ｎｏ、Ｎ−１１２７）
を用いる比色法により分析した。反応は４０５ｎｍにお
いて分光光度計で追跡した。
β−ラクタマーゼ分析：　β−ラクタ→−ゼ活性の量を
Ｏ’Ｃａ１１ａ、ｇｈａｎ　　ｅｔａｔ、　Ａｎｔｉｍ
ｉｅｒｏｂ。
Ａｇｅｎｔｓ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ、　５ユ、（１９６
８）により記載されたのと全く同じように分光光度測定
により決定した。
浸透衝撃：　細胞質周囲に位置する蛋白質をＮｏ５ａｅ
ｌ　ａｔ　ｍｌ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｓｍ、２４１
．３０５５（１９６５）に記載されたのと全く同じよう
に浸透衝撃により放出させた。
実施例 １、　ｆｆｉ白質白質ジヌクレオチド配列析蛋白質Ａ遺
伝子は１個のＩｇＧ結合領域（領域Ｅ、　Ｄ、　Ａ、　
Ｂ、　Ｃ）及び１個の細胞壁結合領域（領域Ｘ）を含む
（ｍ１図）。これら２８１の領域の前に７グナル配列が
おる。
シグナル配列の後及び領域Ｅの後裔々に融合点を含有す
−る融合媒介体を作るためには、融合点の周囲のヌクレ
オチド配列を知ることが望ましい。
蛋白質Ａのヌクレオチド配列が知られている（Ｕｈｌｅ
’ｎ、　Ｍ、　ｅｔａｔ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ
ｍ、　２５９　。
１６９５−１７０２（１９８４））。
シグナル配列（以下Ｓと称する）の後の融合点において
、Ｍａｔ　　ｌ制限酵素部位がある。領域Ｅの後、また
Ｍｓｔｌ制限酵素部位がある。以下に記載するように、
Ｍｓｔｌにより適轟なプラスミド媒介体中で蛋白質入遺
伝子を消化させ、次いでリンカ−を挿入することにより
、一般的な使用可能な媒介体が得られる。
Ｉｌ、ｐＡｓ、ｐＡｓＥ及びｐＡｓＥＥの構成次の工程
において、独特なＥｃｏＲＩ部位がＳ及びＳＥ各々に置
かれたプラスミド媒介体の構成を記載している。また、
ＳＥＥがＥＦ領領域間にかつＳＥＥ構成体の後にＥｃｏ
ＲＩ部位を有するように構成されるかを記載している。
Ａ、ｐＡＳ、ｐＡｓＥ及びｐＡＳＥＥプラスミド　介０
構成 ５０ｐｔのｐＲＩＴ４　（Ｎｔ１自ｓｏｎ、Ｂ、ｅｔａ
４ＥＭＢＯＪ。４．１０７５（１９８５））（第２図）
を５Ｕの制限酵素を用いてＭｓｔＩで消化させ、３７℃
で２時間温飯した。６５℃で３０分間温装置た後、反応
混合物を３種の別個の反応に分けた。異なる長さのＥｃ
ｏＲＩ’）ンカーを各反応に各々添加した。第一の試験
管に、８量体リンカーを添加しくＧＧＡＡＴＴＣＣ）、
第二の試験管に１０量体リンカ−を添加しく　ＣＣＧＡ
ＡＴＴＣＧＧ）、そして第三の試験管に１２：３１体リ
ンカ−を添加した（ＣＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧＧ）。（通
常方法に記載したように）結柴後、結に混合物を各々Ｅ
ｃｏＲ４で消化させ、次いで２μｆ／−まで希釈し、結
紮した。通常方法に記載したように転換を行ない、アン
ピシリン抵抗性被転換体を選択した。各反応において、
２種の主要な型の媒介体が見出された。−万の型はシグ
ナル配列、その後にＥｃｏＲＩリンカ−及びｍｐ　９マ
ルチリンカ−を含有している。ベクトルの他方の型は領
域Ｅの後でＥｃｏＲＩ！Ｊンカー、その後にｍｐ９リン
カ−を含有している。異なる長さでＥｅ　ｏＲＩを添加
することにより、各型の構成体について３種の解読ワク
においてｍｐ９！Ｊンカー制限部位が入手できる（第３
図）。
第３図に示したこれら２種の型の媒介体とは別に、１２
量体ＥｃｏＲＩリンカーを含有する実験において、も５
１種の型のプラスミド媒介体が回収できた。この構成体
はＳ　Ｅ　−１２量体り／カーーＥ−ｍｐ９りンカーを
含有する。このようにして、４８Ｉのアミノ酸が２株の
Ｅ領域間１ｃＥｃｏＲＩ制限部位と同様に導入てれる。
この媒介体はｐＡＳＥＥと命名され、３型解読ワク中で
ｍｐ　９リンカ−を有している（第３図）。全ての構成
体はＤＮＡ配列化を用いてリンカ−領域上に確紹できた
。
ｍ、Ｂ遺伝子フラグメントの構成 以下の実験はブドウ球函性蛋白ＩＪｉＬ人の領域Ｂをコ
ード化する遺伝子フラグメントのサブクローン化を記載
している。
出発物質、プラスミド媒介体ｐｓＰＡ１１は領域Ｂから
下流の領域０１１７個の塩基対中に位置する５ａｕ３Ａ
Ｉ制限部位１での蛋白質Ａ遺伝子を有する。ａｓＰＡｌ
ｌのｙｒｋ製後、精製プラスミドを、Ｂａｔ３１処理に
おける競合抑制剤として作用するＲＮＡを含有しない純
粋なプラスミドを得るためセファロース６Ｂカラムに通
した。約１００μ？の精製ｐＳＰＡＩＩ（第４図）をｇ
ｅ　ｏＲＩで消化させ領域Ｂから下流の１１７個の塩基
を開裂した。エクソヌクレアーゼＢａｔ３１を通常方法
に記載したように製造した。Ｂａｔ３１消化の後、反応
混合物をＥｔＯＨで沈殿させ、０．５　ｍＭ　ｄＮＴＰ
　ｓの存在下でＩＯＵＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで処理
することにより鈍末端を確実にした。異型長のＤＮＡを
プールしたものをＢａｍＨＩＢ量体リンカ−（ＣＧＧＡ
ＴＣＣＧ）で結合した。結紮後、反応混合物をＢａｍＨ
Ｉ及びＨｉｎｄＩ［ｌで開裂した。Ｈ３ｎｄｌ１１部位
は領域Ｂの７９個の塩基対上流に位置している。反応混
合物を５チポリアクリルアミドゲル電気流動にかけるこ
とによυ異型長のフラグメントを分離した。２５０個の
塩基対付近のフラグメントをゲルから切り出し、電気溶
離させ、ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄｎｌで既に開裂させた
ｐＥＭＢＬ９に結紮させた。大腸菌に転換後、ＪＭ１０
３白色コｏニーをＸ−ｇａｌ及びＩＰＴＧを含有するＴ
ＢＡＢプレート上で分離した。領域Ｂから除去した４種
のヌクレオチドを有するクローンを更に仕上げるために
選択した（第５図）。
このクローンからのプラスミドＤＮＡを精製し、セファ
ロース６Ｂ上に流しＲＮＡを除去した。約１００μ２の
プラスミドＤＮＡを更にＨｌｎｄｌｆｆで消化させエク
ソヌクレアーゼＢａｔ３１で通常方法中に記載したよう
に処理した。鈍末端を確実にするため、０．５ｍＭｄＮ
ＴＰの存在下で３７℃で３０分間Ｋｌｅｎｏｗポリメラ
ーゼ（１０Ｕ）で処理した後、反応混合物をＥｅｏＲｌ
ｌ　０量体リンカー（ＣＣＧＡＡＴＴＣＧＧ）に結紮し
た。ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで消化後、ＤＮＡを５％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動に付した。１７９個の
塩基対の所望の長さ付近の細片を切り出し、電気溶離に
かけた。溶離から単離したＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＢａ
ｍＨＩで消化させたｐ　ＥＭＢ　Ｌ　９に結紮した。大
Ｍ菌ＪＭＩ　Ｏ３に転換した後、白色コロニーをＸ−ｇ
ａｌ及びＩＰＴＧを含有するＴＢＡＢプレート上で選択
した。配列分析により、３：ｌｌｌ［の興味めるクロー
／（各々０．−１及び−２と言及する）が見出され、こ
れらを仕上げのため選択した。数字（０，−１及び−２
）は第５図に示したようにＥｅｏＲＩ！Ｊンカーの結合
の前に領域Ｂ中に消化されるヌクレオチドの数を示す。
領域Ｂ中への３種の異なる解読ワクの３種のクローン（
以下Ｂ−０，Ｂ−１及びＢ−２と称する）をＢａｍＨＩ
で開裂した。ＢａｍＨＩの粘着性末端を通常方法中に記
載したように８１−ヌクレアーゼで除去した。第６図に
示した翻訳ストップリンカ−を各反応混合物に結紮した
。各構成体中のりジン残基は今や第６図に示したように
入ってくるストップリンカ−の配向に依存してｃｔｙま
た／ｄ、　Ａ　ｌ　ｍのいずれかで置換されよう。大腸
菌ＪＭ１０３に転換後、下流に結合されたストップリン
カ−を有するＢフラグメントを含有する単離されたクロ
ーンの配列分析を行なった。配列分析により％Ｂ−０は
Ｇ１ｙ残基により、Ｂ−１はＡｌａ残基により。
そしてＢ−２はＡｌａ残基により終っていることが分っ
た。
これらのフラグメントは今やＩに記載した媒介体のある
ものにクローン化されることになる。
Ｍ、ｐＡｓＥＢ、ｐＡｓＢｌ及びｐＡｓＢ２の構成りの
フラグメントはここでｐＡＳ及びｐＡＳＥにクローン化
されることになった。
約５０μｔのＢ　−０，Ｂ　−１及びＢ−２及びストッ
プリンカ−を有する媒介体をＥｅｏＲＩ及びＨｉｎｄｌ
ｌ［で各々開裂した。Ｈｉｎｄｌｌ［はストップリンカ
−の直ちに後で開裂させる。各媒介体からのＢフラグメ
ントはポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて単離し
た。
Ｂ−０フラグメントをＥｅ　ｏＲＩ及びＨｉｎｄｌｌ［
で開裂されたｐＡｓ２　　（第３図）に結紮した。大腸
菌ＨＢ　１０１に転換し、個々のクローンからプラスミ
ドＤＮＡを制限分析した後、ｐＡＳＢ−１プラスミド媒
介体が７グナル配列の後に蛋白質ＡのフラグメントＢを
有して単離できた。
Ｂ−０フラグメントをＥｃ　ｏＲＩ及びＨｉｎｄｌｆｆ
で開裂されたｐＡｓＢ（第３図）に結紮した。犬ｗｋ菌
ＨＢ１０１に転換し、個々のクローンからプラスミドＤ
ＮＡを制限分析した彼、ｐＡｓＢ−２プラスミド媒弁体
がシグナル配列の後にフラグメントＢを有して単離でき
た。
ｐＡＳＢ−１及びＰＡＳＢ−２間の差は第７図に示した
ようにＥｃｏＲＩ！Ｊンカーに存在する３種のアミノ酸
である。
Ｂ−２フラグメントをＥｅｏＲＩ及びＨｉｎｄｌ［［で
開裂されたＰＡＳＥＩ（第３図）に結紮した。大腸菌Ｈ
ＢＩＯＩに転換し個々のクローンからプラスミドＤＮＡ
を制限分析した後ｐＡＳＥＢプラスミド媒介体が領域Ｅ
に結合された蛋白質入の７ラグメントを有して単離でき
た。
Ｖ、　　ｐＡＳＥＥ−ＩＧＦ−１の構成この実験におい
て、いかにしてヒトインシュリン様発育因子１　（ＩＧ
Ｆ−りをコード化する合成遺伝子を第１部にて記載した
ｐＡｓＥＥ媒介体にクローン化したかを示す。
ＩＧＦ−１をコード化する合成遺伝子（第８図）（Ｅｌ
ｍｂｌａｄ　、　Ａ、　ｅｔａ４　Ｔｈ１ｒｄ　Ｅｕｒ
ｏｐｅａｎＣｏｎｇｒｅｓｓ　ｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｙ　ｍ、　２８７−２９６Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈ
ｅｍｉｅ、　Ｗｅｉｎｈｅｉｍ　（１９８４）をｐＵＣ
８からＥｅｏＲＩ及びＨｌｎｄ　［［ｌで開裂した。Ｉ
　ＧＦ−１をコード化する遺伝子フラグメントをポリア
クリルアミドゲル屯気泳動次いで電気溶離により単離し
た。
プラスミド媒介体ｐＡＳＥＥｔ−ＥｅｏＲＩで部分的に
開裂させ、線状化させた媒介体は１％アガロースゲルを
気泳動から単離した。電気溶離後、線状媒介体をＨｌｎ
ｄ　ｍで消化させ、次いで１％アガロースゲルを気泳動
により単離した。ＩＧＦ−１７ラグメントをこのｐＡｓ
ＥＥ媒介体に結紮し、そして　４次いで転換後％ｐＡｓ
ＥＥ−ＩＧＦ−１はｐＡＳＥ−ＩＧＦ−１の背景にて単
離できた。ｐＡｓＥＥ−ＩＧＦＩはシグナル配列の後、
ＩＧＦ−１に融合したＥＥをコード化している。
■　ｐＥ８ＥＥ−ＩＧＦ−１の構成 この部ではいかにして５ＥＥ−ＩＧＦ−１が第１部にて
記載したｐＡｓ媒介体と比較してｐ　ＥＭＢ　１．の他
の配向においてクローン化されるかを示している。
約５０μ２のｐＡｓＥＥ−ＩＧＦ−１（第５部にて記載
したように）をＴａｑｌ及びＨｌ　ｎｄ　ｍで開裂させ
た。
制限エンドヌクレアーゼＴａｑＩは蛋白質Ａ遺伝子の翻
訳出発から上流の１７９個の塩基対を開裂させ、Ｈｉｎ
ｄｌ［ＩはＩＧＦ−１遺伝子の下流を開裂させる。
反応混合物を４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にか
け、５ＥＥＩＧＦＩ−１７ラグメントを切り出し電気溶
離させた。
このフラグメントをＡｃｃｌ及びＨｆｎｄｌ［Ｉで開裂
されたｐ　ＥＭＢ　Ｌ　８に結紮した。大腸菌ＨＢ　１
０１に転換した後、プラスミドｐＥ８ＥＥ−ＩＧＦ−１
は制限分析により分析されたように単離できた。
■　ｐＥ９ＥＤＡＢｃの構成 この部ではいかにして逆配向において蛋白′ＸＡのＩｇ
Ｇ結合部分を得るために５ＥＤＡＢＣをｐＥＭＢＬ９に
クローン化させるかを示している。
プラスミド媒介体ｐＲＩＴ４をＴａｇ（及びＥｅ　ｏＲ
Ｉで開裂させた。制御エンドヌクレアーゼＴａｑｌはＴ
ＴＧ出発コドンから上流の１７９個の塩基対を開裂し、
ＥｃｏＲＩは蛋白質Ａの領域Ｃ中で開裂させる。
このフラグメントはＡｃｅＩ及びＥｅ　ｏＲＩで開裂さ
れたＰＥＭＢＬ９Ｋｌ：結紮した。大腸菌ＨＢＩＯＩに
転換した後、プラスミド媒介体ｐＥ９ＥＤＡＢＣが単離
できた。このプラスミドは複製の原型から配向された蛋
白質Ａ遺伝子を有していた。
■　蛋白質入誘導フラグメントの大腸菌中の発現及び周
圧化 異なる蛋白質Ａ構成体を１晩増殖はせ、蛋白質Ａ、β−
ガラクトシダーゼ（細胞内マーカー）及びβ−ラクタマ
ーゼ（細胞質周囲壁間マーカー）の発現水準及び周圧化
を測定した。プラスミドｐＡＳＥＥを、他の構成体と同
じ大腸菌株中に宿るように大腸菌ＨＢ１０１に転換した
。１晩の増殖の後、細胞を遠心分離した。細胞を浸透衝
撃次いで遠心分離で（通常方法に記載したように）処理
した。
ペレット千のスフェロプラストを超音波処理することに
より細胞内蛋白質を放出させた。
媒介体の型（ＡまたはＢ）はβ−ラクタマーゼ（ＡＭ）
遺伝子に比較した蛋白質Ａ訪導栴成体の配向を言及して
いる（第８図）。β−ガラトシダーゼ、β−ラクタマー
ゼ及び蛋白質Ａの分析方法を通常方法に記載したように
行なった。
実験からの結果は第１表にみられる。
蛋白質Ａの小さなフラグメントは繊維状増殖並びに蛋白
質入誘導フラグメントを包含して細胞質周囲に位置した
蛋白質の漏出を誘発するとみている。
シグナル配列の直ちに後の領域Ｂを含有する遺伝子構成
体（ｐＡｓＢｉ跡ｐＡｓ１１２）において、蛋白質Ａフ
ラグメントの主要部分が細胞内画分中に見出される。結
論はこの挙動はミグナルペプチドを開裂除去するリーダ
ーペプチダーゼの不能によるものであり、そして翻訳さ
れ九Ｂペプチドは細胞質膜に付着するということである
。
ｐＡｓＢｌ及びｐＡＳＢ２　　プラスミド各々を保持′
　する大腸Ｉ！ｉｆＨ養物から精製されたＢフラグメン
トの（通常のＥｄｍａｎ分解技術による）Ｎ末端配列化
はシグナル配列中へのプロセッシング部位を明らかにし
、リーダーペプチダーゼがシグナルベプテドを開裂除去
しないことを確認した（第７図）。
更に、高められた発現水準がこれらの構成体、繊維状増
殖並びに通常細胞質周囲Ｉ／ｃある蛋白質の細胞外対応
体への漏出から見られる。
ｐＡｓＥＥ−ＩＧＦ’−１構成体はまた細胞外バイブ□
リッド蛋白質を与え、これは繊維状増殖と相関がある。
Ｂ型媒介体を表わす２種の構成体（ｐＥ８ＥＥ−ＩＧＦ
−１及びｐＥ８ＫＤＡＢｃ）は最も顕著な繊維状増殖を
示す。
大腸菌ＨＢ　１０１中ＩＣ発現されたｐＥ８ＥＤＡＩ＋
（＞は高い発現水準並びに分泌を与え−１ｐＲＩＴ４は
低い発現を与えることが注目に値する。この高められた
発現はｐＥ９ｇＤＡＢｃ構成において上流Ｉａｅ−プロ
モーターに依存することが主張できた。しかしながら、
この繊維状増殖及び発現水準は（ｌａｃ−ブロモ−ター
から転写を誘発すると知られた）ＩＰＴＧの添加に依存
しないことが示された。
この分泌から結論できることは蛋白質Ａプロモーター及
びシグナル配列に基ずく異なる構成体が繊維状増殖、増
殖培地への細胞質周囲蛋白質の輸送及び蛋白質入構成体
から高められた発現を誘発することである。
線維状増殖は大腸菌中の熱衝撃応答に相関しているので
、次の実験は蛋白質Ａプロモーターからの高い発現は熱
衝撃応答によるのか、おるいは理由の分らない高い発現
が熱衝撃応答を与えるのかを知るために行なった。
プラスミドｐＲＩＴ４は人型媒介体中で蛋白質Ａの■ｇ
Ｇ結合部分を保持している舘２図、第９図及び第１部）
、大腸菌ＨＢ　１０１を１晩増殖するとき、蛋白質入Ｆ
ｉ増殖培地にわずかしか分泌されない（９％）。この蛋
白質Ａ構成体を、４チＥｔＯＨ及び異なる酸化性剤が熱
衝撃応答を得るためのよく知られた他の方法ではあるが
、温度上昇として熱衝撃を用いまたは用いず増殖させる
よう選択した。
ｐＲＩＴ４を保持する大Ｓ菌ＨＢＩＯＩを１晩増殖はせ
た（３０℃）。１晩の培養胸を７０μｔ／ｄアンビｙ　
７リンを官有する１５ｍの新しいＴＢＳ培地にに！しく
１５０μＬ）、細胞は２個の別個の振盪フラスコ中で２
．５時間増殖させた。
培養物の−１を１５ｍのＴＢＳ（３０℃）で希釈し、３
０Ｃで温置した。他のフラスコに５４℃で１５−のＴＳ
Ｂを添加し、フラスコを４２０で温置した。
切替時から３時間温飯した後、細胞を遠心分離した。［
ｉｌベレットを１０−のＰＢＳＴで１回洗浄し％　５−
のＰＢＳＴで再懸濁し、３×３０秒（ＭＳＥ超音波処理
器中、ミクロチップ、出力レベル６）超音波処理した。
１０分間１６．００　Ｏｆで遠心分離後、上澄液を集め
た。
蛋白質Ａを培地中及び超音波処理画分中で定量し、細胞
質周囲及び細胞質中の全量に対応する。
結果は以下の通りであった。
ｐＲＩＴ４　３０い３０℃　０．２１０　０．１６　　
　（→　　１３ｐＲＩＴ４　３０Ｃ−０４２℃　０．２
８９　３．１４　　　＋　　　６８比較的低い発現が、
低い光学濃［（ＯＤ５Ｂ０）により立証される。熱衝撃
細胞培養物中の発現水準は２０倍高い。
これはもし蛋白ＩＪＭＡ遺伝子自体の転写調節が熱衝撃
応答のものである場合のみ説明されうる。
本発明はわずか数棟の特定な遺伝子を用いて本明細書中
に例示してきたが、本発明の基本概念はいかなる所望の
遺伝子をも発現させる遺伝子を必すとするものに適用で
きる。かぐして、例えば子（ＮＧＦ）、皮屑発育因子（
ＥＧＦ）、血小板発育因子（？ＤＧＦ）のような他のソ
マトメジン類の製造に使用できる。本発明の技術はまた
アルファー、ベーター及ヒカンマーインターフェロン類
％　イアターロイシン類、インシュリン、フィロペプチ
ド類、胃腸ペプチド類、または他の興味あるペプチド類
の製造に使用できる。
史に、本発明は宿主細胞として大腸菌の使用に限定され
るわけではなく、他の細菌性宿主細胞を用いても同様に
適用されることが観察される。
史に、蛋白質Ａから発したもの以外のシグナル配列が使
用できる。
【図面の簡単な説明】
第１図はその異なるコード化領域を示す蛋白質Ａ遺伝子
の模式図である。 第２図は蛋白質Ａ遺伝子を含有するプラスミド媒介体ｐ
ＲＩＴ４を例示している。 第３、発明の詳細な説明の実施例第１部に記載したよう
なｐＡＳ及びｐＡｓＥ媒介体である。 第４図は蛋白質Ａ遺伝子続いて多重制限酵素リンカ−を
保持するプラスミド媒介体を示す。 第５図は蛋白質ＡのＢ領域をコード化する異なる遺伝子
フラグメントを示している。 第６図はストラグリンカ−の配向とは独立して既時の翻
訳停止を生じさせるストップリンカ−を示している。 第７図は天然蛋白質Ａにおける結合と比較したシグナル
ペプチド及び異なるｐＡＳＢ構成体間の結合のアミノ酸
配列を示している。 椰８図は合成ＩＧＦ−１遺伝子のヌクレオチド配列を示
している。 第９図は異なる蛋白３ｆ［Ａ誘導体を発現させるのに用
いられた２種のタイプのプラスミド媒介体を示している
。 代理人　弁理士　秋　沢　政　光 他１名

Claims (32)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）ａ）プロモーター、転座及びプロセッシングを可
    能とするシグナル配列及び発現させるべき所望の蛋白質
    をコード化する構造遺伝子を含む組換体ＤＮＡ構造をグ
    ラム（−）菌中に導入し、 ｂ）細菌を繊維状増殖が生じるような条件下で培養し、
    そして ｃ）細胞外分泌された蛋白質を回収する 工程を含む、グラム（−）菌中に蛋白質を発現させ、そ
    の細胞外分泌をもたらす方法。
  2. （２）所望の蛋白質の発現が繊維状増殖のものと同一の
    転写調節を受ける特許請求の範囲第（１）項記載の方法
    。
  3. （３）該転写調節はシグマ−３２蛋白質因子を発現する
    ｈｔｐＲの誘発に基づく特許請求の範囲第（２）項記載
    の方法。
  4. （４）工程ｂ）における繊維状増殖は組換体ＤＮＡ構造
    及びそれから発現される蛋白質（Ａ）の性質による特許
    請求の範囲第（１）〜（３）項のいずれか一つの項記載
    の方法。
  5. （５）工程ｂ）における繊維状増殖は外部誘発による特
    許請求の範囲第（１）〜（３）項のいずれか一つの項記
    載の方法。
  6. （６）工程ｂ）における繊維状増殖は組換体ＤＮＡ構造
    及びそれから発現される蛋白質（Ａ）の性質及び外部誘
    発のいずれにもよる特許請求の範囲第（１）〜（３）項
    のいずれか一つの項記載の方法。
  7. （７）外来または誤つて折重られたと認められた発現蛋
    白質が細菌中でロン（ｌｏｎ）−応答を誘発する特許請
    求の範囲第（４）項記載の方法。
  8. （８）繊維状増殖は培養中の温度上昇により起こされ熱
    衝撃応答を誘発する特許請求の範囲第（５）項記載の方
    法。
  9. （９）繊維状増殖は培養培地中に変性剤を導入すること
    により起こされる特許請求の範囲第（５）項記載の方法
    。
  10. （１０）組換体ＤＮＡ構造はプラスミド媒介体により細
    菌中に導入される特許請求の範囲第（１）〜（９）項の
    いずれか一つの項記載の方法。
  11. （１１）組換体ＤＮＡ構造は細菌の染色体ＤＮＡ中に導
    入される特許請求の範囲第（１）〜（９）項のいずれか
    一つの項に記載の方法。
  12. （１２）組換体ＤＮＡ構造はシグナル配列として蛋白質
    Ａのものを含有する特許請求の範囲第（１）〜（１１）
    項のいずれか一つの項に記載の方法。
  13. （１３）シグナル配列に隣接した構造遺伝子は回収され
    るべき成熟蛋白質のＮ末端アミノ酸残基をコード化する
    開裂領域を含有する特許請求の範囲第（１２）項記載の
    方法。
  14. （１４）該開裂領域は少なくとも６個のアミノ酸残基を
    コード化するように構成されている特許請求の範囲第（
    １３）項記載の方法。
  15. （１５）該残基は Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｌａ、で
    ある特許請求の範囲第（１４）項記載の方法。
  16. （１６）構造遺伝子は蛋白質ＡのＥ、ＥＥ及びＥＢ領域
    から選択された遺伝子を含む特許請求の範囲第（１２）
    、（１３）、（１４）または（１５）項記載の方法。
  17. （１７）構造遺伝子はインシュリン様発育因子１（ＩＧ
    Ｆ−１）をコード化する遺伝子も含む特許請求の範囲第
    （１６）項記載の方法。
  18. （１８））プロモーター、シグナル配列及び開裂領域を
    含有する構造遺伝子を含む組換体ＤＮＡ構造であつて、
    該構造遺伝子が式 （Ｅ）＿ｎ（Ｂ）＿ｍ−Ｙ （式中、ｎは１以上の整数であり、ｍは整数であり、Ｙ
    は所望の蛋白質をコード化するＤＮＡ配列であり、そし
    てＥ及びＢは蛋白質Ａ領域Ｅ及びＢに対応する遺伝子で
    ある）で表わされ、但し、構造遺伝子は天然蛋白質Ａを
    コード化するものとは異なることを前提とする組換体Ｄ
    ＮＡ構造。
  19. （１９）ｎは１であり、そしてｍは０である特許請求の
    範囲第（１８）項記載の組換体ＤＮＡ構造。
  20. （２０）ｎは２であり、そしてｍは０である特許請求の
    範囲第（１８）項記載の組換体ＤＮＡ構造。
  21. （２１）ｎは１であり、そしてｍは０である特許請求の
    範囲第（１８）項記載の組換体ＤＮＡ構造。
  22. （２２）ｎは２であり、ｍは０であり、そしてＹはＩＧ
    Ｆ−１またはＩＧＦ−２をコード化する遺伝子である特
    許請求の範囲第（１８）項記載の組換体ＤＮＡ構造。
  23. （２３）開裂領域は少なくとも６個のアミノ酸残基をコ
    ード化するよう構成されている特許請求の範囲第（１８
    ）〜（２２）項のいずれか一つの項に記載の方法。
  24. （２４）該残基は Ａｌａ　Ｇｌｎ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａ１ａ、で
    ある特許請求の範囲第（２３）項記載の組換体ＤＮＡ構
    造。
  25. （２５）特許請求の範囲第（１８）〜（２４）項のいず
    れか一つの項に記載の組換体ＤＮＡ構造を含むプラスミ
    ド媒介体。
  26. （２６）ｐＥＭＢＬ９から発生する特許請求の範囲第（
    ２５）項記載のプラスミド媒介体。
  27. （２７）特許請求の範囲第（１８）〜（２４）項のいず
    れか一つの項に記載の組換体ＤＮＡ構造を保持するグラ
    ム（−）菌。
  28. （２８）その染色体中の該構造を保持する特許請求の範
    囲第（２７）項記載のグラム（−）菌。
  29. （２９）特許請求の範囲第（２５）または（２６）項記
    載のプラスミド媒介体を保持するグラム（−）菌。
  30. （３０）大腸菌である特許請求の範囲第（２７）〜（２
    ９）項のいずれか一つの項に記載のグラム（−）菌。
  31. （３１）大腸菌ＨＢ１０１である特許請求の範囲第（３
    ０）項記載のグラム（−）菌。
  32. （３２）特許請求の範囲第（１）〜（１７）項のいずれ
    か一つの項に記載の方法により得られた蛋白質。
JP61296510A 1985-12-13 1986-12-12 グラム陰性菌の増殖培地に遺伝子生成物を輸送する方法 Expired - Lifetime JPH082314B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE8505921A SE8505921D0 (sv) 1985-12-13 1985-12-13 A method to export gene products to the growth medium of gram negative bacteria
SE8505921-0 1985-12-13

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP6079184A Division JP2504723B2 (ja) 1985-12-13 1994-03-28 組換体ｄｎａとこれを含むプラスミドベクタ―とこのような組換体ｄｎａを保持する大腸菌

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS62190088A true JPS62190088A (ja) 1987-08-20
JPH082314B2 JPH082314B2 (ja) 1996-01-17

Family

ID=20362467

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP61296510A Expired - Lifetime JPH082314B2 (ja) 1985-12-13 1986-12-12 グラム陰性菌の増殖培地に遺伝子生成物を輸送する方法
JP6079184A Expired - Lifetime JP2504723B2 (ja) 1985-12-13 1994-03-28 組換体ｄｎａとこれを含むプラスミドベクタ―とこのような組換体ｄｎａを保持する大腸菌

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP6079184A Expired - Lifetime JP2504723B2 (ja) 1985-12-13 1994-03-28 組換体ｄｎａとこれを含むプラスミドベクタ―とこのような組換体ｄｎａを保持する大腸菌

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5156959A (ja)
EP (1) EP0225860B1 (ja)
JP (2) JPH082314B2 (ja)
AT (1) ATE82320T1 (ja)
AU (1) AU597317B2 (ja)
CA (1) CA1314010C (ja)
DE (1) DE3687112T2 (ja)
DK (1) DK175020B1 (ja)
ES (1) ES2052497T3 (ja)
GR (1) GR3006597T3 (ja)
SE (1) SE8505921D0 (ja)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE8601940D0 (sv) * 1986-04-25 1986-04-25 Kabigen Ab Preparation of fused proteins, antibodies and processes therefor
JPH03505401A (ja) * 1988-06-27 1991-11-28 ジェネックス・コーポレーション 組換えタンパク質の培養培地への熱放出
JPH04500754A (ja) * 1988-09-30 1992-02-13 アライド―シグナル・インコーポレーテッド 異種遺伝子発現のための改良細菌株
EP0550771B1 (en) * 1991-07-25 1999-09-29 Oriental Yeast Co., Ltd. Immunoglobulin-binding artificial protein
EP0695359B1 (en) * 1993-03-29 1997-06-04 E.I. Du Pont De Nemours & Company Incorporated A method for enhancing the production of biologically active recombinant proteins
US6958148B1 (en) 1998-01-20 2005-10-25 Pericor Science, Inc. Linkage of agents to body tissue using microparticles and transglutaminase
KR100312456B1 (ko) 1999-03-13 2001-11-03 윤덕용 슈도모나스 플루오레슨스 유래의 외래단백질 분비촉진유전자
JP3553858B2 (ja) 1999-08-25 2004-08-11 東洋紡績株式会社 血管網類似構造体を有する細胞培養用モジュール
JP4220756B2 (ja) 2002-10-28 2009-02-04 極東製薬工業株式会社 培養器、培養器の製造方法及び培養方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4338397A (en) * 1980-04-11 1982-07-06 President And Fellows Of Harvard College Mature protein synthesis
IE56720B1 (en) * 1983-02-07 1991-11-20 Battelle Memorial Institute Methods and compositions for expression of competent eukaryotic gene products
SE8300693L (sv) * 1983-02-09 1984-08-10 Sven Lofdahl Sett att framstella och isolera proteiner och polypeptider samt en hybridvektor for detta
US4472302A (en) * 1983-03-09 1984-09-18 Merck & Co., Inc. Heat shock process for the isolation of bacterial protein
US4624922A (en) * 1983-12-09 1986-11-25 Rikagaku Kenkyusho Plasmid, method for construction of the same, microorganism carrying the plasmid and method for cultivation of the microorganism
FR2556740B1 (fr) * 1983-12-14 1987-02-27 Merieux Inst Nouveaux mutants d'escherichia coli, capables d'excreter dans le milieu extracellulaire des proteines periplasmiques, leur obtention et leur application a la preparation de beta-lactamases ou de proteines hybrides de beta-lactamases
SE8505922D0 (sv) * 1985-12-13 1985-12-13 Kabigen Ab Construction of an igg binding protein to facilitate downstream processing using protein engineering

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
THE EMBO JOURNAL=1985 *

Also Published As

Publication number Publication date
DK175020B1 (da) 2004-04-26
EP0225860B1 (en) 1992-11-11
JPH0746988A (ja) 1995-02-21
DE3687112T2 (de) 1993-06-03
ATE82320T1 (de) 1992-11-15
JPH082314B2 (ja) 1996-01-17
DE3687112D1 (de) 1992-12-17
JP2504723B2 (ja) 1996-06-05
CA1314010C (en) 1993-03-02
ES2052497T3 (es) 1994-07-16
SE8505921D0 (sv) 1985-12-13
DK600386A (da) 1987-06-14
AU6633286A (en) 1987-06-18
DK600386D0 (da) 1986-12-12
EP0225860A2 (en) 1987-06-16
US5156959A (en) 1992-10-20
GR3006597T3 (ja) 1993-06-30
AU597317B2 (en) 1990-05-31
EP0225860A3 (en) 1988-10-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0135532B1 (en) Method of producing and selectively isolating proteins and polypeptides, recombinant and expression vector therefor and fusion protein able to bind to the constant region of immunoglobulins
EP0230869B1 (en) Construction of an igg binding protein to facilitate downstream processing using protein engineering
JP4243104B2 (ja) 重要なタンパク質の細菌培養上清中への分泌のための融合タンパク質
JP2703770B2 (ja) 結合タンパク質に融合されたタンパク質の生産及びその精製
US5100784A (en) Process for the preparation of mature human serum albumin
Baty et al. Extracellular release of colicin A is non‐specific.
JP2000135092A (ja) オリゴペプチド反復単位を有する大ポリペプチド
HU193504B (en) Process for preparing and applying recombinated plasmids containing basic phosphatase gens
JPS63503032A (ja) 免疫グロブリン結合性タンパク質の産生方法と手段
JPH06500006A (ja) ユビキチン特異的プロテアーゼ
Sichwart et al. Maximized autotransporter-mediated expression (MATE) for surface display and secretion of recombinant proteins in Escherichia coli
US4642333A (en) Immunologically reactive non-glycosylated amino acid chains of glycoprotein B of herpes virus types 1 and 2
Pohlner et al. Neisseria gonorrhoeae IgA protease. Secretion and implications for pathogenesis
Wong The ABCs of gene cloning
JPS62190088A (ja) グラム陰性菌の増殖培地に遺伝子生成物を輸送する方法
JPH07100039B2 (ja) グラム陰性宿主細胞を使用する蛋白質の遺伝子工学的取得法
JPH02501108A (ja) 微生物によるヒト副甲状腺ホルモンの生産
AU8492291A (en) A method for rapid selection of efficient secretion vectors
EP0133063A1 (en) Immunologically reactive non-glycosylated amino acid chains of glycoprotein B of herpes virus types 1 and 2
US20070031937A1 (en) Co-expression of recombinant proteins
KR101044332B1 (ko) 외래 단백질의 발현ㆍ분비용 재조합 벡터
JP2008501364A (ja) 機能的に連結されたｒｇｇ遺伝子及びｇｔｆｇプロモーターを含む発現系
EP0314184A1 (en) Expression plasmids
NO864442L (no) Mutantkodende sekvens.
JPS61280292A (ja) 菌体外分泌による蛋白質の製造法

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term