JPH07100039B2 - グラム陰性宿主細胞を使用する蛋白質の遺伝子工学的取得法 - Google Patents
グラム陰性宿主細胞を使用する蛋白質の遺伝子工学的取得法Info
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- JPH07100039B2 JPH07100039B2 JP62504234A JP50423487A JPH07100039B2 JP H07100039 B2 JPH07100039 B2 JP H07100039B2 JP 62504234 A JP62504234 A JP 62504234A JP 50423487 A JP50423487 A JP 50423487A JP H07100039 B2 JPH07100039 B2 JP H07100039B2
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- C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
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- C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は所望の蛋白質をコードする遺伝子少なくとも１
つを有するベクターがその中に導入されるグラム陰性宿
主細胞を使用し、該遺伝子を転写し、かつ翻訳する蛋白
質の遺伝子工学的取得法に関する。
つを有するベクターがその中に導入されるグラム陰性宿
主細胞を使用し、該遺伝子を転写し、かつ翻訳する蛋白
質の遺伝子工学的取得法に関する。
蛋白質の取得のための遺伝子工学的方法はすでに長いこ
と公知である。このためには容易に培養可能であり、生
産した蛋白質の取得を簡単な方法で行なうことのできる
微生物を使用するのが有利である。多く使用される微生
物はこの際E.コリであり、これは非常に容易に培養可能
であり、かつその特性は十分に知られている。この微生
物属の欠点は、グラム陰性微生物として生じた蛋白質も
しくはポリペプチドをしばしば周囲に出さず、場合によ
つてはペリプラズマ中に放出する。従つて、後処理に手
数がかかり、微生物の破壊によつてのみ行なうことがで
きる。
と公知である。このためには容易に培養可能であり、生
産した蛋白質の取得を簡単な方法で行なうことのできる
微生物を使用するのが有利である。多く使用される微生
物はこの際E.コリであり、これは非常に容易に培養可能
であり、かつその特性は十分に知られている。この微生
物属の欠点は、グラム陰性微生物として生じた蛋白質も
しくはポリペプチドをしばしば周囲に出さず、場合によ
つてはペリプラズマ中に放出する。従つて、後処理に手
数がかかり、微生物の破壊によつてのみ行なうことがで
きる。
多数の蛋白質がグラム陰性菌中で分泌される。しかしな
がら、外膜を通る第２のトランスロケーシヨン工程のた
めに特異的な細菌蛋白質が分泌のために必要であること
が示された。相応する構造遺伝子のクローン化がE.コリ
のペリプラズマ中での該蛋白質の蓄積に導びく。同じ効
果がヘモフイルス・インフルエンザIgA−プロテアーゼ
に関しても記載されており、これは天然の宿主中では細
胞外に分泌されるが、これをE.コリ中でクローン化する
時ペリプラズマ中で見い出される。更に複雑であるのは
E.コリ−ヘモリジンの分泌である。ここでは唯一のオペ
ロン上にコードされる、全部で４つの異なる蛋白質成分
が必要である。
がら、外膜を通る第２のトランスロケーシヨン工程のた
めに特異的な細菌蛋白質が分泌のために必要であること
が示された。相応する構造遺伝子のクローン化がE.コリ
のペリプラズマ中での該蛋白質の蓄積に導びく。同じ効
果がヘモフイルス・インフルエンザIgA−プロテアーゼ
に関しても記載されており、これは天然の宿主中では細
胞外に分泌されるが、これをE.コリ中でクローン化する
時ペリプラズマ中で見い出される。更に複雑であるのは
E.コリ−ヘモリジンの分泌である。ここでは唯一のオペ
ロン上にコードされる、全部で４つの異なる蛋白質成分
が必要である。
従つて、本発明の課題はグラム陰性宿主細胞を使用して
蛋白質を遺伝子工学的に取得する方法を、この所望の蛋
白質がその宿主細胞中で形成された後、該細胞から放出
され、次いでこれを培地から細胞外で取得することがで
きるように改良することである。
蛋白質を遺伝子工学的に取得する方法を、この所望の蛋
白質がその宿主細胞中で形成された後、該細胞から放出
され、次いでこれを培地から細胞外で取得することがで
きるように改良することである。
この課題は、所望の蛋白質をコードする遺伝子少なくと
も１つを有する組換えベクターがその中に導入されるグ
ラム陰性宿主細胞を使用し、この遺伝子を転写し、かつ
翻訳することにより蛋白質を遺伝子工学的に取得し、細
胞外分泌する方法において、所望の蛋白質の細胞外取得
のために、融合ポリペプチドをコードする組換えDNAが
生じるように、この蛋白質をコードする遺伝子をベクタ
ー中に挿入するが、該DNAは： ｉ）グラム陰性宿主細胞の内膜の通過のためのＮ−末端
リーダー部 ii）所望の蛋白質を有する部分、及び iii）グラム陰性宿主細胞の外膜を通過するための第３
図によるIgA−プロテアーゼ−プレカーサー−遺伝子の
ヘルパーセグメントからのＣ−末端部、ここでヘルパー
−セグメントからの部分は融合ポリペプチドの細胞外分
泌に作用するように選択されている、 を含有することを特徴とする。
も１つを有する組換えベクターがその中に導入されるグ
ラム陰性宿主細胞を使用し、この遺伝子を転写し、かつ
翻訳することにより蛋白質を遺伝子工学的に取得し、細
胞外分泌する方法において、所望の蛋白質の細胞外取得
のために、融合ポリペプチドをコードする組換えDNAが
生じるように、この蛋白質をコードする遺伝子をベクタ
ー中に挿入するが、該DNAは： ｉ）グラム陰性宿主細胞の内膜の通過のためのＮ−末端
リーダー部 ii）所望の蛋白質を有する部分、及び iii）グラム陰性宿主細胞の外膜を通過するための第３
図によるIgA−プロテアーゼ−プレカーサー−遺伝子の
ヘルパーセグメントからのＣ−末端部、ここでヘルパー
−セグメントからの部分は融合ポリペプチドの細胞外分
泌に作用するように選択されている、 を含有することを特徴とする。
人の粘膜上で成長するナイセリア・ゴノルロエー（Neis
seria gonorrhoeae）及びナイセリア・メニンギチジス
（Neisseria meningitidis）のようなナイセリア属の種
々の病原菌種は人IgA1に関して特異的である細胞外プロ
テアーゼを放出する。この免疫グロブリンはIgA2ととも
にそのような病原体での伝染に対して保護すべき分泌免
疫性の主成分である。病原体でない、使用細菌種は全く
IgA−プロテアーゼを生産しない。
seria gonorrhoeae）及びナイセリア・メニンギチジス
（Neisseria meningitidis）のようなナイセリア属の種
々の病原菌種は人IgA1に関して特異的である細胞外プロ
テアーゼを放出する。この免疫グロブリンはIgA2ととも
にそのような病原体での伝染に対して保護すべき分泌免
疫性の主成分である。病原体でない、使用細菌種は全く
IgA−プロテアーゼを生産しない。
ナイセリア属の菌から得られたIgA−プロテアーゼ遺伝
子は意外な特性を示す。形成されたIgA−プロテアーゼ
もしくはそのプレカーサーは天然の宿主中でだけでな
く、異なるグラム陰性宿主細胞、例えばエンテロバクテ
リアツエー（Enterobacteriaccae）中でも活発に分泌さ
れる。大きなプレカーサーをコードする唯一の遺伝子が
異なる宿主細胞中でもIgA−プロテアーゼの生産及び細
胞外分泌のために十分である。分子量わずか106kdであ
る完成細胞外IgA−プロテアーゼよりほぼ63kd大きい、
分子量170kdを有するこのプレカーサーは、グラム陰性
宿主細胞の膜を通る搬送の際に、かつ酵素の自己蛋白質
分解活性による工程により該プレカーサー分子のいくつ
かの部分が切断されてIgA−プロテアーゼの活性型にな
る。このプレカーサー蛋白質は5KbのDNA−フラグメント
によりコードされる。
子は意外な特性を示す。形成されたIgA−プロテアーゼ
もしくはそのプレカーサーは天然の宿主中でだけでな
く、異なるグラム陰性宿主細胞、例えばエンテロバクテ
リアツエー（Enterobacteriaccae）中でも活発に分泌さ
れる。大きなプレカーサーをコードする唯一の遺伝子が
異なる宿主細胞中でもIgA−プロテアーゼの生産及び細
胞外分泌のために十分である。分子量わずか106kdであ
る完成細胞外IgA−プロテアーゼよりほぼ63kd大きい、
分子量170kdを有するこのプレカーサーは、グラム陰性
宿主細胞の膜を通る搬送の際に、かつ酵素の自己蛋白質
分解活性による工程により該プレカーサー分子のいくつ
かの部分が切断されてIgA−プロテアーゼの活性型にな
る。このプレカーサー蛋白質は5KbのDNA−フラグメント
によりコードされる。
該プレカーサーは均質なアミノ末端リーダーペプチド、
実際のプロテアーゼ部及び比較的大きなカルボキシ端末
ヘルパー部の３つの機能ドメインを形成する。
実際のプロテアーゼ部及び比較的大きなカルボキシ端末
ヘルパー部の３つの機能ドメインを形成する。
リーダーペプチドはIgA−プロテアーゼプレカーサーを
ペリプラズマスリツト中に導びき、内膜のシグナルペプ
チダーゼによりプレカーサーから除去される。従つて、
IgA−プロテアーゼの搬送における開始工程は規則的な
コー又はポストトランスレーシヨン法に等しく、ペリプ
ラズマ蛋白質及び外膜蛋白質の多くはこれに従がう。
ペリプラズマスリツト中に導びき、内膜のシグナルペプ
チダーゼによりプレカーサーから除去される。従つて、
IgA−プロテアーゼの搬送における開始工程は規則的な
コー又はポストトランスレーシヨン法に等しく、ペリプ
ラズマ蛋白質及び外膜蛋白質の多くはこれに従がう。
第２の工程においては、プロテアーゼ及びヘルパー部か
らなる残つたプレカーサー複合体が外膜中に搬送され、
かつ細胞外に放出される。この工程の機械的経過はIgA
−プロテアーゼ−プレカーサー複合体のヘルパー機能で
説明することができる。アミノ末端ヘルパー部は強く極
性であり、これに対してカルボキシ末端部はむしろ疎水
性であり、膜積層にとつて典型的な特徴を示す。該ヘル
パーが外膜中で孔を形成し、その際親水性部がこの孔中
に突き出すということが、この観察から結果として得ら
れた説明である。なおヘルパーと結合している実際のプ
ロテアーゼ部は、次いでこの孔を通つて押し出され、細
胞外にその活性配置をとる。継続的な自己蛋白質分解工
程は次いでIgA−プロテアーゼの完成した活性型を細胞
外環境に放出する。活性搬送に必要であるエネルギーは
ヘルパーの自己蛋白質分解的切断に因る。
らなる残つたプレカーサー複合体が外膜中に搬送され、
かつ細胞外に放出される。この工程の機械的経過はIgA
−プロテアーゼ−プレカーサー複合体のヘルパー機能で
説明することができる。アミノ末端ヘルパー部は強く極
性であり、これに対してカルボキシ末端部はむしろ疎水
性であり、膜積層にとつて典型的な特徴を示す。該ヘル
パーが外膜中で孔を形成し、その際親水性部がこの孔中
に突き出すということが、この観察から結果として得ら
れた説明である。なおヘルパーと結合している実際のプ
ロテアーゼ部は、次いでこの孔を通つて押し出され、細
胞外にその活性配置をとる。継続的な自己蛋白質分解工
程は次いでIgA−プロテアーゼの完成した活性型を細胞
外環境に放出する。活性搬送に必要であるエネルギーは
ヘルパーの自己蛋白質分解的切断に因る。
所望の蛋白質の細胞外取得のためにはナイセリア属のIg
A−プロテアーゼを含有するベクター中に、このコード
する遺伝子を自体公知法で組み込む。該IgA−プロテア
ーゼ遺伝子の配列は前記のように３つの主ドメインであ
る、リーダー部、IgAプロテアーゼ自体に関してコード
する配列及びヘルパー部からなる。プロテアーゼをコー
ドする範囲とヘルパードメインとの間、もしくはヘルパ
ードメインの中に３つの天然の切断部位が存在すること
が、意外にも確認された。この第１図中に示した遺伝子
配列中ａ、ｂ及びｃで示されている切断部位は次のアミ
ノ酸から形成されている： 切断部位（ａ）:Pro−Ala−Pro−Ser−Pro 切断部位（ｂ）:Pro−Pro−Ser−Pro 切断部位（ｃ）:Pro−Arg−Pro−Pro−Ala−Pro。
A−プロテアーゼを含有するベクター中に、このコード
する遺伝子を自体公知法で組み込む。該IgA−プロテア
ーゼ遺伝子の配列は前記のように３つの主ドメインであ
る、リーダー部、IgAプロテアーゼ自体に関してコード
する配列及びヘルパー部からなる。プロテアーゼをコー
ドする範囲とヘルパードメインとの間、もしくはヘルパ
ードメインの中に３つの天然の切断部位が存在すること
が、意外にも確認された。この第１図中に示した遺伝子
配列中ａ、ｂ及びｃで示されている切断部位は次のアミ
ノ酸から形成されている： 切断部位（ａ）:Pro−Ala−Pro−Ser−Pro 切断部位（ｂ）:Pro−Pro−Ser−Pro 切断部位（ｃ）:Pro−Arg−Pro−Pro−Ala−Pro。
所望の蛋白質に関してコードする配列をIgA−プロテア
ーゼの種々の範囲に組み込むことが今や可能である。リ
ーダー部への挿入は、この部分が内膜を介する通過の際
に脱離されるので、考慮されない。
ーゼの種々の範囲に組み込むことが今や可能である。リ
ーダー部への挿入は、この部分が内膜を介する通過の際
に脱離されるので、考慮されない。
本発明による方法の変法は、所望の蛋白質に関してコー
ドする遺伝子をIgA−プロテアーゼドメイン中に挿入す
ることである。IgA−プロテアーゼ−プレカーサー遺伝
子のプロテアゼドメインの一定の位置にIgA−プロテア
ーゼ活性を破壊なしにこの組込みは可能である。この場
合、IgA−プレカーサーを表現すると、この際所望の蛋
白質がプロテアーゼ部分の中に存在する。
ドする遺伝子をIgA−プロテアーゼドメイン中に挿入す
ることである。IgA−プロテアーゼ−プレカーサー遺伝
子のプロテアゼドメインの一定の位置にIgA−プロテア
ーゼ活性を破壊なしにこの組込みは可能である。この場
合、IgA−プレカーサーを表現すると、この際所望の蛋
白質がプロテアーゼ部分の中に存在する。
なお不活性なIgA−プロテアーゼ、もしくはそのプレカ
ーサーが前記のような方法で放出される。次いで所望の
蛋白質が少なくとも部分的になお活性のプロテアーゼに
結合して存在する。プロテアーゼの分離はこのために好
適なプロテアーゼによるこのプロテアーゼの処理工程に
より、又は化学反応により行なわれる。
ーサーが前記のような方法で放出される。次いで所望の
蛋白質が少なくとも部分的になお活性のプロテアーゼに
結合して存在する。プロテアーゼの分離はこのために好
適なプロテアーゼによるこのプロテアーゼの処理工程に
より、又は化学反応により行なわれる。
所望の蛋白質に関してコードする遺伝子を、活性IgA−
プロテアーゼをもはや形成することができず、こうして
IgA−プロテアーゼ活性がもはや存在しないように、IgA
−プロテアーゼ−ドメイン中に挿入することもできる。
この場合、本発明による方法の有利な実施形は、同時に
培養される、同じバクテリア中又は異なるバクテリア中
に、全IgA−プロテアーゼ遺伝子を有するベクターを導
入することである。所望の蛋白質と同時に形成されるIg
A−プロテアーゼは次いで所望の蛋白質をヘルパーか
ら、こうして膜から分離することができ、こうして培養
液から取得することを可能とする。
プロテアーゼをもはや形成することができず、こうして
IgA−プロテアーゼ活性がもはや存在しないように、IgA
−プロテアーゼ−ドメイン中に挿入することもできる。
この場合、本発明による方法の有利な実施形は、同時に
培養される、同じバクテリア中又は異なるバクテリア中
に、全IgA−プロテアーゼ遺伝子を有するベクターを導
入することである。所望の蛋白質と同時に形成されるIg
A−プロテアーゼは次いで所望の蛋白質をヘルパーか
ら、こうして膜から分離することができ、こうして培養
液から取得することを可能とする。
本発明による方法の有利な実施形においては、所望の蛋
白質をコードする遺伝子配列を天然の切断部位（ａ）、
（ｂ）及び／又は（ｃ）の間にあるIgA−プロテアーゼ
−プレカーサー遺伝子の遺伝子切断片中に挿入する。こ
の場合、IgA−プロテアーゼの活性は保持され、かつ所
望の蛋白質は両方の膜を通つて放出された後、プレカー
サーの処理において天然の脱離によりプロテアーゼから
分離され、培地中に遊離して存在するから、これを培地
から公知法で単離することができる。
白質をコードする遺伝子配列を天然の切断部位（ａ）、
（ｂ）及び／又は（ｃ）の間にあるIgA−プロテアーゼ
−プレカーサー遺伝子の遺伝子切断片中に挿入する。こ
の場合、IgA−プロテアーゼの活性は保持され、かつ所
望の蛋白質は両方の膜を通つて放出された後、プレカー
サーの処理において天然の脱離によりプロテアーゼから
分離され、培地中に遊離して存在するから、これを培地
から公知法で単離することができる。
IgA−遺伝子のプロテアーゼドメイン中への組込みはIgA
−プロテアーゼドメインの１部又は全体を破壊するよう
に行なうこともできる。IgA−プロテアーゼ活性の破壊
により、グラム陰性細菌種の両方の膜を介して所望の蛋
白質の放出までは行なわれるが、膜に会合するヘルパー
を酵素から分離するプロテアーゼ活性が欠けているの
で、所望の蛋白質はヘルパーに結合して残り、こうして
細胞壁に会合する。本発明による方法のこの実施形は生
ワクチンの製造に特に好適である。このようにして、例
えば表面抗原はグラム陰性微生物の外膜に結合し、抗体
の生成に使用することができる。
−プロテアーゼドメインの１部又は全体を破壊するよう
に行なうこともできる。IgA−プロテアーゼ活性の破壊
により、グラム陰性細菌種の両方の膜を介して所望の蛋
白質の放出までは行なわれるが、膜に会合するヘルパー
を酵素から分離するプロテアーゼ活性が欠けているの
で、所望の蛋白質はヘルパーに結合して残り、こうして
細胞壁に会合する。本発明による方法のこの実施形は生
ワクチンの製造に特に好適である。このようにして、例
えば表面抗原はグラム陰性微生物の外膜に結合し、抗体
の生成に使用することができる。
所望の蛋白質の本発明による取得のためにはグラム陰性
宿主細胞、特にエンテロバクテリアツエー（Enterobact
eriaceae）の微生物は非常に良好である。エシエリキア
属（Escherichia）及びサルモネラ属（Salmonella）の
微生物を使用するのが有利である。E.コリ、サルモネラ
・チフイムリウム（Salmonella typhimurium）及び弱毒
化サルモネラ・チフイイ（Salmonella typhii）の菌株
を用いる実験は、これらの宿主細胞を用いて、天然宿主
であるN.ゴノルロエー（gonorrhoeae）におけるより高
いIgA−プロテアーゼ活性が上澄中に放出されることを
示した。細胞外酵素が同一であり、同じプレカーサーか
ら工程を経るので、これらすべてのグラム陰性システム
中でのIgA−プロテアーゼの分泌は同じ機能に因る。
宿主細胞、特にエンテロバクテリアツエー（Enterobact
eriaceae）の微生物は非常に良好である。エシエリキア
属（Escherichia）及びサルモネラ属（Salmonella）の
微生物を使用するのが有利である。E.コリ、サルモネラ
・チフイムリウム（Salmonella typhimurium）及び弱毒
化サルモネラ・チフイイ（Salmonella typhii）の菌株
を用いる実験は、これらの宿主細胞を用いて、天然宿主
であるN.ゴノルロエー（gonorrhoeae）におけるより高
いIgA−プロテアーゼ活性が上澄中に放出されることを
示した。細胞外酵素が同一であり、同じプレカーサーか
ら工程を経るので、これらすべてのグラム陰性システム
中でのIgA−プロテアーゼの分泌は同じ機能に因る。
本発明による方法は蛋白質の取得のために好適である。
本発明による方法を用いて生理学的又は治療上の活性の
蛋白質を取得するのが特に有利である。本発明による方
法のもう１つの適用は、グラム陰性細菌性生接種物質中
で適用するために抗原エピトープを放出することにあ
る。本発明による方法はプラスミドpIP100を含有するE.
コリDSM3775を宿主細胞として用いて実施するのが特に
有利である。プラスミドpIP100はプラスミドpBR322から
誘導され、IgA−プロテアーゼ−プレカーサーの全遺伝
子配列を有する。
本発明による方法を用いて生理学的又は治療上の活性の
蛋白質を取得するのが特に有利である。本発明による方
法のもう１つの適用は、グラム陰性細菌性生接種物質中
で適用するために抗原エピトープを放出することにあ
る。本発明による方法はプラスミドpIP100を含有するE.
コリDSM3775を宿主細胞として用いて実施するのが特に
有利である。プラスミドpIP100はプラスミドpBR322から
誘導され、IgA−プロテアーゼ−プレカーサーの全遺伝
子配列を有する。
本発明による方法は簡単に蛋白質を得ることを可能にす
る。宿主細胞として、容易に培養可能であるグラム陰性
菌を使用するにもかかわらず蛋白質は培地から得ること
ができる。
る。宿主細胞として、容易に培養可能であるグラム陰性
菌を使用するにもかかわらず蛋白質は培地から得ること
ができる。
本発明により使用したIgA−プロテアーゼ−プレカーサ
ーに関してコードするDNA−フラグメントは塩基対4602
の長さの唯一の関連開放読み取り域を形成する、塩基対
4899の全配列を有する。遺伝子配列は第１図からわか
る。
ーに関してコードするDNA−フラグメントは塩基対4602
の長さの唯一の関連開放読み取り域を形成する、塩基対
4899の全配列を有する。遺伝子配列は第１図からわか
る。
開放読み取り域の第３コドンであるATG−開始コドン及
びシヤイン・ダルガルノ配列に似た配列は104位に翻訳
開始点を示す。該翻訳は4700位でTAA−オーカー終止コ
ドンで終わる。翻訳開始シグナルの前のAT−豊富域はプ
ロモーターの典型的な特徴を示し、かつIgA−プロテア
ーゼ遺伝子の転写を指揮する。翻訳終止コドンに続くパ
リンドローム配列は転写ターミネーターとして働らく。
びシヤイン・ダルガルノ配列に似た配列は104位に翻訳
開始点を示す。該翻訳は4700位でTAA−オーカー終止コ
ドンで終わる。翻訳開始シグナルの前のAT−豊富域はプ
ロモーターの典型的な特徴を示し、かつIgA−プロテア
ーゼ遺伝子の転写を指揮する。翻訳終止コドンに続くパ
リンドローム配列は転写ターミネーターとして働らく。
ヌクレオチド配列データの精確な評価は、169kdの蛋白
質を示すIgA−プロテアーゼプレカーサーに関するアミ
ノ酸1532の全体を示した（第１図）。完全なプレカーサ
ー配列はアミノ酸11の間隔で見い出された２つのシステ
イン基のみを有する。システインの不存在が多くの分泌
蛋白質に関して特徴的であるので、このことは興味深い
ことである。親水性プロフイールはいくつかの優れた特
徴を有する規則的に交替するパターンを示す：アミノ末
端の末端部の短かい疎水性配列は、アミノ末端のプラス
の電荷４つ及び中央疎水性域１つを示す典型的な分泌シ
グナルペプチドを形成する。このリーダーペプチドとし
て示した配列の切断部位は位置−１及び＋１のアラニン
基２つの間にある（第１図）。プレカーサーの第１次構
造の最もきわだつ特徴はプレーカーサーの中央域の右側
の著るしく親水性の域２つ及びそのカルボキシ末端の短
かい域である。
質を示すIgA−プロテアーゼプレカーサーに関するアミ
ノ酸1532の全体を示した（第１図）。完全なプレカーサ
ー配列はアミノ酸11の間隔で見い出された２つのシステ
イン基のみを有する。システインの不存在が多くの分泌
蛋白質に関して特徴的であるので、このことは興味深い
ことである。親水性プロフイールはいくつかの優れた特
徴を有する規則的に交替するパターンを示す：アミノ末
端の末端部の短かい疎水性配列は、アミノ末端のプラス
の電荷４つ及び中央疎水性域１つを示す典型的な分泌シ
グナルペプチドを形成する。このリーダーペプチドとし
て示した配列の切断部位は位置−１及び＋１のアラニン
基２つの間にある（第１図）。プレカーサーの第１次構
造の最もきわだつ特徴はプレーカーサーの中央域の右側
の著るしく親水性の域２つ及びそのカルボキシ末端の短
かい域である。
完成した細胞外IgA−プロテアーゼに相応する部分はプ
レカーサー分子のアミノ末端域中でリーダーペプチドに
続いて存在する。
レカーサー分子のアミノ末端域中でリーダーペプチドに
続いて存在する。
プロテアーゼ及びヘルパー間の境界域は種々のプロリン
豊富域を有し、これは人IgA1においてN.ゴノルロエーか
らのIgA−プロテアーゼの切断部位と目だつた配列一致
を示す。第３図はａ、ｂ、ｃで示されるこれらの位置の
アミノ酸配列を示す（第１図）。この位置はIgA−プロ
テアーゼの自己蛋白質分解攻撃点である。これを安定に
するために、酵素での切断をトランスで行なつた。この
目的のためにMS2/IgA−プロテアーゼ融合蛋白質を調製
用量でゲル上で単離し、精製したIgA−プロテアーゼ少
量と共に恒温保持する。種々のIgA−プロテアーゼ融合
体と活性酵素との恒温保持は実際に特異的な分解生成物
に導びいた。第２図に示した融合蛋白質fp180は120kdと
60kdを有する２つの主生成物と45kdと15kdを有する２つ
のより小さな生成物に切断された。対照の恒温保持はIg
A−プロテアーゼでの特異的反応に関して予期されてい
たようにマイナスである。完成したプロテアーゼに対し
て向いているモノクロン抗体の使用下に120kd−バンド
はイムノブロツト中で反応する。fp42融合蛋白質（第２
図）に向いた抗血清は60kd及び45kd生成物と、同様に15
kd生成物と交差反応を示す。120kd生成物との交差反応
は融合蛋白質中のMS2ポリメラーゼ部分に因る。このデ
ータは部位（ａ）及び／又は（ｂ）が実際にIgA−プロ
テアーゼの攻撃部位であることを支持する。45kd及び15
kd生成物は多分部位（ｃ）での部分的な消化により生じ
る（第２図）。この部位の他に他の域は融合蛋白質中で
IgA−プロテアーゼの攻撃部位として認められない。内
部プレカーサー攻撃部位に関する詳細なインフオーメー
シヨンは60kd切断生成物のアミノ末端配列分析により得
られる（第３図）。この蛋白質フラグメントはアクリル
アミドゲル中で融合バンドとして現われ、遺伝子地図に
よればプレカーサーのカルボキシ末端部を形成する（第
１図）。この分析は配列決定工程１、２、４、５、７及
び９〜13に関するあいまいでないデータを示す。部位８
までのすべての他の工程に関しては２つのアミノ酸の配
列分析シグナルが生じる。これら２つのアミノ酸のそれ
ぞれは任意の位置で部位（ａ）もしくは部位（ｂ）の配
列と一緒に重なる（第３図）。部位９〜13は部位（ｂ）
のアミノ末端配列と一緒に重なる。従つて、蛋白質配列
の異種性は２つの部位（ａ）及び（ｂ）をIgA−プロテ
アーゼのための攻撃部位として使用することを保証す
る。
豊富域を有し、これは人IgA1においてN.ゴノルロエーか
らのIgA−プロテアーゼの切断部位と目だつた配列一致
を示す。第３図はａ、ｂ、ｃで示されるこれらの位置の
アミノ酸配列を示す（第１図）。この位置はIgA−プロ
テアーゼの自己蛋白質分解攻撃点である。これを安定に
するために、酵素での切断をトランスで行なつた。この
目的のためにMS2/IgA−プロテアーゼ融合蛋白質を調製
用量でゲル上で単離し、精製したIgA−プロテアーゼ少
量と共に恒温保持する。種々のIgA−プロテアーゼ融合
体と活性酵素との恒温保持は実際に特異的な分解生成物
に導びいた。第２図に示した融合蛋白質fp180は120kdと
60kdを有する２つの主生成物と45kdと15kdを有する２つ
のより小さな生成物に切断された。対照の恒温保持はIg
A−プロテアーゼでの特異的反応に関して予期されてい
たようにマイナスである。完成したプロテアーゼに対し
て向いているモノクロン抗体の使用下に120kd−バンド
はイムノブロツト中で反応する。fp42融合蛋白質（第２
図）に向いた抗血清は60kd及び45kd生成物と、同様に15
kd生成物と交差反応を示す。120kd生成物との交差反応
は融合蛋白質中のMS2ポリメラーゼ部分に因る。このデ
ータは部位（ａ）及び／又は（ｂ）が実際にIgA−プロ
テアーゼの攻撃部位であることを支持する。45kd及び15
kd生成物は多分部位（ｃ）での部分的な消化により生じ
る（第２図）。この部位の他に他の域は融合蛋白質中で
IgA−プロテアーゼの攻撃部位として認められない。内
部プレカーサー攻撃部位に関する詳細なインフオーメー
シヨンは60kd切断生成物のアミノ末端配列分析により得
られる（第３図）。この蛋白質フラグメントはアクリル
アミドゲル中で融合バンドとして現われ、遺伝子地図に
よればプレカーサーのカルボキシ末端部を形成する（第
１図）。この分析は配列決定工程１、２、４、５、７及
び９〜13に関するあいまいでないデータを示す。部位８
までのすべての他の工程に関しては２つのアミノ酸の配
列分析シグナルが生じる。これら２つのアミノ酸のそれ
ぞれは任意の位置で部位（ａ）もしくは部位（ｂ）の配
列と一緒に重なる（第３図）。部位９〜13は部位（ｂ）
のアミノ末端配列と一緒に重なる。従つて、蛋白質配列
の異種性は２つの部位（ａ）及び（ｂ）をIgA−プロテ
アーゼのための攻撃部位として使用することを保証す
る。
N.ゴノルロエーの培養上澄液から製造された完成IgA−
プロテアーゼは、106/109kd二重バンドをアクリルアミ
ドゲル中で形成する異種蛋白質であるという観察は、部
位（ａ）又は部位（ｂ）に相応する完成IgA−プロテア
ーゼの異種カルボキシ末端により説明することができ
る。部位（ａ）及び（ｂ）間の間隔を橋渡しする3kdペ
プチドセグメントは両方の形の分子量における差異に関
与しているのであろう。
プロテアーゼは、106/109kd二重バンドをアクリルアミ
ドゲル中で形成する異種蛋白質であるという観察は、部
位（ａ）又は部位（ｂ）に相応する完成IgA−プロテア
ーゼの異種カルボキシ末端により説明することができ
る。部位（ａ）及び（ｂ）間の間隔を橋渡しする3kdペ
プチドセグメントは両方の形の分子量における差異に関
与しているのであろう。
粗培養上澄中には付加的なバンド121kdが示されてお
り、これはIgA−プロテアーゼに属する。このバンドは
抗プロテアーゼ血清とだけではなく、融合蛋白質fp42に
対する抗血清とも交差反応し、このことは121kd蛋白質
がヘルパーの境界部を有していることを示した。
り、これはIgA−プロテアーゼに属する。このバンドは
抗プロテアーゼ血清とだけではなく、融合蛋白質fp42に
対する抗血清とも交差反応し、このことは121kd蛋白質
がヘルパーの境界部を有していることを示した。
その大きさにより、中間生成物のカルボキシ末端はIgA
−プロテアーゼ−プレカーサーの内部攻撃点の１つであ
る部位（ｃ）（第１図）に正確に存在する。
−プロテアーゼ−プレカーサーの内部攻撃点の１つであ
る部位（ｃ）（第１図）に正確に存在する。
細胞外IgA−プロテアーゼの３つの型の比較量を成長す
るE.コリ培地中で測定した。これらの実験の結果は成長
段階の早期においては121kd中間生成物が主であるとい
うことを示す。成長の時間と共に酵素が集まる時に、主
に109kd中間生成物が、次いでIgA−プロテアーゼの完成
106kd型を検出することができる。このことは高分子中
間生成物の完成酵素へのゆつくりとした変換を意味す
る。いくつかのIgA−プロテアーゼ調剤中に主要フラク
シヨンとして含有される、分子量109kdの中間生成物は
長期間の貯臓後に低分子量の形にゆつくりと変換すると
いうこととこの観察は一致する。
るE.コリ培地中で測定した。これらの実験の結果は成長
段階の早期においては121kd中間生成物が主であるとい
うことを示す。成長の時間と共に酵素が集まる時に、主
に109kd中間生成物が、次いでIgA−プロテアーゼの完成
106kd型を検出することができる。このことは高分子中
間生成物の完成酵素へのゆつくりとした変換を意味す
る。いくつかのIgA−プロテアーゼ調剤中に主要フラク
シヨンとして含有される、分子量109kdの中間生成物は
長期間の貯臓後に低分子量の形にゆつくりと変換すると
いうこととこの観察は一致する。
この実験は、ヘルパーの極性部が少なくともIgA−プロ
テアーゼ自体と共に細胞外分泌されるということを示
す。イムノブロツトにより内部切断位（ｂ）及び（ｃ）
の間に存在する、ヘルパーの小さい12kd部分は実際に細
胞外環境中にIgA−プロテアーゼと一緒に遊離される。
この域の極性特性はIgA−プロテアーゼの細胞外分泌に
特に重要であるということが推論される。
テアーゼ自体と共に細胞外分泌されるということを示
す。イムノブロツトにより内部切断位（ｂ）及び（ｃ）
の間に存在する、ヘルパーの小さい12kd部分は実際に細
胞外環境中にIgA−プロテアーゼと一緒に遊離される。
この域の極性特性はIgA−プロテアーゼの細胞外分泌に
特に重要であるということが推論される。
ナイセリア属の微生物の病原性は場合によりIgA−プロ
テアーゼの形成に起因するとも思われる。従つて、これ
らの微生物に起因する重い病気の治療のための可能性
は、プレカーサーをもはや切断することができないよう
に、すなわちその固有の切断部位がもはや感知されず、
こうして有害作用に関与する活性酵素がもはや生じるこ
とができないようにIgA−プロテアーゼ−プレカーサー
の切断位を遮蔽することにある。
テアーゼの形成に起因するとも思われる。従つて、これ
らの微生物に起因する重い病気の治療のための可能性
は、プレカーサーをもはや切断することができないよう
に、すなわちその固有の切断部位がもはや感知されず、
こうして有害作用に関与する活性酵素がもはや生じるこ
とができないようにIgA−プロテアーゼ−プレカーサー
の切断位を遮蔽することにある。
プレカーサーの切断位を遮蔽するためには、切断部位
（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）を構成するアミノ酸配
列と結合性の物質、特にこのアミノ酸配列に向いた抗体
を使用するのが有利である。
（ａ）、（ｂ）及び／又は（ｃ）を構成するアミノ酸配
列と結合性の物質、特にこのアミノ酸配列に向いた抗体
を使用するのが有利である。
もう１つの可能性は、ペプチド類似物質の添加によりIg
A−プロテアーゼの切断位を遮蔽することであり、この
ペプチド類似物質は切断部位の配列に関してわずかに変
性したアミノ酸配列を有し、こうしてこれは切断位に積
層するが、切断されず、こうして切断部位についたまま
離れない。
A−プロテアーゼの切断位を遮蔽することであり、この
ペプチド類似物質は切断部位の配列に関してわずかに変
性したアミノ酸配列を有し、こうしてこれは切断位に積
層するが、切断されず、こうして切断部位についたまま
離れない。
次の実施例により本発明を図面と関連させて詳説する。
第１図はN.ゴノルロエー株MS11のIgA−プロテアーゼの
ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。開放読み取
り域から誘導されたアミノ酸配列はIgA−プロテアーゼ
のプレカーサーを包含する。ヌクレチオド配列はpIP100
中のクローン化したDNA−フラグメントの重なつたセグ
メントの分析から判明した全データから得られた。この
際マキサム（Maxam）及びギルバート（Gilbert）による
方法、並びにザンガー（Sanger）等による方法を使用し
た。
ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。開放読み取
り域から誘導されたアミノ酸配列はIgA−プロテアーゼ
のプレカーサーを包含する。ヌクレチオド配列はpIP100
中のクローン化したDNA−フラグメントの重なつたセグ
メントの分析から判明した全データから得られた。この
際マキサム（Maxam）及びギルバート（Gilbert）による
方法、並びにザンガー（Sanger）等による方法を使用し
た。
第２図はヌクレオチド−及びアミノ酸配列の特性を示
す。IgA−プロテアーゼ遺伝子の転写（−43、−35及び
−10）及び翻訳（SD）の開始のためのシグナルは太い線
で示した。転写の終止に関与するパリンドロームは太い
矢印を下に記した。IgA−プロテアーゼのアミノ末端シ
グナル配列はわくに入れた。成長したIgA−プロテアー
ゼのアミノ末端は蛋白質配列決定により分析された。部
位（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）はIgA−プロテアーゼの内
部切断位を示す（第３図及び第６図も参照）。切断され
たペプチド結合（矢印により示される）は蛋白質配列決
定により決められ、このデータと誘導されたアミノ酸配
列との一致は星印で示した。全プレカーサーの唯二つの
システイン基をわくで囲んだ。
す。IgA−プロテアーゼ遺伝子の転写（−43、−35及び
−10）及び翻訳（SD）の開始のためのシグナルは太い線
で示した。転写の終止に関与するパリンドロームは太い
矢印を下に記した。IgA−プロテアーゼのアミノ末端シ
グナル配列はわくに入れた。成長したIgA−プロテアー
ゼのアミノ末端は蛋白質配列決定により分析された。部
位（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）はIgA−プロテアーゼの内
部切断位を示す（第３図及び第６図も参照）。切断され
たペプチド結合（矢印により示される）は蛋白質配列決
定により決められ、このデータと誘導されたアミノ酸配
列との一致は星印で示した。全プレカーサーの唯二つの
システイン基をわくで囲んだ。
第３図はIgA−プロテアーゼ及びその遺伝子の物理的特
性を示す。A;E.コリ中のゴノコツケン（Gonococcen）Ig
A−プロテアーゼの合成及び分泌に作用するpIP100挿入
の制限地図。B;pEX表現システムと共に製造したIgA−プ
ロテアーゼプレカーサーの融合蛋白質。濃く太い線は表
現システムのアミノ末端MS2ポリメラーゼキヤリヤーを
示し、中空の線は融合蛋白質中に含有されているプレカ
ーサーの相応する部分に関連する。キヤリヤーとプレカ
ーサー部分の境界は表現ベクターが結合した、IgA−プ
ロテアーゼ遺伝子中の部位に相当する。C;プレカーサー
の直線地図である。塗りつぶした部分はリーダーペプチ
ドであり、中空部分はプロテアーゼドメインであり、か
つ交差線の部分はヘルパードメインである。矢印は内部
IgA−プロテアーゼ切断位（ａ、ｂ及びｃ）を示す。（S
H）はプレカーサー中の唯２つのシステインの位置に関
連し、（ｘ）は外膜の仮定のトランスロケーシヨンシグ
ナルの位置を示す。D;プレカーサーの第１次構造のヒド
ロパシ−ブロツトである。
性を示す。A;E.コリ中のゴノコツケン（Gonococcen）Ig
A−プロテアーゼの合成及び分泌に作用するpIP100挿入
の制限地図。B;pEX表現システムと共に製造したIgA−プ
ロテアーゼプレカーサーの融合蛋白質。濃く太い線は表
現システムのアミノ末端MS2ポリメラーゼキヤリヤーを
示し、中空の線は融合蛋白質中に含有されているプレカ
ーサーの相応する部分に関連する。キヤリヤーとプレカ
ーサー部分の境界は表現ベクターが結合した、IgA−プ
ロテアーゼ遺伝子中の部位に相当する。C;プレカーサー
の直線地図である。塗りつぶした部分はリーダーペプチ
ドであり、中空部分はプロテアーゼドメインであり、か
つ交差線の部分はヘルパードメインである。矢印は内部
IgA−プロテアーゼ切断位（ａ、ｂ及びｃ）を示す。（S
H）はプレカーサー中の唯２つのシステインの位置に関
連し、（ｘ）は外膜の仮定のトランスロケーシヨンシグ
ナルの位置を示す。D;プレカーサーの第１次構造のヒド
ロパシ−ブロツトである。
第４図はIgA−プロテアーゼに関する攻撃位置及び蛋白
質配列分析を示す。A;人IgA1中のIgA−プロテアーゼ切
断位のアミノ酸配列及びIgA−プロテアーゼプレカーサ
ー中の攻撃点の配列（第１及び第２図と比較）。B;融合
蛋白質fp180の切断の際に精製したIgA−プロテアーゼと
共に生じた60kd生成物のアミノ末端配列分析。配列決定
データの定量的評価は、生成物の80％が切断位（ｂ）で
の切断から生じ、わずかに20％が切断位（ａ）での切断
により生じたことを示す。
質配列分析を示す。A;人IgA1中のIgA−プロテアーゼ切
断位のアミノ酸配列及びIgA−プロテアーゼプレカーサ
ー中の攻撃点の配列（第１及び第２図と比較）。B;融合
蛋白質fp180の切断の際に精製したIgA−プロテアーゼと
共に生じた60kd生成物のアミノ末端配列分析。配列決定
データの定量的評価は、生成物の80％が切断位（ｂ）で
の切断から生じ、わずかに20％が切断位（ａ）での切断
により生じたことを示す。
第５図はIgA−プロテアーゼの超生産のためのベクター
の製造を示す、このためにはIgA−プロテアーゼプレカ
ーサーの完全な遺伝子をpEX−表現システムの制御下に
製造した。プラスミドpEX1000はMS2−ポリメラーゼ/IgA
−プロテアーゼプレカーサー−ハイブリツド蛋白質の細
胞内形成に導びく。細胞外搬送の経過において、この融
合蛋白質の切断及び培養上澄液中へのIgA−プロテアー
ゼ及びα−蛋白質の遊離に至る。
の製造を示す、このためにはIgA−プロテアーゼプレカ
ーサーの完全な遺伝子をpEX−表現システムの制御下に
製造した。プラスミドpEX1000はMS2−ポリメラーゼ/IgA
−プロテアーゼプレカーサー−ハイブリツド蛋白質の細
胞内形成に導びく。細胞外搬送の経過において、この融
合蛋白質の切断及び培養上澄液中へのIgA−プロテアー
ゼ及びα−蛋白質の遊離に至る。
第６図はグラム陰性菌からの蛋白質の分泌のためのシス
テムにおける表現シグナル並びにIgA−プロテアーゼド
メインの交換を示す。Liga、Piga及びHigaはIgA−プロ
テアーゼプレカーサーのドメインを表わす。PigaはIgA
−プロテアーゼ遺伝子の当初のプロモーターを示し、こ
れは構成されたハイブリツド蛋白質中で抗原Ａのプロモ
ーター（Pa）と交換された。Laは内膜を通る搬送に必要
である、抗原Ａのリーダーペプチドを表わす。
テムにおける表現シグナル並びにIgA−プロテアーゼド
メインの交換を示す。Liga、Piga及びHigaはIgA−プロ
テアーゼプレカーサーのドメインを表わす。PigaはIgA
−プロテアーゼ遺伝子の当初のプロモーターを示し、こ
れは構成されたハイブリツド蛋白質中で抗原Ａのプロモ
ーター（Pa）と交換された。Laは内膜を通る搬送に必要
である、抗原Ａのリーダーペプチドを表わす。
第７図はゴノコツケン株（Gonokokkenstaemme）R16（タ
イプ１）、514（タイプ２）及び74（タイプ１）の部分
的に配列決定したIgA−プロテアーゼ遺伝子切断片をゴ
ノコツケン株MS11のIgA−プロテアーゼ遺伝子中の相応
する遺伝子切断片と比較する。比較した配列切断片はヌ
クレオチド部位1079〜2140、2410〜2571及び3011〜3172
を包含する。図面中にはそのうちのヌクレオチドの置換
も示すそれぞれの範囲が示されている。ヌクレオチド位
は第１図中で確定されている。配列決定した遺伝子切断
片中で個々のプロテアーゼ遺伝子間に全体で３〜６％の
配列差が検出された。
イプ１）、514（タイプ２）及び74（タイプ１）の部分
的に配列決定したIgA−プロテアーゼ遺伝子切断片をゴ
ノコツケン株MS11のIgA−プロテアーゼ遺伝子中の相応
する遺伝子切断片と比較する。比較した配列切断片はヌ
クレオチド部位1079〜2140、2410〜2571及び3011〜3172
を包含する。図面中にはそのうちのヌクレオチドの置換
も示すそれぞれの範囲が示されている。ヌクレオチド位
は第１図中で確定されている。配列決定した遺伝子切断
片中で個々のプロテアーゼ遺伝子間に全体で３〜６％の
配列差が検出された。
例 １ IgA−プロテアーゼの超生産及び培養上澄液中への搬送
の最適化 IgA−プロテアーゼ−プレカーサーの完全な遺伝子とMS2
−ポリメラーゼ遺伝子とをpEX−表現システム中で合成
オルゴヌクレオチドを用いて融合した（第５図）。生じ
たプラスミドpEX1000をIgA−プロテアーゼ−プレカーサ
ーの全アミノ酸配列と結合したMS2−ポリメラーゼのア
ミノ末端のアミノ酸99個からなる大きなハイブリツド蛋
白質の表現のために宿主細胞の細胞質に導入した。この
融合蛋白質は分泌の間に蛋白質分解により切断され、培
地上澄液中にIgA−プロテアーゼ並びに中間生成物を遊
離する。分泌されるヘルパーのセグメント中のわずかな
アミノ酸の欠失により、IgA−プロテアーゼ分泌の効率
も品質も著しく上昇する（第１表参照）。
の最適化 IgA−プロテアーゼ−プレカーサーの完全な遺伝子とMS2
−ポリメラーゼ遺伝子とをpEX−表現システム中で合成
オルゴヌクレオチドを用いて融合した（第５図）。生じ
たプラスミドpEX1000をIgA−プロテアーゼ−プレカーサ
ーの全アミノ酸配列と結合したMS2−ポリメラーゼのア
ミノ末端のアミノ酸99個からなる大きなハイブリツド蛋
白質の表現のために宿主細胞の細胞質に導入した。この
融合蛋白質は分泌の間に蛋白質分解により切断され、培
地上澄液中にIgA−プロテアーゼ並びに中間生成物を遊
離する。分泌されるヘルパーのセグメント中のわずかな
アミノ酸の欠失により、IgA−プロテアーゼ分泌の効率
も品質も著しく上昇する（第１表参照）。
第１表は種々のバクテリア種のIgA−プロテアーゼ分泌
並びに表現シグナルの変化の影響並びにIgA−プロテア
ーゼの遺伝子中での改変を比較したものである。蛋白質
量はSDS−ポリアクリルアミドゲル及びウエスタンブロ
ツト分析により測定した。
並びに表現シグナルの変化の影響並びにIgA−プロテア
ーゼの遺伝子中での改変を比較したものである。蛋白質
量はSDS−ポリアクリルアミドゲル及びウエスタンブロ
ツト分析により測定した。
例 ２ IgA−プロテアーゼ−プレカーサー中へのオリゴペプチ
ドの組込み及び培養上澄液中への搬送 遺伝子工学的方法を使用してIgA−プロテアーゼの遺伝
子中に３ケ所で長さ12bpの合成DNA−二本鎖を組み込ん
だ。このことは蛋白質の翻訳の後、それぞれ４つの付加
的なアミノ酸挿入に相応する。これらの３ケ所すべての
挿入（第１表参照）はIgA−プロテアーゼの搬送及び酵
素的活性に全く影響を示さない。プラスミドpEX1000.A5
1、−.R9及び−.A36に関しては（第５図及び第１表参
照）、バクテリアの上澄中に当初のクロンpIP100におけ
ると同じIgA−プロテアーゼの中間体及び同じ最終状態
が表われる。pEX1000.A36中の挿入オリゴペプチドは切
断位（ｂ）及び（ｃ）の間に存在し、こうして自己蛋白
質分解の後12kd切断生成物と共に可溶性で媒体中に放出
される。
ドの組込み及び培養上澄液中への搬送 遺伝子工学的方法を使用してIgA−プロテアーゼの遺伝
子中に３ケ所で長さ12bpの合成DNA−二本鎖を組み込ん
だ。このことは蛋白質の翻訳の後、それぞれ４つの付加
的なアミノ酸挿入に相応する。これらの３ケ所すべての
挿入（第１表参照）はIgA−プロテアーゼの搬送及び酵
素的活性に全く影響を示さない。プラスミドpEX1000.A5
1、−.R9及び−.A36に関しては（第５図及び第１表参
照）、バクテリアの上澄中に当初のクロンpIP100におけ
ると同じIgA−プロテアーゼの中間体及び同じ最終状態
が表われる。pEX1000.A36中の挿入オリゴペプチドは切
断位（ｂ）及び（ｃ）の間に存在し、こうして自己蛋白
質分解の後12kd切断生成物と共に可溶性で媒体中に放出
される。
例 ３ 表現シグナル及びプロテアーゼ−ドメインの置換IgA−
プロテアーゼ−プレカーサー蛋白質のカルボキシ末端の
60kdの大きさのヘルパードメインはプロテアーゼ−ドメ
インを外膜を介して搬送するために必要である。蛋白質
分泌においてヘルパーの基本的な意義を強化するため
に、プロテアーゼ−ドメインPiga、プロモーターPiga及
びシグナル配列Ligaの大部分を遺伝子工学的方法で置換
した。この変換は（ｉ）遺伝子表現のためのシグナル、
（ii）細菌内膜を介する蛋白質搬送のためのPa、シグナ
ル配列Laを含有しているフラグメントに対して行なわれ
る。更にこのフラグメントは抗原Aaに関してコードする
配列（iii）を供給する。ヘルパー配列Higaとの並進的
融合は、組換えE.コリ細胞の培養上澄液中に約36kdのヘ
ルパー特異的蛋白質バンドの検出を可能とした。このた
めにモノクロン抗体を使用した。従来、この予期した大
きさの完全な融合蛋白質を検出することはできなかつ
た。組換えクロンの全細胞溶解物中に45kdのヘルパー特
異的蛋白質の検出が達せられたが、その培養上澄液中で
はなかつた。この観察から、36kdの大きさのヘルパー特
異的蛋白質は45kdヘルパーバンドの分解生成物であると
判明した。この記載した分解は従来組換Ｅ−コリ細胞に
おいて観察されただけで、天然の宿主においてではなか
つた。
プロテアーゼ−プレカーサー蛋白質のカルボキシ末端の
60kdの大きさのヘルパードメインはプロテアーゼ−ドメ
インを外膜を介して搬送するために必要である。蛋白質
分泌においてヘルパーの基本的な意義を強化するため
に、プロテアーゼ−ドメインPiga、プロモーターPiga及
びシグナル配列Ligaの大部分を遺伝子工学的方法で置換
した。この変換は（ｉ）遺伝子表現のためのシグナル、
（ii）細菌内膜を介する蛋白質搬送のためのPa、シグナ
ル配列Laを含有しているフラグメントに対して行なわれ
る。更にこのフラグメントは抗原Aaに関してコードする
配列（iii）を供給する。ヘルパー配列Higaとの並進的
融合は、組換えE.コリ細胞の培養上澄液中に約36kdのヘ
ルパー特異的蛋白質バンドの検出を可能とした。このた
めにモノクロン抗体を使用した。従来、この予期した大
きさの完全な融合蛋白質を検出することはできなかつ
た。組換えクロンの全細胞溶解物中に45kdのヘルパー特
異的蛋白質の検出が達せられたが、その培養上澄液中で
はなかつた。この観察から、36kdの大きさのヘルパー特
異的蛋白質は45kdヘルパーバンドの分解生成物であると
判明した。この記載した分解は従来組換Ｅ−コリ細胞に
おいて観察されただけで、天然の宿主においてではなか
つた。
Claims (10)
- 【請求項１】所望の蛋白質をコードする遺伝子を少なく
とも１つを有する組換えベクターがその中に導入される
グラム陰性宿主細胞を使用し、この遺伝子を転写し、か
つ翻訳することにより蛋白質を遺伝子工学的に取得し、
細胞外分泌する方法において、所望の蛋白質の細胞外取
得のために、融合ポリペプチドをコードする組換えDNA
が生じるように、この蛋白質をコードする遺伝子をベク
ター中に挿入するが、該DNAは： ｉ）グラム陰性宿主細胞の内膜の通過のためのＮ−末端
リーダー部 ii）所望の蛋白質を有する部分、及び iii）グラム陰性宿主細胞の外膜を通過するための第３
図によるIgA−プロテアーゼ−プレカーサー−遺伝子の
ヘルパーセグメントからのＣ−末端部、ここでヘルパー
−セグメントからの部分は融合ポリペプチドの細胞外分
泌に作用するように選択されている、 を含有することを特徴とするグラム陰性宿主細胞を使用
する蛋白質の遺伝子工学的取得法。 - 【請求項２】IgA−プロテアーゼ−プレカーサー−遺伝
子からのＮ−末端リーダー部を使用する請求の範囲第１
項記載の方法。 - 【請求項３】IgA−プロテアーゼ−プレカーサー−遺伝
子から由来しない、Ｎ−末端リーダー部を使用する請求
の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項４】ナイセリア属の微生物からのIgA−プロテ
アーゼ−プレカーサー−遺伝子を含有するベクター中に
所望の蛋白質をコードする遺伝子を、このコードする遺
伝子がプロテアーゼセグメント及び／又はヘルパーセグ
メントに関する配列中ではあるが、IgA−プロテアーゼ
−プレカーサー−遺伝子のリーダーセグメントに関する
配列中ではない位置に配置されるように挿入する請求の
範囲第１項記載の方法。 - 【請求項５】所望の蛋白質をコードする遺伝子を、生じ
る組換えDNAが活性IgA−プロテアーゼをコードする遺伝
子セグメントを含有するように挿入する請求の範囲第１
項から第４項までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項６】プロテアーゼセグメント及びヘルパーセグ
メントの境界域にあるIgA−プロテアーゼ−プレカーサ
ー−蛋白質の天然の切断部位間にあるIgA−プロテアー
ゼ−プレカーサー−遺伝子の位置に、コードする遺伝子
を挿入する請求の範囲第５項記載の方法。 - 【請求項７】コードする遺伝子をIgA−プロテアーゼを
コードする遺伝子セグメント中に挿入する請求の範囲第
４項記載の方法。 - 【請求項８】更に、同時に培養されている同じ宿主細胞
又は他の宿主細胞にIgA−プロテアーゼをコードするベ
クターを導入する請求の範囲第７項記載の方法。 - 【請求項９】膜に付着する蛋白質の遊離を特異的なプロ
テアーゼ、特にIgA−プロテアーゼの添加により又は化
学薬剤により行なう請求の範囲７項記載の方法。 - 【請求項１０】宿主細胞としてエンテロバクテリアツエ
ーの微生物を使用する請求の範囲第１項から第９項まで
のいずれか１項記載の方法。
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