JPH06189765A - 真核生物の発現系 - Google Patents

真核生物の発現系

Info

Publication number
JPH06189765A
JPH06189765A JP4362189A JP36218992A JPH06189765A JP H06189765 A JPH06189765 A JP H06189765A JP 4362189 A JP4362189 A JP 4362189A JP 36218992 A JP36218992 A JP 36218992A JP H06189765 A JPH06189765 A JP H06189765A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
sequence
gene
nucleotide
protein
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP4362189A
Other languages
English (en)
Inventor
Roelof Ary Lans Bovenberg
アリ ランス ボーフェンベルハ ルーロフ
Adrianus Wilhelmus Vollebregt
ウィルヘルムス フォレブレヒト アドリアヌス
Solingen Pieter Van
ファン ソーリンゲン ピーテル
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gist Brocades NV
Original Assignee
Gist Brocades NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Gist Brocades NV filed Critical Gist Brocades NV
Publication of JPH06189765A publication Critical patent/JPH06189765A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

(57)【要約】 【目的】 真核微生物、特に糸状菌用の効率的な遺伝子
発現およびタンパク分泌系、より詳細には転写並びに翻
訳開始および転写終止配列を提供することを目的とす
る。 【構成】 配列リスト１のヌクレオチド１からヌクレオ
チド426 までのヌクレオチド配列または本質的に同一の
ヌクレオチド配列、またはその機能性部分を含む、転写
並びに翻訳開始調節配列；配列リスト１のヌクレオチド
850 からヌクレオチド1514までのヌクレオチド配列また
は本質的に同一のヌクレオチド配列、またはその機能性
部分を含む、転写終止調節配列；配列リスト１のヌクレ
オチド427からヌクレオチド537 までのヌクレオチド配
列または本質的に同一のヌクレオチド配列、またはその
機能性部分を含む、タンパク分泌シグナルコード配列。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は真核細胞、特に菌類細胞
用の遺伝子発現系並びにタンパク分泌系に関するもので
ある。
【０００２】
【技術的背景】タンパクの工業的生産は工業的バイオテ
クノロジーの主要な目標である。そのために、ある範囲
の生物が使用され、その多くは微生物、特にエシェリヒ
ア(Escherichia) 、バチルス(Bacillus)、アクチノマイ
セーテス(Actinomycetes) 種のバクテリア；サッカロマ
イセス(Saccharomyces) およびクリベロマイセス(Kluyv
eromyces) 種の酵母；およびアスペルギルス(Aspergill
us) およびトリコデルマ(Trichoderma) 種の糸状菌であ
る。生細胞内に新たなDNA 配列を導入しかつそこでこれ
を発現する能力は、微生物によるタンパク生産の多くの
新たな可能性を生み出した。糸状菌のための信頼できる
遺伝子転移系の開発は、これら微生物の工業的タンパク
生産工程での利用に関する興味を著しく駆り立てた。こ
れらの興味は以下の事実により説明できる。 1) 糸状菌は本来的に大量のタンパクを合成し、かつ分
泌できる。 2) 幾つかの菌類は長きに渡り工業的に利用されてお
り、セーブ(save)(GRAS)生産微生物として認識されてい
る。 3) かなりの知見並びに経験が、大規模醗酵および菌類
培養物の処理に関して入手できる。 4) 糸状菌により生産される異種タンパクの構造は、末
端、変性および折り畳みに関してこれらタンパクの標準
的な構造にかなり類似している（または同等である）。
これは非相同遺伝子発現に対する宿主としてバクテリア
または酵母細胞を使用した場合には往々にして達成する
ことができない。 5) 菌類株内での形質転換されたrDNAの高い安定性。
【０００３】これら全ての好ましい特徴にもかかわら
ず、僅かに限られた数の糸状菌種がタンパク生産工程で
利用されているに過ぎない。更に、これら糸状菌種内で
の異種タンパクの発現は、一般に同種タンパクの発現程
には効率的でない。かくして、効率的な遺伝子発現およ
びタンパク分泌を可能とし、かつタンパクの生産に対す
る糸状菌宿主の能力範囲を広げる系の開発、特にそのペ
ニシリウムクリソゲヌム（Penicillium chrysogenum)へ
の応用が強く望まれている。P.クリソゲヌムはペニシリ
ンの工業的生産において40年以上に渡り世界的規模で利
用されている菌類である。結果として、P.クリソゲヌム
の醗酵に関する多大な知見が得られている。その上、P.
クリソゲヌムの非−ペニシリン産生変異体が得られ、こ
れは生成タンパクのペニシリン汚染の問題の回避を可能
とする。現在までのところ、かかる効率的な遺伝子発現
およびタンパク分泌系は開発されていない。アスペルギ
ルスニガー(Aspergillus niger) 、アスペルギルスオリ
ザエ(Aspergillus oryzae)、ムコルミエヘイ(Mucor mie
hei)およびトリコデルマリーゼイ(Trichoderma reesei)
等の糸状菌種が、例えば食品工業で使用するための酵素
の工業的生産において使用されている。これに関して
は、例えばストリーカート(Strijkert) の文献（アント
ニーファンリーウベンヘック(Antonie van Leeuwenhoe
k), 1987, 53, pp. 357-362) およびウンクレス(Unkle
s)の文献（ニトレート同化の分子的並びに遺伝的局面(M
olecular and Genetic Aspects of Nitrate Assimilati
on),レイ(Wray), J.L. &キングホーン(Kinghorn), J.R.
編, 1989, pp. 341-363,オックスフォードサイエンスパ
ブリケーションズ(Oxford Science Publications) 、英
国、オックスフォード）を参照のこと。
【０００４】アスペルギルスニガー(D. カレン(Cullen)
等, Biotechnology, 1987, 5, pp.369-376; A. ハーキ
(Haarki)等, Biotechnology, 1989, 7, pp. 596-600;お
よびEP-A-420358)、アスペルギルスニドランス(Aspergi
llus nidulans)(G.L. グレイ(Gray)等, Gene, 1986, 4
8, pp. 41-53;およびD.I.グイン(Gwynne)等, Biotechno
logy, 1987, 5, pp. 713-719)およびアスペルギルスオ
リザエ(T. クリステンセン(Christensen) 等, Biotechn
ology, 1988, 6, pp. 1419-1422)も、食品並びに洗浄剤
において、および薬品工業において使用するための、種
々の異種タンパクの発現に利用されている。使用される
発現系は転写および翻訳の開始並びに終止配列、および
A.ニガーグルコアミラーゼ(gla) 遺伝子、T.リーゼイセ
ロバイオハイドロラーゼ(cbhI)遺伝子、A.オリザエα−
アミラーゼ遺伝子およびA.ニドランスアルコールデヒド
ロゲナーゼ(alcA)遺伝子から得られる発現されたタンパ
クを処理し、かつ分泌するための配列を利用する（D.I.
グイン等の上記文献、A.ハーキ等の上記文献、およびT.
クリステンセン等の上記文献）。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は真核微
生物、特に糸状菌用の効率的な遺伝子発現系およびタン
パク分泌系、より詳細には転写並びに翻訳開始および転
写終止配列を提供することにある。また、本発明の目的
はこれらの配列を形質転換された宿主、特に糸状菌宿主
内で使用して遺伝子を発現することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】従って、本発明は真核微
生物、特に糸状菌用の効率的な遺伝子発現系およびタン
パク分泌系、即ちそれぞれ配列リスト１のヌクレオチド
１からヌクレオチド426 までのヌクレオチド配列および
配列リスト１のヌクレオチド850 からヌクレオチド1514
までのヌクレオチド配列、または本質的に同一のヌクレ
オチド配列、またはその機能性部分を含む、転写並びに
翻訳開始および転写終止配列を提供するものである。典
型的には、これらの調節配列は遺伝子Ｙ由来のものであ
る。本発明はまた、形質転換された宿主、特に糸状菌宿
主、好ましくはP.クリソゲヌム内でのこれらの調節配列
の使用、即ち該調節配列と遺伝子の読み取り枠との融合
による該遺伝子の発現をも提供する。本発明は、更に配
列リスト１のヌクレオチド427 からヌクレオチド537 ま
でのヌクレオチド配列または本質的に同一のヌクレオチ
ド配列、またはその機能性部分を含む、タンパク分泌シ
グナルコード配列、および場合により上記の転写並びに
翻訳開始配列および／または終止配列と共に形質転換さ
れた宿主、特に糸状菌宿主、好ましくはP.クリソゲヌム
内でのこれらのタンパク分泌シグナルコード配列の利
用、即ち該タンパクをコードしかつ発現するヌクレオチ
ド配列と該分泌シグナルコード配列との融合による該タ
ンパクの分泌にも関する。効率的なタンパク発現系は、
宿主として糸状菌種、特にP.クリソゲヌムを使用するこ
とにより得られる。この発現系は、転写（プロモータ）
および翻訳の効果的な開始のためのDNA 配列、転写およ
び3' mRNA プロセッシング（ターミネータ）の効果的な
終止のためのDNA 配列、および発現されたタンパクの効
果的なプロセッシングおよび分泌に必要なDNA 配列を備
えている。
【０００７】この発現系は糸状菌P.クリソゲヌムから単
離された遺伝子Ｙ(EP-A-354624に記載されている）から
誘導された。遺伝子ＹはP.クリソゲヌム内で高度に発現
性であり、遺伝子Ｙは培養肉汁中に高い効率で分泌され
る。興味あるタンパクの発現は該対象とするタンパクの
読み取り枠を遺伝子Ｙ配列に融合することにより達成さ
れる。融合は当分野で周知の様々な分子遺伝学的技術を
利用して行われる。融合遺伝子の構造は、対象とするタ
ンパクをコードする配列の遺伝子Ｙ配列への融合サイト
に依存して大幅に変化する可能性がある。他の発現系と
の類推によれば、異なる融合遺伝子を構築し、発現に対
して最適の融合構築体を実験的に決定する必要があるか
もしれない（M.ワード(Ward)等, Biotechnology, 1990,
8, pp.435-440;および特許出願WO 90/15860)。本発明
の好ましい態様においては、該融合遺伝子は、分泌シグ
ナルとしての以下のアミノ酸配列： MQITTVALFLFAAMGGVATPIESVSNDLDARAEAGVL （配列リスト１参照）（一文字コード）、またはその機
能性部分をコードする。これらの融合構築体を当分野で
公知の方法に従って糸状菌宿主、好ましくはP.クリソゲ
ヌム、最も好ましくはP.クリソゲヌムの非−ペニシリン
産生株内で形質転換する。これらの形質転換体を、例え
ばS.ヒンダスタヌスフレオマイシン耐性遺伝子（ドロッ
カート(Drocourt)等, Nucl. Acids Res., 1990, 18, p.
4009)、A.ニドランスamdS遺伝子（ベリおよびターナー
(Beri and Turner), Curr. Genet.,1987, 11, pp. 693-
641）、niaD遺伝子（ゴーカ(Gouka) 等, J. Biotechn.,
1991, 20, pp. 189-200)またはP.クリソゲヌムのfacA
遺伝子(EP-A-487118) 等の菌類選別マーカーを使用する
ことにより選別する。これらの形質転換体を精製し、対
象とするタンパクの発現につきテストする。遺伝子Ｙの
発現はグルコース抑制次第であった。従って、この遺伝
子Ｙ発現系を使用するタンパクの発現を醗酵用培地中の
グルコースの量により制御する。
【０００８】本発明のもう一つの局面によれば、該遺伝
子融合体から該Ｙ分泌シグナル配列を省略することによ
り、細胞内タンパクの調節された高いレベルの発現のた
めに遺伝子Ｙプロモータおよびターミネータ配列を使用
する。この応用は、制御された様式でタンパク、即ちペ
ニシリン生合成酵素またはP.クリソゲヌム内では自然に
生成されることのないタンパク、例えばセファマイシン
生合成酵素のセファロスポリン等の濃度を高める上で特
に有用であり得る。更に別の本発明の局面によれば、遺
伝子Ｙプロモータ配列は、これもグルコース抑制に依存
するペニシリン生合成遺伝子の調節に関与する調節因子
の単離並びに同定における極めて有用な手段となり得
る。かくして、共通調節因子をペニシリン生合成遺伝子
の調節に特異的に関与する因子から分離し、かつこれを
同定することができる。この遺伝子Ｙ発現系をP.クリソ
ゲヌムから得たが、周知の醗酵特性を有する他の糸状菌
宿主、例えばペニシリア(Penicillia)、アクレモニウム
(Acremonium)、アスペルギリ(Aspergilli)、トリコデル
マ(Trichoderma) およびムコール(Mucor) 等に上記方法
を適用することも可能である。プロモータ、ターミネー
タおよび分泌シグナルの非相同発現は糸状菌における遺
伝子発現に関する研究に共通して見られることである。
また、遺伝子Ｙ同族体は、プローブとしてP.クリソゲヌ
ム遺伝子Ｙ配列を使用して、またはポリメラーゼ連鎖反
応(PCR) 法および遺伝子Ｙ由来のオリゴヌクレオチドプ
ローブを使用して、他の菌類から容易に検出並びに単離
できる。
【０００９】また、当分野で周知の分子遺伝学的方法を
利用して、P.クリソゲヌムのクロ−ン化遺伝子Ｙを改良
された発現および／または分泌特性をもつ変異Ｙ遺伝子
を生成するのに利用できる。タンパクの発現並びに分泌
のためのハイブリッド配列が遺伝子Ｙ分泌シグナル配列
と他のプロモータまたはターミネータ配列とを組み合わ
せることにより得られることが認識されている。遺伝子
Ｙプロモータ、分泌シグナルおよびターミネータ配列、
またはその機能性部分は、完全な発現系における個々の
カセットと見做され、かつカセットとして適用できる。
更に、本発明は異なるヌクレオチド配列をもつ遺伝子を
も含み、該遺伝子はP.クリソゲヌムのＹ遺伝子またはそ
の部分と相同である。相同性とは、ここではパラメータ
設定ギャップ(parameter settings gap)の重み5.000 お
よび長さの重み0.300 、およびウイスコンシンシーケン
スアナリシスソフトウエアーパッケージ(Wisconsin Seq
uence Analysis Software Package;バージョン6.0 、19
89年発売、GCG 、米国ウイスコンシン大学）のベストフ
ィット(BestFit) プログラムを使用した遺伝子Ｙとの配
列比較において少なくとも70％の同等性評価値をもつヌ
クレオチド配列として定義する。相同遺伝子は天然源か
ら単離できるか、あるいはP.クリソゲヌムの遺伝子Ｙの
変異形成により生成し得る。好ましい態様において、タ
ンパクは相同遺伝子Ｙ発現シグナルを使用して、P.クリ
ソゲヌム内で発現される。
【００１０】
【実施例】以下の実施例は本発明を例示する目的であた
えられるものであり、本発明を何等限定するものではな
い。本特許出願における遺伝子クロ−ニング、遺伝子の
特徴付け、遺伝子操作および遺伝子の取扱いのための手
順は当分野で周知であり、例えばサンブルック(Sambroo
k)等の文献（モレキュラークロ−ニング、アラボラトリ
ーマニュアル(Molecular Cloning, a Laboratory Manua
l)、コールドスプリングハーバー(Cold Spring Harbo
r)、米国、1989）に十分に記載されている。P.クリソゲ
ヌムウイスコンシン(Wisconsin）54-1255 から得た変異
株npe10 はセントラールビューローブールシメルカルチ
ャーズ(Centraal Bureau voor Schimmelcultures),オー
ステルストラート(Oosterstraat) 1, 3742 SK バーン(B
aarn),オランダ国に、1990年３月13日付けで承認番号N
o. CBS 143.90の下で寄託されている。
【００１１】実施例１ 遺伝子Ｙ 判別スクリーニング(differential screening)法を利用
した遺伝子Ｙの単離はEP-A-354624 に詳しく記載されて
いる。まず、P.クリソゲヌムのゲノムDNA を含み、４キ
ロベース(kb)SphI制限フラグメントにマッピングされて
いる組み換えλ−ファージB9、L5およびG5(EP-A-35462
4) について遺伝子Ｙを単離した。λ−G5のSphI制限フ
ラグメントを含む遺伝子Ｙを２種の配向でベクターpTZ1
8R（商標；スウェーデンのファルマシア(Pharmacia)
社）にサブクロ−ニングした。得られたプラスミドをそ
れぞれpRH01 およびpRH02 と命名した。プラスミドpRH0
1 を模式的に図１に示した。プラスミドpRH01 およびpR
H02 を、該４kbP.クリソゲヌム由来のDNA(図１）のより
詳細な制限マップを得るために、かつハイブリダイゼー
ション解析によりより正確に該４kbSphIフラグメントの
中央部近傍の1.2 kbSacI- HindIII 制限フラグメントに
遺伝子Ｙを位置させるのに利用した。判別スクリーニン
グのためにEP-A-354624 で記載の如く調製した一本鎖cD
NAをプローブとして使用した。遺伝子Ｙの転写方向も、
同じプローブおよびプラスミドpRH01 およびpRH02 由来
の一本鎖 DNAを使用して、SacI(5')からHindIII(3') ま
での制限サイトのハイブリダイゼーション解析により決
定した。プラスミドpRH01 およびpRH02 を、SacI−Hind
III 制限フラグメント（配列リスト１）を包含する1.5
kb領域のヌクレオチド配列の決定のために使用した。こ
の配列解析は当分野で周知の手順（サンガー(Sanger)
等, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, 74, PP. 5463-
5467）に従って実施した。
【００１２】実施例２ 遺伝子ＹcDNA 遺伝子ＹcDNAはPCR 法を利用して得た。cDNAクロ−ニン
グ、特徴付け、取扱いおよび操作のためのPCR 法および
他の手順は周知であり、サンブルック(Sambrook)等の上
記文献およびイニス(Innis) 等の文献（PCR プロトコー
ルズ、アガイドツーメソッズ＆アプリケーションズ(PCR
Protocols, a Guide to Methods and Applications),
1990, アカデミックプレス）に十分に記載されている。
RNA ゾール(RNAzol:商標：USA テキサス州のシナ／バイ
オテックス(Cinna/Biotecx) Lab. Int. Inc.から入手）
を該製造業者の指示に従って使用して、P.クリソゲヌム
のペニシリン産生培養物から全RNA を単離した。mRNA精
製キット（スウェーデンのファルマシア社製）を使用し
たオリゴ−dTセルロースクロマトグラフィーにより全RN
A からPolyA + RNA を単離した。約60μｇのPolyA + RN
A が、約200 μｇの全RNA から単離され、これを200 μ
ｌのRNアーゼを含まない水に溶解した。
【００１３】逆転写酵素を使用し、かつプライマーとし
てオリゴ−dTを使用して、mRNA/cDNA の合成を実施し
た。典型的な反応は17μｌのPolyA + mRNA、1.9 μｌの
RNA シン(RNAsin, 40 U/μl,米国プロメガ(Promega)
社）、10μｌの5xRTバッファー(250 mM Tris・ HCl, pH
8.3, 15mM MgCl2, 375mM KCl) 、10μｌの50mMDTT(ジチ
オスレイトール）、５μｌの８mM dNTP-混合物（各８mM
のdATP, dCTP, dTTP, dGTP) 、５μｌのBSA(ウシ血清ア
ルブミン(1 mg/ml; 米国シグマ(Sigma) 社))および2.5
μｌのモロニー(Moloney) 逆転写酵素(200 U／μl, BR
L, FRG)を含有していた。この反応混合物を37°Ｃにて6
0分間インキュベートし、このインキュベート開始の30
分後に１μｌの逆転写酵素を含むアリコートを添加し
た。この反応を、該反応混合物に50μｌの水、10μｌの
0.2 M EDTAおよび110 μｌのクロロホルムを添加するこ
とにより停止した。核酸をクロロホルム抽出およびエタ
ノールでの沈殿により精製した。遠心処理後に得られた
ペレットを10μｌの水に再溶解し、mRNA/cDNA ハイブリ
ッド濃度を約0.5 mg/ml とした。オリゴヌクレオチドを
DNA 合成装置（米国カリフォルニア州のアプライドバイ
オシステムズ(Applied Biosystems)社）で化学的に合成
した。表１に示されたこれらのオリゴヌクレオチドの配
列は、配列リスト１に示した遺伝子Ｙのゲノム配列から
誘導した。
【００１４】
【表１】cDNA合成およびヌクレオチド配列解析に使用し
たオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列 オリゴ AB2277 5'-CCC GGG ACT AGT ATG CAA ATC ACC ACA GTT GCC-3' AB2278 5'-CCC GGG ACT AGT ATG ACC CTC AAT TCC ATA TAG-3' AB2280 5'-CCC GGG GGA TCC TCA CAG GGC ATC TCG CAT ATC-3' AB2308 5'-CCC GGG ACT AGT GCC AGT CAC CGT GTC AAG CGT-3' AB2309 5'-CCC GGG ACT ACT CCA CCC GTA AGA ATA TAC CAG-3' AB2312 5'-CCC GGG ACT ACT TTG GAC CTG AGC ATT GTA TGT-3' AB2313 5'-CCC GGG GGA TCC GAT GGG AGT GAT ACT ATA TGG-3' AB2314 5'-CCC GGG ACT AGT ATA TCC CAT ACC TTA AGT ACT-3' AB2315 5'-CCC GGG GGA TCC AGT ACT TAA GGT ATG GGA TAT-3' AB2316 5'-CCC GGG GGA TCC TAT TTA CAT TCG TTC TTA GAT-3' AB2317 5'-CCC GGG GGA TCC GTT CTT TGT GGG TGT AGG GTA-3' AB2319 5'-CCC GGG GGA TCC ACG ATC AAA AGA TGC TGG ATA-3' AB2425 5'-CCC GGG ACT AGT TAT AGT ATC ACT CCC ATC ACA-3' AB2426 5'-GGG CTT GAG ATG ATG ATC-3' 逆プライマー 5'-AAC AGC TAT GAC CAT-3'
【００１５】オリゴヌクレオチドは通常21ヌクレオチド
を含み、それぞれSpeIおよびSmaI、またはBamHI および
SmaI制限酵素認識サイトを含む12ヌクレオチドをもつ遺
伝子Ｙおよびフランキング配列に相補的である。オリゴ
ヌクレオチドを10mM Tris ・HCl(pH 8.0), 0.1mM EDTA
に溶解した。PCR に対して最適の濃度は1xTBE バッファ
ー(45mM Tris・ 硼酸塩, 1 mM EDTA, pH 8.0;サンブルッ
クの上記文献）中での4% Nu シーブ-GTG(Sieve-GTG)(FM
C, USA) アガロースゲル電気泳動およびPCR 実験により
決定した。PCR を遺伝子ＹcDNAの単離のために使用し
た。典型的なPCR 反応（50μｌ容量）は、５μｌの10xR
バッファー(500 mM KCl, 100 mM Tris・ HCl, pH 8.3, 2
0 mMMgCl2、0.1% (w/v)ゼラチン）、８μｌのdNTP混合
物（各1.25 mM のdATP、dCTP、dGTPおよびdTTP）、場合
により５μｌのDNA-希釈バッファー(10 mM Tris ・ HCl,
pH 8.0, 1 mM EDTA, 10 mM NaCl）、約0.05-0.1μｇの
mRNA/cDNA ハイブリッド、約0.5 μｇの各オリゴヌクレ
オチド、および最終体積を50μｌとするのに必要な水を
含んでいた。
【００１６】PCR を、1.3 単位のTaq DNA ポリメラーゼ
およびPCR 装置(DNAサーマルサイクラー、パーキンエル
マーセタス(Perkin Elmer Cetus)社、USA)を使用して実
施した。フラグメントの長さに応じて約20〜25サイクル
を実施した（１サイクル当たり、該フラグメントの長さ
に応じて94°Ｃにて２分間、55°Ｃにて２分間、72°Ｃ
にて３分間）。最後のサイクルにおいて、変性工程は省
略した。このPCR 法により得られた生成物を、1xTBE バ
ッファー中での1.4% Nu シーブアガロースゲル電気泳動
により分析した。PCR 生成物をクロロホルムで抽出し、
エタノールで沈殿させることにより、かつRDP ミニ(Min
i)カラム（米国、カリホルニア州のバイオ−ラド(Bio-R
ad) 社）を使用することにより精製した。最後に、PCR
生成物を水に溶解し、制限酵素SpeIおよびBamHI で消化
し、SpeI、BamHI 消化ｐブルースクリプト(pBluescrip
t) II KS(商標）ベクター（米国、カリホルニア州のス
トラタジーヌ(Stratagene)社）に標準的なクローニング
法により結合した。E.コリ菌株HB101(ボイヤー(Boyer)
等, J. Mol. Biol., 1969, 41, pp. 459-465; およびサ
ンブルック等の上記文献）またはWK6(ゼル＆フリッツ(Z
ell and Fritz), EMBOJ., 1987, 6, pp. 1809-1815)
を、形質転換およびプラスミド増殖のために利用した。
二本鎖プラスミドDNA を使用するか、あるいは形質転換
体のヘルパーファージM13K07による重感染によってプラ
スミド由来の一本鎖DNA を単離することにより（ビエイ
ラ(Vieira), J., Meth. Enzymol., 1987, 153, pp. 3-1
1)および当分野で周知の手順に従って、ｐブルースクリ
プト由来並びに遺伝子Ｙ由来の数種のオリゴヌクレオチ
ドを利用することにより（サンガーの上記文献）、クロ
−ン化PCR フラグメントのヌクレオチド配列を決定し
た。数種の異なるオーバーラップPCR フラグメントの配
列からコンパイルした遺伝子ＹcDNAのヌクレオチド配列
を配列リスト３に示した。このcDNA配列から推定したア
ミノ酸配列を配列リスト１に示した。
【００１７】実施例３ 遺伝子Ｙの機能的構造 遺伝子Ｙの機能的構造を配列リスト１にまとめた。ヌク
レオチド１〜1514は遺伝子Ｙのゲノム配列を示す。ヌク
レオチド553-628および719-786 は読み取り枠(ORF) を
分断する２種のイントロンの位置を示す。２つの枠内の
ATG 開始コドンはそれぞれ位置427-430 および466-469
に見いだされ、１つのUAG 終止コドンが位置847-849 に
見いだされ、これは使用するATG 開始コドンに依存し
て、該ORF をヌクレオチド427-849 または466-849 に制
限する。この同定されたORF は計算上の分子量(MW)1001
3 Ｄを有し、55アミノ酸をもつ小さな、システインに富
むタンパクをコードする。該N-末端アミノ酸は、分泌に
関与するリーダー配列に典型的に見られる高い疎水性の
アミノ酸含量を有する。ヌクレオチド１から426 までは
転写の開始（プロモータ）、ＹmRNAの5'- 末端（非−翻
訳リーダー）プロセッシング、および翻訳の開始に必要
な領域（の一部）を画成し、かつ転写並びに翻訳開始調
節配列と呼ばれる。この配列内の典型的なプロモータ成
分が識別された。即ち、ヌクレオチド225-228 のCAATボ
ックスおよびピリミジンに富む配列を伴うヌクレオチド
312-315 におけるTATAボックスである。転写およびＹmR
NAの3'- 末端プロセッシングの終止に必要とされる領域
はヌクレオチド850-1514に制限されており、かつ転写終
止調節配列と呼ばれる。
【００１８】実施例４ 遺伝子Ｙの発現 P.クリソゲヌム 菌株を、規定された炭素源としてグルコ
ースまたはラクトースを含有する標準的な複合培地上で
培養した（レビラ(Revilla) 等, J. of Bacteriol., 19
86, 168, pp. 947-952; およびレビラ(Revilla) 等, J.
Antibiot., 1984, 37, pp. 781-789)。２〜５日後に、
実施例２に記載の如くして得られた菌糸体から全RNA を
単離した。約20μｇの全RNA を含有する試料をグリオキ
サールおよびDMSOを使用して変性し（サンブルックの上
記文献）、10mMの燐酸バッファー(pH 7.0)内の1.0%アガ
ロースゲル上での電気泳動に付した。電気泳動に続い
て、製造業者等の指示に従ってナイロン膜（ジーヌスク
リーン(GeneScreen + ）、米国のニューイングランドヌ
クレアー(New England Nuclear) 社）上にRNA をブロッ
ティングした。次いで、何れもランダムプライマー標識
キット（ベーリンガー(Boehringer)社製）およびα
[32P] dATP(3000 Cu/mM,英国のアマーシャム(Amersham)
社製）を使用して標識された２種のプローブの混合物で
ノーザンブロットをプローブ処理した。プローブ１、即
ちプラスミドpHR01(実施例1)の4kb SphI制限フラグメン
トを、ＹmRNAの検出に使用した。プローブ２、即ちプラ
スミドpGJ02(ビーンストラ(Veenstra)等, J. Biotechno
l., 1990, 19,pp. 81-90)の1.2kb HindII制限フラグメ
ントを、penDE mRNAの検出のために使用した。後者のプ
ローブはクロス−ハイブリッド形成により5S rRNA をも
つシグナルをも発生し（ビーンストラ等の50イヤーズオ
ブペニシリンアプリケーション、シンポジウムインホナ
ーオブサーエドワードP.アブラハム(50 Years of Penic
illin Application, Symposium in Honour of Sir Edwa
rd P. Abraham), 1990, ９月８日、ベルリン、FRG にお
ける文献）、これは添加されたRNA の量のコントロール
として使用される。ハイブリッド形成および膜の洗浄の
ための標準的かつ厳密な条件を維持した（サンブルック
の1989年の上記文献）。
【００１９】典型的な結果を図２に示したが、本図はpe
nDE mRNAと比較して高いレベルのYmRNAの存在を立証し
ている。遺伝子Ｙの発現は過剰のグルコースの存在によ
り抑制され、かつ過剰のグルコースが存在しないことに
より抑制解除されおよび／または発現が誘発される。更
に、遺伝子Ｙの効率的かつ調節された発現が、pcbAB-pc
bC- penDE 遺伝子クラスタ(EP-A-448180) のないP.クリ
ソゲヌムウイスコンシン54-1255 の非−ペニシリン産生
派生体であるnpe 10菌株で観察された。遺伝子Ｙの発現
は、またP.クリソゲヌム培養物のブロス中に存在するタ
ンパクの分析により、タンパクレベルでも調べた。ブロ
ス試料を濾過し、メタノールで沈殿させることにより濃
縮した。濾液のタンパク組成を、ラエムリ(Laemlli) の
文献(Nature, 1970, 227, pp. 680-685)に従って、変性
17.5-20% PAAGE（アクリルアミド：ビスアクリルアミ
ド; 39:1 (w/w)）0.1% SDSスラブゲル上での電気泳動に
より分析した。この電気泳動はTris・グリシン-SDSバッ
ファー(25 mM Tris,192 mM グリシン, 0.1% SDS, pH 8.
5) 中で実施した。この電気泳動の後、タンパクをその
場でクーマシーブリリアントブルーR250で染色し、次い
で写真撮影した。典型的な結果を図３に示した。図３か
ら明らかな如く、約８kDの予想されたサイズのタンパク
がY mRNAの発現条件下で高度に発現されていることが分
かる。図３に示した菌株に加えて、遺伝子Ｙの形質転換
により得た遺伝子Ｙの複数のコピーを含むP.クリソゲヌ
ム菌株は、培養物濾液中に高い濃度の８kDタンパクを含
むことを示した。
【００２０】実施例５ 遺伝子Ｙの同定 P.クリソゲヌム の培養濾液中の該Ｙ遺伝子生成物として
の該８kDタンパクの同定を、部分N-末端アミノ酸配列分
析により行った。P.クリソゲヌム菌株ウイスコンシン54
-1255 をY-発現条件下（規定された炭素源としてラクト
ースを使用）で実施例４記載の如く成長させた。培養ブ
ロスを集め、濾過し、濃縮し、実施例４に記載した如く
変性SDS-PAAGE ゲル上での電気泳動によりタンパクを分
離した。この電気泳動に引き続いて、タンパクをPVDF膜
（ポリビニリデンジフルオライド、孔径0.45μｍ、ミリ
ポア(Millipore) 社、MA, USA)上に、半−乾燥ブロッテ
ィング系（ノバ(Nova)ブロット、スウェーデン、LKB)を
使用してブロッティングした。このブロッティング後、
クーマシーブリリアントブルーR250で染色することによ
りタンパクを可視化した。該膜の８kDタンパク含有部分
を集め、自動解析機（米国のアプライドバイオシステム
ズ(Applied Biosystems)社）を使用したエドマン(Edma
n) の分解法によるN-末端配列解析に使用した。決定し
たアミノ酸配列を配列リスト４に示した。この配列解析
は、該８kDタンパクの該Ｙ遺伝子生成物との同等性を立
証した。分泌された成熟Ｙのアミノ酸１〜21は第一のAT
G コドンで開始するORF のアミノ酸38-58 に対応してい
る（実施例３および配列リスト１参照）。Ｙのプロセッ
シングおよび分泌に対する該リーダー配列は、その結果
配列リスト１に示されたアミノ酸-37-１の配列に閉じ込
められている。
【００２１】実施例６ 遺伝子Ｙ発現シグナルを使用することによるP.クリソゲ
ヌム内でのフィターゼ発現 P.クリソゲヌム フィターゼ発現カセットを、フィターゼ
の成熟型をコードするアスペルギルスフィクーム(Asper
gillus ficuum)のフィターゼ遺伝子配列(EP-A-420358)
を遺伝子Ｙの発現シグナル、即ちプロモータ、分泌シグ
ナルおよび遺伝子Ｙのターミネータ配列と融合すること
により構築した。この融合はPCR 法（イニスの上記文
献）を適用することにより実施し、これは配列リスト１
中のヌクレオチド538 〜846 の、EP-A-420358 の図６に
記載のフィターゼ遺伝子配列のヌクレオチド382 〜1715
との置換を生じた。プラスミドpRH01(図１）およびpAF2
-2S(EP-A-420358)をPCR 実験で使用した。得られたプラ
スミドpPYPH01 は、P.クリソゲヌムのホスホグリセレー
トキナーゼ(PGK) 遺伝子のプロモータの制御下で、Y-フ
ィターゼ遺伝子融合体並びにS.ヒンダスタヌス(S. hind
ustanus)フレオマイシン耐性遺伝子を含んでいた。pPYP
H01 を、当分野で周知の方法（ビーンストラ等の上記文
献）に従って形質転換することによりP.クリソゲヌム中
に導入した。形質転換体をフレオマイシン耐性に関して
選別し、精製し、次いでEP-A-420358 に詳細に記載され
ている方法により、フィターゼの発現に関して分析し
た。
【００２２】
【配列表】
【配列リスト１】P.クリソゲヌム の遺伝子Ｙのヌクレオチド配列および誘
導されたアミノ酸の配列。
【配列リスト２】P.クリソゲヌム のタンパクＹのアミノ酸配列。
【配列リスト３】 Y cDNAの部分ヌクレオチド配列。
【配列リスト４】P.クリソゲヌム のタンパクＹの部分N-末端アミノ酸配
列。
【配列リスト５〜19】 遺伝子Ｙ由来の合成オリゴヌクレオチドのヌクレオチド
配列。 配列リスト (1) 一般的情報： (i) 出願人：ギスト−ブロカデス(Gist-brocades) N.
V. (ii) 発明の名称：真核生物発現系 (iii) 配列数：19 (iv) コンピュータ読み取り可能型： (A) 媒体型：フロッピーディスク (B) コンピュータ：IBM PCコンパーチブル (C) 動作システム：PC-DOS/MS-DOS (D) ソフトウエアー：パテンチンリリース(PatentIn Re
lease) #1.0,バージョン#1.25(EPO) (v) 現アプリケーションデータ： アプリケーションNo. (2) 配列ID NO: 1の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：1514塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の状態：二本鎖 (D) 形態：線状 (ii) 分子型：DNA(ゲノム） (iii) 仮定：なし (vi) 起源： (B) 菌株：ペニシリウムクリソゲヌム (ix) 特徴： (A) 名称／キー(NAME/KEY)：エクソン (B) 位置：427・・552 (ix) 特徴： (A) 名称／キー：イントロン (B) 位置：553・・628（ｉｘ） 特徴： (A) 名称／キー：エクソン (B) 位置：629・・718 (ix) 特徴： (A) 名称／キー：イントロン (B) 位置：719・・786 (ix) 特徴： (A) 名称／キー：エクソン (B) 位置：787・・846 (ix) 特徴： (A) 名称／キー：CDS (B) 位置：結合点(427・・552, 629・・718, 787・・846) (D) 他の情報：／コドン開始 = 427 ／生成物＝「抗真菌タンパク（プレタンパク質）」 (ix) 特徴： (A) 名称／キー：sig-ペプチド (B) 位置：427・・537 (ix) 特徴： (A) 名称／キー：mat-ペプチド (B) 位置：538・・846 (C) 同定法：実験 (D) 他の情報：／生成物＝「抗真菌タンパク（プレタン
パク質）」 ／証拠＝実験 (xi) 配列の記載：SEQ ID NO:1: GCCAGTCACC GTGTCAAGCG TTCAGCCGTT TCTCTGCTTT TTAGGAAATT GATTACCACT 60 AGGTAAGCCC AAAAATATCT TCCTGGTAAA CAAGTAGTGC ATTCTTACCC CGGAGGCTGA 120 AGCAGGTAAG GGATTTTGGA GAGACCCCAC CCGTAAGAAT ATACCAGCCA AGAGGTCCAG 180 TATCCTGAAG TATGTGAGGC ATTAATGTCA TTGGAGAAGT CATGCAATCC ATAAGCTGCC 240 ACCCCCAAGA TGACTGCATT GGACCTGAGC ATTGTATGTG TCACCTTTCA CACAGAGCTC 300 ATGATCTGGT TTATAAAGGC GGCTTCATGA CCCTCAATTC CATATAGTAT CACTCCCATC 360 ACAGCATTTC GATATCTTCA ACCACTTTAA CCTTCTCCAG AGGATCATCA TCTCAAGCCC 420 TTCATA ATG CAA ATC ACC ACA GTT GCC CTT TTT CTC TTC GCT GCA ATG 468 Met Gln Ile Thr Thr Val Ala Leu Phe Leu Phe Ala Ala Met -37 -35 -30 -25 GGC GGG GTA GCC ACC CCC ATT GAG TCT GTA TCA AAC GAC CTC GAT GCC 516 Gly Gly Val Ala Thr Pro Ile Glu Ser Val Ser Asn Asp Leu Asp Ala -20 -15 -10 AGG GCT GAG GCC GGT GTC CTG GCC AAA TAC ACC GGA GTGAGTAAAC 562 Arg Ala Glu Ala Gly Val Leu Ala Lys Tyr Thr Gly -5 1 5 ATCAATATCC CATACCTTAA GTACTCACTT GGGAATCGCG ACTAACGGTT CGGGACCACA 622 ACTCAG AAA TGC ACC AAA TCT AAG AAC GAA TGT AAA TAC AAG AAC GAT 670 Lys Cys Thr Lys Ser Lys Asn Glu Cys Lys Tyr Lys Asn Asp 10 15 GCT GGA AAG GAC ACT TTT ATC AAG TGC CCC AAG TTT GAT AAC AAG AAG 718 Ala Gly Lys Asp Thr Phe Ile Lys Cys Pro Lys Phe Asp Asn Lys Lys 20 25 30 35 GTAGAATATC AATCATTCGG AAGTAGCCAT CTGAATCGAT TTCGTGCTAA TCTCGCTCTT 778 TTTTCCAG TGC ACC AAG GAT AAT AAC AAA TGT ACC GTC GAC ACC TAC AAC 828 Cys Thr Lys Asp Asn Asn Lys Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asn 40 45 AAC GCT GTC GAT TGT GAC TAGATGGTCT CTGCGATCAC CAGGGCATTT 876 Asn Ala Val Asp Cys Asp 50 55 AATGGTTTTT GGTTCCCTTC TTGTTGGTGA TATGCGAGAT GCCCTGTGAT TCTCGAAGCT 936 TACTACCCTA CACCCACAAG GAACTCGGAA CCAAGGAACT GCTCGGTGGG TGATACATAT 996 ACACCCAGTA TCTATCCAGC TTCAATTTTC GGCGAATTTT GTTTCTTATT TCATAAAGAC 1056 ACTCGTTTGA TATCTAGCTA GATATTGTTG CTCATCAACG AAATGGTTGT AGATTATCGA 1116 ATATATCCAG CATCTTTTGA TCGTAGTCGG AAGTGAAATG GAGTACTATG ATACGACACA 1176 TGTACATTGT AAGCAGAAAT AGGCTAGAGG GATAACTATC AAACTGCTGC AGCAGCGCTA 1236 CTCTTGCTTC TGTGCGGGGT CAAACTTGTT TGCGAGCCGG ACTGCCAAAT CAGGGTCTGG 1296 GTAATGCTGG GGGCCGATTC CCTGTTATGC GGTAAGGATT AACTGGGGTT CTCAAAATGT 1356 TTCACACAGC CACTTCGTTA TTCCTTATAC CTGCCAAAAT CCCGCAATTT AATTCCTTAG 1416 TACACCCGTT ATACATCTAT CGCTGATAAG GTTTATCATA GGTACAATAG CTTTGATTAT 1476 AGGGACACGT CCAATGCTTA AATGCAATTT CCTTAACA 1514 (2) 配列ID NO: 2の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：92アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (D) 形態：線状 (ii) 分子型：タンパク (xi) 配列の記載：SEQ ID NO:2: Met Gln Ile Thr Thr Val Ala Leu Phe Leu Phe Ala Ala Met Gly Gly -37 -35 -30 -25 Val Ala Thr Pro Ile Glu Ser Val Ser Asn Asp Leu Asp Ala Arg Ala -20 -15 -10 Glu Ala Gly Val Leu Ala Lys Tyr Thr Gly Lys Cys Thr Lys Ser Lys -5 1 5 10 Asn Glu Cys Lys Tyr Lys Asn Asp Ala Gly Lys Asp Thr Phe Ile Lys 15 20 25 Cys Pro Lys Phe Asp Asn Lys Lys Cys Thr Lys Asp Asn Asn Lys Cys 30 35 40 Thr Val Asp Thr Tyr Asn Asn Ala Val Asp Cys Asp 45 50 55 (2) 配列ID NO: 3の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：355 塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の状態：一本鎖 (D) 形態：線状 (ii) 分子型：cDNA〜mRNA (iii) 仮定：なし (vi) 起源： (A) 微生物：ペニシリウムクリソゲヌム (xi) 配列の記載：SEQ ID NO:3: ATGCAAATCA CCACAGTTGC CCTTTTTCTC TTCGCTGCAA TGGGCGGGGT AGCCACCCCC 60 ATTGAGTCTG TATCAAACGA CCTCGATGCC AGGGCTGAGG CCGGTGTCCT GGCCAAATAC 120 ACCGGAAAAT GCACCAAATC TAAGAACGAA TGTAAATACA AGAACGATGC TGGAAAGGAC 180 ACTTTTATCA AGTGCCCCAA GTTTGATAAC AAGAAGTGCA CCAAGGATAA TAACAAATGT 240 ACCGTCGACA CCTACAACAA CGCTGTCGAT TGTGACTAGA TGGTCTCTGC GATCACCAGG 300 GCATTTAATG GTTTTTGGTT CCCTTCTTGT TGGTGATATG CGAGATGCCC TGTGA 355 (2) 配列ID NO: 4の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：21アミノ酸 (B) 型：アミノ酸 (D) 形態：線状 (ii) 分子型：ペプチド (iii) 仮定：なし (v) フラグメント型：N-末端 (vi) 起源： (A) 微生物：ペニシリウムクリソゲヌム (xi) 配列の記載：SEQ ID NO:4: Ala Lys Tyr Thr Gly Lys Xaa Thr Lys Ser Lys Asn Glu Xaa Lys Tyr 1 5 10 15 Lys Asn Asp Ala Gly 20 (2) 配列ID NO: 5の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：33塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の状態：一本鎖 (D) 形態：線状 (ii) 分子型：DNA （合成） (iii) 仮定：なし (vi) 起源： (C) 個々の単離体: AB2277 (xi) 配列の記載：SEQ ID NO:5: CCCGGGACTA GTATGCAAAT CACCACAGTT GCC (2) 配列ID NO: 6の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：33塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の状態：一本鎖 (D) 形態：線状 (ii) 分子型：DNA （合成） (iii) 仮定：なし (vi) 起源： (C) 個々の単離体: AB2278 (xi) 配列の記載：SEQ ID NO:6: CCCGGGACTA GTATGACCCT CAATTCCATA TAG (2) 配列ID NO: 7の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：33塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の状態：一本鎖 (D) 形態：線状 (ii) 分子型：DNA （合成） (iii) 仮定：なし (vi) 起源： (C) 個々の単離体: AB2280 (xi) 配列の記載：SEQ ID NO:7: CCCGGGGGAT CCTCACAGGG CATCTCGCAT ATC (2) 配列ID NO: 8の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：33塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の状態：一本鎖 (D) 形態：線状 (ii) 分子型：DNA （合成） (iii) 仮定：なし (vi) 起源： (C) 個々の単離体: AB2308 (xi) 配列の記載：SEQ ID NO:8: CCCGGGACTA GTGCCAGTCA CCGTGTCAAG CGT (2) 配列ID NO: 9の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：33塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の状態：一本鎖 (D) 形態：線状 (ii) 分子型：DNA （合成） (iii) 仮定：なし (vi) 起源： (C) 個々の単離体: AB2309 (xi) 配列の記載：SEQ ID NO:9: CCCGGGACTA GTCCACCCGT AAGAATATAC CAG (2) 配列ID NO:10の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：33塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の状態：一本鎖 (D) 形態：線状 (ii) 分子型：DNA （合成） (iii) 仮定：なし (vi) 起源： (C) 個々の単離体: AB2312 (xi) 配列の記載：SEQ ID NO:10: CCCGGGACTA GTTTGGACCT GAGCATTGTA TGT (2) 配列ID NO:11の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：33塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の状態：一本鎖 (D) 形態：線状 (ii) 分子型：DNA （合成） (iii) 仮定：なし (vi) 起源： (C) 個々の単離体: AB2313 (xi) 配列の記載：SEQ ID NO:11: CCCGGGGGAT CCGATGGGAG TGATACTATA TGG (2) 配列ID NO:12の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：33塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の状態：一本鎖 (D) 形態：線状 (ii) 分子型：DNA （合成） (iii) 仮定：なし (vi) 起源： (C) 個々の単離体: AB2314 (xi) 配列の記載：SEQ ID NO:12: CCCGGGACTA GTATATCCCA TACCTTAAGT ACT (2) 配列ID NO:13の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：33塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の状態：一本鎖 (D) 形態：線状 (ii) 分子型：DNA （合成） (iii) 仮定：なし (vi) 起源： (C) 個々の単離体: AB2315 (xi) 配列の記載：SEQ ID NO:13: CCCGGGGGAT CCAGTACTTA AGGTATGGGA TAT (2) 配列ID NO:14の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：33塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の状態：一本鎖 (D) 形態：線状 (ii) 分子型：DNA （合成） (iii) 仮定：なし (vi) 起源： (C) 個々の単離体: AB2316 (xi) 配列の記載：SEQ ID NO:14: CCCGGGGGAT CCTATTTACA TTCGTTCTTA GAT (2) 配列ID NO:15の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：33塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の状態：一本鎖 (D) 形態：線状 (ii) 分子型：DNA （合成） (iii) 仮定：なし (vi) 起源： (C) 個々の単離体: AB2317 (xi) 配列の記載：SEQ ID NO:15: CCCGGGGGAT CCGTTCCTTG TGGGTGTAGG GTA (2) 配列ID NO:16の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：33塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の状態：一本鎖 (D) 形態：線状 (ii) 分子型：DNA （合成） (iii) 仮定：なし (vi) 起源： (C) 個々の単離体: AB2319 (xi) 配列の記載：SEQ ID NO:16: CCCGGGGGAT CCACGATCAA AAGATGCTGG ATA (2) 配列ID NO:17の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：33塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の状態：一本鎖 (D) 形態：線状 (ii) 分子型：DNA （合成） (iii) 仮定：なし (vi) 起源： (C) 個々の単離体: AB2425 (xi) 配列の記載：SEQ ID NO:17: CCCGGGACTA GTTATAGTAT CACTCCCATC ACA (2) 配列ID NO:18の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：18塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の状態：一本鎖 (D) 形態：線状 (ii) 分子型：DNA （合成） (iii) 仮定：なし (vi) 起源： (C) 個々の単離体: AB2426 (xi) 配列の記載：SEQ ID NO:18: GGGCTTGAGA TGATGATC (2) 配列ID NO:19の情報 (i) 配列の特徴 (A) 長さ：16塩基対 (B) 型：核酸 (C) 鎖の状態：一本鎖 (D) 形態：線状 (ii) 分子型：DNA （合成） (iii) 仮定：なし (vi) 起源： (C) 個々の単離体: 逆配列プライマー (xi) 配列の記載：SEQ ID NO:19: AACAGCTATG ACCATG
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミドpRH01 を模式的に示した図である。
【図２】遺伝子Ｙ発現のノーザンブロット解析を表す電
気泳動の写真である。レーン１：P.クリソゲヌムウイス
コンシン54-1255/ラクトース；レーン２：P.クリソゲヌ
ム npe10/ラクトース；レーン3-7:グルコースの飽和量
（レーン3-4)および制限された量（レーン5-7)でのP.ク
リソゲヌムウイスコンシン54-1255 。
【図３】ブロスタンパクのSDS-PAAGE 解析の結果を表す
電気泳動の写真である。レーン１：分子量マーカー(LMW
マーカー94.000/67.000/43.000/30.000/20.100/14.400;
ファルマーシア社、スウェーデン）；レーン2-3:グルコ
ース（レーン３）およびラクトース（レーン２）培養物
からのP.クリソゲヌムウイスコンシン54-1255 ブロス；
レーン4-5:グルコース（レーン５）およびラクトース
（レーン４）培養物からのP.クリソゲヌム npe10 ブロ
ス。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:82） (Ｃ１２Ｎ 15/31 Ｃ１２Ｒ 1:82） (72)発明者 アドリアヌス ウィルヘルムス フォレブ レヒト オランダ国 2671 ウェーゼット ナール トウェイク ベレクラウ 13 「ヘルマニ ュス」 (72)発明者 ピーテル ファン ソーリンゲン オランダ国 2671 ヴェーゼット ナール トウェイク ロッシーニ 16

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 配列リスト１のヌクレオチド１からヌク
    レオチド426 までのヌクレオチド配列または本質的に同
    一のヌクレオチド配列、またはその機能性部分を含む、
    転写並びに翻訳開始調節配列。
  2. 【請求項２】 配列リスト１のヌクレオチド850 からヌ
    クレオチド1514までのヌクレオチド配列または本質的に
    同一のヌクレオチド配列、またはその機能性部分を含
    む、転写終止調節配列。
  3. 【請求項３】 遺伝子発現のために、形質転換された宿
    主内で請求項１および／または２に記載の転写並びに翻
    訳調節配列に該遺伝子の読み取り枠を融合することによ
    る、それぞれの該転写並びに翻訳調節配列の使用。
  4. 【請求項４】 配列リスト１のヌクレオチド427 からヌ
    クレオチド537 までのヌクレオチド配列または本質的に
    同一のヌクレオチド配列、またはその機能性部分を含
    む、タンパク分泌シグナルコード配列。
  5. 【請求項５】 タンパク分泌のために、形質転換された
    宿主内で請求項４記載の分泌シグナルコード配列に該タ
    ンパクをコードしかつ発現するヌクレオチド配列を融合
    することによる、該分泌シグナルコード配列の使用。
  6. 【請求項６】 該遺伝子の発現のために、請求項３記載
    の転写並びに翻訳調節配列を使用する、請求項５記載の
    分泌シグナルコード配列の使用。
  7. 【請求項７】 糸状菌、好ましくはペニシリウムクリソ
    ゲヌム内での請求項３記載の転写並びに翻訳調節配列の
    使用または請求項５または６記載の分泌シグナルコード
    配列の使用。
JP4362189A 1991-12-23 1992-12-24 真核生物の発現系 Pending JPH06189765A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP91203400 1991-12-23
NL91203400:6 1991-12-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JPH06189765A true JPH06189765A (ja) 1994-07-12

Family

ID=8208106

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP4362189A Pending JPH06189765A (ja) 1991-12-23 1992-12-24 真核生物の発現系

Country Status (5)

Country Link
EP (1) EP0549062B1 (ja)
JP (1) JPH06189765A (ja)
AT (1) ATE177788T1 (ja)
DE (1) DE69228665T2 (ja)
ES (1) ES2131518T3 (ja)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7005128B1 (en) 1993-12-17 2006-02-28 Genencor International, Inc. Enzyme feed additive and animal feed including it
US5861271A (en) * 1993-12-17 1999-01-19 Fowler; Timothy Cellulase enzymes and systems for their expressions
US6268196B1 (en) 1993-12-17 2001-07-31 Genencor International, Inc. Method and compositions for treating cellulose containing fabrics using truncated cellulase enzyme compositions
US5922561A (en) * 1994-10-03 1999-07-13 Novo Nordisk Biotech, Inc. Genes encoding signal recognition particle of Aspergillus niger
EP2617732A1 (en) 2012-01-19 2013-07-24 Vib Vzw Tools and methods for expression of membrane proteins
WO2015032899A1 (en) 2013-09-05 2015-03-12 Vib Vzw Cells producing fc containing molecules having altered glycosylation patterns and methods and use thereof
DK3320105T3 (da) 2015-07-09 2021-06-07 Vib Vzw Celler, der producerer glycoproteiner med ændrede o- og o-glycosyleringsmønstre, samt tilhørende fremgangsmåder og anvendelse
GB201901608D0 (en) 2019-02-06 2019-03-27 Vib Vzw Vaccine adjuvant conjugates

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FI104984B (fi) * 1988-08-11 2000-05-15 Dsm Nv Menetelmä biosynteettisten tai säätelygeenien identifioimiseksi ja käyttämiseksi sekundääristen metaboliittien tuoton parantamiseksi
CZ289014B6 (cs) * 1989-09-27 2001-10-17 Dsm N. V. Vyčiątěná a izolovaná sekvence DNA kódující fungální fytázu, konstrukt pro expresi, vektory a transformované hostitelské buňky a způsob produkce fytázy

Also Published As

Publication number Publication date
DE69228665T2 (de) 1999-07-22
DE69228665D1 (de) 1999-04-22
ATE177788T1 (de) 1999-04-15
ES2131518T3 (es) 1999-08-01
EP0549062A2 (en) 1993-06-30
EP0549062A3 (ja) 1994-02-09
EP0549062B1 (en) 1999-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU683728B2 (en) Yeast strains and modified albumins
JPH08504327A (ja) 糸状菌における異種タンパクの生産
JPS62104585A (ja) ピチア属酵母の部位選択的ゲノム修飾
HU204097B (en) Process for producing cloning system relating to kluyveromyces species
JP3095391B2 (ja) クラスター状生合成遺伝子を用いた二次代謝産物生産増加法
JPH06189765A (ja) 真核生物の発現系
KR100490190B1 (ko) 개량된 단백질 발현균주
JP2954601B2 (ja) 二次代謝産物生産増加のための生合成遺伝子又は制御遺伝子の単離法及び使用法
US6001590A (en) Promoter and terminator sequences of formate dehydrogenase gene of Candida boidinii
Rodriguez et al. Invertase secretion in Hansenula polymorpha under the AOX1 promoter from Pichia pastoris
JPH08266290A (ja) フサリウムオキシスポラムからのペニシリンｖアミドヒドロラーゼ遺伝子
AU748759B2 (en) Expression vector for improved production of polypeptides in yeast
CN113755509A (zh) 溶血磷脂酶变体及其构建方法和在黑曲霉菌株中的表达
US5747285A (en) DNA comprising regulatory regions from gene y of penicillium chrysogenum
AU734541B2 (en) Increased production of secreted proteins by recombinant yeast cells
CN1125180C (zh) 启动子
US6534286B1 (en) Protein production in Aureobasidium pullulans
JPH06343471A (ja) ポリペプチドの製造方法
CN113056554A (zh) 重组酵母细胞
JPH06165691A (ja) プロテアーゼ阻害剤の生産方法
JP2002505587A (ja) Ｔ．バリアビリス由来のｄ−アミノ酸オキシダーゼプロモーター
JP3505743B2 (ja) 変異型ａｏｘ２プロモーター、それを担持するベクター、形質転換体および異種蛋白質の製造方法
KR0185980B1 (ko) 알부민 유전자-함유 플라스미드, 이를 함유하는 형질전환체, 이러한 형질전환체의 생산방법 및 알부민의 생산방법
HUT73214A (en) Production of glycolate oxidase in methylotrophic yeast
JPH0568569A (ja) エンドチアペプシン前駆体