CN112899209A - 一种锌离子诱导重组蛋白表达体系、其诱导方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种锌离子诱导重组蛋白表达体系、其诱导方法和应用，属于基因和蛋白工程领域；本发明通过将大肠杆菌锌耐受操纵子znt的启动子序列PzntA和重组蛋白的编码基因进行融合，并利用pUC57‑Kan载体转化到zntA基因被敲除的大肠杆菌体内，往培养基中添加外源锌离子即可高效诱导和表达重组蛋白。此方法无需使用其他诱导剂，只需添加一定浓度的锌离子即可制备得到活性强、产量高的锌离子结合蛋白，可显著降低制备成本。另外，本系统具有很强的抗干扰能力，其他杂质或强酸条件不会影响重组蛋白的表达效率，所以可以利用含有锌离子的工业废水进行重组蛋白的诱导，达到节能减排、实现资源回收利用的目的。

Description

一种锌离子诱导重组蛋白表达体系、其诱导方法和应用

技术领域

本发明涉及基因和蛋白质工程领域，特别是涉及一种锌离子诱导重组蛋白表达体系、其诱导方法和应用。

背景技术

利用基因工程和蛋白质工程技术在表达宿主体内制备和获取重组蛋白是目前应用十分广泛的技术。目前商业化的重组蛋白表达质粒，一般都需要添加诱导剂才能高效诱导蛋白表达，比如IPTG、阿拉伯糖等，这些诱导剂相对比较昂贵，尤其是在制备工业级数量的重组蛋白时，成本较高。虽然目前已有一些无需添加诱导剂的自诱导方法被报道，但一般这些自诱导方法需要使用专门的自诱导培养基(添加额外化合物)，配制起来仍显繁琐。此外，如果需要制备某种金属作为辅基的重组蛋白时，诱导时需要往培养基中添加相应的金属溶液。

细菌等微生物在进化过程中衍生出一套能够对抗环境中高浓度重金属毒性作用的自我保护机制。以锌离子为例，大肠杆菌(E.coli)体内存在一套锌耐受znt操纵子。当E.coli处在高浓度锌离子环境中时，znt系统被激活，其中ZntA蛋白被大量诱导表达，ZntA的作用是将细胞质内的锌离子向细胞外泵出，这样可以将细胞质内的锌离子浓度控制在较低水平。如果将znt系统的功能基因序列替换成重组目的蛋白编码序列，保留zntA上游的启动子序列，将可以利用锌离子作为诱导剂进行重组蛋白的高效表达。而且，如果制备锌离子为辅基的蛋白质时，更为简便、廉价，仅添加锌离子即可得到活性蛋白。由于此系统的抗干扰能力很强，使用含有其他杂质的含锌工业废水同样能够有效诱导重组蛋白表达，同时还能达到降低废水中锌离子含量的目的。

目前没有利用微生物的重金属耐受机制及原理进行重组蛋白诱导表达的相关报道。而为了降低重组蛋白制备成本，且同时实现除污减排，利用细菌重金属耐受机制的优势发明一种新的重组蛋白诱导方法，将对改进现有技术产生相当重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种锌离子诱导重组蛋白表达体系、其诱导方法和应用，只需要添加锌离子溶液或工业含锌废水，不需要使用其他诱导剂，即可高效诱导重组蛋白表达；该方法具有成本低廉、绿色环保的特点，具有广泛的应用前景。

本发明所述应用即应用于DNA聚合酶Pfu蛋白和锌结合乙醇脱氢酶YqhD蛋白的重组诱导表达，验证了该方法的优势和可应用性。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种宿主大肠杆菌，所述宿主大肠杆菌中zntA基因被敲除。

本发明提供一种表达载体，所述表达载体中包括加入优化的MCS序列的大肠杆菌锌耐受操纵子znt的启动子序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明提供一种锌离子诱导的重组蛋白表达体系，所述的表达体系包括所述宿主大肠杆菌和所述的表达载体。

本发明还提供一种锌离子诱导重组蛋白表达的方法，具体包括以下步骤：

(1)将目的蛋白的编码序列克隆到所述的表达载体中；

(2)得到的表达载体转化入所述的宿主大肠杆菌中过夜生长；

(3)过夜生长的菌株加入培养基中培养至对数生长期；

(4)再向菌株培养基中添加含锌离子液体进行诱导。

进一步地，步骤3)中，所述的菌株培养基为新鲜的LB培养基或2×LB培养基。

进一步地，步骤3)中过夜生长的菌株加入培养基中时，使起始菌夜OD₆₀₀值为0.02。

进一步地，步骤4)中所述的含锌离子液体的浓度为2-2000μmol/L。

进一步地，步骤4)中所述的含锌离子液体为含锌工业废水。

进一步地，步骤4)中所述的诱导条件为16℃诱导24h。

进一步地，所述的目的蛋白为Pfu蛋白或YqhD蛋白。

本发明公开了以下技术效果：

本发明通过将大肠杆菌zntA基因的启动子序列和优化的MCS(multiple cloningsite，多克隆位点)序列进行融合，并将融合片段克隆到pUC57K载体，构建得到锌离子诱导重组蛋白表达通用型载体PzntA-pUC57K。表达目的蛋白只需根据目的蛋白融合N端或C端组氨酸标签选择合适的MCS位点，将目的蛋白的编码序列克隆到PzntA-pUC57K，得到PzntA-M-pUC57K(M为任一目的蛋白编码基因)，并将此载体转化入ΔzntA菌株。通过往菌株培养基中添加一定浓度的锌离子溶液或者含锌工业废水，即可诱导表达得到高产量、高活性的目的蛋白。本发明公开的该重组蛋白诱导表达方法具备简便、廉价的特点，并且可以实现除污减排、回收利用资源的目的，在蛋白工业化制备领域将具有广泛的推广价值和应用前景。

附图说明

图1为本发明锌离子诱导重组蛋白表达通用型载体PzntA-pUC57K的质粒图谱；

图2为本发明锌离子诱导DNA聚合酶Pfu蛋白表达的全细胞SDS-PAGE电泳分析结果；

图3为本发明锌离子诱导Pfu蛋白表达的蛋白产量结果；

图4为本发明锌离子诱导Pfu表达并纯化得到的Pfu蛋白SDS-PAGE电泳纯度分析结果；

图5为本发明锌离子诱导Pfu表达并纯化得到的Pfu蛋白的DNA聚合酶活性分析结果；

图6为本发明锌离子诱导Pfu表达对其他金属抗干扰实验的SDS-PAGE电泳分析结果；

图7为本发明锌离子诱导Pfu表达对其他金属抗干扰实验的DNA聚合酶活性分析结果；

图8为本发明锌离子诱导锌结合乙醇脱氢酶YqhD蛋白表达的全细胞SDS-PAGE电泳分析结果；

图9为本发明锌离子诱导YqhD蛋白表达的蛋白产量结果；

图10为本发明锌离子诱导YqhD蛋白表达并纯化得到的YqhD蛋白SDS-PAGE电泳纯度分析结果；

图11为本发明锌离子诱导YqhD蛋白表达并纯化得到的YqhD蛋白的锌结合含量结果；

图12为本发明锌离子诱导YqhD蛋白表达并纯化得到的YqhD蛋白的脱氢酶活性结果；

图13为本发明含锌工业废水诱导DNA聚合酶Pfu蛋白表达的全细胞SDS-PAGE电泳分析结果；

图14为本发明含锌工业废水诱导Pfu蛋白表达并纯化得到的Pfu蛋白的DNA聚合酶活性分析结果。

具体实施方式

下面结合附图进一步说明本发明的实施例，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1敲除大肠杆菌zntA基因，构建对锌离子敏感的ΔzntA菌株

1、敲除引物以及鉴定引物的设计

针对zntA基因敲除，分别设计两对引物，其中一对引物是两端含有zntA基因两翼50bp同源序列的敲除引物zntA-Knockout-P1和zntA-Knockout-P2，以及zntA基因上下游分别为800bp位置处的序列作为外侧的一对鉴定引物zntA-Check-P1和zntA-Check-P2，引物序列信息如下：

zntA-Knockout-P1(如SEQ ID NO.1所示)：

ATGTCGACTCCTGACAATCACGGCAAGAAAGCCCCTCAATTTGCTGCGTTTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG；

zntA-Knockout-P2(如SEQ ID NO.2所示)：

TTATCTCCTGCGCAACAATCTTAACGCATTCGCTGTCACCAGCACCGTCGCATATGAATATCCTCCTTA；

zntA-Check-P1(如SEQ ID NO.3所示)：

TCAGTAACTTTGTCTGGCTGGGGA；

zntA-Check-P2(如SEQ ID NO.4所示)：

ACTGGTTGCTAAAGAGACGGATGG。

2、大肠杆菌zntA基因的敲除

利用基于Red同源重组系统的基因敲除技术，对大肠杆菌的zntA基因进行敲除，得到对锌离子敏感的ΔzntA菌株。

1)PCR扩增带FRT位点的氯霉素抗性基因

PCR体系150μL反应体系，如表1所示：

表1

PCR扩增条件如下：95℃3min；95℃40s；55℃40s；72℃2min；72℃10min；循环35次。

取2-3μL PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。在1200bp附近有一条明亮条带扩增出来，则说明氯霉素抗性基因打靶片段扩增成功，剩余的所有扩增产物用宝生物DNA胶回收试剂盒进行跑胶回收纯化，加入20μL的无菌去离子水洗脱回收的DNA，再次取1-2μL电泳鉴定，确保条带大小正确，纯度较高，并储存备用。

2)pKD46质粒转化入野生型MC4100菌株，获得pKD46/MC4100菌株。

3)大肠杆菌pKD46/MC4100具备重组能力的电转化感受态细胞制备

(1)将-80℃冻存的pKD46/MC4100接种于5mL含有氨苄霉素的LB液体培养基中，30℃振荡培养过夜。

(2)将过夜长浓的细菌以1:100的比例稀释加入到含有50ml Amp⁺/LB液体培养基的锥形瓶中，30℃振荡培养至OD₆₀₀为0.1，加入终浓度为0.02％的阿拉伯糖，继续30℃振荡培养到OD₆₀₀为0.5。

(3)将菌液转移至冰上预冷的灭菌的50mL塑料离心管中，冰上放置30min。

(4)4℃，4000rpm离心15min，去上清，用30mL预冷的10％无菌甘油重悬菌体。

(5)4℃，4000rpm离心15min，去上清。

(6)重复步骤(5)一次。

(7)用400mL 10％甘油重悬菌体，小心混匀后每管40μL分装，放-80℃冻存或直接用来转化。

4)打靶PCR扩增DNA片段的电转化

(1)取40μL pKD46/MC4100感受态细胞，加入纯化的打靶DNA片段若干微升，确保至少有3-4μg的DNA量，轻轻混匀后转入电击杯，冰上放置5分钟。

(2)用Bio-Rad电击仪进行电击转化。条件：200Ω，25F，电压2.3kV，持续时间5ms。

(3)电击后迅速加入1mL液体LB培养基，37℃振荡培养1-2h，之后吸取一半菌液涂到氯霉素平板(氯霉素浓度20g/mL)，37℃培养。

5)PCR鉴定长出的氯霉素抗性克隆，挑选敲除成功的阳性转化子

用高压灭菌的枪头挑取平板上长出的菌落，涂到已经分隔划线并编号的氯霉素平板上，37℃培养过夜，第二天用枪头挑取少许涂开的菌斑，混于事先配制好的总体积20μLPCR体系中，做好PCR管上的编号，直接上PCR仪扩增。扩增体系与普通无特殊区别，扩增引物使用zntA基因的敲除引物(如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2所示)，并且加入1μL野生型MC4100菌液作为扩增模板的对照。

PCR扩增条件如下：95℃3min；95℃40s；55℃40s；72℃2min；循环35次；72℃10min；。

PCR结束后取3-5μL产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。用设计在zntA基因上下游800bp的鉴定引物(如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示)，以野生型菌株为模板，扩增出3796bp的条带，以待鉴定的敲除菌株ΔzntA为模板扩增出2749bp的条带，表明已经在野生型MC4100菌株的基础上成功敲除了zntA基因，得到ΔzntA菌株。

6)pCP20质粒的转化

将pCP20质粒转化入通过冷CaCl₂法制备的ΔzntA感受态细胞，菌液均匀涂布于LB/Amp⁺-Cm⁺平板上，待菌液充分吸收后倒置平板，30℃培养过夜。

7)氯霉素抗性基因的消除

用接种针从pCP20-ΔzntA细菌转化平板上取一个单菌落接种于3mL LB液体培养基中，42℃，250rpm振荡培养4h；取一菌环分区划线接种于LB平板上，37℃培养过夜。用接种针分别从37℃培养过夜的细菌(此时氯霉素抗性基因已去除，pCP20质粒已丢失)平板上挑取3个单菌落分别点种于LB/Cm⁺与LB空白平板上，置于37℃培养6h；于LB/Cm⁺平板上不生长而LB平板上生长的细菌，说明氯霉素抗性基因已成功去除。进一步通过PCR鉴定，证明抗性基因已完全清除。挑取菌落直接加入100μL水中煮沸10min后，离心作为模板，用鉴定引物对(如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示)配制PCR体系进行PCR扩增。

3)ΔzntA单敲除菌的纯化

从ΔzntA分区划线平板上挑取单菌落，用接种环蘸取少许细菌分区划线于新的LB平板，37℃培养过夜。余下菌落挑至100μL无菌水中，煮沸10min后离心，取上清作为模板用鉴定引物对(如SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4所示)进行PCR鉴定，鉴定正确后得到纯化的ΔzntA单敲除菌。

实施例2锌离子诱导重组蛋白表达通用型载体PzntA-pUC57K的构建

1、根据大肠杆菌锌耐受操纵子znt的启动子序列PzntA，加上一段优化的MCS序列，由南京金斯瑞生物科技公司直接合成此融合序列PzntA-MCS(如SEQ ID NO.5所示)。所述MCS序列可根据目的蛋白融合N端或C端组氨酸标签选择合适的MCS位点进行酶切；如表达N端组氨酸标签蛋白，需要用Hind III以及后面任一一个酶切位点；如表达C端组氨酸标签蛋白，用Nhe I和BglII(或Xho I)。用引物PzntA-MCS-1和PzntA-MCS-2进行PCR扩增PzntA-MCS基因片段；上述引物序列分别为：

PzntA-MCS-1(如SEQ ID NO.6所示)：GGCCTCTACCACTGGTGCTG；

PzntA-MCS-2(如SEQ ID NO.7所示)：AAGTCAGTGGTGGTGGTGGT；

PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃40s、50℃40s、72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

用引物pUC57K-1和pUC57K-2进行PCR扩增线性pUC57K载体；上述引物序列分别为：

pUC57K-1(如SEQ ID NO.8所示)：

ACCACCACCACCACTGACTTGGTGTAATCATGGTCATAGCTG；

pUC57K-2(如SEQ ID NO.9所示)：

CAGCACCAGTGGTAGAGGCCGATATCTAGATGTATTCGCGAGGTACC

2、电泳进行扩增产物验证，其验证扩增成功后，将PzntA-MCS基因片段和线性pUC57-Kan载体(简写为pUC57K)载体分别进行胶回收，并按照无缝克隆试剂盒说明书的操作将两个片段混合进行无缝克隆，连接产物转化入感受态细胞，挑取阳性克隆，测序验证并构建得到锌离子诱导重组蛋白表达通用型载体PzntA-pUC57K(质粒图谱如图1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示)。

实施例3锌离子诱导DNA聚合酶Pfu蛋白表达的载体PzntA-Pfu-pUC57K的构建

1、根据高温嗜热菌Pyrococcusfuriosis的DNA聚合酶Pfu蛋白的氨基酸序列，由南京金斯瑞生物科技公司按照大肠杆菌密码子偏好性，直接合成此蛋白的编码基因pfu。用引物Pfu-1和Pfu-2进行PCR扩增pfu基因片段；上述引物序列分别为：

Pfu-1(如SEQ ID NO.11所示)：

TGCCGCGCGGCAGCAAGCTTATGATCCTGGACGTGGACTAC

Pfu-2(如SEQ ID NO.12所示)：

TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAGCTTTTCTTGATGTTCAGCCAGC

PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃40s、50℃40s、72℃3min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

2、电泳进行扩增产物验证，其验证扩增成功后，将pfu基因片段进行胶回收，并按照无缝克隆试剂盒说明书的操作，与经Hind III和Xho I双酶切后的PzntA-pUC57K线性载体进行无缝克隆，连接产物转化入感受态细胞，经双酶切鉴定后挑取阳性克隆，测序验证并构建得到锌离子诱导DNA聚合酶Pfu蛋白表达的载体PzntA-Pfu-pUC57K(DNA序列如SEQ IDNO：13所示)。

实施例4锌离子诱导锌结合乙醇脱氢酶YqhD蛋白表达的载体PzntA-YqhD-pUC57K的构建

1、根据大肠杆菌的锌结合乙醇脱氢酶YqhD蛋白的氨基酸序列，由南京金斯瑞生物科技公司进行密码子序列优化，直接合成此蛋白的编码基因yqhD。用引物YqhD-1和YqhD-2进行PCR扩增yqhD基因片段；上述引物序列分别为：

YqhD-1(如SEQ ID NO.14所示)：

TGCCGCGCGGCAGCAAGCTTATGAACAACTTCAACCTGCACACCCCG；

YqhD-2(如SEQ ID NO.15所示)：

TGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAACGCGCCGCTTCATAGATACG。

2、电泳进行扩增产物验证，其验证扩增成功后，将yqhD基因片段进行胶回收，并按照无缝克隆试剂盒说明书的操作，与经Hind III和Xho I双酶切后的PzntA-pUC57K线性载体进行无缝克隆，连接产物转化入感受态细胞，经双酶切鉴定后挑取阳性克隆，测序验证并构建得到锌离子诱导锌结合乙醇脱氢酶YqhD蛋白表达的载体PzntA-YqhD-pUC57K(DNA序列如SEQ ID NO：16所示)。

实施例5锌离子诱导DNA聚合酶Pfu蛋白表达情况分析和Pfu蛋白的活性测定

将实施例3所得PzntA-Pfu-pUC57K质粒转化入实施例1所述野生菌MC4110和ΔzntA感受态细胞，得到PzntA-Pfu-pUC57K/MC4100以及PzntA-Pfu-pUC57K/ΔzntA。

将PzntA-Pfu-pUC57K/MC4100和PzntA-Pfu-pUC57K/ΔzntA菌株过夜生长。吸取10μL过夜生长的上述菌液分别加入到1L新鲜LB液体培养基中，使起始菌液OD₆₀₀值为0.02，并加入卡那霉素，在37℃恒温250r/min振荡培养，监测其OD₆₀₀至0.6，每种菌液分别加入终浓度为0、5、25、100、500、1000μmol/L的ZnCl₂水溶液，16℃条件下诱导24h。之后8000r/min，4℃离心10min收集菌体，用Tris缓冲液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH 8.0)重悬，使细菌密度OD₆₀₀为10。每种菌液样品吸取10μL进行SDS-PAGE电泳鉴定蛋白表达情况。

如图2所示，为不同浓度锌离子诱导DNA聚合酶Pfu蛋白表达的SDS-PAGE电泳分析图。结果显示：PzntA-Pfu-pUC57K质粒在MC4100菌株内，只有当锌离子浓度升高到1000μmol/L时，Pfu蛋白才有较明显地表达。但是在ΔzntA菌株中，25μmol/L的锌离子浓度即可显著诱导表达Pfu蛋白。这表明zntA基因敲除后，大肠杆菌对锌离子非常敏感，只需要很低浓度的锌离子即可诱导重组蛋白表达。所以从节约成本提高蛋白产量的角度出发，后续将使用ΔzntA菌株作为锌离子诱导重组蛋白表达的宿主。另外从电泳分析结果可知，Pfu在ΔzntA菌株中表达，当培养基中锌离子浓度为100μmol/L时，单位菌量的蛋白表达量即可达到饱和，继续增加锌离子浓度不会增加蛋白表达量。

接着对单位体积的含菌培养基能产生的蛋白产量进行分析。从图3所示，单位体积蛋白产量首先随着锌离子浓度升高而逐渐增加，当锌离子浓度为100μmol/L时，单位体积蛋白产量达到最高值，为44.21mg/L(每升菌液可获得44.21mg的Pfu蛋白)。由于高浓度的锌离子会抑制细菌的生长，当培养基锌离子浓度继续升高时，单位体积蛋白产量反而会逐步减少，所以100μmol/L认为是锌离子诱导Pfu蛋白表达的最佳浓度。将诱导后的菌体破碎，离心后取上清，用镍柱进行纯化，可得到纯度大于95％的Pfu纯化蛋白(如图4所示)。

之后对纯化的Pfu蛋白的DNA聚合酶活性进行分析。50μL的PCR体系如下：模板PzntA-YqhD-pUC57K质粒20ng，上下引物各1μL(20μM，序列分别为(如SEQ ID NO.17所示核苷酸序列：GGTGATGACGGTGAAAACCTCTGAC和SEQ ID NO.18所示核苷酸序列：CAATCTATCGCTTGTATGGGAAGCCCG)，纯化的Pfu蛋白0.5μL(浓度分别为3μM(泳道2)、1.5μM(泳道3)、0.75μM(泳道4))，Pfu缓冲液和水补齐到50μL。另外用购买的商业化Pfu酶(5U/μL)作为阳性对照(泳道1)。PCR反应条件：95℃预变性5min，95℃40s、50℃40s、72℃4min，共35个循环，最后72℃延伸10min。

如图5结果所示，用锌离子诱导的Pfu蛋白与商品化的Pfu相似，具有较高的DNA聚合酶活性，比活性为38,280U/mg。

此外，本发明还分析了锌离子诱导重组蛋白表达系统的抗干扰能力。当PzntA-Pfu-pUC57K/ΔzntA菌株生长至其OD₆₀₀为0.6时，将菌液分装多管，每管菌液分别同时加入终浓度为25μmol/L的锌离子以及50μmol/L的其他各个金属离子，包括Mg²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Pb²⁺、Cr⁶⁺。16℃诱导24h后用SDS-PAGE电泳鉴定蛋白表达以及分析单位体积培养基的蛋白产量。如图6所示，其他各种过量的金属离子都不会影响锌离子诱导Pfu蛋白的表达产量。此外，图7显示其他金属离子也不会影响Pfu蛋白的DNA聚合酶活性。这表明使用含锌的混合溶液而无需使用纯锌溶液即可有效诱导Pfu蛋白的表达，提示使用含锌废水作为诱导剂成为可能，将进一步降低成本。

实施例6锌离子诱导锌结合乙醇脱氢酶YqhD蛋白表达情况分析和YqhD蛋白的活性测定

1、将实施例4所得PzntA-YqhD-pUC57K质粒分别转化入实施例1所述野生菌MC4110和ΔzntA感受态细胞，得到PzntA-YqhD-pUC57K/MC4100、PzntA-YqhD-pUC57K/ΔzntA菌株。

2、将PzntA-YqhD-pUC57K/MC4100和PzntA-YqhD-pUC57K/ΔzntA菌株过夜生长。吸取10μL过夜生长的上述菌液分别加入到1L新鲜LB液体培养基中，使起始菌液OD₆₀₀值为0.02，并加入卡那霉素，在37℃恒温250r/min振荡培养，监测其OD₆₀₀至0.6，每种菌液分别加入终浓度为0、5、25、100、500、1000、2000μmol/L的ZnCl₂水溶液，16℃条件下诱导24h。之后8000r/min，4℃离心10min收集菌体，用Tris缓冲液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH 8.0)重悬，使细菌密度OD₆₀₀为10。每种菌液样品吸取10μL进行SDS-PAGE电泳鉴定蛋白表达情况。

如图8所示，为不同浓度锌离子诱导锌结合乙醇脱氢酶YqhD蛋白表达的SDS-PAGE电泳分析图。结果显示：PzntA-YqhD-pUC57K质粒在MC4100菌株内，锌离子浓度升高到1000μmol/L才能显著诱导YqhD蛋白表达。而在ΔzntA菌株中，不添加外源锌离子(LB培养基本身含有少量浓度的锌离子)，YqhD蛋白也有一定程度地表达，所以后续使用ΔzntA菌株作为锌离子诱导YqhD蛋白表达的宿主。另外从电泳分析结果可知，Pfu在ΔzntA菌株中表达，当培养基中锌离子浓度为100μmol/L时，单位菌量的蛋白表达量可达到饱和值。从图9可知，单位体积蛋白产量首先随着锌离子浓度升高而逐渐增加，当锌离子浓度为100μmol/L时，单位体积蛋白产量达到最高值，为33.28mg/L(每升菌液可获得33.28mg的YqhD蛋白)。高浓度的锌离子会抑制细菌的生长，所以培养基锌离子浓度继续升高时，单位体积蛋白产量会有所下降。将诱导后的菌体破碎，离心后取上清，用镍柱进行纯化，可得到纯度大于95％的YqhD纯化蛋白(如图10所示)。

YqhD蛋白是锌结合蛋白，所以用ICP-MS仪器对YqhD蛋白的锌结合含量进行测定。如图11所示，YqhD蛋白的锌结合含量随着培养基中锌离子浓度的升高而增加，当培养基中添加1000μmol/L锌离子时，YqhD结合锌含量基本达到饱和值(每分子蛋白结合1.04个锌离子)。相比之下，从MC4100菌中(斜线柱形图)纯化的YqhD蛋白结合较少的锌离子。

另外用NADPH作为底物对YqhD的脱氢酶活性进行分析。150μL活性测定体系如下：终浓度20mM正丁醛、终浓度0.5mM NADPH、终浓度1μMYqhD蛋白，缓冲液补齐体积。阴性对照用缓冲液代替相同体积的蛋白。37℃孵育5min，监测340nm的吸光度OD值。氧化1pmol的NADPH所需的酶量代表一个活性单位U。

如图12所示，培养基中100μmol/L和500μmol/L锌离子诱导的YqhD蛋白的脱氢酶活性相对较低，而1000μmol/L的锌离子诱导的YqhD具有较高的活性。此脱氢酶活性结果与锌离子含量结果较为一致，表明YqhD蛋白的脱氢酶活性依赖于锌离子的结合。结合YqhD的蛋白产量和脱氢酶活性两者考虑，1000μmol/L可认为是锌离子诱导YqhD蛋白表达的最佳浓度。

实施例7利用含锌工业废水诱导重组蛋白表达和活性分析

本发明从电镀工业园区随机采集了52份水样，用ICP-MS对水样中的锌离子进行测定，从中随机挑选了锌离子含量超标(>2.0mg/L，依据WHO最高允许锌排放浓度)的5份水样和锌离子含量较低的1份水样(阴性对照)。之后对6份水样的酸碱度(pH)、总溶解固体含量(TDS)也分别进行检测，结果如表2所示：

表2

水样编号	1	2	3	4	5	6
							Zn<sup>2+</sup>(mg/L)	0.038	2.36	4.05	2.10	5.37	3.25
pH	6.8	4.2	3.7	4.1	3.9	5.1
							TDS(g/L)	0.48	3.24	1.05	1.97	3.84	2.28

将PzntA-Pfu-pUC57K/ΔzntA菌株过夜生长。吸取10μL过夜生长的上述菌液分别加入到6瓶250mL的2×LB液体培养基(各成分含量是常规用量的2倍，抗生素浓度不变)中，使起始菌液OD₆₀₀值为0.02，在37℃恒温250r/min振荡培养，监测其OD₆₀₀至0.6，分别在每瓶中加入编号为1–6号的上述水样，16℃条件下诱导24h。之后8000r/min，4℃离心10min收集菌体，用Tris缓冲液(20mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH 8.0)重悬，每种菌液吸取少量进行SDS-PAGE电泳鉴定蛋白表达情况。剩余菌液破碎离心，上清用镍柱进行纯化。之后对纯化得到的Pfu蛋白进行DNA聚合酶活性测定。

如图13所示，为不同工业废水水样诱导Pfu蛋白表达的SDS-PAGE电泳分析图。由于1号水样含锌量低，所以没有看到Pfu表达。而2–6号水样含有较高浓度的锌离子，均可明显诱导Pfu蛋白的表达。图14显示2–6号水样诱导的Pfu蛋白具有较高的酶活性。

值得强调的是，如上述表格所示，2–6号水样呈现不同程度的酸性，且均含有高含量的可溶性固体杂质，此结果表明本发明的锌离子诱导重组蛋白表达系统具有较好的抗干扰能力，能够直接用含锌工业废水诱导表达重组蛋白，具有良好的应用前景。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 温州医科大学

<120> 一种锌离子诱导重组蛋白表达体系、其诱导方法和应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtcgactc ctgacaatca cggcaagaaa gcccctcaat ttgctgcgtt tgtgtaggct 60

ggagctgctt cg 72

<210> 2

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttatctcctg cgcaacaatc ttaacgcatt cgctgtcacc agcaccgtcg catatgaata 60

tcctcctta 69

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcagtaactt tgtctggctg ggga 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

actggttgct aaagagacgg atgg 24

<210> 5

<211> 555

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggcctctacc actggtgctg ctggttctgg gtgcgctgtt actggcgatt atctggacgc 60

gcctggaaga gtaccgttgg cctatctgca cgtttatcgg catgacgctg gtgatggtgt 120

ggctggcagg tgaactgtgg ttcttccgtc cgaccgctcc ggcgctctct gcgtttgttg 180

gcgcttcgtt gctgtttatc agtaactttg tctggctggg gagccactat cgccgacgct 240

tccgtgcgga taacgcgatt gctgcggcct gctactttgc cggtcacttc ctgatcgtcc 300

gctcgctgta tctctgataa aacttgactc tggagtcgac tccagagtgt atccttcggt 360

taatgagaaa aaacttaacc ggaggatgcc atggctagca gccatcatca tcatcatcac 420

agcagcggcc tggtgccgcg cggcagcaag cttgctacca tgactggtgg acagcaaatg 480

ggtcgggatc cgaattcgag ctccgtcatc agatctgcgg ccgcactcga gcaccaccac 540

caccaccact gactt 555

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggcctctacc actggtgctg 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aagtcagtgg tggtggtggt 20

<210> 8

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

accaccacca ccactgactt ggtgtaatca tggtcatagc tg 42

<210> 9

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cagcaccagt ggtagaggcc gatatctaga tgtattcgcg aggtacc 47

<210> 10

<211> 3092

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagagaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420

tacatctaga tatcggcctc taccactggt gctgctggtt ctgggtgcgc tgttactggc 480

gattatctgg acgcgcctgg aagagtaccg ttggcctatc tgcacgttta tcggcatgac 540

gctggtgatg gtgtggctgg caggtgaact gtggttcttc cgtccgaccg ctccggcgct 600

ctctgcgttt gttggcgctt cgttgctgtt tatcagtaac tttgtctggc tggggagcca 660

ctatcgccga cgcttccgtg cggataacgc gattgctgcg gcctgctact ttgccggtca 720

cttcctgatc gtccgctcgc tgtatctctg ataaaacttg actctggagt cgactccaga 780

gtgtatcctt cggttaatga gaaaaaactt aaccggagga tgccatggct agcagccatc 840

atcatcatca tcacagcagc ggcctggtgc cgcgcggcag caagcttgct accatgactg 900

gtggacagca aatgggtcgg gatccgaatt cgagctccgt catcagatct gcggccgcac 960

tcgagcacca ccaccaccac cactgacttg gtgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg 1020

tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa 1080

gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct 1140

ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga 1200

ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc 1260

gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa 1320

tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt 1380

aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa 1440

aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt 1500

ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg 1560

tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc 1620

agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc 1680

gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta 1740

tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct 1800

acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc 1860

tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa 1920

caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa 1980

aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa 2040

aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt 2100

ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaagc ccaatctgaa taatgttaca accaattaac 2160

caattctgat tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg 2220

attatcaata ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag 2280

gcagttccat aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc 2340

aatacaacct attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg 2400

agtgacgact gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc agacttgttc 2460

aacaggccag ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat 2520

tcgtgattgc gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac 2580

aggaatcgaa tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga 2640

atcaggatat tcttctaata cctggaatgc tgtttttccg gggatcgcag tggtgagtaa 2700

ccatgcatca tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt 2760

cagccagttt agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg 2820

tttcagaaac aactctggcg catcgggctt cccatacaag cgatagattg tcgcacctga 2880

ttgcccgaca ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt 2940

taatcgcggc ctcgacgttt cccgttgaat atggctcata acaccccttg tattactgtt 3000

tatgtaagca gacagtttta ttgttcatga tgatatattt ttatcttgtg caatgtaaca 3060

tcagagattt tgagacacgg gccagagctg ca 3092

<210> 11

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tgccgcgcgg cagcaagctt atgatcctgg acgtggacta c 41

<210> 12

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tggtggtggt ggtgctcgag ttagcttttc ttgatgttca gccagc 46

<210> 13

<211> 5348

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagagaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420

tacatctaga tatcggcctc taccactggt gctgctggtt ctgggtgcgc tgttactggc 480

gattatctgg acgcgcctgg aagagtaccg ttggcctatc tgcacgttta tcggcatgac 540

gctggtgatg gtgtggctgg caggtgaact gtggttcttc cgtccgaccg ctccggcgct 600

ctctgcgttt gttggcgctt cgttgctgtt tatcagtaac tttgtctggc tggggagcca 660

ctatcgccga cgcttccgtg cggataacgc gattgctgcg gcctgctact ttgccggtca 720

cttcctgatc gtccgctcgc tgtatctctg ataaaacttg actctggagt cgactccaga 780

gtgtatcctt cggttaatga gaaaaaactt aaccggagga tgccatggct agcagccatc 840

atcatcatca tcacagcagc ggcctggtgc cgcgcggcag caagcttatg atcctggacg 900

tggactacat taccgaagag ggcaagccgg ttatccgcct gttcaagaaa gagaatggca 960

agttcaaaat cgagcacgac cgtaccttcc gtccgtacat ctatgcgctg ctgcgtgacg 1020

atagcaaaat tgaggaagtg aagaaaatca ccggcgagcg tcacggcaag attgtgcgta 1080

tcgtggacgt tgaaaaagtt gagaagaaat ttctgggtaa accgattacc gtttggaagc 1140

tgtacctgga acacccgcag gatgttccga ccatccgtga gaaagtgcgt gaacacccgg 1200

cggtggttga cattttcgag tacgatatcc cgtttgcgaa acgttatctg attgacaagg 1260

gtctgatccc gatggaaggc gaggaagagc tgaaaattct ggcgttcgat atcgaaaccc 1320

tgtatcacga aggcgaagag tttggcaagg gcccgatcat tatgattagc tacgcggacg 1380

agaacgaagc gaaagtgatt acctggaaga acatcgatct gccgtacgtt gaggtggtta 1440

gcagcgagcg tgaaatgatc aagcgtttcc tgcgtatcat tcgtgaaaaa gacccggata 1500

tcattgtgac ctacaacggt gacagcttcg attttccgta tctggcgaag cgtgcggaga 1560

aactgggcat taagctgacc atcggtcgtg acggcagcga gccgaagatg cagcgtattg 1620

gtgatatgac cgcggtggaa gttaaaggcc gtatccactt cgacctgtat cacgtgatta 1680

cccgtaccat caacctgccg acctacaccc tggaggcggt gtatgaagcg atttttggta 1740

aaccgaagga gaaagtttac gcggacgaaa tcgcgaaagc gtgggaaagc ggcgagaacc 1800

tggaacgtgt tgcgaaatac agcatggagg atgcgaaggc gacctatgag ctgggtaaag 1860

aattcctgcc gatggaaatc cagctgagcc gtctggttgg tcaaccgctg tgggatgtga 1920

gccgtagcag caccggcaac ctggtggagt ggtttctgct gcgtaaggcg tacgagcgta 1980

acgaagttgc gccgaacaaa ccgagcgaag aggaatacca acgtcgtctg cgtgagagct 2040

ataccggtgg cttcgtgaaa gagccggaaa agggtctgtg ggaaaacatc gtttacctgg 2100

actttcgtgc gctgtatccg agcatcatta tcacccacaa cgtgagcccg gacaccctga 2160

acctggaagg ttgcaaaaac tatgatatcg cgccgcaggt tggccacaag ttctgcaaag 2220

atattccggg ttttattccg agcctgctgg gtcacctgct ggaggaacgt cagaagatta 2280

aaaccaagat gaaagaaacc caagacccga ttgaaaagat cctgctggat taccgtcaaa 2340

aggcgatcaa actgctggcg aacagcttct acggttacta tggctatgcg aaagcgcgtt 2400

ggtattgcaa agaatgcgcg gaaagcgtga ccgcgtgggg tcgtaagtac attgagctgg 2460

tttggaaaga actggaggaa aaattcggtt ttaaggtgct gtacatcgac accgatggcc 2520

tgtatgcgac cattccgggt ggcgagagcg aggaaatcaa gaaaaaggcg ctggaattcg 2580

ttaaatatat taacagcaag ctgccgggcc tgctggagct ggaatacgag ggtttttata 2640

aacgtggctt ctttgttacc aaaaagcgtt acgcggtgat cgacgaggaa ggtaaagtga 2700

ttacccgtgg cctggagatc gtgcgtcgtg attggagcga gattgcgaag gaaacccagg 2760

cgcgtgtgct ggaaaccatc ctgaaacacg gtgacgttga ggaagcggtg cgtattgtta 2820

aagaagtgat ccagaagctg gcgaactacg agatcccgcc ggaaaagctg gcgatttatg 2880

agcaaatcac ccgtccgctg cacgaataca aagcgattgg tccgcacgtg gcggttgcga 2940

aaaagctggc ggcgaagggc gttaagatca aaccgggtat ggttattggc tatatcgtgc 3000

tgcgtggtga cggcccgatt agcaaccgtg cgatcctggc ggaggaatac gacccgaaaa 3060

agcacaaata tgatgcggag tactatattg aaaaccaagt tctgccggcg gtgctgcgta 3120

tcctggaggg ttttggctac cgtaaggaag atctgcgtta tcaaaagacc cgtcaagttg 3180

gcctgaccag ctggctgaac atcaagaaaa gctaactcga gcaccaccac caccaccact 3240

gacttggtgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 3300

ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc 3360

taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc 3420

cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct 3480

tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 3540

gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 3600

atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 3660

ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 3720

cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 3780

tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 3840

gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 3900

aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 3960

tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 4020

aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 4080

aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 4140

ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 4200

ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 4260

atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 4320

atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa 4380

tcaagcccaa tctgaataat gttacaacca attaaccaat tctgattaga aaaactcatc 4440

gagcatcaaa tgaaactgca atttattcat atcaggatta tcaataccat atttttgaaa 4500

aagccgtttc tgtaatgaag gagaaaactc accgaggcag ttccatagga tggcaagatc 4560

ctggtatcgg tctgcgattc cgactcgtcc aacatcaata caacctatta atttcccctc 4620

gtcaaaaata aggttatcaa gtgagaaatc accatgagtg acgactgaat ccggtgagaa 4680

tggcaaaagt ttatgcattt ctttccagac ttgttcaaca ggccagccat tacgctcgtc 4740

atcaaaatca ctcgcatcaa ccaaaccgtt attcattcgt gattgcgcct gagcgagacg 4800

aaatacgcga tcgctgttaa aaggacaatt acaaacagga atcgaatgca accggcgcag 4860

gaacactgcc agcgcatcaa caatattttc acctgaatca ggatattctt ctaatacctg 4920

gaatgctgtt tttccgggga tcgcagtggt gagtaaccat gcatcatcag gagtacggat 4980

aaaatgcttg atggtcggaa gaggcataaa ttccgtcagc cagtttagtc tgaccatctc 5040

atctgtaaca tcattggcaa cgctaccttt gccatgtttc agaaacaact ctggcgcatc 5100

gggcttccca tacaagcgat agattgtcgc acctgattgc ccgacattat cgcgagccca 5160

tttataccca tataaatcag catccatgtt ggaatttaat cgcggcctcg acgtttcccg 5220

ttgaatatgg ctcataacac cccttgtatt actgtttatg taagcagaca gttttattgt 5280

tcatgatgat atatttttat cttgtgcaat gtaacatcag agattttgag acacgggcca 5340

gagctgca 5348

<210> 14

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgccgcgcgg cagcaagctt atgaacaact tcaacctgca caccccg 47

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

tggtggtggt ggtgctcgag ttaacgcgcc gcttcataga tacg 44

<210> 16

<211> 4184

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagagaatt cgagctcggt acctcgcgaa 420

tacatctaga tatcggcctc taccactggt gctgctggtt ctgggtgcgc tgttactggc 480

gattatctgg acgcgcctgg aagagtaccg ttggcctatc tgcacgttta tcggcatgac 540

gctggtgatg gtgtggctgg caggtgaact gtggttcttc cgtccgaccg ctccggcgct 600

ctctgcgttt gttggcgctt cgttgctgtt tatcagtaac tttgtctggc tggggagcca 660

ctatcgccga cgcttccgtg cggataacgc gattgctgcg gcctgctact ttgccggtca 720

cttcctgatc gtccgctcgc tgtatctctg ataaaacttg actctggagt cgactccaga 780

gtgtatcctt cggttaatga gaaaaaactt aaccggagga tgccatggct agcagccatc 840

atcatcatca tcacagcagc ggcctggtgc cgcgcggcag caagcttatg aacaacttca 900

acctgcacac cccgacccgt atcctgtttg gcaagggcgc gattgcgggc ctgcgtgaac 960

agatcccgca cgacgcgcgt gttctgatta cctacggtgg cggtagcgtg aagaaaaccg 1020

gtgttctgga ccaagtgctg gatgcgctga aaggcatgga tgttctggag ttcggcggta 1080

tcgaaccgaa cccggcgtat gagaccctga tgaacgcggt gaagctggtt cgtgaacaga 1140

aagtgacctt cctgctggcg gttggcggtg gcagcgtgct ggacggtacc aagtttattg 1200

cggcggcggc gaactatccg gagaacatcg atccgtggca cattctgcaa accggtggca 1260

aggaaatcaa aagcgcgatt ccgatgggtt gcgttctgac cctgccggcg accggtagcg 1320

agagcaacgc gggtgcggtg atcagccgta agaccaccgg cgacaaacag gcgttccaca 1380

gcgcgcacgt gcaaccggtt tttgcggtgc tggatccggt ttacacctat accctgccgc 1440

cgcgtcaggt ggcgaacggt gtggttgacg cgttcgttca caccgtggaa cagtacgtta 1500

ccaagccggt ggacgcgaaa attcaagatc gttttgcgga gggtatcctg ctgaccctga 1560

ttgaagacgg cccgaaggcg ctgaaagagc cggaaaacta tgatgttcgt gcgaacgtta 1620

tgtgggcggc gacccaggcg ctgaacggtc tgattggtgc gggcgttccg caagactggg 1680

cgacccacat gctgggtcac gagctgaccg cgatgcatgg tctggatcat gcgcagaccc 1740

tggcgattgt tctgccggcg ctgtggaacg agaaacgtga caccaagcgt gcgaaactgc 1800

tgcaatacgc ggaacgtgtg tggaacatca ccgagggtag cgacgatgaa cgtatcgatg 1860

cggcgattgc ggcgacccgt aacttctttg aacagctggg cgttccgacc cacctgagcg 1920

actacggtct ggatggcagc agcatcccgg cgctgctgaa gaaactggag gaacacggta 1980

tgacccaact gggcgagaac cacgacatta ccctggatgt gagccgtcgt atctatgaag 2040

cggcgcgtta actcgagcac caccaccacc accactgact tggtgtaatc atggtcatag 2100

ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc 2160

ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc 2220

tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 2280

cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg 2340

ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg 2400

ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag 2460

gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 2520

gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 2580

taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 2640

accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 2700

tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 2760

cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 2820

agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 2880

gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca 2940

gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 3000

tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 3060

acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 3120

cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc 3180

acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa gcccaatctg aataatgtta 3240

caaccaatta accaattctg attagaaaaa ctcatcgagc atcaaatgaa actgcaattt 3300

attcatatca ggattatcaa taccatattt ttgaaaaagc cgtttctgta atgaaggaga 3360

aaactcaccg aggcagttcc ataggatggc aagatcctgg tatcggtctg cgattccgac 3420

tcgtccaaca tcaatacaac ctattaattt cccctcgtca aaaataaggt tatcaagtga 3480

gaaatcacca tgagtgacga ctgaatccgg tgagaatggc aaaagtttat gcatttcttt 3540

ccagacttgt tcaacaggcc agccattacg ctcgtcatca aaatcactcg catcaaccaa 3600

accgttattc attcgtgatt gcgcctgagc gagacgaaat acgcgatcgc tgttaaaagg 3660

acaattacaa acaggaatcg aatgcaaccg gcgcaggaac actgccagcg catcaacaat 3720

attttcacct gaatcaggat attcttctaa tacctggaat gctgtttttc cggggatcgc 3780

agtggtgagt aaccatgcat catcaggagt acggataaaa tgcttgatgg tcggaagagg 3840

cataaattcc gtcagccagt ttagtctgac catctcatct gtaacatcat tggcaacgct 3900

acctttgcca tgtttcagaa acaactctgg cgcatcgggc ttcccataca agcgatagat 3960

tgtcgcacct gattgcccga cattatcgcg agcccattta tacccatata aatcagcatc 4020

catgttggaa tttaatcgcg gcctcgacgt ttcccgttga atatggctca taacacccct 4080

tgtattactg tttatgtaag cagacagttt tattgttcat gatgatatat ttttatcttg 4140

tgcaatgtaa catcagagat tttgagacac gggccagagc tgca 4184

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggtgatgacg gtgaaaacct ctgac 25

<210> 18

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

caatctatcg cttgtatggg aagcccg 27

Claims (10)

1.一种宿主大肠杆菌，其特征在于，所述宿主大肠杆菌中zntA基因被敲除。

2.一种表达载体，其特征在于：所述表达载体中包括加入优化的MCS序列的大肠杆菌锌耐受操纵子znt的启动子序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

3.一种锌离子诱导的重组蛋白表达体系，其特征在于，所述的表达体系包括权利要求1所述宿主大肠杆菌和权利要求2所述的表达载体。

4.一种锌离子诱导重组蛋白表达的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

(1)将目的蛋白的编码序列克隆到权利要求2所述的表达载体中；

(2)得到的表达载体转化入权利要求1所述的宿主大肠杆菌中过夜生长；

(3)过夜生长的菌株加入培养基中培养至对数生长期；

(4)再向菌株培养基中添加含锌离子液体进行诱导。

5.根据权利要求4所述的锌离子诱导重组蛋白表达的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的菌株培养基为新鲜的LB培养基或2×LB培养基。

6.根据权利要求4所述的锌离子诱导重组蛋白表达的方法，其特征在于，步骤3)中过夜生长的菌株加入培养基中时，使起始菌夜OD₆₀₀值为0.02。

7.根据权利要求4所述的锌离子诱导重组蛋白表达的方法，其特征在于，步骤4)中所述的含锌离子液体的浓度为2-2000μmol/L。

8.根据权利要求4所述的锌离子诱导重组蛋白表达的方法，其特征在于，步骤4)中所述的含锌离子液体为含锌工业废水。

9.根据权利要求4所述的锌离子诱导重组蛋白表达的方法，其特征在于，步骤4)中所述的诱导条件为16℃诱导24h。

10.根据权利要求4-9任一项所述的锌离子诱导重组蛋白表达的方法，其特征在于，所述的目的蛋白为Pfu蛋白或YqhD蛋白。

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