CN104946682A - 一种检测水体重金属铅的微生物学方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种检测重金属铅的大肠杆菌工程菌株的构建方法及其检测水体中铅方法的建立。本发明所述基因工程菌株为PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2/E.coliΔzntRΔzntA，命名为E.coli WMC-008p CGMCC No.9748，其中zntA和zntR基因发生缺失突变失活，来源于耐金属贪铜菌CH34株的pbr操纵子敲入表达红色荧光蛋白DsRed-express2。本发明所述工程菌株相比含报告质粒的大肠杆菌报告菌株具备操作简便、荧光本底值低、信号稳定等优势。本发明所述工程菌株能够反映水体中铅的生物有效性，将为客观评价水体中铅的生物毒性效应提供依据。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测重金属铅的微生物学方法，具体涉及利用基因工程技术改造的大肠埃希氏菌的构建方法及其检测水体环境中铅方法的建立。
背景技术
随着工农业的发展，很多含有铅离子的污染物排放入江河湖泊中，污染土壤、水源甚至是日常食用的粮食蔬菜。环境中的铅主要来源于各种油漆、涂料、蓄电池、冶炼、五金、机械、电镀、化妆品、染发剂、釉彩碗碟、餐具、燃煤、膨化食品、自来水管等。研究发现过量的重金属铅对于所有的生命体都是有毒的，人体吸收过量的铅后，可蓄积于人体重要器官肝、肾、脑等。它是通过皮肤、消化道、呼吸道进入体内与多种器官亲和，主要毒性效应是贫血症、神经机能失调和肾损伤，易受害的人群有儿童、老人、免疫低下人群。铅对水生生物的安全浓度为0.16mg/L，用含铅0.1～4.4mg/L的水灌溉水稻和小麦时，作物中铅含量明显增加。人体内正常的铅含量应该在0.1mg/L，如果含量超标，容易引起贫血，损害神经系统。而幼儿大脑受铅的损害要比成人敏感得多，一旦血铅含量超标，应该采取积极的排铅毒措施。儿童可服用排铅口服液或借助其他产品进行排铅。
目前监测和检测重金属污染物主要有两种方法：(1)物理化学分析法，如电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等，其优点是具备高检测灵敏度和高特异性，但也存在一些不足，如仪器设备昂贵，操作复杂，检测周期长，最重要的一点是，传统的物理化学方法主要是对环境重金属总量进行测定，不能检测重金属的生物可利用度；(2)微生物法，其优势是成本低廉、操作简易，可以直接反映污染物对生物有机体的毒性及影响。除此，该方法常用的模式生物(如大肠埃希菌)繁殖及生存能力强，易储存和稳定性高，以其为生物学感应元件的微生物细胞传感器可以极大简化传感器的制作过程，提高传感器的检测效率。
但是，目前关于铅在大肠埃希菌的具体耐受机制仍未见报道。然而根据Rensing C等在文献Pb(II)-translocating P-type ATPases.J Biol Chem.1998Dec 4；273(49)：32614-7，已发现大肠埃希菌中负责编码将铅离子泵出的P-Type ATPase基因zntA及其调节蛋白基因zntR；但是zntA基因的启动子对铅并非完全特异，它还能被锌、镉等离子非特异性启动，故其启动子不能作为铅检测的特异性元件。据Hobman JL，Julian DJ等在Cysteine coordination of Pb(II)is involved in thePbrR-dependent activation of the lead-resistance promoter，PpbrA，from Cupriavidus metalliduransCH34.BMC Microbiol.2012Jun 18；12：109和Wei Wei等在文献Simple Whole-Cell Biodetectionand Bioremediation of Heavy Metals Based on an Engineered Lead-Specific Operon.Environ SciTechnol.2014Mar 18；48(6)：3363-71报道，贪铜菌属中PbrR的启动子能被铅离子特异性启动表达下游基因，其对铅离子的特异性已得到证实。
2008年，Aparna Chaudhari等在文献GFP expressing bacterial biosensor to measure leadcontamination in aquatic environment.Research Communications.2008Mar 25；(94)：800-805中以大肠埃希菌DH5α为宿主菌，Cupriavidus metallidurans CH34中PbrR及其启动子PbrO/P为感应元件，RFP作为报告基因检测地表水中的铅。据该文献报道，在LB培养基中，37℃经过12h的培养，可检测的铅离子浓度范围是50-400μM；铅离子浓度为250μM，红色荧光蛋白表达达到峰值，若铅浓度的再升高，红色荧光蛋白荧光强度反而呈降低趋势。
构建检测铅离子的以质粒为载体、细菌为宿主的微生物法，存在以下问题：(1)铅是一种常见的剧毒性环境污染重金属，大部分细菌存在一套对有害重金属泵出机制，对铅的沉淀物或者活性形式都有抗性，故其敏感性不高。Aparna中检测的铅离子浓度范围是50-400μM，远高于《地表水环境质量标准》GB3838-2002中II类水源对铅的限值0.01mg/L(0.05μM)、III类水源限值0.05mg/L(0.25μM)。(2)研究是基于质粒作为荧光表达载体，质粒传代过程可能出现拷贝数不一、丢失和高本底等缺陷致使检测结果不稳定。Aparna中检测铅离子需在LB培养基中，37℃经过12h的培养，周期过长，时效性差，不利于现场检测。
发明内容
本发明的目的是通过基因敲除和基因敲入技术构建了一株大肠埃希菌生物检测菌株，进而建立特异、稳定检测水体中重金属铅的方法。本发明的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)WMC-008p，已于2014年9月29日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏编号为CGMCC No.9748。
本发明E.coli WMC-008p CGMCC No.9748生物菌株的构建及应用方法如下：
1.构建ΔzntAΔzntR双基因突变菌株
PCR扩增含zntA和zntR上下游各50bp同源臂带FRT位点的氯霉素抗性基因；将扩增的氯霉素抗性基因转入含Red重组酶的菌株中；选择氯霉素抗性转化体；FLP重组酶消除氯霉素抗性基因；双敲为在单敲除菌基础上重复上述操作。
2.E.coli WMC-008p CGMCC No.9748的构建
2.1融合基因PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2的构建
PCR分别扩增人工合成的pbrR基因及其启动子PpbrA片段和pbrA基因启动子和报告基因DsRed-express2片段，再通过交叉PCR技术将两片段连接，形成PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2融合报告基因。
2.2pKOV法将融合基因敲入ΔzntAΔzntR双基因突变菌株基因组
将pKOV-PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2转化入E.coliΔzntAΔzntR，pKOV通过温度及蔗糖的选择，发生两次同源重组，最后将PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2报告基因置换到zntA编码基因位置，筛选获得能够特异、敏感和快速检测铅的大肠埃希菌生物检测菌株E.coli WMC-008p。
3.建立本发明检测水体中重金属铅的微生物学方法
3.1培养基的配制：
1g/L胰蛋白胨、0.5g/L酵母膏、1g/LNaCl，先加50ml MilliQ H2O，振荡至完全融解后加MilliQ H2O定容至80ml，高压蒸汽灭菌，再加入10ml 400mM无菌MOPS缓冲液，混匀。
3.2标准曲线的制定：
把铅单元素标准品用无菌MilliQ级的纯水稀释成适当的浓度梯度。
3.2.1从步骤2.2获得的甘油保存菌E.coli WMC-008p菌株中取5-10μl接入步骤3.2.1配制的新鲜5ml步骤3.1配制的LB培养基，37℃，250rpm过夜培养；
3.2.2取5-10μl步骤3.2.1的E.coli WMC-008p过夜菌加入到LB培养基中，37℃，250rpm，恒温震荡培养至OD600值在0.5-0.6，取90-900μl菌液分装至96孔透明底黑色微孔板或15×150mm规格的检测管内，同时在每个检测孔或检测管内加入铅离子使终浓度分别为0.05、0.25、0.50、1.00、5.00、7.50、10.00、12.50、15.00μmol/L，37℃、250rpm振荡孵育3-5h；
3.2.3将步骤3.2.2菌液4,000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml含500mM NaCl、20mM Tris-HCl、20μg/ml氯霉素、pH 8.0DB缓冲液中，制成菌悬液；
3.2.4将步骤3.2.3重悬菌液稀释20倍，使E.coli WMC-008p全细胞悬浮液的OD600≤0.2，混匀，分别测量其稀释液荧光值，激发波长为550nm，发射波长为570nm，并测其OD600值；
3.2.5数据处理：
相对荧光值(Relative fluorescence unit，RFU)：RFUM＝FM/OD600M，FM为与铅单元素标准品孵育E.coli WMC-008p菌悬液的荧光值，OD600M为与铅单元素标准品孵育E.coliWMC-008p菌悬液的吸光度；RFUW＝FW/OD600W，FW为与MilliQ级纯水孵育E.coliWMC-008p菌悬液的背景荧光值，OD600W为与MilliQ级纯水孵育E.coli WMC-008p菌悬液的吸光度；
绝对荧光值(Absolutee fluorescence unit，AFU)：AFU＝RFUM-RFUW，RFUM为与铅单元素标准品孵育E.coli WMC-008p菌悬液的相对荧光值，RFUW为与MilliQ级纯水孵育E.coli WMC-008p菌悬液的相对背景荧光值。
3.3样品检测：
用移液枪吸取E.coli WMC-008p CGMCC No.9748过夜菌种子液加入到含有终浓度为40mM MOPS缓冲成分的LB培养基中，使起始菌液OD600值为0.5-0.6，分装至15×150mm规格的无菌试管或康宁公司的96孔透明底黑色微孔板中，并在开始接菌时即加入1/1000-1/100体积不同浓度的Pb2+溶液或待检测环境水体样品，另加等体积无菌MilliQ H2O作为阴性对照，每种浓度或样品各做3个平行管或3个平行孔，37℃、250rpm振荡孵育3h，4,000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml DB中，然后将重悬菌液稀释20倍，混匀，分别测量其稀释液在激发波长为550nm，发射波长为570nm条件下的荧光值与OD600值。然后将测得的未知环境水体样品荧光强度值代入上述步骤3.2所得方程，计算得到未知环境水体样品中铅的浓度。
4.菌株E.coli WMC-008p CGMCC No.9748应用
在含有40mM MOPS缓冲成分的LB培养基中，E.coli WMC-008p菌株对水体样品的pH值具有较强的抗干扰能力，并能应用于环境水体样品中铅离子的检测。相对于原子吸收光谱法，E.coli WMC-008p菌株对pH值范围为1.5-12.9的水体样品中Pb2+的加标回收率为91％-109％，对温州医科大学附近工业废水样品中Pb2+的加标回收率为87％-116％。
利用本发明提供的E.coli WMC-008p菌株检测水体中铅浓度时，其具备以下创新点及优势：(1)荧光本底值低、检测信号稳定：由于报告元件位于宿主菌的基因组，基因组为单拷贝，故本发明的荧光本底值几乎为0且检测信号稳定。(2)检测时效性好。本发明E.coliWMC-008p菌株的最佳诱导时间为2～3h，时效性远高于基于质粒载体的12h。(3)检测灵敏度高、结果精确。由于E.coli WMC-008p菌株是在大肠埃希菌MC4100基础上敲除了基因zntA和zntR，大大提高了铅进入菌内的量，进而提高铅检测的灵敏度；且位于基因组的检测元件随着传代而复制，不会因传代而丢失或拷贝量改变，故其结果稳定而准确。(4)本发明克服了物理化学法操作繁琐、成本高等缺陷，并且能够反映不同结合形式铅的生物有效性，客观评价水体中铅的生物毒性效应。(5)E.coli WMC-008p菌株中未导入任何外源抗生素抗性基因，属环境友好菌株。利用本发明提供的E.coli WMC-008p菌株可以在检测酸性矿山、电镀废水、生活污水中铅浓度方面得到应用。
附图说明
图1.双基因敲除流程图。
A/C：zntA上/下游基因；B：zntA基因；H1/H2：zntA上游或下游50bp同源臂，P1/P2：上游或下游引物。
图2.检测元件示意图
pbrR：调节蛋白基因；PbrR：调节蛋白；DsRed：荧光蛋白DsRed-express2基因；启动子：PpbrA。
图3.基因敲入流程图
A/C：zntA基因的N/C端；B：zntA基因D：PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2；sacB/repA/cat：pKOV质粒所带的基因。
图4.cat基因PCR电泳图
M：DL5000DNA Marker；1/2：含zntA/zntR 50bp同源臂的cat基因。
图5.zntA基因敲除PCR电泳图：
M：DL 5000DNA Marker；1：未敲除zntA的MC4100(2499bp)；2：敲除zntA的MC4100(ΔzntA：：cat)(1249bp)；3：成功敲除zntA的突变菌(500bp)。
图6.zntR基因敲除PCR电泳图
M：DL 5000DNAMarker；1：野生型zntR(726bp)；2：敲除zntR的MC4100(ΔzntR：：cat)(1249bp)；3：成功敲除zntR的突变菌(500bp)。
图7.ΔzntAΔzntR/MC4100菌株PCR鉴定电泳图：
M：DL 5000DNA Marker；1：ΔzntA/MC4100(498bp)；2：ΔzntR/MC4100(408bp)。
图8.融合报告载体PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2-pMD 19的构建流程：
M：DL 5000DNAMarker；1：PpbrA-pbrR(521bp)；2：PpbrA：：DsRed-express2(774bp)；3：PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2片段(1295bp)；4、5、15：连接成功
PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2菌株鉴定。
具体实施方式
本发明所述重金属铅生物检测菌株的构建具体方法如下：
实施例1.双敲除敏感菌株的构建，见图1
1.1PCR扩增含zntA和zntR上下游50bp同源臂带FRT位点的氯霉素抗性基因
根据http：//ecogene.org/公布的zntA/zntR基因序列和GenBank公布的cat基因序列，设计合成含zntA和zntR上下游50bp同源臂带FRT位点的氯霉素抗性基因及其鉴定的引物。具体信息见表1，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。用无菌ddH2O将引物溶解，配成浓度为10μmol/L的储存液，-20℃保存。
表1.基因敲除引物详细信息表
取含有质粒pKD3的MC4100过夜菌液1ml于1.5ml的EP管中，12,000rpm离心1min，弃上清，菌体用1ml无菌MilliQ H2O重悬洗涤两次后，沸水煮10min，12,000rpm离心3min，按照下表配制PCR反应管，混匀。
PCR反应条件如下：95℃3min；95℃40sec，48℃40sec，72℃2min，35个循环；72℃10min，4℃30min。产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定，如附图4。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的无菌MilliQ H2O溶解洗脱备用。
1.2将扩增的氯霉素抗性基因转入含Red重组酶的菌株中
将转化有pKD46的MC4100菌株接种，30℃培养过夜，次日1：100接种至含氨苄青霉素100mg/L 50ml LB培养基，30℃培养至A600＝0.1时，1：500加入20％L-阿拉伯糖，诱导至OD600≈0.5时制备电转感受态，40μl/每管。将1.1中扩增的片段5μl加入感受态菌株，用Bio-Rad电击仪电转化，电击条件：200Ω，25μF，电击电压2.5kV，电击时间5ms，电击后迅速加入1ml LB,250rpm，37℃培养1.5h，之后涂布于含氯霉素20mg/L平板，次日观察。
1.3选择氯霉素抗性转化体
氯霉素平板上长出的克隆，挑取长势良好的单菌落接于5ml含氯霉20mg/L的LB液体培养基中，250rpm，37℃培养至肉眼可见的浑浊。取1mL于1.5ml的EP管中，12,000rpm离心1min，弃上清，菌体用1ml无菌MilliQ H2O重悬洗涤两次后，沸水煮10min，12,000rpm离心3min，按照下表配制PCR反应管，混匀。
PCR反应条件如下：95℃3min；95℃40sec，52℃40sec，72℃2min，25个循环；72℃10min，4℃30min。产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定，如附图5、6。
1.4FLP重组酶消除氯霉素抗性基因
将pCP20转入氯霉素抗性阳性的克隆，30℃培养10h，后提高到42℃过夜。接种环醮取过夜菌液涂布于无抗性LB平板，37℃培养过夜。过夜无抗平板长出的克隆，分别先后分格划线于新氯霉素抗性和无抗LB平板，37℃培养过夜。选取氯霉素抗性无生长和无抗LB平板生长的单菌落增菌，按照步骤1.3中PCR条件重复操作，结果如附图7。
1.5双敲为在单敲除菌基础上重复步骤1.1～1.4
实施例2.基因敲入片段的融合，如图2
2.1引物信息及合成
根据Harvard MoLecuLar TechnoLogy Group&Lipper Center for ComputationaL Genetics网站http：//arep.med.harvard.edu/Labgc/adnan/projects/EcoLiKOprimers/EcoLiKOprimers.htm提供的敲除zntA基因的引物序列、http：//ecogene.org/公布的zntA基因序列和GenBank公布的PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2基因序列，设计zntA基因N末端和C末端的内侧引物(P2：zntA-Ni和P5：zntA-Ci)和外侧引物(P1：zntA-No和P6：zntA-Co)，使P2与P3，P4与P5之间存在互补序列，基因敲除两个外侧引物不变，P3与P4为一对扩增PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2基因引物。具体信息见表2，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。用无菌ddH2O将引物溶解，配成浓度为10μmol/L的储存液，-20℃保存。
表2.基因融合引物详细信息表
注：下划线基因序列为酶切位点
2.2两侧同源臂的扩增
取MC4100过夜菌液1ml于1.5ml的EP管中，12,000rpm离1min，弃上清，菌体用1m1无菌MilliQ H2O重悬洗涤两次后，沸水煮10min，12,000rpm离心3min，按照下表加入PCR反应管中，混匀。
PCR反应条件如下：95℃3min；95℃40sec，50℃40sec，72℃1min，35个循环；72℃10min，4℃30min。产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的无菌MilliQ H2O溶解洗脱备用。
2.3PpbrA-pbrR-PpbrA：；DsRed-express2基因的扩增
取含有PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2质粒(CLonetech)的过夜菌液1ml于1.5ml的EP管中，12,000rpm离心1min，弃上清，菌体用1ml MilliQ H2O重悬洗涤两次，沸水煮10min，12,000rpm离心3min，根据下表加入PCR反应管中，混匀。
PCR反应条件如下：95℃3min；95℃40sec，53℃40sec，72℃2min，35个循环；72℃10min，4℃30min。产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定，如图8。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的无菌MilliQ H2O溶解洗脱备用。
2.4N端同源臂与PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2基因融合
PCR反应体系如下：
注：该表格中“N端同源臂PCR反应产物”和“PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2”，基因PCR反应产物”浓度相近，若浓度差别很大则按照mol比1∶1。
PCR反应条件如下：95℃3min；95℃40sec，65℃40sec，72℃2min，8个循环；72℃10min，4℃30min。反应结束后再按照下表继续加入原PCR反应管，混匀。
PCR反应条件如下：95℃3min；95℃40sec，55℃40sec，72℃3min，35个循环；72℃10min，4℃30min。
2.5C端同源臂与“N端-PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2”基因融合参照步骤2.4。
实施例3.基因敲入片段的测序
3.1基因敲入片段加A反应与纯化：PCR反应体系如下
PCR反应条件如下：72℃、1h，4℃、30min。PCR产物用纯化试剂盒进行纯化，最后加适量的无菌MilliQ H2O溶解洗脱备用。
3.2目的片段与pMD19-T simple载体连接
按TaKaRa公司的pMD19-T simpLe Vector试剂盒说明书进行T载体与目的基因的连接，连接反应体系如下：
16℃，连接过夜。
3.3转化
通过冷CaCl2法将连接产物转化入大肠埃希菌DH5α感受态细胞中。
3.4测序
挑选一个经外侧引物P1和P6PCR鉴定和质粒酶切鉴定正确的单克隆菌株送华大基因有限公司测序，测序结果与NCBI上提供的标准参考序列比对。
实施例4.目的片段与pKOV载体连接并实现敲入，如图3
4.1pMD19T-zntA No-Ni-PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2-zntA Ci-Co质粒的双酶切及酶切产物的回收：a).质粒的提取采用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.3.0试剂盒小提质粒。b).pMD19T-zntA No-Ni-PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2-zntA Ci-Co质粒的双酶切反应体系如下：
37℃，酶切3h。酶切产物zntA No-Ni-PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2-zntA Ci-Co融合基因的切胶回收：酶切反应后产物行1％低熔点琼脂糖凝胶电泳，在长波紫外灯下切割目的DNA片段，以TaKaRa公司胶回收试剂盒进行回收，最后以NaNoDrop2000核酸/蛋白分析仪对回收产物定量。
4.2pKOV质粒的双酶切及酶切产物回收
体系及酶切条件同pMD19T-zntANo-Ni-PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2-zntA Ci-Co质粒，回收纯化载体片段。
4.3打靶载体pKOV-zntA No-Ni-pbrR-PpbrA-PpbrA：：DsRed-express2-zntA Ci-Co的构建及保存。
4.3.1目的片断与载体的连接反应
连接反应体系如下：
16℃，连接过夜(PpbrA-pbrR-PpbrA：；DsRed-express2片断与pKOV载体的摩尔比为10∶1)。
4.3.2将连接好的产物转入E.coliΔzntAΔzntR感受态细胞中。
4.4阳性克隆的鉴定：
4.4.1PCR鉴定
用接种针挑取上述LB CM+平板上生长的单菌落少许分区划线接种于一个新的无菌LBCM+平板上，30℃恒温培养箱中倒置培养10h。然后，用接种针分别挑取该LB CM+平板上生长的单菌落少许，混于含50μl无菌水的EP管中，沸水煮10min，12,000rpm离心3min后，取上清按照下表加入PCR反应管中作为PCR鉴定模板，混匀。
PCR反应条件如下：94℃、1min；88℃、4min；94℃10sec，66℃5min，25个循环；72℃10min，4℃保存。取5μl产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定。电泳显示PCR片断长度在2.0kb左右的单克隆被挑选出来，进行下面的质粒提取和双酶切鉴定。
4.4.2质粒双酶切鉴定
上述克隆质粒的中量提取如步骤4.1。
体系及酶切条件同pMD19T-zntA No-Ni-PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2-zntA Ci-Co质粒。酶切反应后产物行1％低熔点琼脂糖凝胶电泳鉴定。酶切片断在2.0kb左右证实打靶载体构建成功。菌种置-80℃保存，备用。
4.5pKOV-PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2整合到大肠埃希菌的基因组中
取于30℃孵育的pKOV-zntANo-Ni-PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2-zntACi-Co/ΔzntAΔzntR过夜菌液10μl接种于42℃预热的含5ml CM/LB培养基的试管中，于42℃，250rpm的恒温培养箱中振荡培养2h，然后分别取42℃孵育2h后的菌液20μl分区划线接种于3-4个42℃预热的LB CM+的平板上。待菌液完全吸收后，倒置于42℃恒温培养箱中培养过夜。
用接种针挑取经42℃孵育的LB CM平板上生长的单菌落少许分区划线接种于一个新的42℃预热的LB CM平板上，42℃恒温培养箱中倒置培养10h。然后，用接种针分别挑取该LB CM平板上生长的单菌落少许，混于含50μl无菌水的EP管中，沸水煮10min，12,000rpm离心3min后，取上清15μl加入200μL PCR反应管中作为PCR鉴定模板。PCR反应体同何表13。
PCR反应条件如下：94℃、1min；88℃、4min；94℃、10sec，66℃、5min，25个循环；72℃、10min，4℃保存。取5μl产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定，PCR产物为两条带，其亮度相当，约500bp和2000bp左右的长度，证明已经发生了第一步同源重组，片断及质粒已经整合到基因组上。
4.6pKOV质粒与基因组分离并丢失
选取一株第一步同源重组成功的菌株于42℃孵育过夜培养的菌液50μl接种于30℃预热的5ml含5％蔗糖的LB培养液的试管中，于30℃，250rpm的恒温培养箱中振荡培养2h，然后分别取30℃孵育2h后的菌液进行十倍系列稀释，选取102、103、104三个稀释梯度的菌液各0.1ml分别涂布于30℃预热的含5％蔗糖的LB平板上。待菌液完全吸收后，倒置培养皿，30℃过夜。
4.6.1氯霉素(CM)平板的负筛选
用接种针挑取30℃、5％蔗糖LB平板上生长的单菌落，分区划线接种于一个LB CM平板和5％蔗糖LB平板上，30℃恒温培养箱中倒置培养过夜。
4.6.2基因敲入阳性菌株的PCR鉴定
挑取在5％蔗糖LB平板上生长，对应于CM/LB平板上不生长的单菌落做菌落PCR鉴定，PCR反应体系同表13，取5μl产物以1.0％的Agarose凝胶电泳鉴定，PCR产物约为2000bp的菌落初步证实为已经发生基因敲入的阳性菌落。分纯菌落，PCR进一步鉴定证实基因敲入成功。并置于-80℃保存，备用。
实施例5.生物检测菌株检测水体中重金属铅方法学的建立
5.1培养基的配制：
1g/L胰蛋白胨、0.5g/L酵母膏、1g/L NaCl，先加50ml MilliQ H2O，振荡至完全融解后加MilliQ H2O定容至80ml，高压蒸汽灭菌121℃，30min，再加入10ml 400mM无菌MOPSpH 7.2缓冲液，混匀。
5.2标准曲线的制定：
用移液枪吸取E.coli WMC-008p过夜菌种子液加入到50ml含终浓度为40mmol/L的MOPS新鲜按步骤5.1所配的LB液体培养基中，使起始菌液OD600值约为0.5-0.6，分装1ml/管，加入等体积不同浓度的Pb2+溶液至各管菌液，使其终浓度分别为0.05、0.25、0.50、1.00、5.00、7.50、10.00、12.50、15.00μmol/L，另加等体积无攻MilliQH2O作为阴性对照。每种浓度各做3个平行管。将以上菌液于37℃，250rpm振荡培养3h后，4,000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml DB中，稀释20倍后分别测量其稀释液荧光值与OD600值，实验结果为三次平行实验的平均值±SD值，得到的方程为y＝46.279x-97.972(R＝0.97)。
5.3样品检测：
用移液枪吸取E.coli WMC-008p过夜菌种子液加入到含有终浓度为40mM MOPS缓冲成分的LB培养基中，使起始菌液OD600值为0.5-0.6，分装至15×150mm规格的无菌试管1ml/管或康宁公司的96孔透明底黑色微孔板中，并在开始接菌时即加入1/1000-1/100体积不同浓度的Pb2+溶液或待检测环境水体样品，pH值范围为1.5-12.9，另加等体积无菌MilliQ H2O作为阴性对照，每种浓度或样品各做3个平行管或3个平行孔，37℃、250rpm振荡孵育3h，4,000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml DB中。为了使背景散射和内滤效应最小化，需要E.coli WMC-008p全细胞悬浮液的OD600≤0.2，故将重悬菌液稀释20倍，混匀，测量其稀释液荧光值，激发波长为550nm，发射波长为570nm，并测其OD600值。最后将测得的未知环境水体样品荧光强度值代入步骤5.2所得方程，计算得到未知环境水体样品中铅的浓度。
实施例6.本发明检测水体中重金属铅浓度的应用实例及方法学评估
6.1菌株E.coli WMC-008p检测工业废水标本中铅
从温州医科大学茶山校区附近某制鞋厂排污口处采集一个水样，经0.22μm的无菌过滤器过滤。用移液枪吸取E.coli WMC-008p过夜菌种子液加入到上述90mL新鲜LB液体培养基中，使起始菌液OD600值约为0.02，37℃，250rpm诱导至OD＝0.5-0.6，最优OD＝0.5，分装0.9ml/管，加入等体积不同浓度的Pb2+溶液至各管菌液，使其终浓度在10-9-10-5M/L之间取四个值，然后再分别加入100μL过滤后的水样至每管菌液，每种浓度各做3个平行管。将以上菌液于37℃，250rpm振荡培养3-5h，最优培养时间为5后，4,000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml Desalting buffer中，然后取50μL重悬菌液20倍稀释于0.95ml Desalting buffer中，混匀，分别测量其稀释液荧光值与OD600值。实验结果为三次独立实验的平均值±SD值，n＝3。
实验结果：E.coli WMC-008p对湖水中铅离子的回收率均在91％-109％之间。用该方法测定的结果与采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测定的结果相接近。说明E.coli WMC-008p具备客观检测实际水体中铅的含量的应用前景。
6.2强酸强碱标本对菌株E.coli WMC-008p检测结果的影响
用移液枪吸取E.coli WMC-008p过夜菌种子液加入到上述90ml新鲜LB液体培养基中，使起始菌液OD600值约为0.02，37℃，250rpm诱导至OD＝0.5-0.6时，分装0.9ml/管，分别加入100μl六种不同pH值0.5、1.5、6.0、12.9的样品，然后再分别加入等体积Pb2+溶液至各管菌液使其终浓度均一致，另加等体积无菌MilliQ H2O作为空白对照。每种pH值样品各做3个平行管。将以上菌液于37℃，250rpm振荡培养3-5h后，4,000rpm水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml Desalting buffer中，然后取50μl重悬菌液20倍稀释于0.95mlDesalting buffer中，混匀，分别测量其稀释液荧光值与OD600值。实验结果为三次独立实验的平均值±SD值，n＝3。
实验结果：E.coli WMC-008p对强酸强碱模拟标本中铅离子的回收率均在87％-116％之间。用该方法测定的结果与采用原子吸收光谱法(AAS)测定的结果相接近。说明E.coli WMC-008p具备客观检测水体中铅的含量而不受水体中强酸强碱的影响。
Claims (4)
1.一株大肠埃希氏菌WMC-008p的应用，其特征在于所述大肠埃希氏菌(Escherichia coli)WMC-010CGMCC No.9748应用于水体重金属铅的检测。
2.根据权利要求1所述的一株大肠埃希氏菌WMC-008p的应用，其特征在于所述的大肠埃希氏菌WMC-008p工程菌株的构建方法如下：
2.1权利要求1所述的大肠埃希菌工程菌株，其特征在于，利用Red重组酶系统中条件复制质粒pKD46和pCP20，敲除野生型大肠埃希菌E.coli MC4100基因组中zntA和zntR两个基因，构建△zntA△zntR双基因突变菌株。
2.2一种铅离子诱导的红色荧光蛋白报告元件，其特征在于，是一个由转录调节蛋白PbrR基因及其启动子PpbrA和该启动子与红色荧光蛋白DsRed-express2的融合片段相连接构建的表达元件，定位于大肠埃希菌的基因组。包括以下步骤：
2.2.1利用交叉PCR技术实现将人工合成pbrR基因及其启动子PpbrA片段和红色荧光基因DsRed-express2与PbrA基因启动子PpbrA相融合的融合报告基因PpbrA：：DsRed-express2片段相连接，形成最终片段PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2；
2.2.2将步骤2.2.1所得片段克隆到pMDTM19-T载体上，构建PpbrA-pbrR-PpbrA：；DsRed-express2-T重组载体；
2.2.3测序分析正确的重组载体PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2-T经sal I和Not I双酶切后的目的条带连接到pKOV载体上，构建打靶载体PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2-pKOV；
2.2.4将步骤2.2.3所得打靶载体转入△zntA△zntR双基因敲除菌株，打靶载体pKOV使PpbrA-pbrR-PpbrA：：DsRed-express2成功替换△zntA△zntR双基因敲除菌株基因组上zntA基因位置。
3.根据权利要求1所述的一株大肠埃希氏菌WMC-008p的应用，其特征在于所述大肠埃希氏菌WMC-008p检测水体中重金属铅的微生物方法，包含以下步骤：
3.1培养基的配制：
1g/L胰蛋白胨、0.5g/L酵母膏、1g/LNaCl，先加50ml MilliQ H2O，振荡至完全融解后加MilliQ H2O定容至80ml，高压蒸汽灭菌，再加入10ml400mM无菌MOPS缓冲液，混匀。
3.2标准曲线的制定：
把铅单元素标准品用无菌MilliQ级的纯水稀释成适当的浓度梯度。
3.2.1从步骤2.2.4获得的甘油保存菌E.coli WMC-008p菌株中取5-10μl接入步骤3.1配制的新鲜5ml LB培养基，37℃，250rpm过夜培养；
3.2.2取5-10μl步骤3.2.1的E.coli WMC-008p过夜菌加入到LB培养基中，37℃，250rpm，恒温震荡培养至OD600值在0.5-0.6，取90-900μl菌液分装至96孔透明底黑色微孔板或15×150mm规格的检测管内，同时在每个检测孔或检测管内加入铅离子使终浓度分别为0.05、0.25、0.50、1.00、5.00、7.50、10.00、12.50、15.00μmol/L，37℃、250rpm振荡孵育3-5h；
3.2.3将步骤3.2.2菌液4,000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml含500mM NaCl、20mM Tris-HCl、20μg/ml氯霉素、pH 8.0DB缓冲液中，制成菌悬液；
3.2.4将步骤3.2.3重悬菌液稀释20倍，使E.coli WMC-008p全细胞悬浮液的OD600≤0.2，混匀，分别测量其稀释液荧光值，激发波长为550nm，发射波长为570nm，并测其OD600值；
3.2.5数据处理：相对荧光值(Relative fluorescence unit，RFU)：RFUM＝FM/OD600M，FM为与铅单元素标准品孵育E.coli WMC-008p菌悬液的荧光值，OD600M为与铅单元素标准品孵育E.coli WMC-008p菌悬液的吸光度；RFUW＝FW/OD600W，FW为与MilliQ级纯水孵育E.coli WMC-008p菌悬液的背景荧光值，OD600W为与MilliQ级纯水孵育E.coli WMC-008p菌悬液的吸光度；绝对荧光值(Absolutee fluorescence unit，AFU)：AFU＝RFUM-RFUW，RFUM为与铅单元素标准品孵育E.coli WMC-008p菌悬液的相对荧光值，RFUW为与MilliQ级纯水孵育E.coli WMC-008p菌悬液的相对背景荧光值。
3.3样品检测：用移液枪吸取E.coli WMC-008p CGMCC No.9748过夜菌种子液加入到含有终浓度为40mM MOPS缓冲成分的LB培养基中，使起始菌液OD600值为0.5-0.6，分装至15×150mm规格的无菌试管或康宁公司的96孔透明底黑色微孔板中，并在开始接菌时即加入l/1000-1/100体积不同浓度的pb2+溶液或待检测环境水体样品，另加等体积无菌MilliQ H2O作为阴性对照，每种浓度或样品各做3个平行管或3个平行孔，37℃、250rpm振荡孵育3h，4,000rpm，水平离心10min，弃上清，收获的菌体重悬于1ml DB中，然后将重悬菌液稀释20倍，混匀，分别测量其稀释液在激发波长为550nm，发射波长为570nm条件下的荧光值与OD600值。然后将测得的未知环境水体样品荧光强度值代入上述步骤3.2所得方程，计算得到未知环境水体样品中铅的浓度。
4.权利要求1所述一株大肠埃希氏菌WMC-008p的应用，其特征在于大肠埃希氏菌WMC-008p检测菌株在检测环境水体中重金属铅的应用：在含有40mM MOPS缓冲成分的LB培养基中，E.coli WMC-008p菌株对水体样品的pH值具有较强的抗干扰能力，并能应用于环境水体样品中铅离子的检测。相对于原子吸收光谱法，E.coli WMC-008p菌株对pH值范围为1.5-12.9的水体样品中pb2+的加标回收率为91％-109％，对温州医科大学附近工业废水样品中pb2+的加标回收率为87％-116％。
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