DE4120303A1 - Verfahren zur zellporation und -fusion sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens - Google Patents
Verfahren zur zellporation und -fusion sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrensInfo
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M35/00—Means for application of stress for stimulating the growth of microorganisms or the generation of fermentation or metabolic products; Means for electroporation or cell fusion
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Description
Die Erfindung ist in der Gen- und Immuntechnik sowie in der
Biotechnologie anwendbar.
Bei den bekannten Zellfusions- und -porationsverfahren, zum
Beispiel: HUNTINGTON POTTER, Elektroporation in Biology,
Analyt. Biochemistry, 174, 361-373 (1988) sowie DE 35 05 147,
DD 2 85 993 und DD 2 85 992, gehört außer der Vorbereitung der
Proben auch die Kontrolle und eine Nachbehandlung (z. B.
Separation). Für diese Verfahrensschritte kann, insbesondere
bei adhärenten Zellen, kaum ein hoher Automatisierungsgrad
erreicht werden (LEDA RAPTIS, KELVIN L. FIRTH, Electroporation
of Adherent Cells In Situ, DNA and Cell Biology,
v. 9, Nr. 8, 1990). Ein nachträgliches Entfernen adhärenter
Zellen bringt Vitalitätsverluste und störende zusätzliche
undefinierte Zellmembranschäden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, häufige Gefäßwechsel,
für adhärente Zellen auch die enzymatische Ablösung, zu
vermeiden und die auf Multischalen oder Mikrotiterplatten
abgestimmte Automatisierung kommerzieller Geräte für die
notwendige Verfahrensschritte optimal zu nutzen.
Erfindungsgemäß werden die Zellkultureinsätze, die aus
zellverträglichem Material mit optisch durchlässiger poröser
Membran am Boden der Zellkultureinsätze, durch die ein
Austausch von Metaboliten stattfinden kann, benutzt. Der
Porenabstand und der Porendurchmesser ist klein gegenüber der
kleinsten Abmessung der Kulturzellen. Dadurch wird das
elektrische Feld zuverlässig und gleichmäßig an jede Zelle
angelegt. Für die Automatisierung ist es von Vorteil, daß in
mehrere Zellkultureinsätze mit unterschiedlichen oder gleichen
Zellproben und definiert gleich oder ungleich abgesenkte obere
Elektroden eingeführt werden.
Die optische Durchlässigkeit der porösen Membran erlaubt die
automatische Untersuchung und Auswertung des
Zellkultureinsatzinhaltes vor und nach der Behandlung mit dem
elektrischen Feld mit optischen Mitteln. Für adhärente Zellen
ist es günstig, eine mikroporöse Membran mit einer Porengröße
und einem Porenabstand von 0,3 µm bis 0,7 µm am Boden der
Zellkultureinsätze zu verwenden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der Vorrichtung ist es
wesentlich einfacher aus einer großen Anzahl von Zellen eine
kleine Anzahl immunspezifischer Zellen, die sich durch
spezielle Rezeptoren an der Membranoberfläche auszeichnen, zu
isolieren und zu fusionieren. Dieses geht besonders dann gut,
wenn Antigenmoleküle oder Antikörper mit der Membran gekoppelt
werden.
Zellinserts für Mikrotiterplatten der Firmen NUNC GmbH und
BECTON DICKENSON GmbH erfüllen diese Bedingungen
überraschenderweise sehr gut.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung besteht aus einer massiven
inerten/zellverträglichen unteren Elektrode (vorzugsweise aus
Edelstahl) mit einer oder mehreren kreisrunden Aussparungen
geringer Tiefe zur Aufnahme der Zellkultureinsätze. Der
elektrische Kontakt wird mit einem Zellkulturmedium in dieser
Aussparung hergestellt. Die Aussparung dient erfindungsgemäß
der Fixierung der Zellkultureinsätze.
Ein Isolierstück als Abstandshalter für die Zellkultureinsätze
befindet sich zwischen unterer Elektrode und oberer
Elektrodenhalterung. Diese ist demontierbar aufgesetzt, so daß
sich über jedem Zellkultureinsatz eine Schraube in der
Elektrodenhalterung mit zylinderförmigem Fortsatz aus
leitfähigem zellverträglichem Material befindet, die verstellbar
eingeschraubt ist.
Der zylinderförmige Fortsatz der Schrauben besitzt einen
Durchmesser von 1 bis 4 mm kleiner als der Innendurchmesser der
Zellkultureinsätze und vorn eine Abrundung auf einer Länge von
10 bis 30% des eigenen Durchmessers, wobei die Abrundung
kontinuierlich in den Zylindermantel übergeht (die
Flächennormale ändert ihre Richtung monoton). Entgegen der
Erwartung ist mit dieser einfachen Abrundung, eine über die
Fläche homogene Wirkung der elektrische Feldpulse zu
erreichen.
Der Abstand der Abrundung von der porösen Membran wird am
besten durch Abstandsscheiben zwischen Schraubenkopf und oberer
Elektrodenhalterung zu kleinen Werten begrenzt oder
reproduzierbar gemacht. Eine gesteuerte Verstellung einzelner
oder aller Schrauben in Abhängigkeit von der Leitfähigkeit
zwischen den Elektroden vor der Impulsbelastung ist für die
erfindungsgemäße Vorrichtung verwendbar. Hierbei würde ein
innerer Parameter der konkreter Probe im Zellkultureinsatz zur
Regelung verwendet werden.
Der entscheidende Vorteil der Vorrichtung ist die für die
Zellen belastungsfreie Überführungsmöglichkeit der
Zellkultureinsätze von und auf Mikrotiterplatten zur Vor- und
Nachbehandlung.
Claims (5)
1. Verfahren zur Zellporation und -fusion, bestehend aus der
Vorbereitung und Kontrolle der Zellen und
Zellsuspensionen, der Durchführung der Elektroporation oder
Elektrofusion und nachfolgenden Messung (Kontrolle) sowie
der Nachbehandlung,
dadurch gekennzeichnet,
daß Zellkultureinsätze, bestehend aus zellverträglichem
Material mit optisch durchlässiger poröser Membran am Boden
des Zellkultureinsatzes, durch die ein Austausch von
Metaboliten stattfinden kann, wobei der Porenabstand und der
Porendurchmesser klein gegenüber der kleinsten Abmessung der
Kulturzellen ist, verwendet werden.
2. Verfahren zur Zellporation und -fusion nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß als optisch durchlässige poröse Membran eine mikroporöse
Membran mit einer Porengröße und einem Porenabstand von
0,3 µm bis 0,7 µm am Boden des Zellkultureinsatzes verwendet
wird.
3. Verfahren zur Zellporation und -fusion nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß mehrere Zellkultureinsätze gleichzeitig mit identischen
oder verschiedenen Zellproben eingesetzt werden, wobei die
oberen Elektroden unterschiedlich tief in die
Zellkultureinsätze eingeführt werden.
4. Verfahren zur Zellporation und -fusion nach Anspruch 1 und 2,
dadurch gekennzeichnet,
daß als Zellkultureinsätze Zellkulturinserts für
Multischalen oder Mikrotiterplatten der Firmen NUNC GmbH und
BECTON DICKENSON GmbH verwendet werden.
5. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der
vorherigen Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß sich in einer massiven inerten/zellverträglichen unteren Elektrode eine oder mehrere kreisrunde Aussparungen geringer Tiefe zur Aufnahme der Zellkultureinsätze und einer geringen Menge des Zellkulturmediums sich befinden,
daß nach einem Isolierstück als Abstandshalter für die Zellkultureinsätze die obere Elektrodenhalterung demontierbar aufgesetzt ist, in der sich über jedem Zellkultureinsatz eine Schraube mit zylinderförmigem Fortsatz aus leitfähigem zellverträglichem Material verstellbar eingeschraubt ist, deren zylinderförmiger Fortsatz einen Durchmesser von 1 bis 4 mm kleiner als der Innendurchmesser der Zellkultureinsätze ist und der vorn eine Abrundung auf einer Länge von 10 bis 30% des eigenen Durchmessers besitzt, wobei die Abrundung kontinuierlich in den Zylindermantel übergeht (die Flächennormale ändert ihre Richtung monoton).
daß sich in einer massiven inerten/zellverträglichen unteren Elektrode eine oder mehrere kreisrunde Aussparungen geringer Tiefe zur Aufnahme der Zellkultureinsätze und einer geringen Menge des Zellkulturmediums sich befinden,
daß nach einem Isolierstück als Abstandshalter für die Zellkultureinsätze die obere Elektrodenhalterung demontierbar aufgesetzt ist, in der sich über jedem Zellkultureinsatz eine Schraube mit zylinderförmigem Fortsatz aus leitfähigem zellverträglichem Material verstellbar eingeschraubt ist, deren zylinderförmiger Fortsatz einen Durchmesser von 1 bis 4 mm kleiner als der Innendurchmesser der Zellkultureinsätze ist und der vorn eine Abrundung auf einer Länge von 10 bis 30% des eigenen Durchmessers besitzt, wobei die Abrundung kontinuierlich in den Zylindermantel übergeht (die Flächennormale ändert ihre Richtung monoton).
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19914120303 DE4120303A1 (de) | 1991-06-17 | 1991-06-17 | Verfahren zur zellporation und -fusion sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19914120303 DE4120303A1 (de) | 1991-06-17 | 1991-06-17 | Verfahren zur zellporation und -fusion sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DE4120303A1 true DE4120303A1 (de) | 1992-12-24 |
Family
ID=6434323
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE19914120303 Withdrawn DE4120303A1 (de) | 1991-06-17 | 1991-06-17 | Verfahren zur zellporation und -fusion sowie vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DE (1) | DE4120303A1 (de) |
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