CN101109006A - 内置微孔滤膜的连通式微生物培养装置及其培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了属于微生物的培养技术的一种内置微孔滤膜的连通式微生物培养装置及其培养方法，以及利用培养基对各种环境中的微生物进行培养、分离纯化，以及观察的技术。该培养装置是在皿体、皿体盖组成的内部空间放置隔板，在隔板上固定微孔滤膜，将培养装置内部空间分为两个空间，分别用于承载微生物培养基以及提供含微生物必须生长因子-微量化学物质的模拟外界环境介质，并允许滤膜两侧的溶解性物质自由交换、而细胞不能通透，从而可以更多地培养常规方法无法培养的微生物。应用该培养装置培养微生物能有效提高环境微生物的可培养性，方便实验系统的构建，操作简便省时，有较强的工业化应用的潜力。
Description
技术领域
本发明属于微生物的实验室培养技术，涉及一种内置微孔滤膜的连通式微生物培养装置及其培养方法。具体说，涉及提高微生物可培养性的新型的微生物培养装置的设计以及利用固体或半固体培养基对环境微生物进行培养、分离纯化以及观察的技术。
背景技术
长期以来，人们利用纯培养技术对环境中的微生物进行调查研究和开发利用。但是，研究表明自然界中绝大多数微生物尚不能被目前的纯培养技术所培养。主要原因是培养微生物的培养介质与微生物实际所在环境的介质差别很大，导致微生物在实验室中无法生长繁殖。具体表现为：
(1)采用偏离实际环境的高浓度营养培养基；
(2)培养基中缺乏微生物生长繁殖所必须的微量化学物质；
(3)忽视环境中各种微生物的相互影响，这包括微生物种间的偏利共生关系(Commersalism)和互惠共生关系(Mutualism)以及群落之间的群体感应(Quorum sensing)。
基于对以上微生物不可培养原因的认识，人们开始尝试多种方法试图培养原本不可培养的微生物。
有些学者在保留常规培养方法所使用的传统培养皿的基础上，改进了部分培养措施使得更多的微生物得到培养。例如，在培养基中加入过氧化氢降解物质或抗氧化剂以减少微生物代谢产生的毒性氧；加入微生物相互作用的信号分子以模拟微生物间的相互作用；以及供应新型的电子供体和受体等。尽管以上种种方法能够适当增加微生物的可培养性，但是这些添加物质的选定往往无法准确地反映自然环境中的全部情况，不能很好地解决常规培养方法的主要缺陷一难以模拟自然环境的真实状态，结果费时费力且改进效果不显著。
另一些学者完全摒弃常规培养装置和方法，改用新型的培养装置并开发新型的培养技术，试图从根本上解决常规培养方法的局限性，结果获得了较为显著的效果。
Button(1993)从概率论的角度提出一个崭新的方法-稀释培养法(Dilutionculture)，认为当把海水中微生物群体稀释至痕量时，在海水中主要存在的寡营养微生物可以不受少数几种优势微生物的竞争作用，因而主体寡营养微生物被培养的可能性会大大提高。随后，Schut(1993)等的实际操作验证了该理论的正确性。Connon(1992)在稀释培养法的基础上提出高通量培养法(High-throughputculturing)。将样品稀释至痕量后，采用小体积48孔细胞培养板分离培养微生物。该方法不仅提高微生物的可培养性，还可在短期内监测大量的培养物，大大提高了工作效率。但是，稀释培养法和高通量培养法没有考虑模拟原有的环境条件，也没有考虑微生物之间的相互关联，致使当微生物极度稀释、初始接种量很小时，一些微生物与其他关联微生物之间的联系被削略，很多微生物仍然不可培养。
此外，Zengler等(2002)将海水和土壤样品中的微生物先进行类似稀释培养法的稀释过程，然后乳化，部分微生物形成了仅含单个细胞的胶状微滴。然后将胶状微滴装入层析柱内，使培养液连续通过层析柱进行流态培养。层析柱进口端用0.1μm滤膜封住，防止细菌的进入而污染层析柱；出口端用8μm滤膜封住，允许培养产生的细胞随培养液流出。该方法的特点是让微生物在开放式培养液中生长，使培养环境接近于微生物的自然生长环境，能够很好地提高微生物可培养性，但是成本较高，不利于普及使用。
值得关注的是，一个首创性的微生物培养装置发表于2002年的Science期刊上，由Kaeberlein等设计用于培养潮间带底泥中的微生物，起名为扩散盒(Diffusion growth chamber)。扩散盒由一个环状的不锈钢垫圈和两侧胶连的0.1um滤膜组成，滤膜只能允许培养环境中的化学物质通过而不能让细胞通过。将底泥样品置于盒内的半固体培养基中，扩散盒放在置于鱼缸底部的天然海洋底泥上，往鱼缸内加入天然海水并保证扩散盒内存有一定空气供微生物生长。培养时，使天然海水循环流动，并不断注入新鲜的海水。培养1周后培养基上产生大量的微型菌落，数目高达接种微生物的40％。该方法相比于前述的各种方法，能较大程度地模拟微生物所处的自然环境。然而，扩散盒法只是对一种新型的培养装置及其方法的尝试，由于在培养过程中每个扩散盒均需手工用微孔滤膜封闭，致使操作繁琐，且不宜大规模的工业化生产，严重限制其市场化推广使用。
中国学者叶姜渝将扩散盒的基本原理应用到常规培养技术中，对传统的培养皿进行改进，申请了申请号为200410037037.8的专利“一种增强微生物可培养性的微孔滤膜近自然培养法及其装置”。该装置在传统培养皿上打孔，培养皿内衬一层至数层微孔滤膜，将培养皿置于适于被培养微生物生长的环境中进行培养。该装置相比于扩散盒，可以实现大规模的工业化生产，但由于人工打孔数量和面积的限制，使得内部微生物的培养介质和模拟外界环境的介质之间的微生物信息交流受到限制。并且，和扩散盒相同，两者均把微生物原位生长的环境介质置于培养装置之外，导致使用者在用该装置进行培养时需要自行构建适于待培养微生物生长的外界环境。此外，若待培养微生物需要用激光共聚焦显微镜进行细微观察时，培养皿底部需要专用的玻璃材质制成，而这两类培养装置均不能满足该要求，限制了其应用范围。
发明内容
本发明是为了克服目前微生物培养过程中采用的培养装置存在的缺点：1)待培养微生物与外界环境介质联系有限，无法很好地模拟微生物所在的环境条件；2)不能大规模工业化生产以及需自行构建，而提出的一种内置微孔滤膜的连通式微生物培养装置及其培养方法。其特征在于，所述内置微孔滤膜的连通式微生物培养装置包括在皿体、皿体盖组成的内部空间放置隔板，在隔板上固定微孔滤膜，将培养装置内部空间分为两个空间，分别用于承载微生物培养基以及提供含微生物必须生长因子-微量化学物质的模拟外界环境介质。
所述微孔滤膜选用选择性的通透微孔滤膜，用于连接上述两个空间。
所述滤膜的孔径大小以允许各种溶解性化学物质自由通过，而不允许微生物细胞通过为基本原则，因此可以保证待培养微生物从模拟外部环境介质中获得作为必须生长因子的微量化学物质。
所述滤膜采用的材料应具有无生物毒性、化学耐受性好，耐弱酸弱碱和亲水特性。
所述培养装置主体应采用透明塑料，并注塑成紧密接触式或旋开式的壁-盖结合结构，防止壁和盖之间漏液，使滤膜成为连接两种介质的唯一通道。该装置适于观察微生物生长。
所述培养装置所采用的培养基是以样品来源的环境载体为主要成分，并加入凝固剂形成的固体或半固体培养基。
所述滤膜和塑料之间粘结所使用的胶连剂也应有较强的化学耐受性且无生物毒性。
所述将培养装置底部原有的塑料材料换成0.17mm厚的特制玻璃，用于激光共聚焦显微镜观察。
所述培养装置的承载模拟外界环境介质的皿体盖上表面部分的外壁打孔，通过泵等设备与外界进行介质更换，使在培养过程中，不断被消耗的模拟外界环境的介质得到定时更新。
所述培养装置分为3种款式：按照微生物培养基在培养过程中的放置方式，分为正置式和倒置式；对于正置式培养装置，又按照微生物培养基和模拟外界环境介质的相对位置，又分为分格式和双层式。
一种内置微孔滤膜的连通式培养装置培养微生物的方法，包含以下步骤：
1)将培养基倒入已灭菌处理的培养装置中一个固定区域中，并使培养基冷却凝结；
2)在培养基上涂布待培养微生物菌液，或划线培养。
3)将皿盖小心地盖好在装有微孔滤膜的皿体上，防止漏液发生。
4)在培养装置的另一区域中加入模拟外界环境介质。该介质与待培养微生物来源的环境介质相同或者相近。
5)盖上组合培养装置的外层皿盖，按照常规微生物培养方法进行培养。
所述培养装置采用环氧乙烷灭菌方式灭菌。
所述若待培养微生物来源于水体，则将该水体作为模拟环境的主体介质加入；若待培养微生物来源于沉积物，则将适量该沉积物样品加入，然后再加入环境中沉积物上层的平衡水体，注意两种介质加入后需待沉积物自然沉积且稳定后方可进入下一步操作；若待培养微生物来源于土壤，则将适量该土壤样品适量加入，然后再加入用该土壤充分平衡过的灭菌盐水，注意两种介质加入后需待土壤自然沉降后方可进入下一步操作；若待培养微生物来源于活性污泥，则将该污泥样品按研究需要适度稀释后加入。
本发明的特点和积极效果：利用模拟微生物原有生长环境的原理，通过微孔滤膜将待培养微生物的培养介质与模拟外界环境的介质联系起来，可有效地提高微生物的可培养性。首次将两种介质同时纳入到培养装置中，培养装置可预先装配，且使用材质和加工方式价格低廉，使得其具有大规模工业化生产的潜力。培养装置内部的培养介质可随时更换，保持适于微生物培养的状态。可利用激光共聚焦显微镜等对培养中的微生物进行原位观察根据不同研究的需要。该培养装置设计为3种不同的款式。
附图说明
图1为分格式微生物培养装置结构示意图。
图2为双层式微生物培养装置结构示意图。
图3a为倒置式微生物培养装置结构示意图，图3b为倒置式微生物培养装置中培养基和模拟外界环境的介质放置示意图。
具体实施方式
本发明提出一种内置微孔滤膜的连通式微生物培养装置及其培养方法，例举三种来源不同环境(水体、沉积物、土壤)的样品进行原位微生物的培养，结合培养装置的3种不同款式附图分别作进一步说明。首先说明，各实施例的待分离微生物是环境样品而不是实验室人工配制的微生物群落，无法预先了解环境样品中所含的微生物类别，只能以环境样品来源进行原位微生物培养。
实施例一
对于来源于水体环境的微生物样品采用内置微孔滤膜的连通式微生物培养装置进行培养。
图1所示为分格式微生物培养装置结构示意图。其中皿盖1同传统培养皿，倒扣于皿体2上，将培养装置内部同外界隔离，保持内部无杂菌污染；隔板3放置在皿体2内部空间，在隔板3上固定微孔滤膜4，将培养皿皿体2内部空间分为两部分，一部分承载待分离微生物的培养基。另一部分承载模拟外界环境的介质，并对琼脂培养基起到支持作用，隔板3的材料同皿体2和皿盖1，制作时和皿体2连为一体；微孔滤膜4为两种介质间化学物质的传递提供通道。培养时，用样品来源的水体作为微生物培养基主体成分，另含有1.5％(w/v)琼脂。将培养基倒入培养皿皿体内承载培养基的空间内，待培养基冷却凝结。在培养基上加入待培养微生物菌液涂布，或划线培养。样品来源的水体作为模拟外界环境的介质，置于培养皿皿体内承载模拟外界环境的介质。将皿盖盖上后培养。
相比于其它两种组合培养装置，分格式培养皿设计尺寸可达到最小，便于实验操作，转移和携带；结构最简单，易于制作，适合大规模工业化生产。但是，培养微生物的有效区域为半圆状，对于涂布培养微生物容易产生死角，造成涂布不均；可有效利用的微孔滤膜面积在三种培养皿中最小；为正置培养，容易污染杂菌。
图2所示为双层式微生物培养装置结构示意图，与分格式培养装置皿体内的两种介质分布方式不同，其中内皿体由中间的环形隔板203分为内外两层。内层皿体201的培养基放置区域206承载待分离微生物的培养基，外层皿体202的模拟外界环境的介质放置区域207承载模拟外界环境的介质。内层皿体和外层皿体连为一体，共同使用一个皿底。内层皿盖203通过强开或旋开方式紧密结合于内层皿体201上。微孔滤膜204胶连在内层皿盖203表面，为两种介质间化学物质的传递提供通道。外层皿盖205倒扣于外层皿体202上，将培养装置内部同外界隔离，保持内部无杂菌污染。培养时，用样品来源的水体作为微生物培养基主体成分，另含有1.5％(w/v)琼脂。将培养基倒入内层皿体201内，待培养基冷却凝结。在培养基上加入待培养微生物菌液涂布，或划线培养。然后盖上/旋上内层皿盖203，使内层皿体内部空间与外界隔离，仅通过微孔滤膜204连通。样品来源的水体作为模拟外界环境的介质，加入在外层皿体202内，将外层皿盖205盖上后培养。注意该介质液面应完全漫过内层皿盖203，以便能通过微孔滤膜204自然渗入内层皿体201内，与培养基接触。
相比于分格式培养皿，双层式培养皿中内置的微孔滤膜占据内层皿盖，可有效利用的微孔滤膜面积较大，使得两种培养介质交换通量较大；微生物培养基成圆形，便于涂布操作。但是，该培养装置体积较大，操作较为繁琐；也为正置培养，容易污染杂菌。
图3a为倒置式微生物培养装置结构示意图，图3b为倒置式微生物培养装置中培养基和模拟外界环境的介质放置示意图。其中内层皿体301的培养基放置区域306承载待分离微生物的培养基308，培养时倒置，皿体301外壁装有接合孔可与外层皿盖305卡合。内层皿盖302通过强开或旋开方式紧密结合在内层皿体301上。微孔滤膜303胶连在内层皿盖302表面，为两种介质间化学物质的传递提供通道。外层皿体304的模拟外界环境的介质放置区域307承载模拟外界环境的介质309，培养时正置。外层皿盖305通过强开或旋开方式紧密结合在外层皿体304上，内表面设有突起的把手通过与内层皿体301的接合孔插接而将其与内层皿体301卡合。该皿盖设计为强开/旋开式，是为了防止外层皿体承载的液体培养介质施加的浮力作用使其漂浮。培养时，用样品来源的水体作为微生物培养基主体成分，另含有1.5％(w/v)琼脂。将培养基倒入内层皿体302的培养基放置区域306内，待培养基冷却凝结。在培养基308上加入待培养微生物菌液涂布，或划线培养。然后盖上/旋上内层皿盖302，使内层皿体内部与外界隔离，仅通过微孔滤膜连通。样品来源的水体作为模拟外界环境的介质309，加入在外层皿体304的模拟外界环境的介质放置区域307内。将内层皿体301倒置并卡合在外层皿盖304上，再将外层皿盖305盖上/旋上，使外层培养皿空间与外界隔离，然后进行培养。注意外层培养介质的液面应完全浸没内层培养基。此外，需要在向外层皿体304的模拟外界环境的介质放置区域307内倒入模拟外界环境的介质309，且盖上外层皿盖305后，将整个培养装置轻微晃动，使得内层皿体301内残存的气泡排净。该操作要求外层皿体304必须达到适当最小高度，使得培养装置在轻微晃动时不会破坏内部培养环境的稳定性。
相比于前两种培养装置，倒置式微生物培养装置较笨重，操作不便。但是，其为倒置培养，可有效减少污染杂菌的可能性；将两种培养介质分离开来，分别置于不同的装置上，便于在定期更换外部模拟环境介质时减少内部培养基污染杂菌的可能性。此外，仅需要更换内层培养皿，外层培养皿和两个皿盖均可反复利用，具有较大的潜力用于大规模工业化生产。
实施例二
对于来源于沉积物环境的微生物样品采用内置微孔滤膜的连通式微生物培养装置进行培养。
使用分格式微生物培养装置进行培养时，用样品来源的沉积物上层的平衡水体作为微生物培养基主体成分，另含有1.5％(w/v)琼脂、1g/L蛋白胨和0.2g/L酵母膏。将培养基倒入培养皿皿体内承载培养基的空间内，待培养基冷却凝结。在培养基上加入待培养微生物菌液涂布，或划线培养。样品来源的沉积物上层的平衡水体加入适量的该沉积物，作为模拟外界环境的介质，置于培养皿皿体内承载模拟外界环境的介质。待沉积物自然沉积在底部且稳定后，将皿盖盖上后培养。
使用双层式微生物培养装置进行培养时，用样品来源的沉积物上层的平衡水体作为微生物培养基主体成分，另含有1.5％(w/v)琼脂、1g/L蛋白胨和0.2g/L酵母膏。将培养基倒入内层皿体，待培养基冷却凝结。在培养基上加入待培养微生物菌液涂布，或划线培养。然后盖上/旋上内层皿盖，使内层皿体内部空间与外界隔离，仅通过微孔滤膜连通。样品来源的沉积物上层的平衡水体加入适量的该沉积物，作为模拟外界环境的介质，加入在外层皿体。待沉积物自然沉积在底部且稳定后，将外层皿盖盖上后培养。
使用倒置式微生物培养装置进行培养时，用样品来源的沉积物上层的平衡水体作为微生物培养基主体成分，另含有1.5％(w/v)琼脂、1g/L蛋白胨和0.2g/L酵母膏。将培养基倒入内层皿体，待培养基冷却凝结。在培养基上加入待培养微生物菌液涂布，或划线培养。然后盖上/旋上内层皿盖，使内层皿体内部与外界隔离，仅通过微孔滤膜连通。样品来源的沉积物上层的平衡水体加入适量的该沉积物，作为模拟外界环境的介质，加入在外层皿体。待沉积物自然沉积在底部且稳定后，将内层皿体倒置并卡合在外层皿盖上，再将外层皿盖盖上/旋上，进行培养。
实施例三
对于来源于土壤环境的微生物样品采用内置微孔滤膜的连通式微生物培养装置进行培养。
使用分格式微生物培养装置进行培养时，用样品来源的土壤充分平衡的灭菌盐水(0.9％NaCl)作为微生物培养基主体成分，另含有1.5％(w/v)琼脂、1g/L蛋白胨和0.2g/L酵母膏。将培养基倒入培养皿皿体内承载培养基的空间内，待培养基冷却凝结。在培养基上加入待培养微生物菌液涂布，或划线培养。用样品来源的土壤充分平衡过的灭菌盐水加入适量的该土壤，作为模拟外界环境的介质，置于培养皿皿体内承载模拟外界环境的介质。待土壤自然沉积在底部且稳定后，将皿盖盖上后培养。
使用双层式微生物培养装置进行培养时，用样品来源的土壤充分平衡的灭菌盐水(0.9％NaCl)作为微生物培养基主体成分，另含有1.5％(w/v)琼脂、1g/L蛋白胨和0.2g/L酵母膏。将培养基倒入内层皿体，待培养基冷却凝结。在培养基上加入待培养微生物菌液涂布，或划线培养。然后盖上/旋上内层皿盖，使内层皿体内部空间与外界隔离，仅通过微孔滤膜连通。用样品来源的土壤充分平衡过的灭菌盐水加入适量的该土壤，作为模拟外界环境的介质，加入在外层皿体。待土壤自然沉积在底部且稳定后，将外层皿盖盖上后培养。
使用倒置式微生物培养装置进行培养时，用样品来源的土壤充分平衡的灭菌盐水(0.9％NaCl)作为微生物培养基主体成分，另含有1.5％(w/v)琼脂、1g/L蛋白胨和0.2g/L酵母膏。将培养基倒入内层皿体，待培养基冷却凝结。在培养基上加入待培养微生物菌液涂布，或划线培养。然后盖上/旋上内层皿盖，使内层皿体内部与外界隔离，仅通过微孔滤膜连通。用样品来源的土壤充分平衡过的灭菌盐水加入适量的该土壤，作为模拟外界环境的介质，加入在外层皿体。将内层皿体倒置并卡合在外层皿盖上。待土壤自然沉积在底部且稳定后，再将外层皿盖盖上/旋上，进行培养。
Claims (13)
1.一种内置微孔滤膜的连通式微生物培养装置，其特征在于，所述内置微孔滤膜的连通式微生物培养装置包括在皿体、皿体盖组成的内部空间放置隔板，在隔板上固定微孔滤膜，将培养装置内部空间分为两个空间，分别用于承载微生物培养基以及提供含微生物必须生长因子-微量化学物质的模拟外界环境介质。
2.根据权利要求1所述内置微孔滤膜的连通式微生物培养装置，其特征在于，所述微孔滤膜选用选择性的通透微孔滤膜，用于连接上述两个空间。
3.根据权利要求1或2所述内置微孔滤膜的连通式微生物培养装置，其特征在于，所述微孔滤膜的孔径大小以允许各种溶解性化学物质自由通过，而不允许微生物细胞通过为基准，因此可以保证待培养微生物从模拟外部环境介质中获得作为必须生长因子的微量化学物质。
4.根据权利要求1或2所述内置微孔滤膜的连通式微生物培养装置，其特征在于，所述微孔滤膜采用的材料应具有无生物毒性、化学耐受性好，耐弱酸弱碱和亲水特性。
5.根据权利要求1所述内置微孔滤膜的连通式微生物培养装置，其特征在于，所述培养装置主体应采用透明塑料，并注塑成紧密接触式或旋开式的壁-盖结合结构，防止壁和盖之间漏液，使滤膜成为连接两种介质的唯一通道，该装置适于观察微生物生长。
6.根据权利要求1所述内置微孔滤膜的连通式微生物培养装置，其特征在于，所采用的培养基是以样品来源的环境载体为主要成分，并加入凝固剂形成的固体或半固体培养基。
7.根据权利要求1所述内置微孔滤膜的连通式微生物培养装置，其特征在于，所述微孔滤膜和塑料之间粘结所使用的胶连剂应有较强的化学耐受性且无生物毒性。
8.根据权利要求1所述内置微孔滤膜的连通式微生物培养装置，其特征在于，将皿体底部原有的塑料材料换成0.17mm厚的特制玻璃，用于激光共聚焦显微镜观察。
9.根据权利要求1所述内置微孔滤膜的连通式微生物培养装置，其特征在于，所述培养装置的承载模拟外界环境介质的皿体盖上表面壁打孔，通过泵等设备与外界进行介质更换，使在培养过程中，不断被消耗的模拟外界环境的介质得到定时更新。
10.根据权利要求1所述内置微孔滤膜的连通式微生物培养装置，其特征在于，所述培养装置分为3种款式：按照微生物培养基在培养过程中的放置方式，分为正置式和倒置式；对于正置式培养装置，又按照微生物培养基和模拟外界环境介质的相对位置，分为分格式和双层式。
11.一种内置微孔滤膜的连通式微生物培养装置培养微生物的方法，包含以下步骤：
1)将培养基倒入已灭菌处理的培养装置中皿体的一个固定区域中，并使培养基冷却凝结；
2)在培养基上涂布待培养微生物菌液，或划线培养；
3)将皿盖小心地盖好在装有微孔滤膜的皿体上，防止漏液发生；
4)在皿体的另一区域中加入模拟外界环境介质，该介质与待培养微生物来源的环境介质相同或者相近。
12.根据权利要求11所述内置微孔滤膜的连通式微生物培养装置培养微生物的方法，其特征在于，所述培养装置采用环氧乙烷灭菌方式灭菌。
13.根据权利要求11所述内置微孔滤膜的连通式微生物培养装置培养微生物的方法，其特征在于，若待培养微生物来源于水体，则将该水体作为模拟环境的主体介质加入；若待培养微生物来源于沉积物，则将适量该沉积物样品加入，然后再加入环境中沉积物上层的平衡水体，注意两种介质加入后需待沉积物自然沉积且稳定后方可进入下一步操作；若待培养微生物来源于土壤，则将适量该土壤样品适量加入，然后再加入用该土壤充分平衡过的灭菌盐水，注意两种介质加入后需待土壤自然沉降后方可进入下一步操作；若待培养微生物来源于活性污泥，则将该污泥样品按研究需要适度稀释后加入。
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