CN108715811B - 河流底泥表层水体中微生物的富集培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于水体微生物培养技术领域，具体涉及一种河流底泥表层水体中微生物的富集培养方法，该方法使用富集装置进行富集培养，富集装置包括由外到内依次套设的外培盒、营养管和培养袋，外培盒盛放富集培养的液体培养基；营养管的内管壁、外管壁之间盛放河流底泥；培养袋盛放待富集培养的河流底泥表层水体样本；富集培养结束后，取出培养袋，浸泡于缓冲液中浸泡后取出培养袋，培养袋内液体为富集培养物。本发明的外培盒液体培养基、河流底泥中的营养物质可顺利通过流入培养袋内，而富集培养后的菌体在培养袋的阻隔下均保留在培养袋内，富集培养时保留了微生物原始生长环境，提高了微生物的生长量和存活率。
Description
技术领域
本发明属于水体微生物培养技术领域，具体涉及一种河流底泥表层水体中微生物的富集培养方法。
背景技术
河流底泥是河流的沉积物，是自然水域的重要组成部分。底泥及水体中含有种类丰富的微生物，比如有分解有机物的细菌。当水域受到污染后，水中的部分污染物可通过沉淀或者颗粒物吸附而存留在底泥中，而水体中的一些细菌可通过分解有机物为小分子产物来影响和调节水体环境，实现水体的净化。因此，研究河流底泥表层水体微生物群落结构及其对应的微生物的生理功能，筛选具有特定生理功能的微生物菌种，对改善河流生态系统具有重要的环境意义。
寇文伯等人研究了鄱阳湖湖泊细菌群落组成及结构，其分别提取了表层水体浮游和底泥微生物基因组DNA，利用454高通量测序技术对细菌的16S rRNA基因进行了序列测定，分析了湖泊底泥细菌、表层水体浮游细菌群落结构特征，结果显示，底泥细菌群落比表层水体更佳多样化。但是由于底泥存在土壤、腐殖酸等多种有机质，造成DNA提取以及微生物分离培养、筛选的困难。而底泥表层水体中既包含了部分底泥颗粒、微生物，又包含了水中的大量微生物等，所以可作为理想的研究对象。
然而，由于不同微生物在水体中的含量不同，即使通过选择底泥表层水体的方式来减少底泥对微生物分离培养、筛选等工作造成的影响，但是仍然无法避免微生物本身数量的限制，因此开发一种河流底泥表层水体中微生物的富集培养方法尤为必要。
现有技术中，微生物富集培养通常采取的措施是将水体样本置于特定配方的选择培养基中培养，富集过程中摒弃了原有的水体环境。然而，在我们筛选未知菌种时，无法明确未知菌种的最适培养基配方到底是什么，因此最大限度的保留为微生物的原始生长环境最有利于其存活。所以现有技术存在的问题是，缺乏一种能够保留微生物原始生长环境的富集培养方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种河流底泥表层水体中微生物的富集培养方法，再富集培养时保留了微生物原始生长环境，提高了微生物的生长量，有利于新菌株的分离筛选。
本发明提供了一种河流底泥表层水体中微生物的富集培养方法，使用富集装置进行富集培养，所述富集装置包括由外到内依次套设的外培盒、营养管和培养袋，所述外培盒的上端和下端均设有液体流通口，所述营养管为双层套管，双层套管的内管壁、外管壁上均开设有若干过滤孔；所述外培盒用于盛放富集培养的液体培养基；所述双层套管的内管壁、外管壁之间用于盛放河流底泥，且所述双层套管上的过滤孔不允许沙子通过，但允许无机盐和氨基酸通过；所述培养袋用于盛放待富集培养的河流底泥表层水体样本，且所述培养袋不允许微生物细胞通过，但允许无机盐和氨基酸通过；富集培养结束后，取出培养袋，浸泡于缓冲液中，每1～4h换缓冲液一次，2～4次后取出培养袋，培养袋内液体为富集培养物。
优选的，上述河流底泥表层水体中微生物的富集培养方法，所述河流底泥是与所述河流底泥表层水体处于同一水域的底泥。
优选的，上述河流底泥表层水体中微生物的富集培养方法，所述河流底泥与待富集培养的所述河流底泥表层水体的水平距离≤50m。
优选的，上述河流底泥表层水体中微生物的富集培养方法，所述营养管由两个直径不同的透析袋套设而成，且所述透析袋的截留分子量为900～1000KD；或者所述营养管由两个直径不同的过滤袋套设而成，且所述过滤套的滤孔直径在0.5～3mm。
优选的，上述河流底泥表层水体中微生物的富集培养方法，所述培养袋为滤孔直径在0.01～0.2μm的微滤袋。
与现有技术相比，本发明提供的一种河流底泥表层水体中微生物的富集培养方法，具有以下有益效果：
本发明利用一般微生物繁殖所需营养物质，比如无机盐、微量元素等分子量或者粒径都小于微生物细胞粒径的原理，采用特殊结构的富集装置进行培养，外培盒用于盛放富集培养的液体培养基；双层套管的内、外管壁之间用于盛放河流底泥，且双层套管上的过滤孔不允许沙子通过，但允许无机盐、氨基酸和其他营养物质通过，沙子对底泥有阻挡和吸附效果，可减缓底泥的流失；培养袋用于盛放待富集培养的河流底泥表层水体样本，且培养袋不允许微生物细胞通过，但允许无机盐、氨基酸和其他营养物质通过。这样外培盒液体培养基中的无机盐等小分子营养物质可顺利通过双层套管及培养袋，河流底泥中本身含有的营养物质或者微生物代谢产物也可流入培养袋内，而富集培养后的菌体在培养袋的阻隔下均保留在培养袋内。营养物质的流入保证微生物的繁殖，从而，富集培养时保留了微生物原始生长环境，经试验证明，利用本发明的富集培养装置进行富集培养，每天每升培养基中固氮细菌和反硝化细菌等的菌体质量显著增加。
液体流通口的设置，可使外培盒中液体培养基流动起来，便于及时补充新的培养基，排出旧的培养基，实现连续富集培养。富集培养结束后，取出培养袋浸泡于缓冲液中，是为了将原培养袋内的无机盐等代谢物和原始样本残留物质透析出，培养袋内只剩下菌体和缓冲液，可直接用于DNA提取、分离筛选培养等步骤，避免菌体代谢物或者原始样本残留物对后续实验的影响，提高后续实验的成功率。
附图说明
图1是本发明中富集装置的结构示意图。
附图标记说明：1.外培盒，11.液体流通口，2.营养管，3.培养袋。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，未注明的实验材料来源均为市售，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。
本发明提供了一种河流底泥表层水体中微生物的富集培养方法，使用富集装置进行富集培养，所述富集装置的结构如图1所示，包括由外到内依次套设的外培盒1、营养管2和培养袋3，所述外培盒1的上端和下端均设有液体流通口11，所述营养管2为双层套管，双层套管的内管壁、外管壁上均开设有若干过滤孔；所述外培盒1用于盛放富集培养的液体培养基；所述双层套管的内管壁、外管壁之间用于盛放河流底泥，且所述双层套管上的过滤孔不允许沙子通过，但允许无机盐和氨基酸通过；所述培养袋3用于盛放待富集培养的河流底泥表层水体样本，且所述培养袋3不允许微生物细胞通过，但允许无机盐和氨基酸通过；富集培养结束后，取出培养袋3，浸泡于缓冲液中，每1～4h换缓冲液一次，2～4次后取出培养袋3，此时的培养袋3内液体为富集培养物。所述营养管2由两个直径不同的透析袋套设而成，且所述透析袋的截留分子量为900～1000KD；或者所述营养管2由两个直径不同的过滤袋套设而成，且所述过滤套的滤孔直径在0.5～3mm。所述培养袋3为滤孔直径在0.01～0.2μm的微滤袋。
具体包括以下实施例。
实施例1
一种河流底泥表层水体中微生物的富集培养方法，使用富集装置进行富集培养，所述富集装置包括由外到内依次套设的外培盒1、营养管2和培养袋3，所述外培盒1的上端和下端均设有液体流通口11，所述营养管2为双层套管，双层套管的内管壁、外管壁上均开设有若干过滤孔；所述外培盒1用于盛放富集培养的液体培养基；所述双层套管的内管壁、外管壁之间用于盛放河流底泥，且所述双层套管上的过滤孔不允许沙子通过，但允许无机盐、氨基酸以及蛋白质等其他营养物质通过；所述培养袋3用于盛放待富集培养的河流底泥表层水体样本，且所述培养袋3不允许微生物细胞通过，但允许无机盐、氨基酸以及蛋白质等其他营养物质通过；本实施例中，营养管2和培养袋3的内管紧密贴合；富集培养结束后，取出培养袋3，浸泡于缓冲液中，缓冲液为蒸馏水，每4h换缓冲液一次，2次后取出培养袋3，此时收集培养袋3内液体，得到富集培养物。其中，所述营养管2由两个直径不同的透析袋套设而成，且所述透析袋的截留分子量为1000KD，允许小分子通过，不允许微生物细胞和小颗粒泥沙通过。
实施例2
一种河流底泥表层水体中微生物的富集培养方法，与实施例1的方法基本相同，区别在于所述营养管2由两个直径不同的过滤袋套设而成，且所述过滤套的滤孔直径在2mm，允许小分子和微生物细胞通过，不允许小颗粒泥沙通过；富集培养结束后，取出培养袋3，浸泡于缓冲液中，缓冲液为0.1mol/L、pH6.8的PBS缓冲液，每1h换缓冲液一次，4次后取出培养袋3，收集培养袋3内液体得到富集培养物。
实施例3
一种河流底泥表层水体中微生物的富集培养方法，与实施例1的方法基本相同，区别在于所述营养管2由两个直径不同的过滤袋套设而成，且所述过滤套的滤孔直径在3mm，允许小分子和微生物细胞通过，不允许小颗粒泥沙通过；富集培养结束后，取出培养袋3，浸泡于缓冲液中，缓冲液为双蒸水，每1h换缓冲液一次，4次后取出培养袋3，收集培养袋3内液体得到富集培养物。需要说明的是，本实施例中，营养管2和培养袋3的内管之间的间隙填充富集培养的液体培养基。
下面我们以具体细菌的培养方法为例，说明本发明的效果。下述实验中所所用河流底泥表层水体样本来自同一鄱阳湖水域区，分成若干小份后采用不同方式进行微生物的富集培养。
一、不同培养装置对富集培养的影响
对比例1
采用250ml三角瓶作为培养装置，取待富集培养的河流底泥表层水体样本，富集培养的目标菌为固氮细菌的，所用液体培养基为常规不含氮的培养基；富集培养的目标菌为反硝化细菌的，向牛肉膏蛋白胨培养基添加氨氮，并使其浓度达500mg/L，且其中亚硝氮占总氮东都的80％。连续培养10天。固氮细菌平均每天每升培养基中菌体质量增加0.058g。反硝化细菌平均每天每升培养基中菌体质量增加0.061g。
对比例2
采用250ml三角瓶作为培养装置，取待富集培养的河流底泥表层水体样本，所用液体培养基为常规营养肉汤培养基，连续培养5天。对富集培养后的液体提取DNA，然后利用454高通量测序技术对细菌的16S rRNA基因进行了序列测定，分析了细菌群落结构，结果显示，共检出细菌类13门，134属。
实验组1
采用实施例1的富集装置进行富集培养，富集培养的目标菌为固氮细菌的，所用液体培养基为常规不含氮的培养基；富集培养的目标菌为反硝化细菌的，向牛肉膏蛋白胨培养基添加氨氮，并使其浓度达500mg/L，且其中亚硝氮占总氮东都的80％。所述双层套管的内、外管壁之间用于盛放的河流底泥来自待富集培养水体样本的正下方。连续培养10天。
固氮细菌平均每天每升培养基中菌体质量增加0.512g。反硝化细菌平均每天每升培养基中菌体质量增加0.523g。
实验组2
采用实施例2的富集装置进行富集培养，所用液体培养基为常规不含氮的培养基；富集培养的目标菌为反硝化细菌的，向牛肉膏蛋白胨培养基添加氨氮，并使其浓度达500mg/L，且其中亚硝氮占总氮东都的80％。所述双层套管的内、外管壁之间用于盛放的河流底泥来自待富集培养水体样本的正下方。
固氮细菌平均每天每升培养基中菌体质量增加0.526g。反硝化细菌平均每天每升培养基中菌体质量增加0.554g。
实验组3
所用液体培养基为常规营养肉汤培养基，其余操作同实验组1，连续培养5天。对富集培养后的液体提取DNA，然后利用454高通量测序技术对细菌的16S rRNA基因进行了序列测定，分析了细菌群落结构，结果显示，共检出细菌类17门，158属。而直接取河流底泥表层水体样本利用454高通量测序技术对细菌的16S rRNA基因进行了序列测定，分析了细菌群落结构，结果显示，共检出细菌类17门，165属。
本实验证明，本发明所用富集装置可有效提高固氮细菌和反硝化细菌的生物量，可有效保留细菌的种类多样性。
二、不同区域河流底泥对富集培养的影响
对比例3
本对比例的操作与实验组1基本相同，区别在于，所用河流底泥与实验组1来自不同的河流。最后测得固氮细菌平均每天每升培养基中菌体质量增加0.413g；反硝化细菌平均每天每升培养基中菌体质量增加0.407g。
三、不同水域面积范围对富集培养的影响
对比例4
本对比例的操作与实验组1基本相同，区别在于，所用河流底泥与实验组1来自同一河流，但是与水体样本水平距离50m。最后测得固氮细菌平均每天每升培养基中菌体质量增加0.505g；反硝化细菌平均每天每升培养基中菌体质量增加0.510g。
对比例5
本对比例的操作与实验组1基本相同，区别在于，所用河流底泥与实验组1来自同一河流，但是与水体样本水平距离100m。最后测得固氮细菌平均每天每升培养基中菌体质量增加0.434g；反硝化细菌平均每天每升培养基中菌体质量增加0.438g。
对比例6
本对比例的操作与实验组1基本相同，区别在于，所用河流底泥与实验组1来自同一河流，但是与水体样本水平距离200m。最后测得固氮细菌平均每天每升培养基中菌体质量增加0.301g；反硝化细菌平均每天每升培养基中菌体质量增加0.305g。
本实验证明，不同河流及不同区域河流底泥的添加对富集培养也具有影响，以位于待富集培养水体正下方的底泥为最佳。
需要说明的是，本发明中涉及数值范围时，应理解为每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用，由于采用的步骤方法与实施例相同，为了防止赘述，本发明描述了优选的实施例。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (1)
1.一种河流底泥表层水体中微生物的富集培养方法，其特征在于，使用富集装置进行富集培养，所述富集装置包括由外到内依次套设的外培盒(1)、营养管(2)和培养袋(3)，所述外培盒(1)的上端和下端均设有液体流通口(11)，所述营养管(2)为双层套管，双层套管的内管壁、外管壁上均开设有若干过滤孔；所述外培盒(1)用于盛放富集培养的液体培养基；所述双层套管的内管壁、外管壁之间用于盛放河流底泥，且所述双层套管上的过滤孔不允许沙子通过，但允许无机盐和氨基酸通过；所述培养袋(3)用于盛放待富集培养的河流底泥表层水体样本，且所述培养袋(3)不允许微生物细胞通过，但允许无机盐和氨基酸通过；富集培养结束后，取出培养袋(3)，浸泡于缓冲液中，每1～4h换缓冲液一次，2～4次后取出培养袋(3)，培养袋(3)内液体为富集培养物；
所述河流底泥是与所述河流底泥表层水体处于同一水域的底泥；
所述河流底泥与待富集培养的所述河流底泥表层水体的水平距离≤50m；
所述营养管(2)由两个直径不同的透析袋套设而成，且所述透析袋的截留分子量为900～1000KD；或者所述营养管(2)由两个直径不同的过滤袋套设而成，且所述过滤套的滤孔直径在0.5～3mm；
所述培养袋(3)为滤孔直径在0.01～0.2μm的微滤袋。
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