CN1056645C - 净化渗析器、生物反应器及膜 - Google Patents

Abstract

本发明提供可用作在渗析中减少溶质分子回滤和在膜生物反应器中改进营养物供应和产物回收的单向或净化膜的双表皮膜，所述膜为优选为中空纤维形式的双表皮聚合物材料，膜在相对各侧上具有对于各种溶质各异的透过性和筛分系数特性的聚合物表皮。各侧表皮具有在10,000倍放大倍数下不可见的孔，所述表皮之间的微孔结构含有能够以增高的浓度将分子量范围约5000～200,000的溶质阻留在内、外表面之间的小孔，采用多束中空纤维膜作为具有净化性能的渗析装置构成改进的渗析装置。

Description

净化渗析器、生物反应器及膜

                    发明的技术领域

本发明涉及流体过滤装置，例如血液渗析装置和生物反应器以及用于这类装置的膜。更具体地说，本发明涉及一种具有净化过滤性能的改进的渗析装置、用于进行这种渗析及其它过滤步骤的双表皮膜。本申请是我们在1992年1月10日提交的共同未决申请(申请号07/818,815)的部分继续申请。

                      发明背景

渗析膜和渗析装置在用于人工肾和其它类型过滤装置中时起着维持生命的重要作用。高流量渗析器的一个普遍承认的问题是不受欢迎的分子从渗析液向血液中的回滤。由于使用无菌和无热原质的渗析液成本高昂，所以非常希望渗析膜能够除掉相对较大的溶质(例如β-2微球蛋白)、同时又阻止大小类似的分子从渗析液透入血液中。但是，能使溶质以高的扩散速度从血液透入渗析液中的膜，也具有溶质以高的逆扩散速度从渗析液返回血液中的缺点。类似地，现有的具有高对流速度的膜也有高回滤速度的缺点。因此，需要渗析膜能充分去除血液中的尿毒毒素，同时阻止不良物质反向传输到血液中。同样，其它的流体过滤过程也会由于有这种净化性能的膜而受益。

还需要诸如生物反应器之类的装置，在这种生物反应器中利用活细胞制造用传统的合成化学技术无法经济地制造的产物，其中由净化膜同时提供了向活细胞供应营养物和由其运走产物及无用的副产物的手段。

                     发明概述

本发明的一个重要目的是提供过滤装置(例如渗析装置)用的新的改良膜。本发明的另一方面是提供内含有净化性能(即，一个方向的筛分系数比另一方向大)的膜的改进的过滤装置及使用这种装置的改进的过滤方法。

本发明的另一重要方面涉及提供双表皮膜，例如中空纤维，这种膜的两个相对表面中的孔大小和结构以及由此形成的筛分系数均不同。在优选的实施方案中，膜具有中空纤维的形状，其中纤维的内壁或内表皮对特定大小分子的筛分系数或透过率比外壁的大。可以按照已知步骤将这种纤维装配到渗析装置中，以便使形成的渗析装置能从在纤维内部流动的流体(如血液)中将大的溶质移除到包围纤维的滤液或渗析液中。因为在纤维的外表面上有一个较紧密或可透性较小的表皮，故此发现从纤维外部向内部的逆向传输大大减少。

本发明的又一重要方面是提供可在渗析中作为减小回滤的单向或净化膜使用的双表皮膜。优选的膜是双表皮的聚合物材料，最好是中空纤维的形式。这些膜在其相对的各面有聚合物表皮，它们的溶质透过性或筛分系数特性不同。这些膜可以通过在挤压溶于溶剂中的聚合物的同时使至少一个表面与和该溶剂混溶的对该聚合物为非溶剂的物质接触来形成。另一表面也与一种非溶剂接触，但是此种非溶剂或是与第一种非溶剂不同，或是其中含有一种可溶性添加剂，它能改变在挤压出的溶解的聚合物上形成的表皮的孔大小和结构。

在本发明的另一方面，使用本发明提供的膜形成了具有净化性能的改进的渗析装置。本发明的优选渗析装置是由在壁内有微孔结构的中空的聚合物纤维膜形成的，该微孔结构有一个聚合物表皮，其中含有与内表面和外表面一起整体形成的不可见的小孔。外表皮的筛分系数与内表皮的不同。本发明的净化渗析装置提供了从体液(如血液)中除去不想要的物质的方法，该方法使溶质从血液中高速过滤到渗析液中，同时保持不想要的溶质从渗析液回滤到血液中的速度很低。

                    图面说明

在以下的详细说明中将参照附图对本发明作进一步的解释：

图1是示例说明形成本发明中空纤维形式的膜的方法的示意图；

图2是在实施本发明中使用的环形挤压模具的截面图；

图3是本发明过滤装置的侧视图及部分截面图；

图4是说明使用本发明过滤装置时设想发生的过滤机制的大大放大的示意图；

图5和6是本发明的中空纤维膜的横截面图，取自电镜照片，放大倍数不同；

图7是根据本发明的一种生物反应器的侧视图；

图8-14是由本文所述的具体实施例的试验得到的结果的图示表示。

                   详细说明

更具体地参看附图，图1示意表示了一个中空纤维纺丝系统60。聚合物在有机溶剂中的溶液62装在容器64中，用计量泵66将该溶液泵送到环形挤压模具68。类似地，在第二个容器70中装入凝聚剂溶液72，它对聚合物为非溶剂，用另一个泵74将其输送到模具68处。

当两个溶液流出模具彼此接触时，非溶剂72和聚合物溶液62在形成的界面63处相互作用，决定了内膜的最终结构和性质。

所形成的挤出物随后穿过空气间隙76进入含有第二种非溶剂凝聚剂溶液80的浴78。挤出物与第二溶液80的相互作用决定了外膜的结构和性质。用驱动辊82将纤维经浴78拉出，根据需要穿过一个或多个附加浴84，完成对中空纤维中溶剂的抽提。抽提过的纤维最后收集在多节绕线器86上令其干燥。将干燥过的纤维88切成一定长度，放在壳90中。用热固性树脂92将纤维88封在壳中。用管端盖帽94和96将此组合件固定。在壳上还装上用于过滤液体的入口97和出口98。

图5和6图示了本发明一个典型纤维88的放大的横截面，它显示了内部微孔结构83、内表皮85和孔隙度与内表皮85不同的外表皮87。本发明的膜的内径优选为约200微米，通常内径的范围是从约100到1000微米。

总筛分系数是进入的溶质中与被过滤的流体一起透过膜的那部分所占的分数。它由膜的下游端溶质的浓度除以膜的上游端溶质的浓度计算得出。

对于单表皮膜，总筛分系数等于表皮的筛分系数，即透过表皮的溶质分数。表皮本身的筛分系数只取决于孔和溶质分子的相对大小。表皮越紧密(即孔越小)，则指定分子穿过表皮的分数越小。

但是，对于双表皮膜，到达第二表皮的溶质浓度与第一表皮的特点及流动条件有关，因此总筛分系数是流动及膜性质这二者的反映，净化膜的一个方向上的筛分系数与另一方向不同，其关键在于沿一个方向的流动造成了溶质在膜的两个表皮之内的积累。

图4是一个双表皮净化膜88的示意图，其中外表皮12比内表皮14紧密，流体在施加的压力梯度作用下由内向外穿透。在这种情形下，进入膜88中心区域16的某些分子在到达较紧密的外表皮12时被拦住。膜内的浓度上升，直到达到某个稳态值，而在纤维外面的流体20中形成的浓度也同时上升。纤维腔18中的浓度没有变化，于是总筛分系数随时间增加，直到达到一个稳态值，此值要比单用紧密表皮12时得到的数值高。

如果对同样的膜施加相反方向的压力梯度，由外向内流动，则溶质很难进入膜，因此不会在膜内积累。在这种情况下膜内的浓度和膜的下游处的浓度都低，总筛分系数比沿另一方向得到的小。

在本发明方法中可以用各种聚合物形成中空纤维。这些聚合物必须在至少一种有机溶剂中溶解，而在另一种与该溶剂混溶的液体中不溶。合适的聚合物的实例有聚砜、聚醚酰亚胺、聚丙烯腈、聚酰胺、聚偏二氟乙烯、聚丙烯和聚醚砜。这类聚合物的溶剂实例包括N-甲基-2-吡咯烷酮，N，N′-二甲基甲酰胺、N，N′-二甲基乙酰胺和γ-丁内酯。可以作为形成表皮用的凝聚剂或胶凝剂使用的优选的非溶剂是水。其它的合适液体包括甲醇、乙醇-水混合物(例如95％或99.5％体积的乙醇水溶液)或异丙醇。可以在非溶剂中加入各种物质以形成不同孔隙度的表皮。其实例包括聚乙烯醇、三水缩四乙二醇、聚乙二醇、高氯酸盐和聚乙烯吡咯烷酮。

本发明的一个重要优点是能够提供这样的纤维，它对于要从液体中滤出的分子，沿不同的滤液流动方向有不同的筛分系数。另一优点是能够提供对分子量范围限定很窄的分子滤出液体的过程有不同筛分系数的纤维。例如，可以形成这样的纤维，它从膜的一面过滤分子量在5000至10000的分子的能力与另一面不同。通过对孔隙度作适当的调整，可以使对于分子量范围从10000到100000甚至200000的分子的筛分系数差别最优化。最优化是通过调节凝聚剂溶液的成分和所加掺加剂的数量及类型、以及通过改变纺丝条件(如流速、线速度和间隙距离)来实现的。

实施例

以下实施例说明了根据本发明制造和使用膜的优选方法。除非另外指明，所有列出的份数均以重量计。

                     实施例1

使用图1和2中所示的纺丝系统及方法在表I所示的配方和工艺条件下制造中空纤维。

试验步骤

在长约22cm、内径约0.6cm的微渗析器外壳中封装100根纤维，组装成试验模件。聚氨酯缸封从两集管各延伸约1cm，剩下约20cm的有效长度。渗析液口位于离各端封装材料约1cm处。

使用血液渗析机配料系统由浓缩物配制成分如下的标准渗析液：

钠      134毫当量/升

钾      2.6毫当量/升

钙      2.5毫当量/升

镁      1.5毫当量/升

氯化物  104毫当量/升

乙酸盐    36.6毫当量/升

葡萄糖    2500毫当量/升在每升渗析液中加入330mg肌红蛋白，配制成肌红蛋白溶液。使用肌红蛋白(分子量17000)作为中等分子(例如β-2微球蛋白，分子量12000)的标志，因为它能用分光光度法测定。

用注射器向腔内和滤液室内灌注醇(异丙醇或乙醇)。然后用过量的渗析液冲洗试验模件，关闭滤液口经过腔泵送250mL，然后使一个滤液口开启，再泵送200mL。为了测量入口流速，关住渗析液口，将注液泵设定在所要求的速度(10.5mL/分钟)，通过计时收集，测定流出量。

为测定筛分系数，将试验模件固定在垂直位置上，纤维与桌面垂直。将一个注液泵与进料储器相连，离开注射泵的管子则连接到底端集管上。顶端集管经管子连通废液。关住渗析液口，开动泵，将试验溶液到达装置的时间记作时间零。

在时间零时，打开两个渗析液旋塞排走渗析液一边的灌注液。然后关住下面的渗析液口，一旦滤液室被充满，立即由上口抽取时间零的滤液样品。与此同时，将出口处腔内样品收集到另一烧杯中。入口处腔内样品则直接取自进料储器。每隔3分钟接连收集滤液样品，样品之间无滤液损失。用Gilford分光光度计测定所有样品的肌红蛋白含量。用以下公式计算筛分系数S：

继续取样，直到3次相连的样品计算出的筛分系数不变。

将纤维组装到试验模件中，按上述步骤测定筛分系数。本实施例的纤维对肌红蛋白的筛分系数，在滤液朝外径向流动时为0.35，当滤液朝内流动时为0.80。J1 J180x                      表  1聚合物                    聚砜溶剂                      N-甲基吡咯烷酮纺丝溶液浓度              15g/100g芯流体成分                15/85，2-丙醇/水沉淀浴成分                2/98，2-丙醇/水洗涤浴成分                水间隙距离                  1cm线速度                    18m/分钟纺丝溶液流速              1.8cc/分钟芯流体轴针直径            0.009英寸模具环形间隙              0.0035英寸

                      实施例2

象实施例1一样制造中空纤维，但是芯流体的成分为10/90的2-丙醇/水，沉淀浴为5/95的2-丙醇/水。图5和6分别是所形成的纤维放大2000倍和400倍的横截面扫描电镜照片，显示了由各边界延伸并汇集在纤维壁中间的指形结构。对肌红蛋白的筛分系数在朝外过滤时为0.45，在朝内流动时为0.90。

                       实施例3

象实施例1一样制备中空纤维，但是芯流体成分为70％异丙醇和30％水。纺丝溶液为20％重量聚砜在含10％丙酮的N-甲基吡咯烷酮中的溶液。沉淀浴是水。用以下步骤测定对葡聚糖的筛分系数：

1)葡聚糖筛分系数。

配制以下成分的葡聚糖在磷酸盐缓冲盐水中的溶液(0.9％)：

葡聚糖FPI(Serva公司)            0.2g/l

葡聚糖4(Serva公司)              1.0g/l

葡聚糖T40(Pharmacia公司)        1.0g/l

葡聚糖T10(Pharmacia)            0.3g/l

经由腔灌注葡聚糖溶液，自壳面一边收集滤液。也从壳面一边灌注葡聚糖溶液，由腔内收集滤液。改变试验的次序。溶液流速为5ml/分钟，横跨膜的压力在150和200mmHg之间。进入的样品直接取自葡聚糖溶液储器。按5分钟间隔取滤液样品。15分钟后滤液浓度值变稳定。使用在40或60分钟时的滤液浓度计算筛分系数。假定本体溶液浓度与其入口处数值相等，而且在渗析器的整个长度上恒定不变。用高效液体色谱(HPLC)分析样品，使用折射率探测器。

结果示于图8中。

用上述步骤测定醇脱氢酶(分子量约150,000)和β-淀粉酶(分子量约200,000)的筛分系数，样品用一种市售的分析盒(Sigma化学公司)测定。醇脱氢酶的筛分系数在朝外流动时为0.05，朝内流动时为0.76；β-淀粉酶的筛分系数在朝外流动时为0.01，朝内流动时为0.17。

                     实施例4

象实施例1一样制备中空纤维，但是芯流体成分为50％异丙醇和50％水。纺丝溶液中含20％重量的聚砜和其中含10％丙酮的N-甲基吡咯烷酮。沉淀浴是水。对于葡聚糖分别测定由腔至壳和由壳至腔的筛分系数。结果示于图9。

                     实施例5

象实施例1一样制备中空纤维，但是芯流体成分是异丙醇。纺丝溶液是15％重量聚砜和15％重量聚乙烯吡咯烷酮的N-甲基吡咯烷酮溶液。芯流体成分是异丙醇，沉淀浴为水。象实施例3中一样地测定对葡聚糖的筛分系数，结果示于图10。

                      实施例6

制备聚砜中空纤维膜，其外表皮的标称截止分子量为5000000道尔顿，而纤维内表面的表皮具有更大但是未知的截止分子量。对于这些纤维，发现各种分子量的葡聚糖的筛分系数在滤液向内径向流动时比滤液向外径向流动时大。

蛋白质筛分系数

将以下蛋白质溶解在磷酸盐缓冲液(0.9％)中：

溶液1，牛血清蛋白                    2.0g/l

溶液2，卵清蛋白(鸡卵清蛋白)          1.0g/l

溶液3，肌红蛋白                      0.089/l

溶液4，细胞色素c                     0.12g/l

经由腔灌注蛋白质溶液，自壳面一边收集滤液。也经壳面一边灌注蛋白质溶液，自腔中收集滤液。变化试验的次序。进入的样品直接取自蛋白质溶液储器。每隔5分钟取滤液样。滤液浓度值在15分钟后稳定。使用40或60分钟时的滤液浓度计算筛分系数。假定本体溶液的浓度与其入口处数值相等，而且在整个渗析器长度上保持恒定。用分光光度计在特征浓长下分析样品的吸光度。牛血清蛋白和卵清蛋白在280nm下分析。肌红蛋白和细胞色素c在410nm下分析。按上述步骤试验的葡聚糖和蛋白质的筛分系数结果示于图11。

                     实施例7

按照实施例1的步骤用以下物质制备中空纤维：

聚合物：        聚醚酰亚胺

溶剂：          N-甲基吡咯烷酮

纺丝溶液浓度：  20％重量

芯流体成分：    水

沉淀浴：        水

试验时对葡聚糖的筛分系数示于图12。

                     实施例8

按照实施例1的步骤用以下物质制备中空纤维：

聚合物：        聚醚酰亚胺

溶剂：          N-甲基吡咯烷酮

纺丝溶液浓度：  25％重量

芯流体成分：    50/50，水/N-甲基吡咯烷酮

沉淀浴：        水

对葡聚糖的筛分系数示于下面的图13中。

                    实施例9

根据现行的关于净化过滤膜性能的理论，内部溶质浓度的分化是造成上述实施例中不对称筛分特性的原因。溶质在膜的两个表皮之间的积累需要有一定的时间才能发生。因此，在某一方向上的筛分系数将随时间增加，直到达到平衡。对于最常用的膜，筛分系数一般在早期测量中最大，并且可能由于被阻留的溶质堵塞了孔而随时间减小。

在图14中显示了实施例3的膜在从壳至腔的方向上筛分系数随时间的变化。对于这一实验，在过滤的头10分钟每隔1分钟收集滤液。筛分系数，特别是分子量从50000到100000的筛分系数，随时间有明显增加。

图7表示一个生物反应器，它由多少与图3所示渗析装置相似的装置构成。但是，在这种情形里，围绕着纤维并为壳90的内部和热固性树脂92包封的空间89形成了供活细胞生长的反应容器。进出口97和98或者省去或者可以如图所示利用阀门99和100关住。根据尺寸大小，产物可以穿透回到膜88中，经纯化与废物流分开。也可以在构成反应器的壳体空间中收集，以半连续的或间歇的方式取出。

营养物、无用产物和所要的生物产物穿过膜的输运可以通过扩散和/或对流完成。在中空纤维内存在的轴向压力降导致Starling流动，在装置入口处发生从管子一边向壳体一边的对流，在装置出口处则是从壳体一边向管子一边的对流。

某些类型的细胞需要昂贵的生长介质，其中可能含10％的胎牛血清。使用净化膜可以使血清组分透过膜到达细胞，然后浓集在壳体空间里，从而减小了介质的体积。这也降低了将透过膜的产物纯化的成本，因为纯化物流的体积较小。

净化膜也可以用来直接浓缩产物。如果所要的产物是由比代谢废产物及营养物大的分子组成，则可以用净化膜装置将产物浓集在壳体空间内，同时使营养物得以到达细胞，而废产物则通过穿透中空纤维膜内部的流体物流冲洗掉。

因此，本发明的膜可以作成在中空纤维膜的内部或外部有较紧密的表皮。在每种情形，重要的是膜的每面的表皮都含有在10000倍放大倍数下看不见的孔。这将保证在膜的各面上都有足够紧密的表皮存在，以便使溶质积累在表皮之间的膜的微孔性内部。据信溶质的这种积累对于构成沿不同方向流过时有不同筛分系数的膜很重要。

Claims (10)

1.一种双表皮的聚合物中空膜(88)，在其壁内具有微孔结构(83)，所述微孔结构具有与其内外表面整体形成的聚合物表皮(85，87)，每个所述表皮均有在10,000倍放大倍数下不可见的小孔，这种微孔结构(83)含有能将选择的分子量范围在5000-200,000范围以内，但是除去5000-20,000范围之外的溶质以增高的浓度阻留在内外表皮之间的小孔，所述膜对于含有上述选择的分子量范围的溶质的流体沿一个方向流过时的总筛分系数与该流体沿相反方向流过时的总筛分系数不同。

2.根据权利要求1的膜，为一种聚砜中空纤维形式。

3.根据权利要求1的膜，为聚醚酰亚胺中空纤维形式。

4.根据权利要求1、2或3的膜，其中该中空膜的内表面上的表皮(85)对溶质通过的限制比外表面上的表皮(87)小。

5.根据权利要求1、2或3的膜，其中该中空膜的外表面上的表皮(87)对溶质通过的限制比内表面上的表皮(85)小。

6.根据权利要求1、2或3的膜，其内径约为100至1000微米。

7.根据权利要求1、2或3的双表皮的聚合物中空膜，其中当含有这种溶质的液体由具有较松的表皮一边穿过膜滤向有较紧密表皮的一边时，所述小孔的大小和结构允许选择的分子量范围的溶质分子迁移通过，但对这种迁移有充分的限制作用，从而造成这类分子的浓度在微孔结构中增高。

8.一种过滤流体的装置，包括许多权利要求1-7之一的双表皮聚合物中空膜，它们以大体平行的取向固定在一个壳体(90)中，壳体(90)具有由包封住纤维外表面的聚合物树脂形成的对面两端，所述纤维的相对两端穿过聚合物树脂伸出，

供第一流体用的流入装置，它通过流体流动与膜一端的腔室连通，

供第一流体周的流出装置，它通过流体流动与膜另一端的腔室连通，

供第二流体用的流入装置(97)和流出装置(98)，它们与上述壳体的内部经流体流动连通，借此可以使第二流体在与所述膜(88)的外表面接触下流动。

9.一种生物反应器，包括许多权利要求1-7之一的双表皮聚合物中空膜(88)，其中所述双表皮聚合物中空膜(88)以大体平行的取向固定在一个壳体(90)中，壳体(90)的对面两端由包封住纤维外表面的聚合物树脂形成，所述纤维的相对两端穿过聚合物树脂伸出，纤维的外表面与壳体的内表面限定了用于活细胞生长的生物反应器，

供第一流体用的流入装置(96)，它通过流体流动与膜(88)一端的腔室连通，和

供第一流体用的流出装置(94)，它通过流体流动与膜(88)另一端的腔室连通。

10.一种制备生物产物的方法，包括将活细胞封闭在权利要求9的生物反应器内，

使含有用于所述细胞的营养物的流体流动通过中空膜(88)，将营养物穿过膜输送给细胞，

随着细胞的废物穿过膜向所述流体转移，除掉细胞的废物，然后，

从所述生物反应器中取出生物产物。

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