CN102667478A - 用于检测致癌融合蛋白的邻近介导试验 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于检测生物样品如全血或肿瘤组织中一种或多种致癌融合蛋白的活化状态和/或总量的基于抗体的阵列及其使用方法。在某些情况下，样品中存在的所述致癌融合蛋白的活化状态和/或总量可与一种或多种信号转导分子联合测量。本发明的组合物和方法具有酶联免疫吸附实验相关的特异性、信号放大相关的灵敏度、和微阵列相关的高通量多重性的优势。

Description

用于检测致癌融合蛋白的邻近介导试验
相关申请的交叉参考 
本申请要求2009年10月20日提交的美国临时申请号61/253,393、2010年2月16日提交的美国临时申请号61/305,084、2010年4月23日提交的美国临时申请号61/327,487和2010年9月15日提交的美国临时申请号61/383,037的优先权，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。 
发明背景 
融合蛋白还称为嵌合蛋白，是通过连接两个或多个原始编码分离蛋白的基因产生的蛋白。该融合基因的翻译产生具有衍生自各原始蛋白的功能性质的单一多肽。当大规模突变（通常是染色体移位）产生含两个不同基因的部分编码序列的新编码序列时，出现嵌合突变蛋白。天然产生的融合蛋白在癌症中很重要，其中所述蛋白起癌蛋白的作用。 
BCR-ABL融合蛋白是致癌融合蛋白的熟知示例。其被认为是慢性髓细胞性白血病(CML)的主要致癌驱动物，但其还与急性淋巴细胞白血病相关。事实上，CML的细胞遗传学特征是费城染色体(Ph)，其形成编码210kDa蛋白的BCR-ABL融合基因。确实，产生的BCR-ABL融合蛋白是对CML发病机理关键的活性酪氨酸激酶。尽管伊马替尼 
Figure BDA00001789353400011
目前是新诊断的CML患者的一线疗法，但约20-25%的患者没有实现持久的完全细胞遗传学反应。研究显示存在连续伊马替尼治疗时BCR-ABL信号传导的再激活是产生抗性的主要原因。在大多数患者中，再激活是BCR-ABL激酶结构域中突变的结果，所述突变损害伊马替尼结合并诱导药物抗性。因此，发现BCR-ABL活性的检测可用于预测对用酪氨酸激酶抑制剂如伊马替尼的治疗响应以及鉴定对所述抑制剂产生抗性的患者。 
当前，可用的检测BCR-ABL活性的方法依赖于对BCR-ABL底物-磷酸化CRKL(pCRKL)的测量。例如La Rosée等(Haematologica,93:765-9(2008))描述了Western印迹分析总白细胞裂解物以检测替代BCR-ABL活性的pCRKL水平(也参见,Hochhaus等，Leukemia,16:2190-6(2002);White等，J.Clin.Oncol., 25:4445-51(2007))。相似地，Khorashad等(Haematologica,94:861-4(2009))描述了基于流式细胞分析的方法测量pCRKL水平以评估BCR-ABL活性(也参见,Hamilton等，Leukemia,20:1035-9(2006))。然而，这些方法缺少测定样品中BCR-ABL活性存在或水平所需的特异性和灵敏度，因为它们是依赖于检测替代蛋白磷酸化的单一抗体试验。因此，需要检测BCR-ABL活性以及其他致癌融合蛋白活性的特异性和灵敏方法用于诊断、预后和治疗目的。本发明满足这种需要，并提供相关优点。 
发明概述 
本发明提供用于检测生物样品如全血（如从分离的稀有循环细胞或白细胞制备的裂解物）或肿瘤组织（如细针吸出物）中一种或多种致癌融合蛋白的活性状态和/或总量的基于抗体的阵列及其使用方法。在某些情况下，样品中存在的所述致癌融合蛋白的活性状态和/或总量可与一种或多种信号转导分子联合测量。本发明的组合物和方法具有酶联免疫吸附实验相关的特异性、信号放大相关的敏感性、和微阵列相关的高通量多重性的优势。 
在一个方面，本发明提供测定致癌融合蛋白水平或活化状态的方法，所述方法包括： 
(a)将细胞提取物与特异于第一全长蛋白的第一结构域的第一结合部分在适于将所述细胞提取物中存在的第一全长蛋白转化为含所述第一全长蛋白和所述第一结合部分的复合物的条件下接触，其中所述第一全长蛋白的第一结构域在对应的致癌融合蛋白中不存在，所述融合蛋白包含与第二不同全长蛋白的第一结构域融合的第一全长蛋白的第二不同结构域。 
(b)将步骤(a)中的复合物从细胞提取物中移除以形成不含所述第一全长蛋白的细胞提取物； 
(c)将步骤(b)中的细胞提取物与特异于所述第一全长蛋白的第二不同结构域的第二结合部分在适于将所述细胞提取物中存在的致癌融合蛋白转化为含所述致癌融合蛋白和所述第二结合部分的复合物的条件下接触；和 
(d)测定步骤(c)中复合物的水平或活化状态，从而测定所述致癌融合蛋白的水平或活化状态。 
在具体实施方式中，测定致癌融合蛋白的水平或激活状态包括检测致癌融合蛋 白（如细胞提取物中）的表达（如浓度）水平和/或活化（如磷酸化）。 
在优选实施方式中，本发明的步骤(c)和(d)包括本文所述的酶联免疫吸附实验(ELISA)、流式细胞分析、标签分选试验或邻近双检测（proximity dual detection）试验。 
在邻近双检测试验的一个具体实施方式中，本发明提供测定致癌融合蛋白水平或活化状态的方法，所述方法包括： 
(a)用致癌融合蛋白特异性捕获抗体的稀释系列孵育细胞提取物形成多种捕获的致癌融合蛋白，其中所述捕获抗体被限制在固体支持物上，其中所述致癌融合蛋白包含对应第一蛋白的第一结构域和对应第二不同蛋白的第二结构域，且其中所述捕获抗体特异于所述融合蛋白的第一结构域。 
(b)用特异于所述致癌融合蛋白的第二结构域的至少两种类型检测抗体孵育所述多种捕获的致癌融合蛋白，形成多种捕获的可检测致癌融合蛋白，其中所述检测抗体包括： 
(1)标记有协助部分的多种活化状态非依赖性抗体，和 
(2)标记有信号放大对的第一元件的多种活化状态非依赖性抗体， 
其中所述协助部分生成传送至信号放大对的第一元件并与之反应的氧化剂； 
(c)用信号放大对的第二元件孵育多种捕获的可检测致癌融合蛋白，生成放大的信号；和 
(d)检测信号放大对第一和第二元件产生的放大信号。 
在邻近双检测试验的另一个具体实施方式中，本发明提供测定致癌融合蛋白水平或活化状态的方法，所述方法包括： 
(a)用致癌融合蛋白特异性捕获蛋白的稀释系列孵育细胞提取物形成多种捕获的致癌融合蛋白，其中所述捕获抗体被限制在固体支持物上，其中所述致癌融合蛋白包含对应第一蛋白的第一结构域和对应第二不同蛋白的第二结构域，且其中所述捕获抗体特异于所述融合蛋白的第一结构域。 
(b)用至少两种类型的检测抗体孵育所述多种捕获的致癌融合蛋白，形成多种捕获的可检测致癌融合蛋白，其中所述检测抗体包括： 
(1)标记有协助部分的多种活化状态非依赖性抗体，其中所述活化状态非依赖性抗体特异于所述融合蛋白的第一结构域，和 
(2)标记有信号放大对的第一元件的多种活化状态依赖性抗体，其中所述活化状态依赖性抗体特异于所述融合蛋白的第二结构域， 
其中所述协助部分生成传送至信号放大对的第一元件并与之反应的氧化剂。 
(c)用信号放大对的第二元件孵育多种捕获的可检测致癌融合蛋白，生成放大的信号；和 
(d)检测信号放大对第一和第二元件产生的放大信号。 
在另一方面，本发明提供给患癌并接受癌症治疗疗程的对象最佳化治疗和/或降低毒性的方法，所述方法包括： 
(a)给予抗癌药后分离癌细胞； 
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物； 
(c)用本文所述试验测量所述细胞提取物中的致癌融合蛋白的表达和/或活化水平；和 
(d)将所测致癌融合蛋白的表达和/或活化水平与疗程早期所测的致癌融合蛋白的表达和/或活化水平作比较；和 
(e)基于步骤(d)的比较确定所述对象疗程的后续剂量或是否需给予对象不同的疗程。 
在某些实施方式中，除了一种或多种致癌融合蛋白以外，还检测存在于所述细胞提取物中的一种或多种信号转导分子。信号传导的示例包括但不限于，受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶、酪氨酸激酶信号级联组分、和/或所述一种或多种致癌融合蛋白的底物（如BCR-ABL底物）。在一些情况中，用本文所述方法检测所述信号转导分子，除了根据试验有两种抗体（即所述捕获抗体和所述检测抗体）或三种抗体（即所述捕获抗体和两种检测抗体）针对相同蛋白。在其他情况中，用本领域技术人员已知的任何方法检测所述信号转导分子。在具体实施方式中，用本文所述试验（如免疫试验）联合检测一种或多种致癌融合蛋白以及存在于所述细胞提取物中的一种或多种信号转导分子。 
在某些实施方式中，本发明还提供实施本文所述邻近双检测试验的试剂盒，所述试剂盒包括：(a)一种或多种限制在固体支持物上的捕获抗体稀释系列，其中所述捕获抗体特异于一种或多种感兴趣的分析物(如致癌融合蛋白或信号转导分子)；和(b)各感兴趣的分析物的多种(如至少两种类型)检测抗体。所述试剂盒还 任选包含其他试剂例如所述信号放大对的第一和第二元件。 
通过以下详细说明和附图，本领域技术人员能明白本发明的其它目的、特征和优点。 
附图简要说明 
图1显示本发明试验形式的一个实施方式，其依赖于两种与酶相连的额外检测抗体的共定位，用于每结合靶标致癌融合蛋白的后续通道事件。 
图2显示本发明的阵列在整个癌症治疗过程中的药物选择上的应用。 
图3A-D显示本发明检测致癌融合蛋白如BCR-ABL的表达和活化水平的试验形式的各种实施方式。 
图4显示移除游离的BCR后K562细胞中的BCR-ABL信号。 
图5显示移除游离的BCR后K562细胞中的BCR信号。 
图6显示K562细胞中BCR-ABL的总水平和磷酸化水平的检测。 
图7显示用或不用BCR C末端抗体偶联珠消耗游离BCR的情况下，K562人慢性髓细胞性白血病细胞中检测的BCR-ABL的磷酸化水平（“磷酸化BCR-ABL”）和总量（“总BCR-ABL”）。 
图8显示用或不用BCR C末端抗体偶联珠移除游离BCR的情况下，K562细胞中的磷酸化BCR-ABL信号。具体地，图8A提供移除或不移除全长BCR（(“非珠处理”=BCR未移除与“珠处理”=BCR用含所述全长BCR C末端特异性抗体偶联的珠移除）的K562细胞裂解物中检测的磷酸化BCR-ABL信号的微阵列比较。图8B提供微阵列数据的图形描绘，相对荧光单位(RFU)随着细胞数量而变化。 
图9显示用或不用BCR C末端抗体偶联珠移除游离BCR的情况下，K562细胞中的总BCR-ABL信号。具体地，图9A提供移除或不移除全长BCR（(“非珠处理”=BCR未移除与“珠处理”=BCR用含全长BCR C末端特异性抗体偶联的珠移除）的K562细胞裂解物中检测的总BCR-ABL信号的微阵列比较。图9B提供微阵列数据的图形描绘，相对荧光单位(RFU)随着细胞数量而变化。 
图10显示K562细胞提取物与偶联BCR C末端抗体的珠接触后从所述细胞提取物中移除游离的全长BCR。具体地，图10A提供移除或不移除全长BCR（(“非珠处理”=BCR未移除与“珠处理”=BCR用含所述全长BCR C末端特异性抗体偶联的珠移除）的K562细胞裂解物中检测的总BCR信号的微阵列比较。图10B提 供微阵列数据的图形描绘，相对荧光单位(RFU)随细胞数量而变化。 
图11显示白细胞(WBC)中存在游离的全长BCR和ABL蛋白，但没有BCR-ABL融合蛋白。 
图12显示K562细胞提取物中掺入WBC提取物时，WBC中存在的游离全长BCR抑制所述K562细胞提取物中的磷酸BCR-ABL信号。 
图13显示用BCR C末端抗体偶联珠移除游离BCR后，掺入WBC提取物的K562细胞中的总BCR-ABL信号。具体地，图13A显示K562细胞提取物中掺入WBC提取物时，游离BCR信号饱和。用偶联BCR C末端抗体的珠治疗后，所述游离BCR被移除。图13B显示在相同实验中用或不用珠处理情况下，BCR-ABL信号没有变化。 
图14显示BCR-ABL抑制剂伊马替尼 
Figure BDA00001789353400061
在K562细胞中剂量依赖性抑制BCR-ABL蛋白的活化（即磷酸化），而非其表达（即总水平）。 
图15显示BCR-ABL抑制剂尼洛替尼 
Figure BDA00001789353400062
在K562细胞中剂量依赖性抑制BCR-ABL蛋白的活化（即磷酸化），而非其表达（即总水平）。 
图16显示BCR-ABL抑制剂达沙替尼 在K562细胞中剂量依赖性抑制BCR-ABL蛋白的活化（即磷酸化），而非其表达（即总水平）。 
图17显示CRKL在K562细胞中存在并活化（即磷酸化）。 
图18显示CRKL在A431人表皮样癌细胞中存在并在EGF处理后活化（即磷酸化）。 
图19显示CRKL在T47D人乳腺导管上皮肿瘤细胞中存在但在EGF处理后未活化（即磷酸化）。 
图20显示CRKL在T47D细胞中存在并在调蛋白（HRG）处理后低水平活化（即磷酸化）。 
图21显示CRKL在MCF-7人乳腺癌细胞中存在并在调蛋白（HRG）处理后低水平活化（即磷酸化）。 
图22表示不同供体的白细胞(WBC)中存在活化（即磷酸化）的CRKL。 
图23表示JAK2在K562细胞和A431细胞中活化（即磷酸化）。 
图24表示可检测并测量用抗CD45磁珠从血液中分离的K562细胞所制备的细胞裂解物中磷酸化的BCR-ABL。 
图25显示当针对天然全长BCR C末端的抗体（BCR-ABL中不存在C末端结构域）与针对BCR-ABL的N末端区域的抗体点样在同一板的同一片上时，总BCR-ABL水平不变化。 
图26显示当针对天然BCR C末端的抗体点样在同一板的同一片上时，用N末端特异性BCR抗体检测到的游离天然BCR信号下降。 
发明详述 
导言 
血液恶性肿瘤是影响血液、骨髓和淋巴结的癌症类型。由于这三种通过免疫系统密切相连，影响所述三种之一的疾病常还会影响其他两种。例如，尽管淋巴瘤严格意义上是淋巴结疾病，但其常扩散到骨髓和血液中。产生具有含两种不同基因部分编码序列的新编码序列的融合蛋白的染色体易位是这些疾病的常见病因，但对于实体瘤是不太常见的病因。因此，重要的是鉴定关联血液恶性肿瘤的致癌融合蛋白的存在和/或活性从而为这类癌症患者提供合适的预后和治疗。 
例如，所述BCR-ABL融合蛋白与慢性髓细胞性白血病（CML）以及急性淋巴细胞白血病（ALL）相关。具体地，所述BCR-ABL蛋白是对癌症发病机理关键的活性酪氨酸激酶。尽管伊马替尼 
Figure BDA00001789353400071
目前是新诊断的CML患者的一线疗法，但约20-25%的患者没有实现持久的完全细胞遗传学反应。研究显示存在连续伊马替尼治疗时BCR-ABL激酶活性的再激活是产生抗性的主要原因。因此，发现BCR-ABL活性的检测可用于预测对用酪氨酸激酶抑制剂的治疗响应以及鉴定对所述抑制剂产生抗性的患者。 
本发明提供用基于抗体的阵列试验系统检测分离细胞中一种或多种融合蛋白（单独或与一种或多种信号转导分子联合）的活化状态和/或总量的方法。从分离的白细胞、循环细胞、或其他细胞类型制备的细胞提取物在本文所述方法中尤其有用。在一些实施方式中，本发明的多重、高通量免疫试验可在单细胞水平检测一种或多种致癌融合蛋白和/或信号转导分子的活化状态。事实上，信号转导分子如EGFR可用约100仄摩尔（zeptomole（10-21摩尔）的灵敏度和约100仄摩尔到约100飞摩尔的线性动态范围检测。因此，一种或多种致癌融合蛋白和/或信号转导分子的活性状态的单细胞检测有助于癌症预后和诊断以及个性化、靶向治疗的设计。 
图1说明本发明的示例性邻近双检测试验，其中致癌融合蛋白如BCR-ABL 结合捕获抗体和两种检测抗体（即活化状态非依赖性抗体和活化状态依赖性抗体）。所述捕获抗体1结合融合蛋白的BCR部分而不依赖于其活化状态。活化状态非依赖性抗体2结合融合蛋白的ABL部分而不依赖于其活化状态，活化状态依赖性抗体3根据活化状态结合融合蛋白的ABL部分（如活化状态依赖性抗体仅结合具有磷酸化残基的BCR-ABL的活化形式）。活化状态非依赖性抗体用协助部分4（“酶A”）标记且活化状态依赖性抗体用信号放大对5的第一元件（“酶B”）标记。两种检测抗体与所述融合蛋白的ABL部分的结合使所述协助部分与所述信号放大对的第一元件足够邻近，从而所述协助部分生成的信号可传至所述信号放大对的第一元件，因而生成可检测和/或可放大信号。本文描述本领域已知的邻近沟道作用的各种方法，包括但不限于FRET、时间分辨荧光-FRET、LOCI等。本发明方法中所用邻近沟道作用的优点是仅对那些结合所有三种抗体的分析物（如融合蛋白或信号转导分子）生成可检测信号，使试验特异性增加、背景降低并简化检测。 
如本文详细描述，为了评价个体患者的潜在抗癌治疗，所述分离的细胞可与一种或多种不同剂量的抗癌药物孵育。然后可进行数分钟（如约1-5分钟）或数小时（如约1-6小时）的生长因子刺激。有或没有抗癌药的信号通路的差异活化可有助于针对各个体患者选择适当剂量的合适癌症治疗。还可在抗癌药治疗期间从患者中分离细胞并用一种或多种生长因子刺激以确定是否需要改变治疗。因此，图2显示本发明的方法优选通过以正确剂量在正确时间为各患者提供正确抗癌药来帮助临床医生。 
定义 
除非另有说明，本文所用的以下术语具有属于它们自身的涵义。 
术语“癌症”包括一类表征为异常细胞的不受控生长的疾病的任何成员。所述术语包括特征为恶性、良性、软组织、或实体的所有已知癌症和肿瘤病症，和所有阶段和级别的癌症包括转移前和转移后癌症。不同类型癌症的非限制性示例包括血液恶性肿瘤(如白血病、淋巴瘤)；成骨肉瘤(如尤因肉瘤)；软组织肉瘤(如隆突性皮肤纤维肉瘤(DFSP)、横纹肌肉瘤)；其他软组织恶性肿瘤、乳头状甲状腺癌；前列腺癌；胃癌(如胃)；乳腺癌；肺癌(如非小细胞肺癌)；消化和胃肠道癌(如结直肠癌、胃肠道基质肿瘤、胃肠道类癌瘤、结肠癌、直肠癌、肛门癌、胆管癌、和小肠癌)；食道癌；胆囊癌；肝癌；胰腺癌；阑尾癌；卵巢癌；肾癌(如肾细胞 癌)；中枢神经系统癌；皮肤癌；绒膜癌；和头颈癌。如本文所用，“肿瘤”包含一种或多种癌细胞。 
“血液恶性肿瘤”包括是影响血液、骨髓和/或淋巴结的任何癌症类型。血液恶性肿瘤的示例包括但不限于白血病、淋巴瘤、和多发性骨髓瘤。不同种类白血病的非限制性示例包括慢性髓细胞性白血病(CML)、急性淋巴细胞性白血病（ALL）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）、急性髓细胞性、白血病（AML）和大颗粒淋巴细胞白血病。CML的亚型包括例如慢性单核细胞白血病。ALL的亚型包括例如前体B细胞急性淋巴细胞白血病、原B细胞急性淋巴细胞白血病、前体T细胞淋巴细胞白血病、和急性双表型白血病。CLL的亚型包括例如B细胞前淋巴细胞性白血病。AML亚型包括例如，急性早幼粒细胞白血病、急性成髓细胞白血病、和急性成巨核细胞白血病。不同类型淋巴瘤的示例包括但不限于霍奇金淋巴瘤(四亚型)和非霍奇金淋巴瘤例如小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、多毛细胞白血病(HCL)、边缘区淋巴瘤(MZL)、伯基特淋巴瘤(BL)、移植后淋巴增殖性疾病(PTLD)、T细胞前淋巴细胞性白血病(T-PLL)、B细胞前淋巴细胞性白血病(B-PLL)、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(还称为淋巴浆细胞性淋巴瘤)、和其他NK或T细胞淋巴瘤。 
术语“分析物”包括测定其存在、含量和/或特性的任何感兴趣分子，通常是大分子，例如多肽。在某些情况中，分析物是癌细胞的细胞组分，优选致癌融合蛋白或信号转导分子。 
术语“转化”或“转变”包括分析物或样品的物理和/或化学改变以提取分析物或者改变或修饰本文所述分析物。如本文所用，提取、处理、化学沉淀、ELISA、复合化、免疫提取、物理或化学修饰分析物或样品以测量分析物的水平或浓度或活化状态都构成转化。换句话说，只要分析物或样品在转化步骤之前与之后不相同，所述改变或修饰就是转化。 
本文所用的术语“稀释系列”旨在包括一系列浓度递降的特定样品(例如，细胞裂解液)或试剂(例如，抗体)。一般通过以下过程产生稀释系列：混合测定量的起始浓度样品或试剂与稀释液(例如，稀释缓冲液)产生较低浓度的样品或试剂，重复该过程足够次数以获得所需数量的稀释系列。可将样品或试剂连续稀 释至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、500、或1000倍而产生包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、或50种浓度递降的样品或试剂的稀释系列。例如，通过将一定量起始浓度的捕获抗体与等量稀释缓冲液混合，产生浓度为0.5毫克/毫升的捕获抗体，重复该过程获得浓度为0.25毫克/毫升、0.125毫克/毫升、0.0625毫克/毫升、0.0325毫克/毫升等的捕获抗体，可生成包含起始浓度为1毫克/毫升的捕获抗体试剂的2倍系列稀释。 
术语所用的术语“优越的动态范围”指该试验能够检测少至1个细胞或多至数千细胞中的特异性分析物。例如，本文所述免疫试验具有高动态范围，因为它们用捕获抗体浓度的系列稀释有利地检测约1-10，000个细胞(例如，约1、5、10、25、50、75、100、250、500、750、1000、2500、5000、7500或10000个细胞)中感兴趣的特定致癌融合蛋白或信号转导分子。 
术语“融合蛋白”或“嵌合蛋白”包括通过连接两个或多个最初编码分离蛋白的基因而产生的蛋白。所述基因融合通常在染色体移位将一个基因的末端外显子替换为第二基因的完整外显子时生成。这样产生可转录、剪接和翻译产生功能融合蛋白的单基因。在具体实施方式中，所述融合蛋白是致癌融合蛋白，即参与癌发生的融合蛋白。致癌融合蛋白的示例包括但不限于BCR-ABL、DEK-CAN、E2A-PBX1、RARα-PML、IREL-URG、CBFβ-MYH11、AML1-MTG8、EWS-FLI、LYT-10-Cα1、HRX-ENL、HRX-AF4、NPM-ALK、IGH-MYC、RUNX 1-ETO、TEL-TRKC、TEL-AML1、MLL-AF4、TCR-RBTN2、COL1A1-PDGF、E2A-HLF、PAX3-FKHR、ETV6-NTRK3、RET-PTC、TMRSS-ERG、和TPR-MET。 
术语“信号转导分子”或“信号转导物”包括细胞将胞外信号或刺激转变成响应过程中起作用的蛋白质和其它分子，所述过程通常涉及细胞内的生物化学反应有序顺序。信号转导分子的示例包括但不限于：受体酪氨酸激酶，例如EGFR(例如，EGFR/HER-1/ErbB1、HER-2/Neu/ErbB2、HER-3/ErbB3、HER-4/ErbB4)、VEGFR-1/FLT-1、VEGFR-2/FLK-1/KDR、VEGFR-3/FLT-4、FLT-3/FLK-2、PDGFR(例如，PDGFRA、PDGFRB)、c-Met、c-KIT/SCFR、INSR(胰岛素受体)、IGF-IR、IGF-IIR、IRR(胰岛素受体-相关受体)、CSF-1R、FGFR 1-4、HGFR 1-2、CCK4、TRK A-C、MET、RON、EPHA 1-8、EPHB 1-6、AXL、MER、TYRO3、 TIE 1-2、TEK、RYK、DDR 1-2、RET、c-ROS、V-钙粘蛋白、LTK(白细胞酪氨酸激酶)、ALK(退行发育性淋巴瘤激酶)、ROR 1-2、MUSK、AATYK 1-3、RTK 106以及受体酪氨酸激酶的截短形式如p95ErbB2；非受体酪氨酸激酶，例如Src、Frk、Btk、Csk、Abl、Zap70、Fes/Fps、Fak、Jak、Ack和LIMK；酪氨酸激酶信号级联组分，例如Akt、MAPK/ERK、MEK、RAF、PLA2、MEKK、JNKK、JNK、p38、Shc(p66)、PI3K、Ras(例如，K-Ras、N-Ras、H-Ras)、Rho、Rac1、Cdc42、PLC、PKC、p70S6激酶、p53、细胞周期蛋白D1、STAT1、STAT3、PIP2、PIP3、PDK、mTOR、BAD、p21、p27、ROCK、IP3、TSP-1、NOS、PTEN、RSK 1-3、JNK、c-Jun、Rb、CREB、Ki67和桩蛋白；核激素受体如雌激素受体（ER）、孕酮受体（PR）、雄激素受体、糖皮质激素受体、盐皮质激素受体、维生素A受体、维生素D受体、类视色素受体、甲状腺激素受体和孤儿受体；核受体辅激活物和抑制物；及其组合。 
本文所用的术语“样品”包括获自患者的任何生物样本。样品包括但不限于：全血、血浆、血清、乳管灌洗液、乳头抽吸物、淋巴（例如淋巴结的播散肿瘤细胞）、骨髓抽吸物、唾液、尿液、粪便(即，排泄物)、痰、支气管灌洗液、眼泪、细针抽吸物（例如通过随机乳晕缘细针抽吸收集）、任何其它体液、组织样品(例如，肿瘤组织)，如肿瘤活检(例如，针吸活检)或淋巴结活检（例如前哨淋巴结活检）和其细胞提取物。在一些实施方式中，样品是全血或其部分组分，例如血浆、血清、红细胞、白细胞如外周血单核细胞、和/或稀有循环细胞。在具体的实施方式中，采用本领域已知的任何技术通过从全血或其细胞组分中分离实体瘤白细胞或循环细胞来获得样品。在其他实施方式中，样品是福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)的例如获自实体瘤的肿瘤组织样品。 
本文所用的术语“循环细胞”包括从实体瘤转移或微转移的瘤旁细胞(extratumoral cell)。循环细胞的示例包括但不限于：循环肿瘤细胞、癌症干细胞和/或迁移至肿瘤的细胞(例如，循环内皮祖细胞、循环内皮细胞、循环促血管生成髓样细胞、循环树突细胞等)。 
"活检"指为诊断或预后评估取出组织样品的过程，和所述组织样品本身。可将本领域已知的任何活检技术应用于本发明的方法和组合物。所用的活检技术通常取决于待评估的组织类型和肿瘤大小及类型(即，实体瘤或悬浮肿瘤(即，血液 或腹水))等因素。代表性活检技术包括切除活检、切开式活检、针吸活检(例如，芯针活检、细针抽吸活检等)、手术活检和骨髓活检。活检技术的描述可参见，例如Harrison′s Principles of Internal Medicine(《哈里森内科学》)，Kasper等编，第16版，2005，第70章，以及整个第V部分。本领域技术人员将理解，可通过活检技术来鉴定给定组织样品中的癌细胞和/或癌前细胞。 
术语“对象”或“患者”或“个体”通常包括人，但也可包括其它动物，例如其它灵长类、啮齿类、犬、猫、马、绵羊、猪等。 
"阵列"或"微阵列"包括固定或限于固相支持物上的捕获抗体的独立组和/或系列稀释，所述固相支持物例如玻璃(例如，载玻片)、塑料、芯片、针、滤器、珠(例如，磁珠，聚苯乙烯珠，等等)、纸、膜(例如，尼龙、硝酸纤维素，聚偏二氟乙烯(PVDF)等)、纤维束或任何其他合适的基质。捕获抗体一般通过共价或非共价相互作用(例如，离子键、疏水相互作用、氢键、范德华力、偶极-偶极键)而固定或限于固体支持物上。在某些情况下，捕获抗体包含能与结合于固相支持物的捕获剂相互作用的捕获标记。本发明试验所用的阵列通常包含偶联于固体支持物表面的不同已知/可寻址位置的多个不同捕获抗体和/或捕获抗体浓度。 
术语"捕获抗体"意指包括对样品中一种或多种感兴趣分析物如白血球或稀少循环细胞的细胞提取物具有特异性(即，结合、被结合或形成复合体)的固定抗体。在优选的实施方式中，捕获抗体限于阵列中的固体支持物上。用于将各种致癌融合蛋白或信号转导分子固定在固体支持物上的合适捕获抗体可购自奥普斯特公司(Upstate，Temecula，CA)、加利福尼亚州卡马里奥市生物资源公司(Biosource，Camarillo，CA)、马萨诸塞州丹弗斯市细胞信号转导技术公司(Cell Signaling Technologies，Danvers，MA)、明尼苏达州明尼阿波利斯研发系统公司(R&D Systems，Minneapolis，MN)、加利福尼亚州弗里蒙特市LV公司(Lab Vision，Fremont，CA)、加利福尼亚州圣克鲁斯市圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)、密苏里州圣路易斯市西格玛公司(Sigma，St.Louis，MO)和加利福尼亚州圣何塞市BD生物科学公司(BD Biosciences，San Jose，CA)。 
本文所用的术语“检测抗体”包括含有样品中一种或多种感兴趣分析物特异 性(即，结合、被结合或与之形成复合物)可检测标记的抗体。该术语还包括一种或多种感兴趣分析物特异性的抗体，其中所述抗体可被包含可检测标记的另一种类结合。可检测标记的示例包括但不限于：生物素/链霉亲和素标记、核酸(例如，寡核苷酸)标记、化学反应活性标记、荧光标记、酶标记、放射性标记和其组合。用于检测各种致癌融合蛋白或信号转导分子中任何一种的活化状态和/或总量的合适检测抗体可购自奥普斯特公司(加州特默库拉)、生物源公司(加州卡玛利奥)、细胞信号传导技术公司(马萨诸塞州丹维斯)、安迪生物（明尼苏达州明尼阿波利斯)、视觉实验室公司(加州弗里蒙特)、圣克鲁斯生物技术公司(加利福尼亚州圣克鲁斯)、西格玛公司(密苏里州圣路易斯)、以及BD生物科技公司(加州圣何塞)。一个非限制性的示例是针对各种磷酸化形式信号转导分子如EGFR、c-KIT、c-Src、FLK-1、PDGFRA、PDGFRB、Akt、MAPK、PTEN、Raf和MEK等的磷酸特异性抗体，可购自圣克鲁斯生物技术公司。 
术语“活化状态依赖性抗体”包括对样品中一种或多种感兴趣分析物的特定活化状态具有特异性(即，结合、被结合或与之形成复合物)的检测抗体。在优选的实施方式中，所述活化状态依赖性抗体能检测一种或多种分析物例如一种或多种致癌融合蛋白或信号转导分子的磷酸化、泛素化和/或复合状态。在一些实施方式中，利用活化状态依赖性抗体检测BCR-ABL融合蛋白的ABL激酶结构域的磷酸化。在其他实施方式中，利用活化状态依赖性抗体检测受体酪氨酸激酶EGFR家族成员的磷酸化和/或EGFR家族成员之间形成的异质二聚体复合物。 
适于用活化状态依赖性抗体检测的活化状态致癌融合蛋白的非限制性示例包括BCR-ABL、DEK-CAN、E2A-PBX1、RARα-PML、IREL-URG、CBFβ-MYH11、AML 1-MTG8、EWS-FLI、LYT-10-Cα1、HRX-ENL、HRX-AF4、NPM-ALK、IGH-MYC、RUNX1-ETO、TEL-TRKC、TEL-AML1、MLL-AF4、TCR-RBTN2、COL1A1-PDGF、E2A-HLF、PAX3-FKHR、ETV6-NTRK3、RET-PTC、TMRSS-ERG、和TPR-MET的磷酸化形式。适合用活化状态依赖性抗体检测的信号转导分子的活化状态(括号中所列)示例包括但不限于：EGFR(EGFRvIII、磷酸化(p-)EGFR、EGFR:Shc、泛素化(u-)EGFR、p-EGFRvIII)；ErbB2(p95:截短(Tr)-ErbB2、p-ErbB2、p95:Tr-p-ErbB2、HER-2:Shc、ErbB2:PI3K、ErbB2:EGFR、ErbB2:ErbB3、 ErbB2:ErbB4)；ErbB3(p-ErbB3、ErbB3:PI3K、p-ErbB3:PI3K、ErbB3:Shc)；ErbB4(p-ErbB4、ErbB4:Shc)；c-Met(p-c-Met或c-Met/HGF复合物),ER(p-ER(S118，S167)；IGF-1R(p-IGF-1R，IGF-1R:IRS，IRS:PI3K，p-IRS，IGF-1R:PI3K)；INSR(p-INSR)；KIT(p-KIT)；FLT3(p-FLT3)；HGFRI(p-HGFRI)；HGFR2(p-HGFR2)；RET(p-RET)；PDGFRa(p-PDGFRa)；PDGFRP(p-PDGFRP)；VEGFRI(p-VEGFRI，VEGFRI:PLCg，VEGFR1:Src)；VEGFR2(p-VEGFR2，VEGFR2:PLCy，VEGFR2:Src，VEGFR2:硫酸肝素，VEGFR2:VE-钙粘蛋白)；VEGFR3(p-VEGFR3)；FGFR1(p-FGFR1)；FGFR2(p-FGFR2)；FGFR3(p-FGFR3)；FGFR4(p-FGFR4)；Tiel(p-Tiel)；Tie2(p-Tie2)；EphA(p-EphA)；EphB(p-EphB)；NFKB和/或IKB(p-IK(S32)，p-NFKB(S536)，p-P65:IKBa)；Akt(p-Akt(T308，S473))；PTEN(p-PTEN)；Bad(p-Bad(S112，S136)，Bad:14-3-3)；mTor(p-mTor(S2448))；p70S6K(p-p70S6K(T229，T389))；Mek(p-Mek(S217，S221))；Erk(p-Erk(T202，Y204))；Rsk-1(p-Rsk-1(T357，S363))；Jnk(p-Jnk(T183，Y185))；P38(p-P38(T180，Y182))；Stat3(p-Stat-3(Y705，S727))；Fak(p-Fak(Y576))；Rb(p-Rb(S249，T252，S780))；Ki67；p53(p-p53(S392，S20))；CREB(p-CREB(S133))；c-Jun(p-c-Jun(S63))；cSrc(p-cSrc(Y416))；和桩蛋白(p-桩蛋白(Y118))。 
术语“活化状态非依赖性抗体”包括对样品中一种或多种感兴趣分析物具有特异性(即，结合、被结合或与之形成复合物)而无论其活化状态的检测抗体。例如，活化状态非依赖性抗体可检测一种或多种分析物例如一种或多种致癌融合蛋白或信号转导分子的磷酸化和非磷酸化形式。 
术语“核酸”或“多核苷酸”包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物，例如DNA和RNA。核酸包括含有已知核苷类似物或经修饰主链残基或连接键的核酸，其可以是合成的、天然产生的和非天然产生的，具有与参比核酸相似的结合特性。这种类似物的示例包括但不限于：硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2'-O-甲基核糖核苷酸和肽-核酸(PNA)。除非明确限定，该术语包括含有天然核苷的已知类似物的核酸，其具有与参比核酸相似的结合特性。除非另有说明，特定核酸序列还隐含其保守性修饰的变体和互补序列以及明确示出的序列。 
术语“寡核苷酸”指RNA、DNA、RNA/DNA杂交体的单链寡聚物或聚合物 和/或其模拟物。在某些情况中，寡核苷酸由天然产生(即，未修饰)的核碱基、糖和核苷间(主链)连接构成。在某些其它情况中，寡核苷酸包含修饰的核碱基、糖和/或核苷间连接。 
本文所用的术语“错配基序”或“错配区”指寡核苷酸中与其互补序列没有100%互补的部分。寡核苷酸可含有至少1、2、3、4、5、6个或更多个错配区。所述错配区可以是连续的，或可被1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个核苷酸隔开。错配基序或区域可包含一个核苷酸或可包含2、3、4、5或更多个核苷酸。 
短语“严谨杂交条件”指寡核苷酸与其互补序列杂交，但不与其它序列杂交的条件。严谨条件是序列依赖性的，在不同情况下不同。较长的序列在较高温度下特异性杂交。有关核酸杂交的详细指南参见Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes(《生物化学和分子生物学技术-与核酸探针杂交)，“Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays(核酸测定的杂交原理和方案概览)”(1993)。通常，严谨条件选择为比特定序列在确定离子强度、pH下的热解链温度(Tm)低约5-10°C。Tm是50%靶标互补探针与靶序列杂交平衡时的温度(在确定离子强度、pH和核酸浓度下)(由于靶序列过量，在Tm时50%探针被平衡地占据)。也可加入去稳定剂如甲酰胺以获得严谨条件。在选择性或特异性杂交中，阳性信号至少是背景杂交的两倍，优选10倍。 
术语“基本相同”或“实质性相同”的两条或多条核酸，指采用序列比较算法或通过手工比对和目测观察进行比较和比对在比较窗口或指定区域的最大对应性时，相同或含有相同特定百分比的核苷酸(即，在特定区有至少约60%，优选至少约65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%相同性)的两条或多条序列或子序列。当文中示出该定义时，还类似地指某序列的互补部分。优选在至少长约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、或100个核苷酸的区域上基本相同。 
术语“酪氨酸激酶抑制剂”包括作为受体和/或非受体酪氨酸激酶的选择或非选择性抑制剂的各种治疗剂或药物中的任何一种。不受任何具体理论限制，酪氨酸激酶抑制剂通常通过结合酶的ATP结合位点抑制靶酪氨酸激酶。酪氨酸激酶抑制剂的示例包括但不限于伊马替尼( 
Figure BDA00001789353400151
STI571)、尼洛替尼 
Figure BDA00001789353400152
达沙 替尼 博舒替尼(SKI-606)、吉非替尼 
Figure BDA00001789353400162
舒尼替尼( SU11248)、埃罗替尼( 
Figure BDA00001789353400164
OSI-1774)、拉帕替尼(GW572016;GW2016)、卡纽替尼(CI 1033)、塞马悉尼（semaxinib）(SU5416)、瓦他拉尼(PTK787/ZK222584)、索拉非尼(BAY 43-9006)、来氟米特(SU101)、凡德他尼（vandetanib）(ZactimaTM;ZD6474)、其衍生物、类似物和组合。其他适用于本发明的酪氨酸激酶抑制剂描述于例如美国专利号5,618,829、5,639,757、5,728,868、5,804,396、6,100,254、6,127,374、6,245,759、6,306,874、6,313,138、6,316,444、6,329,380、6,344,459、6,420,382、6,479,512、6,498,165、6,544,988、6,562,818、6,586,423、6,586,424、6,740,665、6,794,393、6,875,767、6,927,293、和6,958,340。本领域技术人员了解其它适用于本发明的酪氨酸激酶抑制剂。在某些情况中，所述酪氨酸激酶抑制剂以药学上可接受的形式给予，所述药学上可接受的形式包括但不限于碱金属或碱土金属盐如铝盐、钙盐、锂盐、镁盐、钾盐、钠盐或锌盐；铵盐如叔胺盐或季铵盐；和酸盐如琥珀酸盐、酒石酸盐、酒石酸氢盐、二盐酸盐、水杨酸盐、半琥珀酸盐、柠檬酸盐、异柠檬酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、乙酸盐、氨基甲酸盐、硫酸盐、硝酸盐、甲酸盐、乳酸盐、葡萄糖酸盐、葡糖醛酸盐、丙酮酸盐、草酰乙酸盐、延胡索酸盐、丙酸盐、天冬氨酸盐、谷氨酸盐、或苯甲酸盐。 
术语"孵育"与“接触”和“暴露”同义使用，不暗指任何特定时间或温度要求，除非另有说明。 
术语“完全细胞遗传学反应”、“完全细胞遗传学缓解”、“CCyR”和”CCgR”包括临床接受的标准，所述标准定义为如骨髓分离细胞的染色体显带所测定，在至少20种处于中期的细胞群中缺失处于中期的费城染色体阳性细胞。在某些情况中，当不能获得分离自骨髓的中期细胞或其不能用染色体显带评价时，所述术语可定义为至少200个评分的核中存在<1%的BCR-ABL阳性核，如血细胞的间期荧光原位杂交(FISH)测定。所述间期FISH可例如用BCR-ABL额外信号、双色、双融合或原位杂交探针进行。这些术语的其他说明参见例如O’Brien等，N.Engl.J.Med.,348:994-1004(2003);Hughes等，N.Eng.l J.Med.,349:1423-1432(2003);和Bacarani等，J.Clin.Oncol.,27:6041-6051(2009)。 
在致癌融合蛋白如BCR-ABL的水平比一种或多种对照蛋白如全长BCR和/或 全长ABL的水平下降至少约2-3个数量级时实现“主要分子响应”、“主要分子缓解”或“MMR”。在某些实施方式中，当抗癌药（如酪氨酸激酶抑制剂）治疗期间致癌融合蛋白水平（如BCR-ABL水平）与对照蛋白水平（如BCR或ABL水平）之比相对抗癌药治疗前相同蛋白之比下降至少约2-3个数量级时实现主要分子响应。与依赖mRNA转录水平检测的主要分子响应的定义相反，本发明的基于抗体的邻近双检测试验优选提供在健康供体的约100000细胞背景中检测一种癌症（如CML）细胞的能力，从而通过测量和对比BCR-ABL、BCR、和/或ABL蛋白水平检测主要分子响应。在其他实施方式中，主要分子响应是定义为BCR-ABL mRNA转录本与ABL或BCR mRNA转录本之比（表示为ABL或BCR mRNA转录水平百分比）中对数（底数10）级别上低于标准基线值至少3个数量级的临床分类。在某些情况中，mRNA转录本的水平用实时定量RT-PCR(qPCR)方法测定。在其他实施方式中，主要分子响应是通过qPCR测定的BCR-ABL与ABL、BCR或对照mRNA转录本之比在国际标准（IS）上定义为值<0.1%时的情况。所述IS依据国际干扰素与STI571随机研究(IRIS)的临床研究中参与的实验室建立的对数降低比例。参见例如，Hughes等，N.Engl.J.Med.,349:1423-1432(2003);Hughes等，Blood，108:28-37(2006),Brand等，Blood，112:3330-3338(2008);和Baccarani等，J.Clin.Oncol.,27:6041-6051(2009)。 
在致癌融合蛋白如BCR-ABL的水平比一种或多种对照蛋白如全长BCR和/或全长ABL的水平下降至少约3-4个数量级时实现“完全分子响应”、“完全分子缓解”或“CMR”。在某些实施方式中，当抗癌药治疗期间致癌融合蛋白水平（如BCR-ABL水平）与对照蛋白水平（如BCR或ABL水平）之比相对抗癌药（如酪氨酸激酶抑制剂）治疗前相同蛋白之比下降至少约3-4个数量级时实现完全分子响应。与依赖mRNA转录水平检测的完全分子响应的定义相反，本发明的基于抗体的邻近双检测试验优选提供在健康供体的约1,000,000细胞背景中检测一种癌症（如CML）细胞的能力，从而能通过测量和对比BCR-ABL、BCR、和/或ABL蛋白水平来检测完全分子响应。在其他实施方式中，完全分子响应是在至少两种优质连续血样中BCR-ABL mRNA转录本不可用qPCR和/或巢式PCR检测的临床分类，所述优质血样确保能检测BCR-ABL mRNA水平的4.0-4.5个数量级的下降。在某些情况中，完全分子响应是定义为BCR-ABL与ABL、BCR或对照mRNA转录本之比（表示 为百分比）在对数级别上低于标准基线值至少4.5个数量级。参见例如，Press等，Blood，107:4250-4256(2006);Muller等,Leukemia.,23:1957-1963(2009);和Baccarani等，J.Clin.Oncol.,27:6041-6051(2009)。 
术语“疗程”包括用于缓解或阻止有关癌症如血液恶性肿瘤（如白血病、淋巴瘤等）的一种或多种症状的任何治疗方法。所述术语涵盖给予任何化合物、药物、方法、和/或方案用于改善患癌个体健康状况，且包括任何本文所述治疗剂。本领域技术人员会理解，可基于用本发明方法测定的一种或多种致癌融合蛋白和/或信号转导分子的表达和/或活化水平对所述疗程或当前疗程的剂量进行改变（如增加或减少）。 
具体实施方式
本发明提供基于抗体的阵列，用于检测生物样品如细胞提取物或裂解物中一种或多种致癌融合蛋白和/或信号转导分子的活化状态和和/或总量。本发明还提供使用所述阵列的方法以协助癌症预后和诊断、预测或鉴定药物治疗抗性、以及个性化靶向治疗的设计。在具体实施方式中，本发明的组合物和方法优选鉴定对用酪氨酸激酶抑制剂如伊马替尼的治疗有抗性的患者，这是由于靶蛋白激酶（如BCR-ABL）中的突变、不符合治疗方案、和/或给予了未达最佳的药物剂量。 
在一个具体实施方式中，本发明提供例如免疫试验的试验用于实时检测生物样品如细胞提取物或裂解物中BCR-ABL、其底物和/或其他信号转导分子的表达水平和/或活化（如磷酸化）程度。因此，本发明优选为接受一种或多种靶向治疗的血液恶性肿瘤如CML患者提供益处，这是通过在整个疗程中筛选和监控他们并评价他们是否需要变为替代的靶向治疗如尼洛替尼 
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以有效抑制所述靶分子（如BCR-ABL）且具有最小毒性。 
在某些实施方式中，本发明提供具有优秀灵敏度范围的方法用于检测致癌融合蛋白如BCR-ABL。当前检测细胞提取物中BCR-ABL蛋白的免疫试验一般能在10-100,000正常细胞中检测一个BCR-ABL阳性细胞，等同于10-0.001%的检测灵敏度（参见例如，Jilani等，Leuk.Res.,32:936-943(2008);Weerkamp等，Leukemia,23:1106-1117(2009);Raponi等，Haematologica,94:1767-1770(2009);和美国专利公开号US 2006/0172345）。本文所述邻近试验优选表现出灵敏度提高为约1:100,000-10,000,000细胞(即一个白血病细胞比约100,000-10,000,000正常细胞； 等于检测灵敏度约0.001-0.00001%)或约1:1,000,000-10,000,000细胞(即一个白血病细胞比约1,000,000-10,000,000正常细胞;等于检测灵敏度约0.0001-0.00001%)，和包括例如约1:100,000细胞、1:200,000细胞、1:300,000细胞、1:400,000细胞、1:500,000细胞、1:600,000细胞、1:700,000细胞、1:800,000细胞、1:900,000细胞、1:1,000,000细胞、1:2,000,000细胞、1:3,000,000细胞、1:4,000,000细胞、1:5,000,000细胞、1:6,000,000细胞、1:7,000,000细胞、1:8,000,000细胞、1:9,000,000细胞、1:10,000,000细胞、1:100,000-500,000细胞、1:100,000-1,000,000细胞、1:500,000-1,000,000细胞、1:100,000-5,000,000细胞、1:500,000-10,000,000细胞、1:2,000,000-10,000,000细胞、1:5,000,000-10,000,000细胞、1:1,000,000-7,500,000细胞、1:1,000,000-5,000,000细胞、和其中包括的任何其他范围。本文所述方法的灵敏度可相当于或超过基于核酸的标准BCR-ABL试验（如qPCR或巢式PCR），所述试验的检测范围落在1个白血病细胞比10,000-1,000,000正常细胞中。基于核酸的标准BCR-ABL试验的灵敏度范围的其他描述参见例如Press等，Blood，107:4250-4256(2006)和Radish JP,Blood，114:3376-3381(2009)。 
在具体实施方式中，与当前检测BCR-ABL的免疫试验和基于核酸的试验相比，本发明基于抗体的邻近试验优选在检测致癌融合蛋白如BCR-ABL的存在、水平和/或活性状态中能产生较高的敏感度和/特异性程度，从而更精确地检测响应指示剂如完全细胞遗传反应、主要分子响应、完全分子响应及其组合。作为非限制性示例，当前基于核酸的试验灵敏度不足以检测患者样品中极低量的BCR-ABL转录本，从而用当前基于核酸的试验检测完全分子响应不一定意味着所述患者被治愈且不再患BCR-ABL介导的疾病（如CML）。 
在一个方面，本发明提供测定致癌融合蛋白水平或活化状态的方法，所述方法包括： 
(a)将细胞提取物与对第一全长蛋白的第一结构域特异的第一结合部分在适于将所述细胞提取物中存在的第一全长蛋白转变为含所述第一全长蛋白和所述第一结合部分的复合物的条件下接触，其中所述第一全长蛋白的第一结构域在对应的致癌融合蛋白中不存在，所述融合蛋白包含与所述第二不同全长蛋白的第一结构域融合的第一全长蛋白的第二不同结构域。 
(b)将步骤(a)中的复合物从细胞提取物中移除以形成不含所述第一全长蛋白 的细胞提取物； 
(c)将步骤(b)中的细胞提取物与对所述第一全长蛋白的第二不同结构域特异的第二结合部分在适于将所述细胞提取物中存在的致癌融合蛋白转变为含所述致癌融合蛋白和所述第二结合部分的复合物的条件下接触；和 
(d)测定步骤(c)中复合物的水平或活化状态，从而测定所述致癌融合蛋白的水平或活化状态。 
在一个实施方式中，所述细胞提取物含分离自样品的细胞提取物。在某些情况中，所述样品选自全血、血清、血浆、细针抽吸物（FNA）、尿液、痰、支气管灌洗液、泪液、乳头抽吸物、淋巴、唾液和其组合物。在另一实施方式中，所述样品获自癌症患者。在一些情况中，所述癌症可由癌细胞中的染色体移位形成致癌融合蛋白引起。所述癌症的示例包括但不限于血液恶性肿瘤、成骨肉瘤、软组织肉瘤和其组合。在具体实施方式中，所述血液恶性肿瘤是白血病或淋巴瘤。在一个优选实施方式中，所述白血病是慢性髓细胞性白血病(CML)。在另一实施方式中，用于制备细胞提取物或裂解物的分离细胞可含循环肿瘤细胞、白细胞或其组合。在某些实施方式中，所述分离细胞用生长因子体外刺激。在一些情况中，所述分离细胞在生长因子刺激前与抗癌药孵育。在其他情况中，所述分离细胞在生长因子刺激后裂解以产生细胞提取物。 
在一些实施方式中，所述细胞提取物用新鲜收集或冷冻的骨髓或全血样品制备。作为非限制性示例，用抗凝剂（如EDTA、肝素和/或柠檬酸葡萄糖（ACD））处理的全血细胞样品首先分离为血浆或血清组分和细胞组分。细胞组分可通过用氯化铵和/或Ficoll-Hypaque(聚蔗糖-泛影葡胺)密度梯度离心对红细胞低渗裂解处理以从血液样品中分离白细胞。可用任何本领域已知的方法裂解细胞组分中存在的分离细胞从而转化所述分离细胞为细胞提取物，如Raponi等，Leuk Res,32:923-43(2008);Weerkamp等，Leukemia,23:1106-1117(2009);和美国专利号6,610,498和6,686,165中所述的方法。 
在一些情况中，所述分离的白细胞在裂解前可用一种或多种细胞穿透性蛋白酶抑制剂处理。细胞穿透性蛋白酶抑制剂包括但不限于氟磷酸二异丙酯(DFP)、4-(2-氨基乙基)苯磺酰基盐酸氟(AEBSF)、氟化苯基甲磺酰基(PMSF)及其混合物。作为非限制性示例，分离的白细胞于冰上在含20mM AEBSF和1mM PMSF的PBS 缓冲液中孵育10-30分钟。细胞以520g于4°C温和离心5分钟，分开上清和分离的白细胞。分离的白细胞用蛋白酶抑制剂处理，如Weerkamp等，Leukemia,23:1106-1117(2009)所述。 
在一些情况中，分离的白细胞可于冰上在含一种或多种蛋白抑制剂的RIPA裂解缓冲液中孵育多至30分钟。RIPA缓冲液包含或主要由50mM Tris HCl、pH7.5、150mM NaCl、1%NP40、和0.1%十二烷基硫酸钠组成。在某些其他情况中，RIPA缓冲液不含脱氧胆酸钠。孵育后，所述细胞混合物于4°C以>18,000g离心1-10分钟以分离细胞提取物和细胞碎片。收集所述细胞提取物。对于细胞裂解方案的其他描述，参见例如Raponi等，Haematologica,94:1767-1770(2009);Weerkamp等，Leukemia,23:1106-1117(2009);和美国专利公开号US 2006/0172345。 
在一些实施方式中，血浆从收集的新鲜外周全血样中制备并用一种或多种抗凝剂(如EDTA、肝素或ACD)处理，如Jilani等，Leuk.Res.,32:936-943(2008)所述。作为非限制性示例，血液样品可分离为血浆或血清组分和细胞组分。所述血浆可在试验前存于-70-80°C，或在血液样品收集96小时内进行试验。 
在某些实施方式中，所述致癌融合蛋白选自下组：BCR-ABL、DEK-CAN、E2A-PBX1、RARα-PML、IREL-URG、CBFβ-MYH11、AML1-MTG8、EWS-FLI、LYT-10-Cα1、HRX-ENL、HRX-AF4、NPM-ALK、IGH-MYC、RUNX 1-ETO、TEL-TRKC、TEL-AML1、MLL-AF4、TCR-RBTN2、COL1A1-PDGF、E2A-HLF、PAX3-FKHR、ETV6-NTRK3、RET-PTC、TMRSS-ERG、TPR-MET和其组合。在具体实施方式中，所述致癌融合蛋白是BCR-ABL。在某些情况中，所述第一全长蛋白是BCR，所述第一全长蛋白的第一结构域含BCR的羧基末端区(BCR-C)，且所述第一全长蛋白的第二不同结构域含BCR的氨基末端区(BCR-N)。在某些其他情况中，所述第二不同全长蛋白是ABL，所述第二不同全长蛋白的第一结构域含ABL的羧基末端区(ABL-C)，且所述第二不同全长蛋白的第二不同结构域含ABL的氨基末端区(ABL-N)。在一个替代实施方式中，所述第一全长蛋白是ABL且所述第二不同全长蛋白是BCR。 
在一些实施方式中，所述活性状态选自下组：磷酸化状态、泛素化状态、复合状态和其组合。在一个优选实施方式中，所述致癌融合蛋白是BCR-ABL且所述活化状态是磷酸化状态。 
在其他实施方式中，本发明的试验方法还包含测定一种或多种信号转导分子的水平或活化状态。在具体实施方式中，所述一种或多种信号转导分子含BCR-ABL底物如CRKL、JAK2、STAT5、Src、FAK、c-ABL、c-CBL、SHC、SHP-2、VAV、BAP-1和其组合。 
在一个具体实施方式中，所述第一结合部分含第一抗体。在一些情况中，所述第一抗体与固体支持物结合。固体支持物的非限制性示例包括玻璃、塑料、芯片、钉、滤器、珠、纸、膜、纤维束和其组合。在优选实施方式中，所述第一抗体结合珠（如磁珠、聚苯乙烯珠等），且所述珠起消耗标签功能以从细胞提取物中去除所述第一全长蛋白。 
在另一具体实施方式中，所述第二结合部分含第二抗体。在一些情况中，所述第一抗体与固体支持物结合。固体支持物的非限制性示例包括玻璃、塑料、芯片、钉、滤器、珠、纸、膜、纤维束和其组合。在一个优选实施方式中，所述第二抗体限于可寻址阵列的固体支持物如膜上（如尼龙、硝酸纤维素、PVDF等）。在另一实施方式中，所述第二抗体结合珠（如磁珠、聚苯乙烯珠等），其中所述珠可任选包含染料如荧光团（如有色珠）。在使用多种珠的情况中，各珠可含独立选择的染料如不同强度或有不同激发和/或发射光谱的荧光团（如红色或红外荧光团）。 
在优选实施方式中，步骤(c)和(d)含本文所述邻近双检测试验(还称为协作邻近免疫试验(“COPIA”))。在其他实施方式中，步骤(c)和(d)包括本文所述的酶联免疫吸附实验(ELISA)、流式细胞分析、或标签分选试验。 
在步骤(c)和(d)含邻近双检测试验的实施方式中，步骤(c)还包括： 
(c’)将步骤(b)中的细胞提取物与第三结合部分和第四结合部分在适于将细胞提取物中存在的致癌融合蛋白转化为含所述致癌融合蛋白与所述第二、第三和第四结合部分的复合物的条件下接触， 
其中所述第三结合部分用协助部分标记且对下述结构域或序列中的一种或多种表位特异（如特异性结合）：(i)所述第二不同全长蛋白的第一结构域;(ii)所述第一全长蛋白的第二不同结构域;或(iii)所述第一全长蛋白的第二不同结构域和所述第二不同全长蛋白的第一结构域的融合位置， 
其中所述第四结合基序用信号放大对的第一元件标记，且对所述第二不同全长 蛋白的第一结构域特异，和 
其中所述协助部分生成传至信号放大对的第一元件并与之反应的氧化剂。 
在步骤(c)和(d)含邻近双检测试验的实施方式中，步骤(d)还包括： 
(c)用信号放大对的第二元件孵育步骤(c’)中的复合物，生成放大的信号；和 
(d”)检测信号放大对第一和第二元件产生的放大信号。 
在某些实施方式中，步骤(b)的细胞提取物可与所述第二结合部分的稀释系列接触，形成多种含所述致癌融合蛋白和所述第二结合部分的复合物。在一些实施方式中，所述第三和第四结合部分可分别包括第三和第四抗体。在一些情况中，所述第三和第四抗体均为活化状态非依赖性抗体。在该情况中，所述信号放大对的第一和第二元件与致癌融合蛋白的总量相关。在其他情况中，所述第三抗体是活化状态非依赖性抗体且所述第四抗体是活化状态依赖性抗体。在该情况中，所述信号放大对的第一和第二元件产生的放大信号与活化（如磷酸化）的致癌融合蛋白总量相关。 
在其他实施方式中，所述第三结合基序可直接用协助部分标记。在其他实施方式中，所述第四结合基序部分用所述信号放大对的第一元件直接标记。在替代的实施方式中，所述第四结合部分用所述信号放大对的第一元件标记，这是通过偶联第二检测抗体的结合对第一元件结合偶联所述信号放大对第一元件的结合对的第二元件。在这些实施方式中，所述结合对的第一元件是生物素和/或所述结合对的第二元件是链霉亲和素。 
在其它实施方式中，所述协助部分是葡萄糖氧化酶。在某些情况中，所述葡萄糖氧化酶和所述第三结合部分偶联巯基活化的右旋糖苷分子。在该情况中，巯基活化的右旋糖苷分子的分子量约为500kDa。在其他情况中，氧化剂是过氧化氢（H2O2）。在该情况中，所述信号放大对的第一元件是过氧化物酶如辣根过氧化物酶（HRP）和/或所述信号放大对的第二部件是酪胺试剂如生物素-酪胺。在具体实施方式中，所述放大信号由生物素-酪胺的过氧化物酶氧化产生活化的酪胺而生成。在某些情况中，所述活化的酪胺被直接检测。在某些其他情况中，所述活化的酪胺在添加信号检测剂后检测。信号检测剂的非限制性示例包括链霉亲和素标记的荧光团以及链霉亲和素标记的过氧化物酶和发色剂如3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)的组合。 
在某些实施方式中，本发明试验方法还包括： 
(e)将细胞提取物与对所述第二不同全长蛋白的第二结构域特异的第五结合部分在适于将所述细胞提取物中存在的第二不同全长蛋白转化为含所述第二不同全长蛋白和所述第五结合部分的复合物的条件下接触，其中所述第二不同全长蛋白在所述致癌融合蛋白中不存在;和 
(f)将步骤(e)中的复合物从细胞提取物中移除以形成不含所述第二不同全长蛋白的细胞提取物； 
其中步骤(e)在步骤(a)之前、之中或之后进行。 
在一个具体实施方式中，所述第五结合部分含第五抗体。在一些情况中，所述第五抗体与固体支持物结合。固体支持物的非限制性示例包括玻璃、塑料、芯片、钉、滤器、珠、纸、膜、纤维束和它们的组合。在优选实施方式中，所述第五抗体结合珠（如磁珠、聚苯乙烯珠等），且所述珠用作消耗标签以从细胞提取物中去除所述第二不同全长蛋白。 
图3A显示用于检测致癌融合蛋白如BCR-ABL(310)存在（总水平）和/或活化状态（磷酸化水平）的示例性邻近试验（300）。由嵌合BCR-ABL基因编码的致癌融合蛋白大小不同，取决于所述BCR基因的断裂点。BCR-ABL融合基因由位于9号染色体长臂上的ABL基因和位于22号染色体长臂上的BCR基因的相互易位生成，产生22q-染色体上的致癌融合基因，又称为费城染色体。参见例如Kurzock等，N.Engl.J.Med.319:990-8(1988);Rosenberg等，Adv.In Virus Res.35:39-81(1988)。根据将ABL基因移位到BCR基因N末端上的染色体断裂点而形成不同长度的BCR-ABL融合基因。已测定ABL基因的断裂点分布在外显子1b-a2的约200kb上，且BCR基因断裂点聚集于3个区域；外显子13-15(b2-b4)之间的主要断裂点(M-BCR)；选择性外显子1和2（e1和e2）之间的次要断裂点(m-BCR)；和内含子19(e19)中的微断裂点(mu-BCR)。因此，根据BCR-ABL基因重排形成独特的BCL-ABL蛋白。参见例如Konopka等，Cell 37:1035-42(1984);van Dongen,JJM,Leukemia 19:1292-5(2005)。 
p210BCR-ABL蛋白从b3a2(e14a2)和/或b2a2(e13a2)基因转录本生成，其在多于95％的CML病例和ALL亚组中检测到。该蛋白含1790个氨基酸并由来自BCR N末端的寡聚化结构域（OLI）组成，然后是正常BCR中不存在的BCR氨基酸序列插入物-BCR的S/T激酶结构域，然后是来自ABL的SH3、SH2和Y 激酶结构域以及ABL的C末端富含脯氨酸的结构域。p190BCR-ABL融合蛋白由e1a2融合基因转录本编码，其主要与Ph-阳性的ALL关联。CML的罕见病例是由于p190型的BCR-ABL基因移位，且在这些情况中，疾病倾向于具有显著的单核细胞组分，类似慢性粒单核细胞白血病(CMML)。p230BCR-ABL蛋白从e19a2基因转录本形成，其与嗜中性粒细胞CML、经典CML和AML相关联。参见例如Konopka等，Cell 37:1035-42(1984);van Dongen,JJM,Leukemia 19:1292-5(2005)。已描述例外的CML病例，BCR断裂点在所定义的三种聚集区之外或ABL中有不寻常的断裂点ABL(参见例如Melo,Baillieres Clin.Haematol.,10:203-22(1997))。本文所述邻近试验能检测在BCR基因中任何位置有断裂点的嵌合BCR-ABL基因编码的BCR-ABL蛋白的总水平和活化水平。 
如图3A所示，全长BCR蛋白可通过用对全长BCR羧基末端区域（311）特异的消耗标签首先从患者样品中移除。该消耗标签的非限制性示例是结合全长BCR羧基末端区域特异性抗体的珠（321b）。一旦全长BCR从样品中移除，用BCR氨基末端区域(BCR-N)特异性捕获抗体捕获BCR-ABL融合蛋白。一旦BCR-ABL通过BCR-N和BCR-N特异性捕获抗体之间的结合所捕获，测定BCR-ABL的总浓度（340），还测量活化BCR-ABL（350）。在一些实施方式中，所述协助部分（如GO）偶联ABL羧基末端区域（ABL-C）特异性抗体，且所述信号放大对的第一元件（如HRP）在不同于所述协助部分偶联抗体识别的表位偶联ABL-C特异性抗体。在某些情况中，所述信号放大对偶联的抗体是活化状态非依赖性抗体，其结合ABL-C而不论其活化状态，从而测量BCR-ABL（340）的总浓度。在某些其他情况中，所述信号放大对偶联的抗体是活化状态依赖性抗体，其结合磷酸ABL-C（如pY245,pY412），从而测量活化的BCR-ABL（350）浓度。在一个替代实施方式中，所述协助部分（如GO）在不同于与所述BCR-ABL捕获抗体识别的表位偶联BCR-N特异性抗体，且所述信号放大对的第一元件（如HRP）偶联ABL-C特异性抗体。所述信号放大对偶联的抗体可为本文所述的活化状态非依赖性抗体或活化状态依赖性抗体。 
在一些实施方式中，在捕获和通过使用全长ABL（330）氨基末端区域特异性消耗标签来检测BCR-ABL表达和/或活化前，全长ABL蛋白可额外地或选择性地从患者样品中移除。该消耗标签的非限制性示例是结合全长ABL氨基末端区域特 异性抗体的珠（321a）。在这些实施方式中，一旦BCR-ABL通过ABL-C和ABL-C特异性捕获抗体之间的结合所捕获，测定BCR-ABL的总浓度（360），还测量活化的BCR-ABL（370）。在一些实施方式中，所述协助部分（如GO）在不同于所述BCR-ABL捕获抗体识别的表位偶联ABL-C特异性抗体，且所述信号放大对的第一元件（如HRP）偶联BCR-N特异性抗体，。在某些情况中，所述协助部分偶联的抗体是活化状态非依赖性抗体，其结合ABL-C而不论其活化状态，从而测量BCR-ABL（360）的总浓度。在某些其他情况中，所述协助部分偶联的抗体是活化状态依赖性抗体，其结合磷酸ABL-C（如pY245,pY412），从而测量活化的BCR-ABL（370）浓度。 
在所述协助部分是GO且所述信号放大对的第一元件是HRP的实施方式中，GO偶联的抗体和HRP偶联的抗体与BCR-ABL融合蛋白的结合使得GO基序充分邻近HRP部分，从而GO部分生成的信号（即H2O2）可传至HRP部分，产生可检测和/或可放大的信号。如本文所述方法中所用，邻近沟道效应的优点在于与BCR-ABL蛋白的总水平或活化水平相关的单一可检测信号仅在所有三种抗体（例如捕获抗体、协助部分偶联的抗体和信号放大对偶联的抗体）结合时生成，使试验特异性增加、背景降低并简化检测。 
用连接抗体检测BCR-ABL(410)的存在（总水平）和/或活化状态（磷酸化水平）的一个替代实施方式中(400)示于图3B。同样，采用珠(421a和/或421b)通过例如其羧基或氨基末端分别移除全长BCR和/或ABL蛋白。然后，使用固定在固体支持物上的特异性结合部分通过捕获BCR-ABL的N末端部分，测定BCR-ABL的总浓度（440），并测量活化的BCR-ABL（450）。总BCR-ABL（460）和活化蛋白（470）还可通过捕获ABL-C测量，并且用连接抗体测量总BCR-ABL水平或用ABL磷酸化特异性抗体测量活化的BCR-ABL水平。 
具体地，图3B（440）显示生物样品如血清中存在的BCR-ABL总量可通过将捕获分析物与以下接触来检测：(i)对BCR氨基末端区域（BCR-N）和ABL羧基末端区域（ABL-C）之间的融合位置或位点特异的第一检测抗体（即连接抗体），和(ii)对ABL-C特异的第二检测抗体。第一和第二检测抗体都结合BCR-ABL而独立于其活化状态。所述第一检测抗体（即连接抗体）用葡萄糖氧化酶（GO）标记，所述第二检测抗体用辣根过氧化物酶（HRP）标记。第一和第二检测抗体与 BCR-ABL融合蛋白的结合使得GO部分充分邻近HRP部分，从而GO部分生成的信号（即H2O2）可传至HRP部分，产生可检测和/或可放大的信号。 
图3B（450）还显示生物样品如血清中存在的活化BCR-ABL量可通过将捕获分析物与以下接触来检测：(i)对BCR-N和ABL-C之间的融合位置或位点特异的第一检测抗体（即连接抗体），和(ii)对BCR-ABL的活化（如磷酸化）形式特异的第二检测抗体。所述第一检测抗体结合BCR-ABL而独立于其活化状态，而所述第二检测抗体结合所述融合蛋白的ABL-C结构域上存在的活化（如磷酸化）位置。所述第一检测抗体（即连接抗体）用葡萄糖氧化酶（GO）标记，所述第二检测抗体用辣根过氧化物酶（HRP）标记。第一和第二检测抗体与BCR-ABL融合蛋白的结合使得GO部分充分邻近HRP部分，从而GO部分生成的信号（H2O2）可传至HRP基序，产生可检测和/或可放大的信号. 
在步骤(c)和(d)含ELISA的实施方式中，所述ELISA可包括夹心ELISA。任何合适的抗体对可用于在夹心ELISA中捕获并检测抗体。本领域技术人员知道并理解如何选择用于试验的合适抗体对。通常，选择在不同表位结合感兴趣靶标如BCR-ABL的两种抗体，从而第一(捕获)抗体的结合不干扰第二(检测)抗体。在优选的实施方式中，所述第一（捕获）抗体结合所述第一全长蛋白的第二不同结构域（如BCR-N）且所述第二（检测）抗体结合所述第二不同全长蛋白的第一结构域（如ABL-C）。在某些实施方式中，所述检测抗体可偶联有酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶（AP），以协助检测所述复合物。在其它实施方式中，所述试验中可使用结合所述检测抗体的酶(例如，HRP或AP)偶联二级抗体。通常，所述复合物随后用发光底物检测，例如，Ultra LITETM(NAG研究实验室公司（(NAG Research Laboratories）)； 
Figure BDA00001789353400271
(AnaSpec公司)；SuperSignal ELISA飞克级最高灵敏度底物(赛默飞世尔(Thermo Scientific))；SuperSignal ELISA皮克级化学发光底物(赛默飞世尔)；和CPSD(3-(4-甲氧基螺旋{1,2-二氧杂环丁烷-3,2’-(5’-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷}-4-基)磷酸苯二钠盐；Tropix公司)。所述CPSD底物可见于化学发光检测系统中，例如ELISA-LightTM系统(应用生物系统公司（Applied Biosystems）)。在一个优选实施方式中，所述BCR-ABL夹心ELISA包括使用抗BCR-N抗体作为捕获抗体，其中所述捕获抗体限制在固体支持物上如微板孔，且HRP偶联的抗ABL-C抗体用作检测抗体，其中所述检测抗体可包括活化状态非依 赖性抗体或活化状态依赖性（如磷酸特异性）抗体。 
图3C显示用于检测BCR-ABL(510)存在（总水平）和/或活化状态（磷酸化水平）的示例性夹心ELISA实施方式（500）。采用珠(521a和/或521b)通过例如其羧基或氨基末端分别移除全长BCR和/或ABL蛋白。然后，通过ELISA和用特异结合部分捕获BCR-ABL的N末端部分，测定BCR-ABL的总浓度（540），并测量活化的BCR-ABL（550）。还可通过捕获ABL-C然后将捕获的BCR-ABL融合蛋白与BCR-N特异性检测抗体或ABL-C上磷酸化位置特异性检测抗体接触，用ELISA分别测定总BCR-ABL(560)和活化的蛋白(570)。 
在步骤(c)和(d)包括流式细胞（FCM）试验的实施方式中，所述FCM试验可包括荧光活化细胞分选（FACS）试验。流式细胞分析是用于计数和检验微观分子如细胞的技术，将其悬浮于液流中并使之通过电子检测仪器。流式细胞分析可同时进行每秒多至上千个分子的物理和/或化学特征的多参数分析。在流式细胞分析中，单一波长的光束（通常为激光）直接照射在流体聚焦的液流上。许多检测器对准所述流体通过光束的位点：一个与所述光束成一行（正面散射或FSC）和数个与之垂直（侧面散射（SSC）和一个或多个荧光检测器）。穿过所述束的约0.2-约150微米的各悬浮颗粒使射线散射，颗粒中发现的或结合所述颗粒的荧光化学物可激发成发射比光源波长更长的光。散射光和荧光的组合由检测器并通过分析各检测器亮度的波动（各荧光的发射峰值用一个）来挑选，然后可得出关于各个体颗粒的物理和化学结构的各类信息。FSC与细胞体积关联，SSC取决于所述颗粒的内部复杂度。一些流式细胞分析不需要荧光且仅用光散射测量，而其他流式细胞分析形成各个体颗粒的荧光、散射光和透射光的图像。 
FACS是一种特殊类型的流式细胞分析。其提供将异质颗粒混合物分选到两种或多种容器中的方法，一次一种颗粒，其基于各颗粒的特定光散射和荧光特征。它是有用的科学仪器，因为其提供个体颗粒荧光信号的快速、客观和定量的记录以及具体感兴趣的颗粒的物理分离。颗粒悬浮液夹带在狭窄、快速流动的液流中央。安排所述流动从而相对于颗粒直径产生颗粒间的大间隔。振荡机制引起颗粒流碎为个体小滴。调整所述系统从而每个小滴极少可能含多于一种颗粒。在流体碎为小滴之前，所述液流穿过检测各颗粒的感兴趣荧光特征的荧光检测位置。充电环就置于流体碎为小滴的位点。基于之前刚进行的荧光强度检测将电荷置于所述环上，且相反 电荷在流体碎为小滴时陷于小滴上。然后带电的小滴穿过静电偏移系统，其根据电荷将小滴转移到容器中。在一些系统中，所述电荷直接应用于所述液流，且碎裂的小滴保留与所述液流一样符号的电荷。然后所述小滴碎裂后，所述液流恢复中性。FACS试验可用获自BD生物科学公司（加利福尼亚州圣何赛）的FACS Calibur流式细胞仪进行。 
在某些实施方式中，用在不同表位结合感兴趣靶标如BCR-ABL的两种抗体进行FACS试验，从而第一(捕获)抗体的结合不干扰第二(检测)抗体。在优选的实施方式中，所述第一（捕获）抗体结合所述第一全长蛋白的第二不同结构域（如BCR-N）且所述第二（检测）抗体结合所述第二不同全长蛋白的第一结构域（如ABL-C）。在某些实施方式中，所述捕获抗体结合珠如聚苯乙烯珠，且所述珠内部用荧光团染色。在一些实施方式中，所述检测抗体可偶联荧光团或酶，以帮助检测所述复合物。所述检测抗体可包括活化状态非依赖性抗体或活化状态依赖性（如磷酸特异性）抗体。在其它实施方式中，所述试验中可使用结合所述检测抗体的荧光团、酶或其他检测部分。通常，所述复合物随后可如上所述检测。 
在步骤(c)和(d)包括标记分选试验的实施方式中，所述标记分选试验可包括 
Figure BDA00001789353400291
试验。 
Figure BDA00001789353400292
试验可获自例如英杰公司（Invitrogen Corporation(加利福尼亚州卡尔斯巴德)）。在一些情况中，所述标记分选试验包括多重 
Figure BDA00001789353400293
试验形式。通常，选择在不同表位结合感兴趣靶标如BCR-ABL的两种抗体，从而第一(捕获)抗体的结合不干扰第二(检测)抗体。在优选的实施方式中，所述第一（捕获）抗体结合所述第一全长蛋白的第二不同结构域（如BCR-N）且所述第二（检测）抗体结合所述第二不同全长蛋白的第一结构域（如ABL-C）。在某些实施方式中，所述捕获抗体结合聚苯乙烯珠，且所述珠内部用不同强度的红色和红外荧光团染色。在一些实施方式中，所述检测抗体可偶联荧光团或酶，以帮助检测所述复合物。所述检测抗体可包括活化状态非依赖性抗体或活化状态依赖性（如磷酸特异性）抗体。在其它实施方式中，所述试验中可使用结合所述检测抗体的荧光团、酶或其他检测部分。通常，所述复合物随后可例如通过使用检测系统如 
Figure BDA00001789353400294
100TM或200TM检测系统来检测，其中所述珠可根据各分析物的分类和定量在单个文件中由双波长激光器读取。 
图3D显示用于检测BCR-ABL(610)存在（总水平）和/或活化状态（磷酸化水 平）的示例性流式细胞分析和标记分选实施方式（600）。采用珠(621a和/或621b)通过例如其羧基或氨基末端分别移除全长BCR和/或ABL蛋白。然后使用通过特定捕获部分来特异性捕获BCR-ABL氨基部分的珠和对ABL的C末端特异的珠。总蛋白（640）通过计数具有两种特定标记或颜色的珠的分子来测定。相似地，活化蛋白的量可通过使用具有ABL磷酸化部分和BCR-ABL N末端特异性捕获抗体的珠来测定。通过计数这两种特定颜色珠或标记，测量活化的BCR-ABL量（650）。还可通过捕获具有特定捕获珠的ABL的C末端并将捕获的BCR-ABL融合蛋白与对BCR-N特异的珠或对ABL磷酸化部分特异的珠接触，测定总BCR-ABL(660)和活化的蛋白(670)。通过计数这两种特定颜色珠或标记，测量BCR-ABL蛋白的总量（660）和活化量（670）。 
适用于如图3A-3D所示测量BCR-ABL总蛋白和/或活化蛋白水平方法的抗体的非限制性示例包括下表1中所列的那些。 
表1本发明BCR-ABL试验的示例性抗体。 
Figure BDA00001789353400301
结合肿瘤特异性BCR-ABL融合蛋白和非致癌天然全长BCR或ABL蛋白的其它抗体示例包括但不限于，识别b2a2p210BCR-ABL、b3a2p210BCR-ABL、p160BCR、和p130BCR蛋白的BCR b2-表位特异性单克隆抗体7C6，如Dhut等，Oncogene,3:561-6(1988)所述；识别e1a2p190BCR-ABL、b2a2、b3a2、和p145ABL蛋白的SH2结构域特异性抗体8E9，如美国专利号5,369,008和6,610,498所述；BCR特异性抗体的氨基末端，如美国专利号6,107,457所述；和圣克鲁斯生物技术公司（加利福尼亚州圣克鲁斯)）的ABL-特异性(24-11)小鼠单克隆抗体#SC-23 的羧基末端。 
适用于结合BCR-ABL嵌合蛋白内融合位置或位点的连接抗体的示例包括但不限于获自细胞信号传导技术公司（马萨诸塞州丹弗斯市）的BCR-ABL b2a2连接特异性(L99H4)小鼠单克隆抗体#3908、美国专利公开号20050214301所述的p210BCR-ABL融合蛋白-特异性分离抗体、van Denderen等，Leukemia,6:1107-12(1992)所述的BCR-ABL b3a2连接特异性多克隆抗体BP-2、和van Denderen等，Leukemia,8:1503-9(1994)所述的BCR-ABL e1a2连接特异性单克隆抗体(ER-FP1)。BCR-ABL连接抗体可用于检测关联（但不限于）Ph-阳性白血病的BCR-ABL融合蛋白。 
在某些实施方式中，提供本发明的方法用于通过回收或分离感兴趣的细胞如白细胞（如慢性髓性白血病（CML）细胞）从新鲜收集或冷冻的骨髓（如骨髓抽吸物）或全血样品制备细胞提取物，例如使用磁珠捕获和抗CD45抗体和/或抗CD15抗体，且细胞回收或分离后不用任何清洗步骤。可分析所得细胞提取物的一种或多种致癌融合蛋白如BCR-ABL、其底物、其途径或其组合的表达和/或活化水平。不受任何具体理论限制，细胞分离后不需要任何清洗步骤具有优势，因为感兴趣的细胞可从血液或骨髓样品中回收，而不改变抗癌药如酪氨酸激酶抑制剂的胞内浓度。如下述实施例9所列，本文所述的不用任何清洗步骤的细胞分离与本领域接受的细胞分离后清洗细胞的实践（如清洗结合珠的细胞）相反，并提供来自回收细胞的细胞提取物而不用对细胞内的抗癌药如酪氨酸激酶抑制剂(如 
Figure BDA00001789353400311
Figure BDA00001789353400312
等)进行大量稀释。 
在替代实施方式中，本发明的方法提供对致癌融合蛋白（如BCR-ABL）以及含所述致癌融合蛋白中发现的序列或结构域（如全长BCR和/或ABL）的一种或两种天然全长蛋白的总量和/或活化状态的同时检测。在一个具体实施方式中，本方法可用于检测和/或测量生物样品如血液或骨髓抽吸物样品中两种总BCR-ABL水平以及总天然全长BCR和/或ABL水平。在某些实施方式中，天然蛋白（如全长BCR和/或ABL）水平与致癌融合蛋白（如BCR-ABL）水平在单板上以多重方法一起检测。在这些实施方式中，天然全长蛋白可优选与致癌融合蛋白一起分离，从而在同一板上测定这些分子的水平。 
如下述实施例10所述，本发明方法的这些替代实施方式可用于检测和/或测量 总BCR-ABL水平以及总天然全长BCR或ABL水平，并可计算总BCR-ABL水平与天然全长BCR或ABL水平的比例。在一些情况中，计算BCR-ABL水平与天然全长BCR或ABL水平之比以提供响应指示剂例如主要分子响应（MMR）、完全分子响应（CMR）、完全细胞遗传反应（CCyR）及其组合的更精确测定。在其他情况中，本发明方法的这些替代实施方式可用于监控BCR-ABL相对对照如天然全长BCR或ABL的表达变化（例如通过计算总BCR-ABL水平与天然全长BCR或ABL水平之比），其随着治疗而变化（如酪氨酸激酶抑制剂治疗）。 
本发明的方法特别用于检测有发展癌症风险、怀疑患有或诊断有癌症如血液恶性肿瘤（如白血病、淋巴瘤等）的患者中一种或多种致癌融合蛋白如BCR-ABL的活化（如磷酸化）状态。在某些情况中，本发明方法通过测量活化的（如磷酸化）致癌融合蛋白水平（如磷酸化BCR-ABL水平）以测定对象是否表达所述致癌融合蛋白的活化形式（如BCR-ABL阳性患者）来帮助、辅助、或促进对象中的癌症诊断。在其他实施方式中，本发明方法在已测定表达致癌融合蛋白的活化形式的对象上进行以最优化治疗、降低毒性、和/或监控治疗性疗法的功效。在这些实施方式的一个具体方面，活化的BCR-ABL蛋白的水平可于疗程期间（如患者处于抗癌药治疗如 
Figure BDA00001789353400321
等时）在BCR-ABL阳性患者中测定以最优化治疗、降低毒性、和/或监控治疗性疗法的功效。在一些实施方式中，致癌融合蛋白（如BCR-ABL）的总水平和活化（磷酸化）水平按照本发明基于抗体的试验测量，并可计算活化与总致癌融合蛋白水平之比（如磷酸化/总BCR-ABL蛋白水平之比）并用于评价对象的疗程，如通过比较所述磷酸化/总致癌融合蛋白水平之比与早期该对象同样计算的比例（如抗癌药治疗早期或抗癌药治疗之前的时间点）。在某些实施方式中，活化与总致癌融合蛋白水平之比（如磷酸化/总BCR-ABL蛋白水平之比）可相对与一种或多种对照蛋白计算，所述对照蛋白例如含所述致癌融合蛋白中发现的序列或结构域（如BCR-ABL融合蛋白的BCR和/或ABL）的一种或两种天然全长蛋白。在优选实施方式中，所述对照蛋白的总水平不受影响或主要由所述抗癌药治疗改变。 
本发明的方法还特别用于检测有发展癌症风险、怀疑患有或诊断有癌症如血液恶性肿瘤（如白血病、淋巴瘤等）的患者中与一种或多种致癌融合蛋白如BCR-ABL相关途径中一种或多种信号转导分子的活化（如磷酸化）状态。示例性信号转导分 子包括BCR-ABL底物如CRKL、JAK2、STAT5、Src、FAK、c-ABL、c-CBL、SHC、SHP-2、VAV、BAP-1和其组合。在某些情况中，本发明方法通过测量活化的（如磷酸化）致癌融合蛋白水平（如磷酸BCR-ABL水平）和活化的（如磷酸化）信号转导分子水平（如磷酸CRKL、磷酸JAK2、磷酸STAT5等的水平）以测定对象是否表达所述致癌融合蛋白的活化形式（如BCR-ABL阳性患者）和/或所述途径中一种或多种信号转导分子的活化形式来帮助、辅助、或促进对象中的癌症诊断。在其他实施方式中，本发明方法在已测定表达致癌融合蛋白的活化形式的对象上进行以最优化治疗、降低毒性、和/或监控治疗性治疗的功效。在这些实施方式的一个具体方面，活化的BCR-ABL蛋白和一种或多种信号转导途径组分（如CRKL、JAK2、STAT5、Src、FAK等）的水平可于疗程期间（如患者处于抗癌药治疗如 
Figure BDA00001789353400331
等时）在BCR-ABL阳性患者中测定以最优化治疗、降低毒性、和/或监控治疗性治疗的功效。在一些实施方式中，致癌融合蛋白（如BCR-ABL）的总水平和活化（磷酸化）水平按照本发明基于抗体的试验测量，并可(例如相对一种或多种对照蛋白水平)计算活化与总致癌融合蛋白水平之比（如磷酸化/总BCR-ABL蛋白水平之比）并用于评价对象的疗程，如通过比较所述磷酸化/总致癌融合蛋白水平之比与早期该对象同样计算的比例（如抗癌药治疗早期或抗癌药治疗之前的时间点）。在其他实施方式中，测量信号转导途径组分的总水平和活化水平，并可(例如相对一种或多种对照蛋白水平)计算活化与总信号转导途径组分水平之比（如CRKL、JAK2、或STAT5的磷酸化/总蛋白水平之比）并用于评价对象的疗程，如通过比较所述磷酸化/总信号转导途径组分水平之比与早期该对象同样计算的比例（如抗癌药治疗早期或抗癌药治疗之前的时间点）。在某些情况中，致癌融合蛋白（如BCR-ABL）的表达水平可与下游信号转导组分如CRKL、JAK2、STAT5、Src、FAK等的活化（如磷酸化）水平关联或相关。 
在一个具体方面，本发明提供给患癌并接受癌症治疗疗程的对象最佳化治疗和/或降低毒性的方法，所述方法包括： 
(a)给予抗癌药（如一种或多种酪氨酸激酶抑制剂如 
Figure BDA00001789353400332
Figure BDA00001789353400333
等）后分离癌细胞； 
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物； 
(c)用本文所述试验测量所述细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化（如 磷酸化）水平；和 
(d)将所测致癌融合蛋白的表达和/或活化水平与疗程早期所测的致癌融合蛋白的表达和/或活化水平作比较；和 
(e)基于步骤(d)的比较确定所述对象疗程的后续剂量或是否需给予对象不同的疗程。 
在具体实施方式中，如通过进行本文所述邻近试验之一在细胞提取物中检测所述致癌融合蛋白的表达水平和活化水平。在某些优选实施方式中，所述致癌融合蛋白包括BCR-ABL。在某些其他优选实施方式中，所述对象表达致癌融合蛋白的活化形式。在具体优选的实施方式中，所述对象为BCR-ABL阳性（如在给予所述抗癌药之所述对象确定为具有可检测的磷酸BCR-ABL水平）。 
在一些实施方式中，在所述细胞提取物中按照本发明基于抗体的试验测量致癌融合蛋白（如BCR-ABL）的总水平和活化（磷酸化）水平，并可计算活化与总致癌融合蛋白水平之比（如磷酸化/总BCR-ABL蛋白水平之比）并用于评价对象的疗程，如通过比较所述磷酸化/总致癌融合蛋白水平之比与早期该对象同样计算的比例（如抗癌药治疗早期或抗癌药治疗之前的时间点）。如下述实施例6所示，抗癌药抑制后致癌融合蛋白（如BCR-ABL）的磷酸化/总水平之比与抗癌药治疗后活化的（如磷酸化）致癌融合蛋白（如磷酸BCR-ABL）信号的抑制百分比相关联（参见例如图14C、15C和16C）。在其他实施方式中，活化与总致癌融合蛋白水平之比（如磷酸化/总BCR-ABL蛋白水平之比）可相对与一种或多种对照蛋白计算，所述对照蛋白例如含所述致癌融合蛋白中发现的序列或结构域（如BCR-ABL的BCR和/或ABL）的一种或两种天然全长蛋白。在优选实施方式中，所述对照蛋白的总水平不受影响或主要由所述抗癌药治疗改变。 
在本文所述方法的最优化治疗的某些方面，对象中致癌融合蛋白（如BCR-ABL）的活化（如磷酸化）水平受到的抑制低于约50%表示需要增加疗程的后续剂量或给予不同的疗程（如通过转换不同抗癌药来改变当前疗程），从而阻止或降低所述对象中癌症复发的风险。作为非限制性示例，在对象进行 
Figure BDA00001789353400341
治疗的情况中，BCR-ABL融合蛋白的磷酸化水平受到的抑制低于约50%表示需要增加 的后续剂量或将患者转成 
Figure BDA00001789353400343
治疗。在某些情况中，对象中致癌融合蛋白（如BCR-ABL）的活化（如磷酸化）水平受到的抑制低于约49%、48%、47%、 46%、45%、44%、43%、42%、41%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、或5%表示需要增加疗程的后续剂量或改变当前疗程。在一些实施方式中，测定致癌融合蛋白活化水平的抑制百分比可通过计算致癌融合蛋白的活化与总水平之比（如BCR-ABL蛋白的磷酸化/总水平之比），任选相对于一种或多种对照蛋白水平（如BCR-ABL的全长BCR和/或ABL），并比较所述磷酸化/总致癌融合蛋白水平之比与早期该对象同样计算的比例（如抗癌药治疗早期或抗癌药治疗之前的时间点）。本领域技术人员了解当前疗程可调整为合适的较高或较低剂量，从而优化药物治疗，例如至少高于或低于当前剂量约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、或100倍的后续剂量。 
在最优化治疗方法的某些其他方面，对象中致癌融合蛋白（如BCR-ABL）的活化（如磷酸化）水平受到的抑制低于约50%表示所述对象未依从所述疗程（如所述对象没有按规律或按医师指导服用抗癌药）和/或存在与疗程相关的可能的副作用或毒性。在这些实施方式中，建议仔细监控（例如由医师或其他护理人员）对当前疗程的依从性，或给予不同疗程（如通过转换不同抗癌药而改变当前疗程）从而增加依从性和/或阻止或降低副作用的风险。在某些情况中，对象中致癌融合蛋白的活化水平受到的抑制低于约49%、48%、47%、46%、45%、44%、43%、42%、41%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、或5%表示所述对象未依从所述疗程和/或存在与疗程相关的可能的副作用或毒性。在一些实施方式中，测定致癌融合蛋白活化水平的抑制百分比可通过计算致癌融合蛋白的活化与总水平之比（如BCR-ABL蛋白的磷酸化/总水平之比），任选相对于一种或多种对照蛋白水平（如BCR-ABL的全长BCR和/或ABL），并比较所述磷酸化/总致癌融合蛋白水平之比与早期该对象同样计算的比例（如抗癌药治疗早期或抗癌药治疗之前的时间点）。 
本文所述最优化治疗方法的其他方面，对象中致癌融合蛋白的活化水平受到的抑制高于约80%表示所述患者在以正确剂量进行正确的治疗。在某些情况中，对象中致癌融合蛋白（如BCR-ABL）的活化（如磷酸化）水平受到的抑制高于约81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%表示所述患者在以正确剂量进行正确的 抗癌药治疗。在一些实施方式中，测定致癌融合蛋白活化水平的抑制百分比可通过计算致癌融合蛋白的活化与总水平之比（如BCR-ABL蛋白的磷酸化/总水平之比），任选相对于一种或多种对照蛋白水平（如BCR-ABL的全长BCR和/或ABL），然后比较所述磷酸化/总致癌融合蛋白水平之比与早期该对象同样计算的比例（如抗癌药治疗早期或抗癌药治疗之前的时间点）。 
在一个相关方面，本发明提供给患癌并接受癌症治疗疗程的对象最佳化治疗和/或降低毒性的方法，所述方法包括： 
(a)给予抗癌药（如一种或多种酪氨酸激酶抑制剂如 
Figure BDA00001789353400361
Figure BDA00001789353400362
等）后分离癌细胞； 
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物； 
(c)用本文所述试验测量所述细胞提取物中致癌融合蛋白和其途径中一种或多种信号转导分子的表达和/或活化（如磷酸化）水平；和 
(d)将所测致癌融合蛋白和信号转导分子的表达和/或活化水平与疗程早期所测的致癌融合蛋白和信号转导分子的表达和/或活化水平作比较；和 
(e)基于步骤(d)的比较确定所述对象疗程的后续剂量或是否需给予对象不同的疗程。 
在具体实施方式中，如通过进行本文所述邻近试验之一在细胞提取物中检测所述致癌融合蛋白和一种或多种信号转导分子的表达水平和活化水平。在某些优选实施方式中，所述致癌融合蛋白包括BCR-ABL。在某些其他优选实施方式中，信号转导分子包括BCR-ABL底物如CRKL、JAK2、STAT5、Src、FAK、c-ABL、c-CBL、SHC、SHP-2、VAV、BAP-1和其组合。在其他实施方式中，所述对象表达致癌融合蛋白的活化形式。在具体优选的实施方式中，所述对象为BCR-ABL阳性（如在给予所述抗癌药之前所述对象确定为具有可检测的磷酸化BCR-ABL水平）。 
在一些实施方式中，致癌融合蛋白（如BCR-ABL）的总水平和活化（磷酸化）水平和信号转导途径组分（如CRKL、JAK2或STAT5）水平按照本发明基于抗体的试验测量，并可计算活化与总致癌融合蛋白水平之比（如磷酸化/总BCR-ABL蛋白水平之比）和活化与总信号转导途径组分水平之比（如CRKL、JAK2、或STAT5蛋白磷酸化/总水平之比）并用于评价对象的疗程，如通过比较致癌融合蛋白和信号转导途径组分的磷酸化/总水平之比与早期该对象同样计算的比例（如抗癌药治 疗早期或抗癌药治疗之前的时间点）。在其他实施方式中，活化与总致癌融合蛋白水平之比（如磷酸化/总BCR-ABL蛋白水平之比）和活化与总信号转导分子水平之比（如CRKL、JAK2、或STAT5蛋白磷酸化/总水平之比）可相对于一种或多种对照蛋白计算，所述对照蛋白例如含所述致癌融合蛋白中发现的序列或结构域（如BCR-ABL的BCR和/或ABL）的一种或两种天然全长蛋白。在优选实施方式中，所述对照蛋白的总水平不受影响或主要由所述抗癌药治疗改变。 
在本文所述最优化治疗方法的某些方面，对象中1、2、3、4、5、6或更多种致癌融合蛋白（如BCR-ABL）和/或信号转导途径组分（如CRKL、JAK2、STAT5）的活化（如磷酸化）水平受到的抑制低于约50%表示需要增加疗程的后续剂量或给予不同的疗程（如通过转换不同抗癌药来改变当前疗程），从而阻止或降低所述对象中癌症复发的风险。作为非限制性示例，在对象进行 治疗的情况中，BCR-ABL融合蛋白和/或信号转导途径组分如CRKL、JAK2、和/或STAT5的磷酸化水平受到的抑制低于约50%表示需要增加 
Figure BDA00001789353400372
的后续剂量或将患者转成 
Figure BDA00001789353400373
治疗。在某些情况中，对象中1、2、3、4、5、6、或更多致癌融合蛋白（如BCR-ABL）和/或信号转导组分（如CRKL、JAK2、STAT5）的活化（如磷酸化）水平受到的抑制低于约49%、48%、47%、46%、45%、44%、43%、42%、41%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、或5%表示需要增加疗程的后续剂量或改变当前疗程。在一些情况中，测定致癌融合蛋白和/或信号转导分子活化水平的抑制百分比可通过计算致癌融合蛋白的活化与总水平之比（如BCR-ABL蛋白的磷酸化/总水平之比）和/或信号转导途径组分的活化与总水平之比（如CRKL、JAK2、或STAT5蛋白的磷酸化/总水平之比），任选相对于一种或多种对照蛋白水平（如BCR-ABL的全长BCR和/或ABL），并比较所计算的磷酸化/总水平之比与早期该对象相同计算的比例（如抗癌药治疗早期或抗癌药治疗之前的时间点）。本领域技术人员了解当前疗程可调整为合适的较高或较低剂量，从而优化药物治疗，例如至少高于或低于当前剂量约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、或100倍的后续剂量。 
在最优化治疗方法的某些其他方面，对象中1、2、3、4、5、6、或更多致癌融合蛋白（如BCR-ABL）和/或信号转导途径组分（如CRKL、JAK2、STAT5） 的活化（如磷酸化）水平受到的抑制低于约50%表示所述患者未依从所述疗程（如所述对象没有按规律或按医师指导服用抗癌药）和/或存在与疗程相关的可能的副作用或毒性。在这些实施方式中，建议仔细监控（例如由医师或其他护理人员）对当前疗程的依从性，或给予不同疗程（如通过转换不同抗癌药而改变当前疗程）从而增加依从性和/或阻止或降低副作用的风险。在某些情况中，对象中1、2、3、4、5、6、或更多致癌融合蛋白（如BCR-ABL）和/或信号转导组分（如CRKL、JAK2、STAT5）的活化水平受到的抑制低于约49%、48%、47%、46%、45%、44%、43%、42%、41%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、或5%表示所述患者未依从所述疗程和/或存在与疗程相关的可能的副作用或毒性。在一些实施方式中，测定致癌融合蛋白的抑制百分比和/或信号转导分子的活化水平抑制百分比可通过计算致癌融合蛋白的活化与总水平之比（如BCR-ABL蛋白的磷酸化/总水平之比）和/或信号转导途径组分的活化与总水平之比（如CRKL、JAK2、或STAT5蛋白的磷酸化/总水平之比），任选相对于一种或多种对照蛋白水平（如BCR-ABL的全长BCR和/或ABL），并比较所计算的磷酸化/总水平之比与早期该对象同样计算的比例（如抗癌药治疗早期或抗癌药治疗之前的时间点）。 
在本文所述最优化治疗方法的其他方面，对象中1、2、3、4、5、6、或更多致癌融合蛋白（如BCR-ABL）和/或信号转导途径组分（如CRKL、JAK2、STAT5）的活化（如磷酸化）水平受到的抑制高于约80%表示所述患者在以正确剂量进行正确的治疗。在某些情况中，对象中1、2、3、4、5、6、或更多致癌融合蛋白（如BCR-ABL）和/或信号转导途径组分（如CRKL、JAK2、STAT5）的活化（如磷酸化）水平受到的抑制高于约81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、或100%表示所述患者在以正确剂量进行正确的抗癌药治疗。在一些实施方式中，测定致癌融合蛋白和/或信号转导分子活化水平的抑制百分比可通过计算致癌融合蛋白的活化与总水平之比（如BCR-ABL蛋白的磷酸化/总水平之比）和/或信号转导途径组分的活化与总水平之比（如CRKL、JAK2、或STAT5蛋白的磷酸化/总水平之比），任选相对于一种或多种对照蛋白水平（如BCR-ABL的全长BCR和/或ABL），然后比较所计算的磷酸化/总水平之比与早期该对象同样计算的比例（如抗癌药治疗早期或抗癌药治疗之前的时间点）。 
本文所述最优化治疗方法的其他方面中，替代信号转导途径的活化表明需要改变或调节当前疗程（如转换不同抗癌药）。作为非限制性示例，在对象进行 
Figure BDA00001789353400391
治疗的情况中，替代信号转导途径如Src的活化（磷酸化）表明需要将所述对象转成用 
Figure BDA00001789353400392
或 
Figure BDA00001789353400393
治疗。 
在另一方面，本发明提供选择用于治疗癌症的合适抗癌药的方法，所述方法包括： 
(a)给予抗癌药之后或用抗癌药孵育前分离癌细胞； 
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物； 
(c)用本文所述试验测定所述细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化（如磷酸化）水平；和 
(d)测定所述抗癌药适合或是不适合用于治疗癌症，通过对比所述致癌融合蛋白的表达和/或活化水平与没有所述抗癌药时产生的参比表达和/或活化分布。 
在优选的实施方式中，选择用于治疗癌症的合适抗癌药的方法包括： 
(a)给予抗癌药之后或用抗癌药孵育前分离癌细胞； 
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物； 
(c)用试验测定细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化（如磷酸化）水平，所述试验包括系列稀释的致癌融合蛋白特异性捕获抗体，其中所述捕获抗体限制在固体支持物上； 
(d)对比所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与没有所述抗癌药时产生的参比表达和/或活化分布；和 
(e)当所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与参比表达和/或活化分布相比发生改变（如显著降低）时表明所述抗癌药适用于治疗癌症。 
在一些实施方式中，本发明方法可用于帮助或辅助选择合适的抗癌药以治疗癌症如血液恶性肿瘤。在其他实施方式中，本发明方法可用于改善选择合适的抗癌药以治疗癌症如血液恶性肿瘤。在某些实施方式中，所述方法另外或替代地包括步骤：当所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与参比表达和/或活化分布相比没有发生改变（如无显著降低）时表明所述抗癌药不适用于治疗癌症。在其他实施方式中，除了检测一种或多种致癌融合蛋白外，还检测细胞提取物中存在的一种或多种信号转导分子，并基于该“分子分布”确定所述抗癌药合适或不合适。 
在另一方面，本发明提供鉴定癌症对抗癌药治疗响应的方法，所述方法包括： 
(a)给予抗癌药之后或用抗癌药孵育前分离癌细胞； 
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物； 
(c)用本文所述试验测定所述细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化（如磷酸化）水平；和 
(d)通过对比所述致癌融合蛋白的表达和/或活化水平与没有所述抗癌药时产生的参比表达和/或活化分布来鉴定所述癌症对所述抗癌药治疗响应或不响应。 
在优选的实施方式中，鉴定癌症对抗癌药治疗响应的方法包括： 
(a)给予抗癌药之后或用抗癌药孵育前分离癌细胞； 
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物； 
(c)用试验测定细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化（如磷酸化）的水平，所述试验包括系列稀释的致癌融合蛋白特异性捕获抗体，其中所述捕获抗体限制在固体支持物上； 
(d)对比所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与没有所述抗癌药时产生的参比表达和/或活化分布；和 
(e)当所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与参比表达和/或活化分布相比发生改变（如显著降低）时表明所述癌症对所述抗癌药治疗响应。 
在一些实施方式中，本发明方法可用于帮助或辅助鉴定癌症如血液恶性肿瘤对抗癌药治疗的响应。在其他实施方式中，本发明方法可用于改善鉴定癌症如血液恶性肿瘤对抗癌药治疗的响应。在某些实施方式中，所述方法另外或替代地包括步骤：当所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与参比表达和/或活化分布相比没有发生改变（如无显著降低）时表明所述癌症对所述抗癌药治疗不响应。在其他实施方式中，除了检测一种或多种致癌融合蛋白外，还检测细胞提取物中存在的一种或多种信号转导分子，并基于该“分子分布”鉴定所述癌症对治疗响应或不响应。 
在另一方面，本发明提供预测患癌对象响应抗癌药治疗的方法，所述方法包括： 
(a)给予抗癌药之后或用抗癌药孵育前分离癌细胞； 
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物； 
(c)用本文所述试验测定所述细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化（如磷酸化）水平；和 
(d)通过对比所述致癌融合蛋白的表达和/或活化水平与没有所述抗癌药时产生的参比表达和/或活化分布来预测所述对象响应抗癌药治疗的可能性。 
在优选的实施方式中，预测患癌对象响应抗癌药治疗的方法包括： 
(a)给予抗癌药之后或用抗癌药孵育前分离癌细胞； 
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物； 
(c)用试验测定细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化（如磷酸化）的水平，所述试验包括系列稀释的致癌融合蛋白特异性捕获抗体，其中所述捕获抗体限制在固体支持物上； 
(d)对比所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与没有所述抗癌药时产生的参比表达和/或活化分布；和 
(e)当所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与参比表达和/或活化分布相比发生改变（如显著降低）时表明所述对象可能响应所述抗癌药治疗。 
在一些实施方式中，本发明方法可用于帮助或辅助预测对象响应抗癌药治疗癌症如血液恶性肿瘤的可能性。在其他实施方式中，本发明方法可用于改善预测对象对抗癌药治疗癌症如血液恶性肿瘤响应的可能性。在某些实施方式中，所述方法另外或替代地包括步骤：当所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与参比表达和/或活化分布相比没有发生改变（如无显著降低）时表明所述对象可能对所述抗癌药治疗不响应。在其他实施方式中，除了检测一种或多种致癌融合蛋白外，还检测细胞提取物中存在的一种或多种信号转导分子，并基于该“分子分布”预测所述对象响应治疗的可能性。 
在另一方面，本发明提供测定患癌对象是否耐受抗癌药治疗的方法，所述方法包括： 
(a)给予抗癌药之后或用抗癌药孵育前分离癌细胞； 
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物； 
(c)用本文所述试验测定所述细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化（如磷酸化）水平；和 
(d)通过对比所述致癌融合蛋白的表达和/或活化水平与没有所述抗癌药时产生的参比表达和/或活化分布来测定所述对象对所述抗癌药治疗是耐受或是敏感。 
在优选的实施方式中，测定患癌对象是否耐受抗癌药治疗的方法包括： 
(a)给予抗癌药之后或用抗癌药孵育前分离癌细胞； 
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物； 
(c)用试验测定细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化（如磷酸化）的水平，所述试验包括系列稀释的致癌融合蛋白特异性捕获抗体，其中所述捕获抗体限制在固体支持物上； 
(d)对比所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与没有所述抗癌药时或早期存在所述抗癌药时产生的参比表达和/或活化分布；和 
(e)当所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与参比表达和/或活化分布相比没有发生改变（如没有显著降低）时表明所述对象耐受所述抗癌药治疗。 
在一些实施方式中，本发明方法可用于帮助或辅助鉴定耐受抗癌药治疗的患癌对象或测定患癌对象是否耐受抗癌药治疗，其中所述对象患有癌症如血液恶性肿瘤。在其他实施方式中，本发明方法可用于改善鉴定耐受抗癌药治疗的患癌对象或测定患癌对象是否耐受抗癌药治疗，其中所述对象患有癌症如血液恶性肿瘤。 
在某些实施方式中，所述方法另外或替代地包括步骤：当所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化（如磷酸化）水平与参比表达或活化分布相比发生改变（如显著降低）时表明所述对象对所述抗癌药治疗敏感。患癌对象耐受抗癌药治疗的原因的非限制性示例包括感兴趣的致癌融合蛋白（如BCR-ABL）中存在一种或多种突变、不依从治疗方案、和/或给予未达最佳的药物剂量。对于所述抗癌药未达最佳的药物剂量，本方法还可包括增加给予所述对象的所述抗癌药的下次或后续剂量。在其他实施方式中，除了检测一种或多种致癌融合蛋白外，还检测细胞提取物中存在的一种或多种信号转导分子，并基于该“分子分布”鉴定所述对象对治疗抵抗或敏感。 
在具体的实施方式中，当抗癌药存在下的致癌融合蛋白或信号转导分子的表达（如总）或活化（如磷酸化）水平比没有抗癌药情况下高或低至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、或95%时，认为其发生“改变”。在一个实施方式中，当抗癌药存在下致癌融合蛋白或信号转导分子的表达（如总）或活化（如磷酸化）水平比没有抗癌药情况下低至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、 或95%时，认为其“显著降低”。在另一实施方式中，当下述情况时，存在抗癌药时致癌融合蛋白或信号转导分子的表达（如总）水平和/或活化（如磷酸化）水平被认为发生“显著降低”：(1)没有抗癌药的致癌融合蛋白或信号转导分子的高或强表达和/或活化变为有抗癌药时的致癌融合蛋白或信号转导分子的中等、弱、低、或极弱表达和/或活化，或(2)没有抗癌药的致癌融合蛋白或信号转导分子的中等表达和/或活化变为有抗癌药时的致癌融合蛋白或信号转导分子的弱、低、或极弱表达和/或活化。 
在一些实施方式中，致癌融合蛋白或信号转导分子的表达水平和/或活化水平表示为相对荧光单位(RFU)值，其对应于用例如邻近试验如本文所述协同邻近免疫试验（COPIA）测定的感兴趣具体分析物的信号强度。在其他实施方式中，致癌融合蛋白或信号转导分子的表达水平和/或活化水平表示为“-”、“±”、“+”、“++”、“+++”、或“++++”，其对应于用例如邻近试验如COPIA测定的感兴趣具体分析物的信号强度。在一些情况中，用例如邻近试验如COPIA测定的感兴趣具体分析物的无法检测或最小可检测表达或活化水平可表示为“-”或“±”。在其他情况中，用例如邻近试验如COPIA测定的感兴趣具体分析物的低表达或活化水平可表示为“+”。在其他情况中，用例如邻近试验如COPIA测定的感兴趣具体分析物的中等表达或活化水平可表示为“++”。在其他情况中，用例如邻近试验如COPIA测定的感兴趣具体分析物的高表达或活化水平可表示为“+++”。在其他情况中，用例如邻近试验如COPIA测定的感兴趣具体分析物的极高表达或活化水平可表示为“++++”。 
在其他实施方式中，致癌融合蛋白或信号转导分子的表达水平和/或活化水平用校准或归一化的RFU值定量，其用例如邻近试验如COPIA针对就感兴趣具体分析物生成的标准曲线测定。在某些情况中，计算单元（CU）值可基于所述标准曲线计算。在其他情况中，所述CU值可根据上述信号强度表示为“-”、“±”、“+”、“++”、“+++”、或“++++”。 
在某些实施方式中，感兴趣的具体分析物的表达或活化水平表示为“-”、“±”、“+”、“++”、“+++”、或“++++”，其可对应于比参比表达水平或活化水平，例如与阴性对照如IgG对照相比、与就感兴趣分析物生成的标准曲线相比、与阳性对照如pan-CK对照相比、与存在抗癌药时测定的表达或活化水平相比、和/或与没有抗癌药时测定的表达或活化水平相比，高或低至少约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、 5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、或100倍(例如，高或低约1.5-3、2-3、2-4、2-5、2-10、2-20、2-50、3-5、3-10、3-20、3-50、4-5、4-10、4-20、4-50、5-10、5-15、5-20、或5-50倍)的表达或活化水平。在一些情况中，所述关联是分析物特异的。作为非限制性示例，使用例如邻近试验如COPIA测定的“+”表达或活化水平可对应于一种分析物的表达或活化相较参比表达或活化水平增加2倍和另一分析物增加5倍。 
在具体实施方式中，细胞提取物中的致癌融合蛋白（如BCR-ABL）或信号转导分子的总水平和活化（磷酸化）水平按照本发明基于抗体的试验测量，并可计算活化与总致癌融合蛋白水平之比（如磷酸化/总BCR-ABL蛋白水平之比）或活化与总信号转导分子水平之比（如CRKL、JAK2、或STAT5蛋白的磷酸化/总水平之比），然后与根据没有所述抗癌药时产生的参比表达和活化分布同样计算的比例作比较。 
在一些实施方式中，步骤(c)中所测定的致癌融合蛋白或信号转导分子的参比表达或活化水平获自没有患诸如血液恶性肿瘤等癌症的健康个体的正常细胞如非癌细胞。在某些其他实施方式中，步骤(c)中所测定的致癌融合蛋白或信号转导分子的参比表达或活化水平获自诸如白血病或淋巴瘤等癌症患者样品（如细胞提取物）的肿瘤细胞。 
在一些实施方式中，步骤(c)中所测定的致癌融合蛋白或信号转导分子的参比表达或活化水平获自没有用抗癌药处理的细胞（如获自患者样品的肿瘤细胞）。在具体实施方式中，没有用抗癌药处理的细胞获自与获得用于产生所述细胞提取物的分离细胞（如待测定的试验细胞）的相同样品。在某些情况中，致癌融合蛋白或信号转导分子的表达或活化水平低于参比表达或活化水平表明所述抗癌药适用于治疗癌症（如所述肿瘤响应所述抗癌药的可能性增加）。在某些其他情况中，与参比表达或活化水平相比，致癌融合蛋白或信号转导分子的表达或活化水平相同、相似或更高表明所述抗癌药不适用于治疗癌症（如所述肿瘤响应所述抗癌药的可能性降低）。 
在替代的实施方式中，步骤(c)中所测定的致癌融合蛋白或信号转导分子的参比表达或活化水平获自用抗癌药处理的对抗癌药敏感的细胞。在该实施方式中，与参比表达或活化水平相比，致癌融合蛋白或信号转导分子的表达或活化水平相同、 相似、或较低表明所述抗癌药适用于治疗癌症（如所述肿瘤响应所述抗癌药的可能性增加）。在某些其他实施方式中，步骤(c)中所测定的致癌融合蛋白或信号转导分子的参比表达或活化水平获自用抗癌药处理的耐受抗癌药的细胞。在该实施方式中，与参考表达或活化水平相比，致癌融合蛋白或信号转导分子的表达或活化水平相同、相似或更高表明所述抗癌药不适用于治疗癌症（如所述肿瘤响应所述抗癌药的可能性降低）。 
在某些实施方式中，当未用所述抗癌药处理的细胞（例如获自患者样品的癌细胞）中、用所述抗癌药处理的抗癌药敏感性细胞中、或用所述抗癌药处理的抗癌药耐受性细胞中的表达或活化水平比相应分析物的参比表达或活化水平高至少约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、或100倍(例如，高约1.5-3、2-3、2-4、2-5、2-10、2-20、2-50、3-5、3-10、3-20、3-50、4-5、4-10、4-20、4-50、5-10、5-15、5-20、或5-50倍)时，认为步骤(c)所测的致癌融合蛋白或信号转导分子的较高表达或活化水平存在于细胞提取物中。 
在其他实施方式中，当未用所述抗癌药处理的细胞（例如获自患者样品的癌细胞）中、用所述抗癌药处理的抗癌药敏感性细胞中、或用所述抗癌药处理的抗癌药耐受性细胞中的表达或活化水平比相应分析物的参比表达或活化水平低至少约1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、或100倍(例如，低约1.5-3、2-3、2-4、2-5、2-10、2-20、2-50、3-5、3-10、3-20、3-50、4-5、4-10、4-20、4-50、5-10、5-15、5-20、或5-50倍)时，认为步骤(c)所测的致癌融合蛋白或信号转导分子的较低表达或活化水平存在于细胞提取物中。 
A.抗体阵列 
在一个方面，本发明提供具有优越动态范围的阵列，所述阵列含对细胞提取物中一种或多种分析物特异的多种捕获抗体系列稀释，其中所述捕获抗体限制在固体支持物上。 
在一些实施方式中，所述细胞提取物用全血、尿液、痰、支气管灌洗液、泪液、乳头抽吸物、淋巴、唾液和/或细针抽吸物（FNA）样品制备。作为非限制性示例，全血样品可首先分离为血浆或血清组分和细胞组分（即细胞团）。所述细胞组分通 常含红细胞、白细胞（白血球）、和/或实体瘤的循环细胞如循环肿瘤细胞（CTC）、循环内皮细胞（CEC）、循环内皮祖细胞（CEPC）、癌症干细胞（CSC）、及其组合。可裂解所述细胞组分中存在的分离细胞，从而通过任何本领域已知的技术将所述分离细胞转化为细胞提取物。 
在一些情况中，所述细胞提取物含实体瘤的循环细胞提取物。所述循环细胞通常用一种或多种分离方法从患者样品中分离，所述方法包括例如免疫磁性分离(参见例如Racila等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95:4589-4594(1998)；Bilkenroth等，Int.J.Cancer,92:577-582(2001))、微流体分离(参见例如Mohamed等，IEEE Trans.Nanobiosci.,3:251-256(2004)；Lin等，摘要编号5147,第97届AACR年会,华盛顿特区(2006))、FACS(参见例如Mancuso等，Blood，97:3658-3661(2001))、密度梯度离心(参见例如Baker等，Clin.Cancer Res.,13:4865-4871(2003))、和消耗方法(参见例如Meye等，Int.J.Oncol.,21:521-530(2002))。 
在其他情况中，所述细胞提取物含白细胞提取物如粒细胞（多形核白细胞），其包括例如嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、和嗜酸性粒细胞；无颗粒白细胞（单核白细胞），其包括例如，外周血单核细胞如淋巴细胞和单核细胞、巨噬细胞；及其混合物。白细胞可用本领域已知的任何分离方法从全血分离，所述方法包括例如聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心、红细胞低渗裂解、和使用密度梯度介质如LymphoprepTM和PolymorphprepTM（挪威奥斯陆的轴盾公司（Axis-Shield））。 
在某些实施方式中，分离的白细胞、循环细胞、或其他细胞（例如经细针抽吸从实体瘤获得的细胞）可在用一种或多种感兴趣的抗癌药孵育之前、期间、和/或之后用一种或多种生长因子体外刺激。刺激生长因子包括但不限于表皮生长因子（EGF）、调蛋白（HRG）、TGF-α、PIGF、血管生成素（Ang）、NRG、PGF、TNF-α、VEGF、PDGF、IGF、FGF、HGF、细胞因子等。在其他情况中，例如生长因子刺激和/或抗癌药治疗后可裂解分离细胞，用本领域已知的任何技术产生所述细胞提取物（如细胞裂解物）。所述细胞裂解优选在生长因子刺激后约1-360分钟开始，且更优选在两个不同的间隔时间：(1)在生长因子刺激后约1-5分钟；和(2)生长因子刺激后约30-180分钟。或者，使用前细胞裂解物可储存在-80°C。循环细胞的分离、刺激和裂解的实验方案描述于PCT公开号WO 2008/036802，其通过引用全文纳入本文以用于所有目的。从组织、活检或初级培养物制备肿瘤细胞提 取物的实验方案描述于PCT公开号WO 2009/108637，其通过引用全文纳入本文以用于所有目的。 
在某些实施方式中，抗癌药包含抗信号传导剂（即细胞抑制药）如单克隆抗体或酪氨酸激酶抑制剂；抗增殖剂；化疗剂（即细胞毒素药）；激素治疗剂；放疗剂；疫苗；和/或任何其他有能力降低或消除异常细胞如癌细胞不受控生长的化合物。在一些实施方式中，所述分离细胞用一种或多种抗信号传导剂、抗增殖剂、和/或激素治疗剂与至少一种化疗剂联合治疗。 
抗信号传导剂的示例包括但不限于单克隆抗体如曲妥珠单抗 
Figure BDA00001789353400471
阿来组单抗 
Figure BDA00001789353400472
贝伐单抗 
Figure BDA00001789353400473
西妥昔单抗 吉姆单抗 
Figure BDA00001789353400475
帕尼单抗(VectibixTM)、利妥昔单抗 
Figure BDA00001789353400476
和托西莫单抗 
Figure BDA00001789353400477
酪氨酸激酶抑制剂如甲磺酸伊马替尼 
Figure BDA00001789353400478
尼洛替尼 达沙替尼 
Figure BDA000017893534004710
博舒替尼(SKI-606)、吉非替尼 舒尼替尼 
Figure BDA000017893534004712
埃罗替尼 拉帕替尼泊(GW-572016; )、卡纽替尼(CI 1033)、塞马悉尼(SU5416)、瓦他拉尼(PTK787/ZK222584)、索拉非尼(BAY43-9006; )、来氟米特(SU101)、和凡德他尼(ZACTIMATM;ZD6474)；和其组合。 
示例性抗增殖剂包括mTOR抑制剂如西罗莫司(雷帕霉素)、坦西莫司(CCI-779)、和依维莫司(RAD001)；Akt抑制剂如1L6-羟甲基-手性-肌醇-2-(R)-2-O-甲基-3-O-十八烷基-sn-甘油碳酸酯、9-甲氧基-2-甲基依利醋铵、1,3-二氢-1-(1-((4-(6-苯基-1H-咪唑[4,5-g]喹喔啉-7-yl)苯基)甲基)-4-哌啶基)-2H-苯并咪唑-2-酮、10-(4’-(N-二乙基氨基)丁基)-2-氯吩恶嗪、3-甲酰色酮缩氨基硫脲(Cu(II)Cl2复合物)、API-2、原癌基因TCL1的氨基酸10-24衍生的15-聚体肽(Hiromura等，J.Biol.Chem.,279:53407-53418(2004)、KP372-1、和Kozikowski等，J.Am.Chem.Soc.,125:1144-1145(2003)和Kau等，Cancer Cell,4:463-476(2003)所述的化合物)；及其组合。 
化疗剂的非限制性示例包括铂基药(如奥沙利铂、顺铂、卡铂、螺铂、异丙铂、沙铂等)、烷化剂(如环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、甲磺酸丁二醇二酯、美法仑、双氯乙基甲胺、尿嘧啶芥、噻替哌、亚硝基脲等)、抗代谢物(如5-氟尿嘧啶、硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤、甲氨蝶呤、甲酰四氢叶酸、卡培他滨、阿糖胞苷、 氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨 
Figure BDA00001789353400481
培美曲塞 
Figure BDA00001789353400482
雷替曲塞等)、植物生物碱(如长春新碱、长春碱、长春瑞滨、去乙酰长春酰胺、足叶草毒素、紫杉醇 
Figure BDA00001789353400483
多西他赛 
Figure BDA00001789353400484
等)、拓扑异构酶抑制剂(如伊立替康、拓扑替康、安吖啶、依托泊甙(VP16)、磷酸依托泊苷、替尼泊苷等)、抗肿瘤抗生素(如多柔比星、阿霉素、柔红霉素、表柔比星、放射菌素、博来霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、普卡霉素等)、其药学上可接受的盐、其立体异构体、其衍生物、其类似物、和其组合。 
激素治疗剂的示例包括但不限于，芳香酶抑制剂(如氨鲁米特、阿那曲唑 
Figure BDA00001789353400485
来曲唑 
Figure BDA00001789353400486
伏氯唑、依西美坦 
Figure BDA00001789353400487
4-雄烯-3,6,17-三酮(6-OXO)、1,4,6-雄甾三烯-3,17-二酮(ATD)、福司曲星 
Figure BDA00001789353400488
等)、选择性雌激素受体调节剂(如巴多昔芬、克罗米芬、氟维司群、拉索昔芬、雷洛昔芬、他莫昔芬、托瑞米芬等)、类固醇(如地塞米松)、非那雄胺、和促性腺激素释放激素激动剂(GnRH)如戈舍瑞林、其药学上可接受的盐、其立体异构体、其衍生物、其类似物、和其组合。 
癌症疫苗的非限制性示例包括生物工艺公司（Active Biotech）的ANYARA、西北生物治疗公司（Northwest Biotherapeutics）的DCVax-LB、IDM制药公司（IDM Pharma）的EP-2101、法莫科萨公司（Pharmexa）的GV1001、井寺制药（Idera Pharmaceuticals）的IO-2055、Introgen医疗公司（Introgen Therapeutics）的INGN225和生物奇迹公司/默克公司(Biomira/Merck)的Stimuvax。 
放疗剂的示例包括但不限于放射性核素如47Sc、64Cu、67Cu、89Sr、86Y、87Y、 90Y、105Rh、111Ag、111In、117mSn、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211At、和212Bi，任选偶联针对肿瘤抗原的抗体。 
在具体实施方式中，细胞提取物中存在的一种或多种分析物单独包括一种或多种致癌融合蛋白或还包括一种或多种信号转导分子。感兴趣的致癌融合蛋白和信号转导分子的非限制性示例如上所述。 
在一些实施方式中，各系列稀释的捕获抗体包含一系列递减的捕获抗体浓度。在某些情况中，所述捕获抗体至少系列稀释2倍(如2、5、10、20、50、100、500、或1000倍)以产生含设定数量（如2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或更多）的递减捕获抗体浓度的系列稀释，其点样在阵列上。各捕获抗体稀释液在所 述阵列上优选至少重复点样2、3、4、5、或6次。 
在其他实施方式中，所述固体支持物包括玻璃(例如，载玻片)、塑料、芯片、针、滤器、珠、纸、膜(例如，尼龙、硝酸纤维素，聚偏二氟乙烯(PVDF)等)、纤维束或任何其他合适的基底。在一个优选实施方式中，所述捕获抗体（例如通过共价或非共价相互作用）限于硝酸纤维素聚合物包被的载玻片例如 
Figure BDA00001789353400491
载玻片，其可从沃特曼有限公司（Whatman Inc.）(新泽西州弗罗汉公园)市售获得。 
作为非限制性示例，本发明的可寻址微阵列包含捕获抗体系列稀释以测定细胞提取物中的BCR-ABL活化状态，其中所述捕获抗体针对BCR-ABL融合蛋白的BCR结构域且所述检测抗体（如活化状态依赖性和活化状态非依赖性抗体）指向所述ABL结构域。在替代的实施方式中，所述捕获和活化状态非依赖性抗体针对BCR-ABL融合蛋白的BCR结构域且所述活化状态依赖抗体针对所述ABL结构域。所述整列还可包括针对递减浓度系列（即系列稀释）中额外融合蛋白和/或信号转导分子的多种不同捕获抗体，其中所述捕获抗体偶联于不同可寻址位置中的固体支持物的表面。 
本领域技术人员会理解所述阵列可为能分泌信号的任何配置，用于待检测的各活化致癌融合蛋白和/或信号转导分子。例如，所述阵列可为所述支持表面上不同区域（如点或斑点）的线或格栅，其中各区域含不同捕获抗体或捕获剂（即结合所述捕获抗体上存在的捕获标记）。所述阵列可配置用于检测单一多重试验中致癌融合蛋白和/或信号转导分子集合的活化状态的方法。在不同实施方式中，所述集合包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、或更多致癌融合蛋白和/或信号转导分子。在具体实施方式中，所述集合包括与至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、或更多其他致癌融合蛋白和/或信号转导分子联合的BCR-ABL融合蛋白。 
B.邻近双检测试验 
在具体方面，本发明检测白细胞或其他细胞类型如实体瘤循环细胞的细胞提取物中感兴趣具体分析物的活化状态的试验是具有优越动态范围的多重、高通量邻近（即三抗体）试验。 
作为非限制性示例，在所述分析物是单一蛋白（如EGFR）的情况中，用于邻近试验的三种抗体可包括：(1)分析物的特异性捕获抗体；(2)分析物活化形式的 特异性检测抗体(即，活化状态依赖性抗体)；和(3)检测分析物总量的检测抗体(即，活化状态非依赖性抗体)。活化状态依赖性抗体能检测，例如分析物的磷酸化、泛素化和/或复合状态。活化状态非依赖性抗体通常能检测活化和未活化形式的分析物。 
作为另一非限制性示例，在所述分析物是含对应于一种蛋白（如BCR）的第一结构域融合对应于另一蛋白（如ABL）的第二结构域的融合蛋白（如BCR-ABL）时，用于所述邻近试验的三种抗体包括：(1)所述融合蛋白第一结构域的特异性捕获抗体；(2)所述活化形式融合蛋白第二结构域的特异性检测抗体(即，活化状态依赖性抗体)；和(3)通过特异性结合融合蛋白的第二结构域（不论其活化状态）来检测融合蛋白总量的检测抗体(即，活化状态非依赖性抗体)。活化状态依赖性抗体能检测，例如融合蛋白的磷酸化、泛素化和/或复合状态。活化状态非依赖性抗体通常能检测活化和未活化形式的融合蛋白。 
在一个优选方面，本发明提供进行具有优越动态范围的多重、高通量免疫试验的方法，所述方法包括： 
(a)用一种或多种融合蛋白特异性捕获抗体的一种或多种稀释系列孵育细胞提取物形成多种捕获的融合蛋白，其中所述捕获抗体限制在固体支持物上，其中各融合蛋白包含对应第一蛋白的第一结构域和对应第二不同蛋白的第二结构域，且其中所述捕获抗体特异于所述融合蛋白的第一结构域。 
(b)用所述融合蛋白的第二结构域的特异性检测抗体孵育所述多种捕获的融合蛋白，形成多种捕获的可检测融合蛋白，其中所述检测抗体包括： 
(1)标记有协助部分的多种活化状态非依赖性抗体，和 
(2)标记有信号放大对的第一元件的多种活化状态非依赖性抗体， 
其中所述协助部分生成传至信号放大对的第一元件并与之反应的氧化剂。 
(c)用信号放大对的第二元件孵育多种捕获的可检测融合蛋白，生成放大的信号；和 
(d)检测信号放大对第一和第二元件产生的放大信号。 
在一个替代方面，进行具有优越动态范围的多重、高通量免疫试验的方法包括： 
(a)用一种或多种融合蛋白特异性捕获抗体的一种或多种稀释系列孵育细胞提取物形成多种捕获的融合蛋白，其中所述捕获抗体限制在固体支持物上，其中各 融合蛋白包含对应第一蛋白的第一结构域和对应第二不同蛋白的第二结构域，且其中所述捕获抗体特异于所述融合蛋白的第一结构域。 
(b)用检测抗体孵育所述多种捕获的融合蛋白，形成多种捕获的可检测融合蛋白，其中所述检测抗体包括： 
(1)标记有协助部分的多种活化状态非依赖性抗体，其中所述活化状态非依赖性抗体特异于所述融合蛋白的第一结构域，和 
(2)标记有信号放大对的第一元件的多种活化状态依赖性抗体，其中所述活化状态依赖性抗体特异于所述融合蛋白的第二结构域， 
其中所述协助部分生成传至信号放大对的第一元件并与之反应的氧化剂。 
(c)用信号放大对的第二元件孵育多种捕获的可检测融合蛋白，生成放大的信号；和 
(d)检测信号放大对第一和第二元件产生的放大信号。 
在另一替代方面，进行具有优越动态范围的多重、高通量免疫试验的方法包括： 
(a)用一种或多种融合蛋白特异性捕获抗体的一种或多种稀释系列孵育细胞提取物形成多种捕获的融合蛋白，其中所述捕获抗体限制在固体支持物上，其中各融合蛋白包含对应第一蛋白的第一结构域和对应第二不同蛋白的第二结构域，且其中所述捕获抗体特异于所述融合蛋白的第一结构域。 
(b)用检测抗体孵育所述多种捕获的融合蛋白，形成多种捕获的可检测融合蛋白，其中所述检测抗体包括： 
(1)标记有协助部分的多种活化状态非依赖性抗体，其中所述活化状态非依赖性抗体特异于所述融合蛋白的第一和第二结构域之间的融合序列、位置或位点，和 
(2)标记有信号放大对第一元件的多种活化状态依赖性抗体，其中所述活化状态依赖性抗体特异于所述融合蛋白的第二结构域， 
其中所述协助部分生成传至信号放大对的第一元件并与之反应的氧化剂。 
(c)用信号放大对的第二元件孵育多种捕获的可检测融合蛋白，生成放大的信号；和 
(d)检测信号放大对第一和第二元件产生的放大信号。 
在某些实施方式中，除了一种或多种融合蛋白以外，还检测存在于所述细胞提取物中的一种或多种信号传导分子。感兴趣的信号转导分子示例如上所述且包括但 不限于，受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶、和/或酪氨酸激酶信号传导级联组分。所述细胞转导分子可用本文所述方法检测，除非所有三种抗体（即捕获抗体和两种检测抗体）都针对同一蛋白，或用任何本领域技术人员已知的任何方法检测。此外，所述信号转导分子可用PCT公开号WO 2008/036802中所述的单一检测（即二抗体）试验来检测，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。在具体实施方式中，用本文所述免疫试验和阵列联合检测一种或多种融合蛋白以及存在于所述细胞提取物中的一种或多种信号传导分子。 
在一些情况中，所述细胞提取物用已经限制在固体支持物上的捕获抗体孵育。在其他情况中，所述细胞提取物先在溶液中用捕获抗体孵育，然后与固体支持物接触以固定捕获的分析物，例如通过捕获抗体上的捕获标记，其与结合所述固体支持物的捕获剂相互作用。 
在一些实施方式中，所述检测抗体用结合溶液中或限于固体支持物的捕获抗体的分析物孵育。在某些情况中，包括多种分析物的细胞提取物先用溶液中的检测抗体孵育，然后与溶液中或限于固体支持物的捕获抗体接触。在某些其他情况中，包括多种分析物的细胞提取物先用溶液中的捕获抗体和检测抗体孵育，然后与固体支持物接触以固定抗体-分析物复合物，例如通过捕获抗体或检测抗体上存在的捕获标记，其与结合所述固体支持物的捕获剂相互作用。在测定步骤前，可清洗固定的复合物以移除非复合的抗体，然后清洗的复合物可从支持表面连续释放，且试验的各分析物的邻近沟道效应可通过本文所述的合适方法检测。 
在所述支持表面包含限于阵列的捕获剂的实施方式中，所述孵育步骤可包括将溶液中含多种分析物的细胞提取物与捕获抗体和检测抗体接触，用过量的所有三种抗体驱动反应至完成。在本方法的一个变体中，得到的抗体-分析物复合物结合固相并清洗移除未结合的抗体。如PCT公开号WO 2008/036802（其通过引用全文纳入本文用于所有目的）的图2所示，所述捕获抗体1可包含捕获标记10。所述复合物通过附着固相并结合捕获标记的捕获剂11来结合固相12，从而固定所述复合物。固定的复合物用合适的缓冲液清洗，然后通过加入释放剂13从固相中释放。所述释放剂可通过任何机制发挥功能，引起经清洗复合物释放。在一个实施方式中，所述捕获标记包括所述释放剂识别和切割的可切割位置。在另一实施方式中，如图2所示，所述释放剂与捕获标记竞争结合所述捕获剂。例如，所述捕获剂可为与结 合捕获抗体的部分互补寡核苷酸（即捕获标记）杂交的第一寡核苷酸；且所述释放剂可为与捕获剂完全互补的寡核苷酸，引起固相中经清洗复合物发生链置换并释放。可用的合适捕获标记/捕获剂/释放剂的其他示例包括但不限于2,4-二硝基酚(DNP)/抗-DNP抗体/2,4-DNP赖氨酸；T2/抗-T3抗体/T3；乌本苷/抗地高辛抗体/地高辛；和脱硫生物素/抗生物素蛋白链菌素/生物素(参见例如Ishikawa等，J.Clin.Lab Anal.,12:98-107(1998))。 
清洗复合物从固相中释放后，其：(1)接触含限制在阵列中的捕获分子的支持物表面，所述分子特异性结合所述捕获抗体上的捕获标记，或(2)解离，且解离的检测抗体接触含捕获剂的支持物表面，所述捕获剂特异性结合所述检测抗体上的捕获标记。PCT公开号WO 2008/036802的图2显示清洗复合物解离且解离的检测抗体与支持物表面14接触的实施方式。所述支持物表面包括限制在“可寻址”或“邮编”阵列中的多种捕获分子。所述阵列的各不同区域包括特异性结合活化状态非依赖性检测抗体2或活化状态依赖性检测抗体3上的捕获标记8的独特捕获剂9，从而限制和排列所述阵列中带标记的检测抗体。在优选实施方式中，所述捕获剂和捕获标记为彼此特异性杂交的寡核苷酸。可寻址阵列包括本领域熟知的寡核苷酸捕获分子(参见例如Keramas等，Lab Chip,4:152-158(2004);Delrio-Lafreniere等，Diag.Microbiol.Infect.Dis.,48:23-31(2004))。 
所述阵列各不同区域存在的检测抗体可直接或用例如协助部分或信号放大对第一元件等部分间接检测。可直接检测的部分示例包括荧光团、生色团、胶体金、着色乳胶等。在一个实施方式中，两种部分为独立选择的荧光团。可使用在彼此邻近时提供可区别读数的任何荧光团对，例如，Cy3/Cy5、Cy5/藻红蛋白等。或者，若使用寡核苷酸可寻址阵列，两种部分可为递送至不同位置编码的相同荧光团。激光扫描共聚焦显微镜可用于检测附着在阵列上的荧光团部分。复合物在检测前从阵列中释放的试验如链置换试验中，检测荧光团部分的合适方法包括毛细流动共聚焦激光诱导荧光、纳米-HPLC、微毛细管电泳等。 
在一些实施方式中，所述活化状态非依赖性抗体还包括有可检测部分。在该情况中，可检测部分的量与细胞提取物中一种或多种分析物的量相关。可检测部分的示例包括但不限于荧光标记、化学反应标记、酶标记、放射标记等。可检测部分优选为荧光团如 染料（如Alexa 
Figure BDA00001789353400532
647）、荧光素、荧光素异硫氰酸 酯(FITC)、Oregon GreenTM；罗丹明、德州红、异硫氰酸四罗丹明(TRITC)、CyDyeTM荧光(如Cy2、Cy3、Cy5)等。可检测的部分可用本领域熟知方法直接或间接偶联于活化状态非依赖性抗体。 
在某些情况中，活化状态非依赖性抗体直接用协助部分标记。协助部分可用本领域熟知方法偶联于活化状态非依赖性抗体。本发明所用的合适协助部分包括任何能生成氧化剂的分子，所述氧化剂导向（即针对）与所述协助部分邻近（即空间上接近或紧密）的另一分子并与之反应（即结合、被结合或形成复合物）。协助部分的示例包括但不限于酶如葡萄糖氧化酶（GO）或涉及催化分子氧（O2）作为电子受体的氧化/还原反应的任何其他酶，和光敏剂例如亚甲蓝、玫瑰红、卟啉类化合物、环丁烯-1.2-二酮染料、酞菁等。氧化剂的非限制性示例包括在氧化/还原反应中转移氧原子或获得电子的过氧化氢（H2O2）、单线态氧、和任何其他化合物。优选当两个部分彼此接近时，辅助部分(例如，葡萄糖氧合酶、光敏剂等)在合适底物(例如，葡萄糖、光)存在下产生传送给信号放大对第一元件(例如，辣根过氧化物酶(HRP)、受保护基团保护的半抗原、通过硫醚与酶抑制剂连接而灭活的酶)并与之反应的氧化剂(例如，过氧化氢(H2O2)、单态氧等)。 
巯基修饰的右旋糖苷分子的制备及其在制备抗体和辅助部分如葡萄糖氧化酶（GO）之间的偶联物中的应用描述于PCT公开号WO 2009/108637，其通过引用全文纳入本文用于所有目的。 
在某些其它情况中，通过偶联于活化状态非依赖性抗体的寡核苷酸接头和偶联于辅助部分的互补寡核苷酸接头之间的杂交，活化状态非依赖性抗体间接标记有辅助部分。可用本领域熟知的方法将寡核苷酸接头偶联于辅助部分或活化状态非依赖性抗体。在一些实施方式中，偶联于辅助部分的寡核苷酸接头与偶联于活化状态非依赖性抗体的寡核苷酸接头100%互补。在其它实施方式中，例如在严格杂交条件下杂交时，该寡核苷酸接头对可包含至少1、2、3、4、5、6个或更多个错配区。本领域技术人员应理解可将对不同分析物特异的活化状态非依赖性抗体偶联于同一寡核苷酸接头或不同寡核苷酸接头。 
偶联于辅助部分或活化状态非依赖性抗体的寡核苷酸接头的长度可以不同。接头序列通常至少长约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、或100个核苷酸。通常产生随机核酸序列以供偶连。作为非限制性示例，可将寡核苷酸接头文 库设计成含有三个不同的连续结构域：间隔结构域、特征结构域和偶联结构域。优选将寡核苷酸接头设计成能有效偶联但不会破坏与之偶联的辅助部分或活化状态非依赖性抗体的功能。 
可将寡核苷酸接头序列设计成能防止或尽量减少在各种试验条件下形成任何二级结构。通常小心监测接头内各区段的解链温度以使它们得以参与整个试验过程。接头序列区段的解链温度范围通常不大于5°C。可用能测定在确定离子浓度下的解链温度、二级结构和发夹结构的计算机算法(例如，OLIGO 6.0)来分析各接头内的三种不同结构域。也可分析总体组合序列的结构特征和它们与其它偶联寡核苷酸接头序列的相容性，例如，它们是否会在严格杂交条件下与互补寡核苷酸接头杂交。 
寡核苷酸接头的间隔区适当隔开了偶联结构域与寡核苷酸交联位点。偶联结构域的功能是，通过核酸杂交将将互补寡核苷酸接头序列标记的分子连接于偶联结构域。可在抗体-分析物(即，抗原)复合物形成前或后进行核酸介导的杂交，从而提供更灵活的试验形式。与许多直接抗体偶联方法不同，相对较小寡核苷酸连接于抗体或其它分子时，对抗体与其靶分析物的特异亲和力，或偶联分子的功能影响最低。 
在一些实施方式中，复杂的多重蛋白质试验可采用寡核苷酸接头的特征序列结构域。可将多种抗体偶联于含不同特征序列的寡核苷酸接头。在多重免疫试验中，可采用合适探针标记的报道寡核苷酸序列来检测多重试验形式中抗体与其抗原之间的交叉反应性。 
可用数种不同的方法将寡核苷酸接头偶联于抗体或其它分子。例如，可以合成在5’或3’端含巯基的寡核苷酸接头。可用还原剂(例如，TCEP-HCl)使巯基脱保护，用离心式脱盐柱纯化得到的接头。可用异双功能交联接头例如SMCC将得到的脱保护寡核苷酸接头偶联于抗体或其它类型蛋白质的伯胺。或者，可用水溶性碳二亚胺EDC处理寡核苷酸上的5’-磷酸基团形成磷酸酯，随后偶联于含胺基的分子。在某些情况中，可将3’-核糖残基上的二醇氧化成醛基，然后用还原胺化偶联于抗体或其它类型蛋白质的胺基。在某些其它情况中，可合成3’或5’端含有生物素修饰的寡核苷酸接头，并偶联链霉亲和素标记的分子。 
可用本领域已知的各种技术合成寡核苷酸接头，所述技术例如Usman等，J.Am.Chem.Soc.，109:7845(1987)；Scaringe等，Nucl.Acids Res.，18:5433(1990)；Wincott 等，Nucl.Acids Res.，23:2677-2684(1995)；和Wincott等，Methods Mol.Bio.，74:59(1997)所述的那些技术。寡核苷酸的合成通常采用常规核酸保护和偶连基团，例如5’-端的二甲氧基三苯甲基和3’-端的亚膦酰胺基。本领域技术人员已知寡核苷酸合成的合适试剂、核酸脱保护方法和核酸纯化方法。 
用于同时检测总体以及磷酸化分析物的寡核苷酸偶联抗体的制备和应用描述于PCT公开号WO 2008/036802，其通过引用全文纳入本文以用于所有目的。 
在某些情况中，用信号放大对的第一元件直接标记活化状态依赖性抗体。可用本领域熟知的方法将信号放大对元件偶联于活化状态依赖性抗体。某些其它情况中，可通过偶联于活化状态依赖性抗体的结合对第一元件和偶联于信号放大对第一元件的结合对第二元件之间的结合，用信号放大对第一元件间接标记活化状态依赖性抗体。可用本领域熟知的方法将结合对元件(例如，生物素/链霉亲和素)偶联于信号放大对元件或活化状态依赖性抗体。信号放大对元件的示例包括但不限于：过氧化物酶，例如辣根过氧化物酶(HRP)、过氧化氢酶、氯过氧化物酶、细胞色素c过氧化物酶、嗜曙红细胞过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶、乳过氧化物酶、髓过氧化物酶、甲状腺过氧化物酶、脱碘酶等。信号放大对元件的其它示例包括受保护基团保护的半抗原和能通过硫醚与酶抑制剂连接而灭活的酶。 
所述捕获抗体、活化状态非依赖性抗体、和活化状态依赖性抗体通常选择为能使其相对分析物结合的竞争最小化（即所有抗体能同时结合其相应融合蛋白或信号转导分子）。 
在邻近沟道效应的一个示例中，辅助部分是葡萄糖氧化酶(GO)，信号放大对第一元件是辣根过氧化物酶(HRP)。当GO与底物例如葡萄糖接触时，可产生氧化剂(即，过氧化氢(H2O2))。如果HRP位于GO的邻近沟道效应内，GO产生的H2O2传送给HRP与之形成HRP-H2O2复合物，在信号放大对第二元件(例如，化学发光底物，如氨基苯二酰肼或异氨基苯二酰肼；或荧光底物，如酪酰胺(例如，生物素-酪酰胺)、高香草酸或4-羟苯基乙酸)存在下，可产生放大的信号。在邻近试验中利用GO和HRP的方法描述于例如Langry等，美国能源部第UCRL-ID-136797号报道(1999)。当生物素-酪酰胺用作信号放大对的第二元件时，HRP-H2O2复合物可氧化酪酰胺产生能共价结合附近亲核残基的反应性酪酰胺基团。活化的酪酰胺可直接检测或在加入信号检测试剂例如链霉亲和 素标记的荧光团或链霉亲和素标记的过氧化物酶和生色试剂的组合后检测。适用于本发明的荧光团的示例包括但不限于：Alexa 
Figure BDA00001789353400571
染料(例如，Alexa 
Figure BDA00001789353400572
555)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、Oregon GreenTM；罗丹明、德克萨斯红、异硫氰酸四罗丹明(TRITC)、CyDyeTM荧光素(例如，Cy2、Cy3、Cy5)等。可用本领域熟知的方法将链霉亲和素标记直接或间接偶联于荧光团或过氧化物酶。适用于本发明的生色试剂的非限制性示例包括3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)、3,3'-二氨基联苯胺(DAB)、2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)、4-氯-1-萘酚(4CN)和/或卟啉原。 
在邻近沟道效应的另一示例中，辅助部分是光敏剂，信号放大对第一元件是用多种半抗原标记的大分子，所述半抗原用保护基团保护以防止半抗原与特异性结合伴侣(例如，配体、抗体等)结合。例如，信号放大对元件可以是用受保护的生物素、香豆素和/或荧光分子标记的右旋糖苷分子。合适的保护基团包括但不限于：苯氧基-、苯胺-(analino-)、烯烃-、硫醚-和烯醚-保护基团。适用于本发明邻近试验的其它光敏剂和受保护的半抗原分子描述于美国专利号5,807,675。当用光激发光敏剂时，可产生氧化剂(即，单态氧)。如果半抗原分子位于光敏剂的邻近沟道效应内，光敏剂产生的单态氧传送给半抗原保护基团的硫醚并与之反应从而产生羰基(酮或醛)和亚磺酸，释放半抗原的保护基团。然后，无保护的半抗原可特异性结合信号放大对第二元件(例如，能产生可检测信号的特异性结合伴侣)。例如，当半抗原是生物素时，其特异性结合伴侣可以是酶标记的链霉亲和素。示范性酶包括：碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、HRP等。洗涤除去未结合的试剂后，通过加入酶的可检测(例如，荧光、化学发光、显色等)底物产生可检测信号，用本领域已知的合适方法及仪器进行检测。或者，可采用酪酰胺信号放大法来放大可检测信号，可直接检测活化的酪酰胺或在加入上述信号检测试剂后检测。 
在邻近沟道效应的另一示例中，辅助部分是光敏剂，信号放大对第一元件是酶-抑制剂复合物。酶和抑制剂(例如，膦酸标记的右旋糖苷)通过可切割接头(例如，硫醚)连在一起。当用光激发光敏剂时，可产生氧化剂(即，单态氧)。如果酶-抑制剂复合物位于光敏剂邻近沟道效应内，光敏剂产生的单态氧传送给可切割接头并与之反应，释放出酶的抑制剂从而活化酶。加入酶底物产生可检测 信号，或者加入放大试剂产生放大的信号。 
在邻近沟道效应的进一步示例中，辅助部分是HRP，信号放大对第一元件是上述受保护的半抗原或酶-抑制剂复合物，保护基团包括对-烷氧基苯酚。加入苯二胺和H2O2产生的反应活性苯二胺传送给受保护的半抗原或酶-抑制剂复合物，与对-烷氧基苯酚保护基团反应产生暴露的半抗原或反应性酶。如上所述产生放大的信号并检测(参见例如美国专利号5,532,138和5,445,944)。 
本领域技术人员会理解抗体以外的结合伴侣可用于根据本文所述的邻近（即三抗体）试验固定和/或检测来自细胞提取物的一种或多种分析物。所述结合伴侣的非限制性示例包括分析物的配体或受体、分析物底物、结合域（如PTB、SH2等）、肽适体等。 
进行本文所述邻近试验的示范性方案见实施例1。 
在另一实施方式中，本发明提供实施上述邻近试验的试剂盒，所述试剂盒包括：(a)限于固体支持物上的多种捕获抗体稀释系列；和(b)多种检测抗体(例如，活化状态非依赖性抗体和活化状态依赖性抗体)。在一些情况中，所述试剂盒还包括用该试剂盒检测一种或多种融合蛋白和/或信号转导分子的活化状态的说明书。试剂盒还包括有关实施本发明特定方法的任何上述额外试剂，例如信号放大对的第一和第二元件、酪酰胺信号放大试剂、辅助部分的底物、洗涤缓冲液等。 
抗体阵列的构建 
在某些方面，本发明提供采用限于固体支持物上的捕获抗体稀释系列检测细胞提取物中一种或多种融合蛋白的活化状态的基于抗体的阵列。本发明试验所用的阵列通常包含偶联于固体支持物表面不同可寻址位置的某一捕获抗体浓度范围的一种或多种不同捕获抗体。 
所述固体支持物可包含任何适合固定蛋白质的基底。固体支持物的示例包括但不限于：玻璃(例如，载玻片)、塑料、芯片、钉、滤器、珠（如磁珠、聚苯乙烯珠等）、纸、膜、纤维束、凝胶、金属、陶瓷等。如尼龙(BiotransTM，ICN生物医学公司(ICN Biomedicals，Inc.，加利福尼亚州科斯拉梅萨)；Zeta- 
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伯乐实验室（Bio-Rad Laboratories，加利福尼亚州海格立斯）；硝酸纤维素( 
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获特满公司（Whatman Inc.，新泽西州弗洛哈姆帕克）)和PVDF (ImmobilonTM，密理博公司(Millipore Corp.，马萨诸塞州比尔里卡))的膜适用作本发明阵列中的固体支持物。所述捕获抗体优选限于包被有硝酸纤维素聚合物的载玻片上，例如可市售获自获特满公司（新泽西州弗洛哈姆帕克）的 
Figure BDA00001789353400591
载玻片。 
所需固体支持物的特定方面包括能结合大量捕获抗体、能结合捕获抗体而变性最小以及不能结合其他蛋白。另一合适方面是当含有捕获抗体的抗体溶液应用于支持物时，该固体支持物显示最少的“芯吸作用”。芯吸作用最少的固体支持物使得少量等分捕获抗体溶液用于该支持物能产生小而明确的固定捕获抗体斑点。 
一般通过共价或非共价相互作用(例如，离子键、疏水相互作用、氢键、范德华力、偶极-偶极键)将捕获抗体直接或间接(例如，通过捕获标记)限于固体支持物上。在一些实施方式中，采用标准的交联方法和条件，利用同双功能或异双功能交联剂将捕获抗体共价连接于固体支持物。合适的交联剂可市售获自零售商，例如皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology，伊利诺斯州洛克福特)。 
产生适用于本发明的阵列的方法包括但不限于：用于构建蛋白质或核酸阵列的任何技术。在一些实施方式中，用微量点样器将捕获抗体点在阵列上，所述点样器通常是配有裂缝针、钝针或喷墨打印头的机器人打印机。打印本文所述抗体阵列的合适机器人系统包括笛卡尔技术公司(Cartesian Technologies；加利福尼亚州爱尔文)的PixSys 5000机器人，其装配有TC国际公司(TeleChem International；加利福尼亚州桑尼维尔)的ChipMaker2裂缝针，以及可市售获自生物机器人公司(BioRobics，马萨诸塞州沃本)和帕卡德仪器公司(Packard Instrument Co.，康涅狄格州梅里登)的其它机器人打印机。各捕获抗体稀释液在所述阵列上优选至少重复点样2、3、4、5、或6次。 
产生本发明阵列的另一方法包括在体积确定的液体能有效吸附于支持物上的条件下，通过使毛细管分配器接触固体支持物将已知体积的捕获抗体稀释液分散在各阵列所选位置，其中用所选捕获抗体稀释液在各选定阵列位置重复该过程从而产生完整阵列。实施该方法形成多个这类阵列，其中在每个重复循环中，溶液沉积步骤应用于多个固体支持物各自所选位置。这种方法的进一步描述可参见例如，美国专利号5,807,522。。 
在某些情况中，可利用纸打印装置产生本发明的抗体阵列。例如，可将所需的捕获抗体稀释液加载入桌面喷墨打印机的打印头中，打印在合适的固体支持物上(参见例如Silzel等，Clin.Chem.，44:2036-2043(1998))。 
在一些实施方式中，固体支持物上产生阵列的密度为至少约5个点/cm2，优选至少约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000或9000、或10,000个点/cm2。 
在某些情况中，固体支持物上的点各自代表不同的捕获抗体。在某些其它情况中，固体支持物上的多个点代表相同的捕获抗体，例如含有一系列浓度递降的捕获抗体稀释系列。 
制备和构建固相支持物抗体阵列的方法的其它实施例描述于美国专利号6,197,599、6,777,239、6,780,582、6,897,073、7,179,638和7,192,720；美国专利公开号20060115810、20060263837、20060292680和20070054326；和Varnum等，Methods Mol.Biol.，264:161-172(2004)。 
扫描抗体阵列的方法是本领域已知的，包括但不限于扫描蛋白质或核酸阵列的任何技术。适用于本发明的微阵列扫描仪可购自帕金埃尔默公司(PerkinElmer,马萨诸塞州波士顿)、安捷仑技术公司(Agilent Technologies，加利福尼亚州帕洛阿尔托)、应用精确公司(Applied Precision，华盛顿州伊萨夸)、GSIL公司(GSI Lumonics Inc.，马萨诸塞州比尔里卡市)和阿克桑仪器公司(Axon Instruments，加利福尼亚州联盟城)。作为非限制性示例，用于荧光检测的GSI扫描阵列3000可与ImaGene软件一起用于定量测定。 
癌症治疗的药物选择和最优化 
在某些方面，本发明提供选择合适治疗以下调或关闭一种或多种失调的信号传导途径的方法。在某些其他方面，本发明提供给患癌并接受癌症治疗疗程的对象最佳化治疗和/或降低毒性的方法。因此，可根据某给定患者癌症或肿瘤中活化的致癌融合蛋白和/或信号转导蛋白集合所提供的特定分子特征，采用本发明来促进设计个性化治疗。 
因此，在一个具体方面，本发明提供给患癌并接受癌症治疗疗程的对象最佳化治疗和/或降低毒性的方法，所述方法包括： 
(a)给予抗癌药（如一种或多种酪氨酸激酶抑制剂如 
Figure BDA00001789353400611
Figure BDA00001789353400612
等）后分离癌细胞； 
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物； 
(c)用本文所述试验测量所述细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化（如磷酸化）水平；和 
(d)将所测致癌融合蛋白的表达和/或活化水平与疗程早期所测的致癌融合蛋白的表达和/或活化水平作比较；和 
(e)基于步骤(d)的比较确定所述对象疗程的后续剂量或是否需给予对象不同的疗程。 
在具体实施方式中，在所述细胞提取物中按照本发明基于抗体的试验测量致癌融合蛋白（如BCR-ABL）的总水平和活化（磷酸化）水平，可计算活化与总致癌融合蛋白水平之比（如磷酸化/总BCR-ABL蛋白水平之比）并用于评价对象的疗程，如通过比较所述磷酸化/总致癌融合蛋白水平之比与早期该对象同样计算的比例（如抗癌药治疗早期或抗癌药治疗之前的时间点）。 
在一个相关方面，本发明提供给患癌并接受癌症治疗疗程的对象最佳化治疗和/或降低毒性的方法，所述方法包括： 
(a)给予抗癌药（如一种或多种酪氨酸激酶抑制剂如 
Figure BDA00001789353400613
等）后分离癌细胞； 
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物； 
(c)用本文所述试验测量所述细胞提取物中致癌融合蛋白和其途径中一种或多种信号转导分子的表达和/或活化（如磷酸化）水平；和 
(d)用所测致癌融合蛋白和信号转导分子的表达和/或活化水平与疗程早期所测的致癌融合蛋白和信号转导分子的表达和/或活化水平作比较；和 
(e)基于步骤(d)的比较确定所述对象疗程的后续剂量或是否需给予对象不同的疗程。 
在具体实施方式中，致癌融合蛋白（如BCR-ABL）和信号转导途径组分（如CRKL、JAK2或STAT5）的总水平和活化（如磷酸化）水平按照本发明基于抗体 的试验测量，可计算活化与总致癌融合蛋白水平之比（如磷酸化/总BCR-ABL蛋白水平之比）和活化与总信号转导途径组分水平之比（如CRKL、JAK2、或STAT5蛋白的磷酸化/总水平之比）并用于评价对象的疗程，如通过比较致癌融合蛋白和信号转导途径组分的磷酸化/总水平之比与早期该对象同样计算的比例（如抗癌药治疗早期或抗癌药治疗之前的时间点）。 
在另一方面，本发明提供选择用于治疗癌症的合适抗癌药的方法，所述方法包括： 
(a)给予抗癌药之后或用抗癌药孵育前分离癌细胞； 
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物； 
(c)用本文所述试验测定所述细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化（如磷酸化）水平；和 
(d)通过对比所述致癌融合蛋白的表达和/或活化水平与没有所述抗癌药时产生的参比表达和/或活化分布，测定所述抗癌药适合或是不适合用于治疗癌症。 
在优选的实施方式中，选择用于治疗癌症的合适抗癌药的方法包括： 
(a)给予抗癌药之后或用抗癌药孵育前分离癌细胞； 
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物； 
(c)用试验测定细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化（如磷酸化）的水平，所述试验包括致癌融合蛋白特异性捕获抗体稀释系列，其中所述捕获抗体限制在固体支持物上； 
(d)对比所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与没有所述抗癌药时产生的参比表达和/或活化分布；和 
(e)当所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与参比表达和/或活化分布相比发生改变（如显著降低）时表明所述抗癌药适用于治疗癌症。 
在某些情况中，优选实施方式还可包括（即如步骤(f)）或替代地包括（即如步骤(e)）步骤：当所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与参比表达和/或活化分布相比没有发生改变（如无显著降低）时表明所述抗癌药不适用于治疗癌症。在其他情况中，除了检测一种或多种致癌融合蛋白外，还检测细胞提取物中存在的一种或多种信号转导分子，并基于该“分子分布”确定所述抗癌药是否合适。 
在具体实施方式中，细胞提取物中致癌融合蛋白（如BCR-ABL）的总水平和 活化（如磷酸化）水平按照本发明基于抗体的试验测量，可计算活化与总致癌融合蛋白水平之比（如磷酸化/总BCR-ABL蛋白水平之比）并用于测定抗癌药适合或不适合用于治疗癌症，例如通过对比致癌融合蛋白的磷酸/总水平之比与根据没有所述抗癌药时产生的参比表达和活化分布同样计算的比例。 
在另一方面，本发明提供鉴定癌症对抗癌药治疗响应的方法，所述方法包括： 
(a)给予抗癌药之后或用抗癌药孵育前分离癌细胞； 
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物； 
(c)用本文所述试验测定所述细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化（如磷酸化）水平；和 
(d)通过对比所述致癌融合蛋白的表达和/或活化水平与没有所述抗癌药时产生的参比表达和/或活化分布来鉴定所述癌症对所述抗癌药治疗响应或不响应。 
在优选的实施方式中，鉴定癌症对抗癌药治疗响应的方法包括： 
(a)给予抗癌药之后或用抗癌药孵育前分离癌细胞； 
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物； 
(c)用试验测定细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化（如磷酸化）的水平，所述试验包括致癌融合蛋白特异性捕获抗体稀释系列，其中所述捕获抗体限制在固体支持物上； 
(d)对比所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与没有所述抗癌药时产生的参比表达和/或活化分布；和 
(e)当所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与参比表达和/或参比活化分布相比发生改变（如显著降低）时表明所述癌症对所述抗癌药治疗响应。 
在某些情况中，优选实施方式还可包括（即如步骤(f)）或替代地包括（即如步骤(e)）步骤：当所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与参比表达和/或活化分布相比没有发生改变（如无显著降低）时表明所述癌症对抗癌药的治疗不响应。在其他情况中，除了检测一种或多种致癌融合蛋白外，还检测细胞提取物中存在的一种或多种信号转导分子，并基于该“分子分布”鉴定所述癌症对治疗响应或不响应。 
在具体实施方式中，细胞提取物中致癌融合蛋白（如BCR-ABL）的总水平和活化（磷酸化）水平按照本发明基于抗体的试验测量，可计算活化与总致癌融合蛋 白水平之比（如磷酸化/总BCR-ABL蛋白水平之比）并用于鉴定所述癌症对抗癌药治疗响应或不响应，例如通过对比致癌融合蛋白的磷酸/总水平之比与根据没有所述抗癌药时产生的参比表达和活化分布同样计算的比例。 
在另一方面，本发明提供预测患癌对象响应抗癌药治疗的方法，所述方法包括： 
(a)给予抗癌药之后或用抗癌药孵育前分离癌细胞； 
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物； 
(c)用本文所述试验测定所述细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化（如磷酸化）水平；和 
(d)通过对比所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与没有所述抗癌药时产生的参比表达和/或活化分布来预测所述对象响应抗癌药治疗的可能性。 
在优选的实施方式中，预测患癌症对象响应抗癌药治疗的方法包括： 
(a)给予抗癌药之后或用抗癌药孵育前分离癌细胞； 
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物； 
(c)用试验测定细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化（如磷酸化）的水平，所述试验包括致癌融合蛋白特异性捕获抗体稀释系列，其中所述捕获抗体限制在固体支持物上； 
(d)对比所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与没有所述抗癌药时产生的参比表达和/或活化分布；和 
(e)当所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与参比表达和/或活化分布相比发生改变（如显著降低）时表明所述对象可能响应所述抗癌药治疗。 
在某些情况中，优选实施方式还可包括（即如步骤(f)）或替代地包括（即如步骤(e)）步骤：当所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与参比表达和/或活化分布相比没有发生改变（如无显著降低）时表明所述对象可能不响应抗癌药的治疗。在其他情况中，除了检测一种或多种致癌融合蛋白外，还检测细胞提取物中存在的一种或多种信号转导分子，并基于该“分子分布”预测所述对象响应治疗的可能性。 
在具体实施方式中，细胞提取物中致癌融合蛋白（如BCR-ABL）的总水平和活化（磷酸化）水平按照本发明基于抗体的试验测量，可计算活化与总致癌融合蛋白水平之比（如磷酸化/总BCR-ABL蛋白水平之比）并用于预测所述对象响应抗癌药治疗的可能性，例如通过对比致癌融合蛋白的磷酸/总水平之比与根据没有所 述抗癌药时产生的参比表达和活化分布同样计算的比例。 
在另一方面，本发明提供测定患癌对象是否耐受抗癌药治疗的方法，所述方法包括： 
(a)给予抗癌药之后或用抗癌药孵育前分离癌细胞； 
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物； 
(c)用本文所述试验测定所述细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化（如磷酸化）水平；和 
(d)通过对比所述致癌融合蛋白的表达和/或活化水平与没有所述抗癌药时或早期存在抗癌药时产生的参比表达和/或活化分布来测定所述对象对所述抗癌药治疗耐受或是敏感。 
在优选的实施方式中，测定患癌对象是否耐受抗癌药治疗的方法包括： 
(a)给予抗癌药之后或用抗癌药孵育前分离癌细胞； 
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物； 
(c)用试验测定细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化（如磷酸化）的水平，所述试验包括致癌融合蛋白特异性捕获抗体稀释系列，其中所述捕获抗体限制在固体支持物上； 
(d)对比所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与没有所述抗癌药时或早期存在所述抗癌药时产生的参比表达和/或活化分布；和 
(e)当所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与参比表达和/或活化分布相比没有发生改变（如没有显著降低）时表明所述对象耐受所述抗癌药治疗。 
在某些情况中，优选实施方式还可包括（即如步骤(f)）或替代地包括（即如步骤(e)）步骤：当所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与参比表达和/或活化分布相比没有发生改变（如无显著降低）时表明所述患者对抗癌药的治疗敏感。在其他情况中，除了检测一种或多种致癌融合蛋白外，还检测细胞提取物中存在的一种或多种信号转导分子，并基于该“分子分布”鉴定所述对象对治疗耐受或是敏感。 
在具体实施方式中，细胞提取物中致癌融合蛋白（如BCR-ABL）的总水平和活化（磷酸化）水平按照本发明基于抗体的试验测量，可计算活化与总致癌融合蛋白水平之比（如磷酸化/总BCR-ABL蛋白水平之比）并用于测定所述对象对抗癌药治疗耐受或是敏感，例如通过对比致癌融合蛋白的磷酸/总水平之比与根据没有 所述抗癌药时或早期存在所述抗癌药时产生的参比表达和活化分布同样计算的比例。 
在某些实施方式中，本发明的方法还可包括将步骤（d）的结果发送或报告给临床医生，例如肿瘤科医生或全科医生。在某些其他实施方式中，本发明的方法还可包括将步骤（d）的结果记录或储存于计算机数据库或者，例如实验室内的其他合适信息储存机器或装置。 
在一些实施方式中，本发明方法还包括从患癌对象中获取样品并分离细胞如癌细胞的步骤。所述样品可在抗癌药处理前（如用抗癌药孵育前）或给予抗癌药之后（如整个癌症治疗疗程的任何时间）从对象获取。合适的样品包括但不限于：全血、血浆、血清、乳管灌洗液、乳头抽吸物、淋巴（例如淋巴结的播散肿瘤细胞）、骨髓抽吸物、唾液、尿液、粪便(即，排泄物)、痰、支气管灌洗液、眼泪、细针抽吸物（例如通过随机乳晕缘细针抽吸收集）、任何其它体液、组织样品(例如，肿瘤组织)，如肿瘤活检(例如，针吸活检)或淋巴结活检（例如前哨淋巴结活检）和其细胞提取物。在一些实施方式中，样品是全血或其部分组分，例如血浆、血清、红细胞、白细胞如外周血单核细胞、和/或稀有循环细胞。在具体的实施方式中，采用本领域已知的任何技术通过从全血或其细胞组分分离实体瘤白细胞或循环细胞来获得样品。若分离细胞获自没有接受抗癌药治疗的对象，则所述分离细胞可在合适条件下与抗癌药中的一种或混合物体外孵育，所述抗癌药靶向步骤(c)中待检测的一种或多种分析物。 
在某些实施方式中，所述癌症是血液恶性肿瘤（如白血病、淋巴瘤）、成骨肉瘤（如尤因肉瘤）、软组织肉瘤（如DFSP、横纹肌肉瘤）、其他软组织恶性肿瘤、甲状腺癌、或前列腺癌。在具体实施方式中，所述癌症可由癌细胞或肿瘤中的染色体移位形成致癌融合蛋白引起。 
在一些实施方式中，分离细胞如本文所述体外用生长因子刺激。在其他实施方式中，所述抗癌药可包括本文所述的一种或多种治疗剂，包括但不限于单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂、化疗剂、激素治疗剂、放疗剂和疫苗。 
在一些实施方式中，细胞提取物中存在的致癌融合蛋白所测得的活性状态可为例如磷酸化状态、泛素化状态、复合状态、或其组合。在其他实施方式中，固体支持物可包括例如玻璃、塑料、芯片、钉、滤器、珠、纸、膜、纤维束和其组合。在 其他实施方式中，捕获抗体限于可寻址阵列中的固体支持物上。 
在某些实施方式中，步骤(c)中所述试验包括： 
(i)孵育（例如，接触）细胞提取物与捕获抗体的系列稀释液，形成多种捕获的致癌融合蛋白(例如，将细胞提取物中存在的致癌融合蛋白转变为含有致癌融合蛋白的捕获致癌融合蛋白与捕获抗体的复合物)； 
(ii)孵育（例如，接触）多种捕获的致癌融合蛋白与检测抗体，所述检测抗体包括对所述致癌融合蛋白的相同或不同结构域特异的活化状态非依赖性抗体和活化状态依赖性抗体，形成多种可检测的捕获致癌融合蛋白(例如，将捕获致癌融合蛋白的复合物转变为包含捕获致癌融合蛋白的可检测捕获致癌融合蛋白与检测抗体的复合物)， 
其中所述活化状态非依赖性抗体用辅助部分标记，活化状态依赖性抗体用信号放大对第一元件标记，所述辅助部分能产生传送给信号放大对第一元件并与之反应的氧化剂； 
(iii)将多个可检测的捕获分析物与信号放大对第二元件一起孵育（例如，接触），产生放大的信号；和 
(iv)检测信号放大对第一和第二元件产生的放大信号。 
所述活化状态非依赖性抗体可用辅助部分直接标记或用辅助部分间接标记，例如通过偶联于活化状态非依赖性抗体的寡核苷酸与偶联于辅助部分的互补寡核苷酸之间的杂交。类似地，所述活化状态依赖性抗体可用信号放大对第一元件直接标记或用信号放大对第一元件间接标记，例如通过偶联于活化状态依赖性抗体的结合对第一元件与偶联于信号放大对第一元件的结合对第二元件之间的结合。在某些情况中，结合对的第一元件是生物素，结合对的第二元件是亲和素，如链霉抗生物素蛋白或中性亲和素。 
在一些实施方式中，所述辅助部分可以是例如葡萄糖氧化酶(GO)。在某些情况中，所述GO以及活化状态非依赖性抗体可偶联于巯基活化的右旋糖苷分子。所述巯基活化的右旋糖苷分子的分子量通常约为500kDa(例如约250、300、350、400、450、500、550、600、650、700或750kDa)。在其他实施方式中，所述氧化剂可以是例如过氧化氢(H2O2)。在其他实施方式中，所述信号放大对的第一元件可以是例如过氧化物酶例如辣根过氧化物酶(HRP)。在其他实施方 式中，所述信号放大对的第二元件可以是，例如酪酰胺试剂（例如，生物素-酪酰胺）。优选过氧化物酶氧化生物素-酪酰胺产生活化的酪酰胺（例如，将生物素-酪酰胺转化成活化的酪酰胺），从而产生放大的信号。活化的酪酰胺可直接检测或间接检测，例如加入信号检测试剂。信号检测试剂的非限制性例子包括链霉亲和素标记的荧光团以及链霉亲和素标记的过氧化物酶和显色剂如3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)的组合。 
在某些情况中，所述HRP以及活化状态依赖性抗体可偶联于巯基活化的右旋糖苷分子。所述巯基活化的右旋糖苷分子的分子量通常约为70kDa(例如约40、45、50、55、60、500、70、75、80、85、90、95或100kDa)。 
抗体产生 
可采用数种方法产生和选择尚未市售可得的抗体，以根据本发明分析生物样品例如细胞提取物或裂解物中致癌融合蛋白或信号转导分子的活化状态。例如，一种方法是用本领域已知的蛋白质表达和纯化方法来表达和/或纯化感兴趣的多肽(即，抗原)，而另一种方法是用本领域已知的固相肽合成方法来合成感兴趣的多肽。参见，例如，Guide to Protein Purification（《蛋白质纯化指南》），Murray P.Deutcher编，Meth.Enzymol.，第182卷(1990)；Solid Peptide Synthesis（《固相肽合成》），Greg B.Fields编，Meth.Enzymol.，第289卷(1997)；Kiso等，Chem.Pharm.Bull.，38：1192-99(1990)；Mostafavi等，Biomed.Pept.Proteins Nucleic Acids，1：255-60，(1995)；和Fujiwara等，Chem.Pharm.Bull.，44：1326-31(1996)。然后将纯化或合成的多肽注入例如小鼠或兔中，产生多克隆或单克隆抗体。本领域技术人员应认识到有许多方法可制备抗体，例如Antibodies，A Laboratory Manual(《抗体，实验室手册》)，Harlow和Lane编，纽约冷泉港的冷泉港实验室（Cold Spring Harbor Laboratory）(1988)所述方法。本领域技术人员还应理解也可通过各种方法从遗传信息制备模拟(例如，保留功能性结合区)抗体的结合片段或Fab片段。参见，例如Antibody Engineering:A Practical Approach(《抗体工程改造：实用方法》)，Borrebaeck编，牛津的牛津大学出版社（Oxford University Press）(1995)；和Huse等，J.Immunol.，149:3914-3920(1992)。 
此外，许多出版物报道了利用噬菌体展示技术产生和筛选多肽文库中能结 合所选靶抗原的多肽(参见，例如Cwirla等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87:6378-6382(1990)；Devlin等，Science，249:404-406(1990)；Scott等，Science，249:386-388(1990)；和Ladner等，美国专利号5,571,698)。噬菌体展示方法的基本概念是在噬菌体DNA编码的多肽与靶抗原之间建立物理关联。这种物理关联由噬菌体颗粒提供，其展示的多肽为衣壳的一部分，该衣壳将编码该多肽的噬菌体基因组包裹在内。在多肽与其遗传物质之间建立这种物理关联可同时大规模筛选携带不同多肽的极大量噬菌体。展示对靶抗原具有亲和力多肽的噬菌体能结合该靶抗原，通过对靶抗原的亲和力筛选赖富集这些噬菌体。通过这些噬菌体各自的基因组可鉴定它们所展示的多肽特性。然后用这些方法，可常规大量合成经鉴定对所需靶抗原具有结合亲和力的多肽(参见例如美国专利号6,057,098)。 
然后选择这些方法产生的抗体，首先就与纯化的感兴趣多肽抗原的亲和力和特异性进行筛选，如果需要，比较抗体与不需要结合的其它多肽抗原的亲和力和特异性结果。筛选方法可包括将纯化的多肽抗原固定在微量滴定板的不同孔中。然后将含有潜在抗体或抗体组的溶液置于各自的微量滴定板孔内，孵育约30分钟到2小时。然后洗涤微量滴定板孔，将标记的二抗(例如，如果产生的抗体是小鼠抗体，则为偶联碱性磷酸酶的抗小鼠抗体)加入各孔并孵育约30分钟，然后洗涤。各孔加入底物后，存在固定多肽抗原的抗体的孔中显示颜色反应。 
然后进一步分析如此鉴定的抗体的亲和力和特异性。在开发靶蛋白质的免疫试验中，将纯化的靶蛋白用作标准品，用所选抗体判断免疫试验的灵敏度和特异性。由于各种抗体的结合亲和力可能不同，例如某些抗体组合可能在空间上彼此干扰，抗体的试验性能可能是比该抗体的绝对亲和力和特异性更重要的量度。 
本领域技术人员应认识到可采用许多方法制备抗体或结合片段，就对各种感兴趣多肽的亲和力和特异性进行筛选和选择，但这些方法不改变本发明的范围。 
A.多克隆抗体 
优选通过多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射感兴趣的多肽和佐剂在动物中产生多克隆抗体。利用双功能或衍生试剂将感兴趣的多肽与在免疫物种中具有免疫 原性的蛋白载体，例如匙孔血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂偶联方有效。双功能或衍生试剂的非限制性例子包括马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(maleimidobenzoyl sulfosuccinimide ester)(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基偶联)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl2和R1N=C=NR，其中R和R1是不同的烷基。 
通过将例如100μg(对于兔)或5μg(对于小鼠)抗原或偶联物与3体积的完全弗氏佐剂混合并皮内多点注射所述溶液，用感兴趣多肽或其免疫原性偶联物或衍生物免疫动物。一个月后，用溶于不完全弗氏佐剂的含约1/5-1/10初始量的多肽或其偶联物皮下多点注射加强免疫动物。7-14天后，动物放血，检验血清的抗体效价。通常使动物加强免疫直至效价到达平台。优选用同一多肽的偶联物加强免疫动物，但也可采用与不同免疫原性蛋白质的偶联和/或通过不同交联剂。还可用重组细胞培养制备的作为融合蛋白的偶联物。在某些例子中，可用凝聚剂，例如明矾增强免疫应答。 
B.单克隆抗体 
单克隆抗体通常获自基本均质的抗体群，即除了极少量存在的可能天然发生的突变外，构成该群体的各抗体相同。因此，定语"单克隆"表示所述抗体特征为不是离散抗体的混合物。例如，可用Kohler等(Nature，256:495(1975))所述的杂交瘤方法或本领域已知的任何重组DNA方法(参见，例如美国专利号4,816,567)制备单克隆抗体。 
在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它合适的宿主动物(例如，仓鼠)以诱导淋巴细胞，所述细胞产生或能生成特异性结合免疫所用感兴趣多肽的抗体。或者，体外免疫淋巴细胞。然后用合适的融合剂，例如聚乙二醇将免疫的淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤细胞(参见，例如Goding，Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(《单克隆抗体：原理和实践》)，学术出版社(Academic Press)，第59-103页(1986))。将如此制备的杂交瘤细胞接种于合适的培养基并培养，所述培养基优选含有能抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)，杂交瘤细胞的培养基通常含有防止HGPRT缺陷型细胞生长的次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)。 
优选的骨髓瘤细胞是能有效融合、支持所选抗体生生细胞稳定高水平产生抗体和/或对培养基例如HAT培养基敏感的那些细胞。用于产生人单克隆抗体的这种优选骨髓瘤细胞系的例子包括但不限于：鼠骨髓瘤细胞系如衍生自MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的细胞系(获自加利福尼亚州圣地亚哥的索尔克研究所细胞配销中心(Salk Institute Cell Distribution Center)，SP-2或X63-Ag8-653细胞(获自美国马里兰州罗克维尔的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection))，以及人骨髓瘤或小鼠-人种间骨髓瘤细胞系(参见，例如，Kozbor，J.Immunol.，133:3001(1984)；和Brodeur等，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications(《单克隆抗体制造技术和应用》)，纽约的MD公司(Marcel Dekker，Inc.)，第51-63页(1987))。 
检验培养杂交瘤细胞的培养基中产生的针对感兴趣多肽的单克隆抗体。优选用免疫沉淀或体外结合试验，例如放射免疫试验(RIA)或酶联免疫吸附试验(ELISA)测定杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。可采用例如Munson等(Anal.Biochem.，107:220(1980))的斯卡查德(Scatchard)分析测定单克隆抗体的结合亲和性。 
鉴定杂交瘤细胞产生的抗体具有所需特异性、亲和性和/或活性后，可用有限稀释法亚克隆所述克隆并用标准方法培养(参见例如Goding，Monoclonal Antibodies:Principles and Practic（单克隆抗体：原理和实践），学术出版社，第59-103页(1986))。适用于此目的的培养基包括例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。此外，杂交瘤细胞可以作为腹水瘤在动物体内培养。可用常规抗体纯化方法例如A蛋白-琼脂糖、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱来分离培养基、腹水或血清中亚克隆分泌的单克隆抗体。 
用常规方法(例如，利用能特异性结合编码鼠抗体重链和轻链基因的寡核苷酸探针)易分离和测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞可用作这种DNA的优选来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后转染入不会产生抗体的宿主细胞，例如大肠杆菌（E.coli）细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以诱导重组宿主细胞合成单克隆抗体。参见，例如Skerra等，Curr.Opin.Immunol.，5:256-262(1993)；和Pluckthun，Immunol Rev.，130:151-188(1992)。也可例如用人重链和轻链恒定区的编码序列取代同源鼠序 列(参见，例如美国专利号4,816,567；和Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81:6851(1984))，或通过将免疫球蛋白编码序列共价连接于非免疫球蛋白多肽的所有或部分编码序列来修饰所述DNA。 
在其他实施方式中，可从采用例如McCafferty等，Nature，348:552-554(1990)；Clackson等，Nature，352:624-628(1991)；和Marks等，J.Mol.Biol.，222:581-597(1991)所述技术从产生的抗体噬菌体文库中分离单克隆抗体或抗体片段。通过链替换产生高亲和性(nM范围)人单克隆抗体描述于Marks等，BioTechnology，10:779-783(1992)。使用组合感染和体内重组作为构建极大噬菌体文库的策略描述于Waterhouse等，Nuc.Acids Res.，21:2265-2266(1993)。因此，这些技术是产生单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤方法的可行替代方法。 
C.人源化抗体 
本领域已知人源化非人抗体的方法。优选地，人源化抗体具有从非人来源引入的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基，它们一般取自“输入”可变区。基本上通过用非人抗体的超变区序列基本取代人抗体的相应序列进行人源化。参见，例如Jones等，Nature，321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature，332:323-327(1988)；和Verhoeyen等，Science，239:1534-1536(1988)。因此，这种“人源化”抗体是嵌合抗体(参见，例如美国专利号4,816,567)，其中短于完整的人可变区基本上被非人物种的相应序列取代。实际上，人源化抗体通常是其中一些超变区残基和可能的一些框架区(FR)残基被啮齿类抗体的类似位置残基取代的人抗体。 
降低抗原性的重要考虑因素是如何选择用于制备本文所述人源化抗体的人轻链和重链可变区。按照所谓的“最佳拟合”方法，用啮齿动物可变区的序列筛选整个已知人可变区序列的文库。然后，将最接近啮齿类序列的人序列接受为人源化抗体的人FR区(参见，例如Sims等，J.Immunol.，151:2296(1993)；和Chothia等，J.Mol.Biol.，196:901(1987))。另一种方法使用衍生自特定轻链或重链亚组的所有人抗体共有序列的特定FR。这种相同的FR可用于数种不同的人源化抗体(参见，例如Carter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4285(1992)；和Presta等，J.Immunol.，151:2623(1993))。 
人源化抗体保留对抗原的高亲和性和其它有利的生物学特性也至关重要。为实现此目的，可利用亲代和人源化序列的三维模型，通过分析亲代序列和各种概念人源化产物的方法制备人源化抗体。本领域技术人员通常可获得并且熟悉三维免疫球蛋白模型。也可利用计算机程序说明和显示所选的候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构。检查这些显示能够分析所述残基在候选免疫球蛋白序列中发挥功能的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合抗原能力的残基。以此方式，可选择FR残基并从受体和输入序列中组合，从而获得所需抗体特征，例如对靶抗原的亲和性增加。超变区残基通常直接或特异性地影响抗原结合。 
本发明考虑了各种形式的人源化抗体。例如，人源化抗体可以是抗体片段，例如Fab片段。或者，人源化抗体可以是完整的抗体，例如完整的IgA、IgG或IgM抗体。 
D.人抗体 
作为人源化的替代方案，可产生人抗体。在一些实施方式中，可产生转基因动物(例如，小鼠)，免疫后其能产生完全的人抗体库但不产生内源性免疫球蛋白。例如，已描述了嵌合型和种系突变型小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合缺失导致完全抑制了内源性抗体的产生。将人种系免疫球蛋白基因阵列转移入这类种系突变型小鼠将导致在抗原刺激后产生人抗体。参见，例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:2551(1993)；Jakobovits等，Nature，362:255-258(1993)；Bruggermann等，Year in Immun.，7:33(1993)；和美国专利号5,591,669、5,589,369和5,545,807。 
或者，可采用噬菌体展示技术(参见，例如McCafferty等，Nature，348:552-553(1990))在体外产生人抗体和抗体片段，用未免疫供体的免疫球蛋白可变(V)区基因库。按照该技术，将抗体V结构域基因框内克隆入丝状噬菌体例如M13或fd的主要或次要外壳蛋白基因中，在噬菌体颗粒表面上展示为功能抗体片段。由于丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，基于抗体功能特性的选择还可选择显示那些特性的抗体编码基因。因此，噬菌体模拟了B细胞的一些特性。可以各种形式进行噬菌体展示，如Johnson等(Curr.Opin.Struct.Biol.，3:564-571(1993))所述。一些来源的V-基因区段可用于噬菌体展示。参见，例如Clackson等，Nature，352:624-628(1991)。可构建未免疫人供体的V基因库，基本上可按照Marks等，J.Mol.Biol.，222:581-597(1991)；Griffith等，EMBO J.，12:725-734(1993)；和美 国专利号5,565,332和5,573,905所述技术，分离针对不同抗原阵列(包括自身抗原)的抗体。 
在某些例子中，可如美国专利号5,567,610和5,229,275所述通过体外活化B细胞产生人抗体。 
E.抗体片段 
已开发了产生抗体片段的各种技术。通常用蛋白酶解消化完整的抗体获得这些片段(参见，例如Morimoto等，J.Biochem.Biophys.Meth.，24:107-117(1992)；和Brennan等，Science，229:81(1985))。然而，目前已用重组宿主细胞直接产生这些片段。例如，可以由上述抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者，可从大肠杆菌细胞直接回收Fab’-SH片段并将其化学偶联形成F(ab')2片段(参见，例如Carter等，BioTechnology，10:163-167(1992))。按照另一方法，直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab')2片段。本领域技术人员显然知道产生抗体片段的其它技术。在其它实施方式中，所选抗体是单链Fv片段(scFv)。参见，例如PCT公开号WO 93/16185；和美国专利号5,571,894及5,587,458。抗体片段还可以是如美国专利号5,641,870所述的线形抗体。这种线形抗体片段可以是单特异性或双特异性。 
F.双特异性抗体 
双特异性抗体是对至少两种不同表位具有结合特异性的抗体。示范性双特异性抗体可结合同一感兴趣多肽的两个不同表位。其它双特异性抗体可同时含有感兴趣多肽的结合位点与一种或多种其它抗原的结合位点。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如，F(ab')2双特异性抗体)。 
制备双特异性抗体的方法为本领域已知。全长双特异性抗体的传统制备方法是基于共同表达两条链具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链(参见，例如Millstein等，Nature，305:537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤)可能产生10种不同抗体分子的混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常须用亲和色谱纯化该正确的分子。PCT公开号WO 93/08829和Traunecker等，EMBO J.，10:3655-3659(1991)中描述了类似的方法。 
根据不同方法，将具有所需结合特异性的抗体可变区(抗体-抗原结合位点)融合 于免疫球蛋白恒定区序列。优选与含有至少部分绞链区、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定区融合。优选使含有结合轻链所必需位点的第一重链恒定区(CH1)出现在至少一个融合物中。将编码免疫球蛋白重链融合物的DNA（如果需要还有免疫球蛋白轻链）插入单独的表达载体中，共同转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的不同比例的三种多肽链提供最优产率的实施方式中，这为调节三个多肽片段的共有部分提供了极大的灵活性。然而，当表达比例相同的至少两种多肽链产生高得率或该比例没有特定意义时，可将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体中。 
在该方法的一个优选实施方式中，双特异性抗体由一条臂中具有第一结合特异性的杂交免疫球蛋白重链和另一臂中的杂交免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。此种不对称结构有助于分离所需的双特异性化合物与不需要的免疫球蛋白链的组合，因为免疫球蛋白轻链仅存在于一半双特异性分子中提供了一种容易的分离方式。参见，例如PCT公开号WO 94/04690和Suresh等，Meth.Enzymol.，121:210(1986)。 
按照美国专利号5,731,168所述的另一方法，可工程改造一对抗体分子之间的界面以最大程度提高从重组细胞培养物中回收的异源二聚体百分比。优选界面包含抗体恒定结构域的至少部分CH3结构域。在这种方法中，用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)取代第一抗体分子界面上的一个或多个较小氨基酸侧链。通过用较小氨基酸侧链(如丙氨酸或苏氨酸)取代较大氨基酸侧链，在第二抗体分子界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空穴”。这提供了提高异源二聚体相对于不希望的终产物如同源二聚体的产率的机制。 
双特异性抗体包括交联或“异源偶联”的抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可偶联于亲和素，另一种偶联于生物素。可采用任何常规的交联方法制备异源偶联物抗体。可采用方便的交联方法制备异质偶联抗体。合适的交联剂和技术为本领域熟知并公开于例如美国专利号4,676,980。 
本领域还已知从抗体片段产生双特异性抗体的合适技术。例如，可利用化学连接制备双特异性抗体。在某些情况中，可通过蛋白水解切割完整抗体产生F(ab')2片段的过程来产生双特异性抗体(参见，例如Brennan等，Science，229:81(1985))。在二硫醇复合剂亚砷酸钠存在下还原这些片段可稳定邻近的二硫醇并 阻止分子间二硫键形成。然后将产生的Fab’片段转变成巯基硝基苯甲酸酯(thionitrobenzoate，TNB)衍生物。然后用巯基乙胺还原将Fab’-TNB衍生物之一再转变成Fab’-硫醇，与等摩尔量的另一Fab’-TNB衍生物混合从而形成双特异性抗体。 
在一些实施方式中，可从大肠杆菌中直接回收Fab’-SH片段，将其化学偶联以形成双特异性抗体。例如，可用Shalaby等，J.Exp.Med.，175:217-225(1992)所述的方法制备完全人源化的双特异性抗体F(ab')2分子。各Fab’片段分别从大肠杆菌细胞分泌，对其进行体外定向化学偶连而形成双特异性抗体。 
从重组细胞培养物直接制备和分离双特异性抗体片段的各种技术也已有描述。例如，利用亮氨酸拉链制备双特异性抗体。参见例如Kostelny等，J.Immunol.,148:1547-1553(1992)。Fos和Jun蛋白质的亮氨酸拉链肽通过基因融合连接于两种不同抗体的Fab’部分。在绞链区还原该同质二聚体抗体形成单体，然后再氧化形成异质二聚体抗体。也可用该方法产生抗体同质二聚体。Hollinger等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90:6444-6448(1993))所述的“二抗体”技术为制备双特异性抗体片段提供了替代机制。这些片段包含通过接头与轻链可变区(VL)相连的重链可变区(VH)，所述接头短到不允许同一链上的两个结构域之间配对。因此，一个片段的VH和VL结构域被迫与另一片段的互补VL和VH结构域配对，从而形成两个抗原结合位点。利用单链Fv(sFv)二聚体制备双特异性抗体片段的另一种策略描述于Gruber等，J.Immunol.，152:5368(1994)。 
还考虑了两价以上的抗体。例如，可制备三特异性抗体。参见例如Tutt等，J.Immunol.147:60(1991)。 
G.抗体纯化 
当采用重组技术时，抗体可在分离的宿主细胞内、宿主细胞的周质间隙中产生，或从宿主细胞直接分泌到培养基中。如果胞内产生抗体，应先通过例如离心或超滤除去颗粒碎片。Carter等(BioTech.，10:163-167(1992))描述了分泌入大肠杆菌周质间隙中的抗体的分离方法。简言之，在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟化物(PMSF)存在下，解冻细胞体(cell paste)约30分钟。可通过离心除去细胞碎片。当抗体分泌入培养基中时，通常用可市售获得的蛋白质浓缩滤器，例如阿米康(Amicon)或密理博Pellicon超滤单元浓缩这种表达系统 的上清液。任何上述步骤中可包含蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白酶解，还可包含抗生素以防止外来污染物的生长。 
可采用例如羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析和亲和色谱纯化从细胞制备的抗体组合物。A蛋白作为亲和配体是否合适取决于抗体中存在的免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。可用A蛋白纯化基于人γl、γ2或γ4重链的抗体(参见，例如Lindmark等，J.Immunol.Meth.，62:1-13(1983))。对于所有小鼠同种型和人γ3，推荐G蛋白(参见，例如Guss等，EMBO J.，5:1567-1575(1986))。最常见的连接亲和配体的基质是琼脂糖，但也可采用其它基质。与琼脂糖相比，机械稳定的基质如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯可实现较快的流动速率和较短的加工时间。抗体包含CH3结构域时，Bakerbond ABXTM树脂(特鲁利贝克(J.T.Baker)；新泽西州菲利浦斯勃格)用于纯化。根据待回收的抗体，还可采用蛋白质纯化的其它技术，例如用离子交换柱分级、乙醇沉淀、反相HPLC、二氧化硅色谱、肝素SEPHAROSETM色谱、阴离子或阳离子交换树脂(例如，聚天冬氨酸柱)色谱、色谱聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。 
初步纯化步骤后，对包含感兴趣抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用色谱，该色谱使用pH约为2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选低盐浓度下进行(如约0-0.25M盐)。 
本领域技术人员应理解功能与抗体相似的任何结合分子，例如样品中一种或多种感兴趣分析物的特异性结合分子或结合伴侣也可用于本发明方法和组合物中。合适的抗体样分子的例子包括但不限于：域抗体、单片式抗体(unibody)、纳米抗体、鲨抗原反应性蛋白(shark antigen reactive protein)、阿微莫(avimers)、阿德耐汀(adnectins)、安替卡莫斯(anticalms)、亲和配体、菲乐莫斯(phylomers)、适体、亲和体、特里耐汀(trinectins)等。 
给药方法 
按照本发明方法，可用本领域已知的任何便利方法将本文所述的抗癌药给予对象。可用本发明方法选择合适的抗癌药或抗癌药组合治疗对象的肿瘤(例如，血液恶性肿瘤)。还可用本发明方法鉴定对象中癌(例如，血液恶性肿瘤)对抗癌药或抗癌药组合治疗的响应。此外，可用本发明方法预测患癌(例如，血液恶性肿瘤)对象对抗癌药或抗癌药组合治疗的响应。此外，可用本发明方法鉴定 耐受抗癌药或抗癌药组合治疗的患癌(例如，血液恶性肿瘤)对象。本领域技术人员应理解可单独给予本文所述的抗癌药或作为组合治疗方法的一部分与常规化疗、放疗、激素治疗、免疫治疗和/或外科手术一起给予。 
在某些实施方式中，抗癌药包含抗信号传导剂（即细胞抑制剂）如单克隆抗体或酪氨酸激酶抑制剂；抗增殖剂；化疗剂；疫苗；和/或任何其他有能力降低或消除异常细胞如癌细胞不受控生长的化合物。在一些实施方式中，联用抗信号转导药物、抗增殖剂和/或激素治疗剂中的一种或多种与至少一种化疗剂治疗对象。示例性单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂、抗增殖剂、化疗剂、激素治疗剂、放疗剂和疫苗如上所述。 
在一些实施方式中，也可共同给予本文所述的抗癌药与常规免疫治疗剂，所述免疫治疗剂包括但不限于：免疫刺激剂(例如，卡介苗(BCG)、左旋咪唑、白介素-2、α-干扰素等)、免疫毒素(例如，抗CD33单克隆抗体-刺孢霉素偶联物、抗CD22单克隆抗体-假单胞菌外毒素偶联物等)、和放射性免疫治疗(例如，与111In、90Y或131I偶联的抗CD20单克隆抗体等)。 
抗癌药可在必要时和适当的药物赋形剂一起给予，并可通过任何可接受的给药方式来进行。因此，给药可以是，例如口服、颊部、舌下、经牙龈、经上颚、静脉内、局部、皮下、经皮、透皮、肌肉内、关节内、胃肠外、小动脉内、真皮内、心室内、颅内、腹膜内、膀胱内、鞘内、病损内、鼻内、经直肠、经阴道、或吸入。“共同给予”表示在给予第二药物(例如，另一种抗癌药、用于减轻抗癌药物治疗相关副作用的药物、放疗剂、激素治疗剂、免疫治疗剂等)的同时，之前或之后给予抗癌药。 
治疗有效量的抗癌药可重复给予，例如，至少2、3、4、5、6、7、8或更多次，或者所述剂量可通过连续灌输给予。所述剂量可以采用固体、半固体、冻干粉末或液体剂型的形式，例如，片剂、丸剂、团剂、囊剂、粉剂、溶液、悬浮剂、乳剂、栓剂、保留灌肠剂、霜剂、油膏剂、洗剂、凝胶剂、气溶胶、泡沫剂等，优选以适合精确剂量单次给药的单位剂型。 
本文所用的术语“单位剂型”指适合作为单一剂量用于人对象或其他哺乳动物的物理离散单位，每个单位包含预定量的抗癌药和合适的药用赋形剂(例如，安瓿)，所述预定量经计算能产生所需的起始反应、耐受性和/或治疗效果。此外，可制备 更浓缩的剂型，然后可由此产生更稀释的单元剂型。因此，所述更浓缩的剂型将含有显著超过例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多倍的所述抗癌药量。 
本领域技术人员已知制备此类剂型的方法(参见例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》)，第18版，宾夕法尼亚州伊斯顿的马克出版公司(Mack Publishing Co.)(1990))。所述剂型通常包括常规的药物载体或赋形剂并可另外包括其它药物剂、载体、佐剂、稀释剂、组织渗透促进剂、增溶剂等。可用本领域熟知方法对特定剂型和给药途径调整合适的赋形剂(参见例如，《雷明顿药物科学》，同上)。 
合适赋形剂的示例包括但不限于：乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、西黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、盐水、糖浆、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和聚丙烯酸如卡波姆（Carbopol），例如卡波姆941、卡波姆980、卡波姆981等。所述剂型可另外包括润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂；助悬剂；防腐剂如羟基苯甲酸甲酯、乙酯和丙酯(即，对羟基苯甲酸酯类)；pH调节剂，例如无机与有机酸和碱；甜味剂；和芳香剂。所述剂型还可包含生物可降解的聚合珠、右旋糖苷和环糊精包合物。 
对于口服给药，治疗有效剂量可以是片剂、囊剂、乳剂、悬浮剂、溶液、糖浆剂、喷剂、锭剂、粉剂和缓释制剂的形式。用于口服给药的合适赋形剂包括药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、明胶、蔗糖、碳酸镁等。 
在一些实施方式中，治疗有效剂量采取丸剂、片剂或胶囊形式，因此，该剂型可含有抗癌药和以下任何一种：稀释剂，例如乳糖、蔗糖、磷酸二钙等；崩解剂，例如淀粉或其衍生物；润滑剂，例如硬脂酸镁等；和粘合剂，例如淀粉、阿拉伯胶、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、纤维素及其衍生物。也可将抗癌药配制成例如聚乙二醇(PEG)运载体中的栓剂。 
可将抗癌药和任选的一种或多种药学上可接受的佐剂溶解或分散于运载体，例如盐水(例如，0.9%w/v氯化钠)、水性右旋糖、甘油、乙醇等中，制备成液体剂型，形成用于例如口服、局部或静脉内给药的溶液或混悬液。也可将抗癌药配制成驻留灌肠剂。 
对于局部给药，治疗有效剂量可以是乳剂、洗剂、凝胶剂、泡沫剂、乳膏剂、胶冻剂、溶液剂、悬浮剂、油膏剂和透皮贴剂的形式。对于吸入给药，可将抗癌药以干粉或液体形式通过喷雾器递送。对于肠胃外给药，治疗有效剂量可以是无菌可注射溶液和无菌包装的粉剂形式。优选地，可注射溶液配制在约4.5-7.5的pH中。 
治疗优选剂量还可以冻干形式提供。此类剂型可包括缓冲液，例如碳酸氢盐，用于在给药前重建，或者所述缓冲液可以包括在冻干剂型中，用于采用例如水来重建。所述冻干剂型还可包含适当的血管收缩剂，例如肾上腺素。所述冻干剂型可以在注射器中提供，可选与重建的缓冲液联合包装，使得重建剂型可以立即给予对象。 
也可以定期的时间间隔监测对象以评估某些治疗方案的效果。例如，某些致癌融合蛋白和/或信号转导分子的活化状态可能根据本文所述一种或多种抗癌药治疗的效果而改变。可监测对象，评估反应和了解某些药物或治疗在个体化方法中的效果。此外，最初响应特定抗癌药或抗癌药组合的对象也可能变得用该药物或药物组合难以治疗，提示这些对象产生了获得性耐药。可停止这些对象的当前治疗，并按照本发明方法处方替代治疗。 
在某些方面，本文所述方法可与多个基因表达标记板联用，来预测各类人群的癌症预后和/或复发概率。可利用这些基因板鉴定不可能复发并因而不可能从辅助化疗获益的对象。可利用这些表达板来鉴定可以安全地避免辅助化疗的对象，而对无病以及总体存活结果不会有不良影响。 
此外，在某些其他方面，本文所述方法可与能鉴定未知原发性癌症（CUP）原始肿瘤的基因表达标记板联用。这些基因板可用来鉴定会从治疗中获益的有转移癌的对象，所述治疗与给予最初诊断为患癌对象的治疗一致。合适的系统包括但不限于Aviara CancerTYPE ID试验，这是一种基于RT-PCR的表达试验，能测量92种基因从而鉴定39种肿瘤的原发部位；以及 
Figure BDA00001789353400801
起源组织试验（Tissue of Origin Test），其检测微阵列上超过1600种基因的表达，并将肿瘤基因表达的“特征”与15种已知组织类型的表达作比较。 
实施例
提供以下实施例，以说明而非限制要求权利的发明。 
实施例1.用具有酪胺信号放大的邻近双检测微阵列ELISA检测单一细胞。 
本实施例描述了具有优越动态范围的多重高通量邻近双检测微阵列夹心ELISA，适合分析分离细胞制备的细胞提取物中融合蛋白和信号转导分子的活化状态。在具体实施方式中，所述邻近试验为可寻址微阵列的形式。 
1)将捕获抗体的1mg/ml-0.004mg/ml系列稀释液点印在16孔FAST载玻片上（获特满公司）。或者可使用各捕获抗体的2倍系列稀释液（0.25mg/ml、0.125mg/ml、和0.0625mg/ml），且各抗体稀释液可使用双重或四重点。对于检测BCR-ABL融合蛋白，示例性捕获抗体包括抗BCR单克隆抗体或多克隆抗体。 
2)干燥过夜，用获特满封闭缓冲液封闭载玻片。 
3)各板上加入80微升10倍系列续稀释的细胞裂解液。室温孵育载玻片2小时。 
4)用TBS-吐温（Tween）洗涤6次后在载玻片上加入80μl用TBS-吐温/2%BSA/1%FBS稀释的邻近试验的检测抗体。对于检测BCR-ABL融合蛋白，示例性检测抗体包括：(1)直接偶联于葡萄糖氧化酶(GO)的抗ABL单克隆或多克隆抗体；和(2)直接偶联于辣根过氧化物酶(HRP)的识别磷酸化ABL的单克隆或多克隆抗体。室温孵育2小时。 
5)或者，检测步骤采用识别磷酸化ABL的偶联生物素的抗体。在这些情况中，洗涤6次后，还包括与链霉亲和素-HRP一起孵育1小时的额外后续步骤。 
6)或者，检测步骤采用寡核苷酸介导的偶联GO的抗ABL抗体。可用HRP与磷酸化ABL抗体的直接偶联或者生物素-链霉亲和素(SA)相连的偶联物。 
6)对于信号放大，加入80微升5μg/ml生物素-酪酰胺并反应15分钟。用TBS-吐温洗涤载玻片六次，用20%DMSO/TBS-吐温洗涤两次，用TBS洗涤一次。 
7)加入80微升SA-Alexa 555并孵育30分钟。然后洗涤载玻片两次，干燥5分钟，用微阵列扫描仪（帕金埃尔默公司(Perkin-Elmer,Inc.)）扫描。 
本文所述的邻近试验微阵列形式优选表现出非常低的背景（如与二抗体试验相比），这是由于测得两种检测抗体之间邻近所获得的特异性提高。 
实施例2.生成活化分布用于药物选择。 
可利用本发明组合物和方法选择癌症治疗药物。作为非限制性示例，本发明用于鉴定血液恶性肿瘤相关的一种或多种致癌融合蛋白的存在和/或活性从而为这类癌症患者提供合适治疗。典型方案需要产生两种分布，参比活化分布和测试活化分布，然后比较两种分布以确定特定药物治疗方案的效果(参见，图2)。 
参比活化分布
为产生参比活化分布，从抗癌药物治疗之前的特定类型癌症(例如，白血病如CML)患者中获得血液样品。可用（例如）本文详述的任何技术分离血液样品中的肿瘤细胞。所述分离细胞可用一种或多种生长因子体外刺激。然后裂解经刺激的细胞产生细胞提取物。将细胞提取物应用于含有一组捕获抗体稀释系列的可寻址阵列，所述捕获抗体对患者癌症类型中活化状态可能改变的一种或多种致癌融合蛋白（单独或与一种或多种信号转导分子联合）特异。用合适的检测抗体(例如，活化状态非依赖性抗体和/或活化状态依赖性抗体)进行单一检测或邻近试验，测定感兴趣的各分析物的活化状态。因此，产生的参比活化分布可提供没有抗癌药时患者癌症中特定分析物如致癌融合蛋白的活化状态。 
测试活化分布
为获得测试活化状态，从抗癌药治疗之前或在给予抗癌药后(例如，在整个癌症疗程的任何时间)特定类型癌症(例如，白血病如CML)患者中获得第二血液样品。分离该血液样品的肿瘤细胞。如果分离的细胞获自未接受抗癌药治疗的患者，则将分离的细胞与靶向上述参比活化分布测定的一种或多种活化致癌融合蛋白和/或信号转导分子的抗癌药一起孵育。例如，如果从参比活化分布测得BCR-ABL融合蛋白被活化，则将细胞与伊马替尼 
Figure BDA00001789353400821
一起孵育。然后所述分离细胞可用一种或多种生长因子体外刺激。然后裂解分离的细胞产生细胞提取物。将细胞提取物应用于可寻址阵列，进行单一检测或邻近试验以测定感兴趣的各分析物的活化状态。如此产生的患者的测试活化分布可提供在特定抗癌药存在时患者癌症中特定分析物如致癌融合蛋白的活化状态。 
药物选择
通过比较测试活化分布与参比活化分布来测定抗癌药是否适合治疗患者的癌症。例如，如果该药物治疗导致大多数或所有致癌融合蛋白和/或信号转导分子的活化比没有药物时显著降低，例如从没有药物时的强活化改变为有药物 时的弱或极弱活化，则可确定该治疗适用于该患者的癌症。在这种情况中，未接受药物治疗的患者可用合适的抗癌药开始治疗，或者已接受药物的患者后续治疗可采用合适的抗癌药。然而，如果认为该药物治疗不适合治疗患者的癌症，可选择不同的药物并用于产生新的测试活化分布，然后将其与参比活化分布作比较。在这种情况中，未接受药物治疗的患者可用合适的抗癌药开始治疗，或者正接受不合适药物治疗的患者的后续治疗改用合适的抗癌药。 
本实施例所述的实验方案还用于鉴定对用酪氨酸激酶抑制剂如伊马替尼的治疗有抗性的患者，这是由于靶蛋白激酶（如BCR-ABL）中的突变、对治疗方案不依从、和/或给予了未达最佳的药物剂量。 
实施例3.癌症相关的示例性致癌融合蛋白 
本实施例提供人肿瘤中移位的非详尽清单，所述移位引起致癌融合蛋白和其相关肿瘤的形成。 
伯基特淋巴瘤：c-myc基因移位t(8;14)(q24;q32)。最常见嵌合肿瘤蛋白是c-myc/IGH。 
AML：染色体8-染色体21的部分移位得到的嵌合肿瘤蛋白是RUNX1/ETO。另一移位t(12;15)(p13;q25)产生TEL/TrkC(激酶)嵌合肿瘤蛋白。 
CML:费城染色体是产生BCR/ABL(激酶)的移位。 
尤因肉瘤：染色体11和22之间的移位。产生的嵌合肿瘤蛋白是EWS/FLI(转录因子)。 
ALL:嵌合致癌蛋白: 
Figure BDA00001789353400831
DFSP:超过95%的DFSP肿瘤具有染色体移位t(17;22)，其产生嵌合肿瘤蛋白COL1A1/PDGF(结合并活化PDGFR)。 
急性早幼粒细胞白血病:标为t(15;17)(q22;q12)的移位。产生的嵌合肿瘤蛋白是RARα/PML(转录复合蛋白)。 
前体B细胞急性淋巴细胞白血病：移位t(17;19)，其产生嵌合肿瘤蛋白E2A/HLF（凋亡抑制剂）。 
急性前B细胞白血病：移位t(1;19)。嵌合肿瘤蛋白为E2A/Pbx1（激酶底物）。 
横纹肌肉瘤：t(2:13)(q35;q14)移位，产生嵌合肿瘤蛋白PAX3/FKHR（转录因子）。 
非常年幼儿童的软组织恶性肿瘤：t(12;15)(p13;q25)重排，产生下述嵌合肿瘤蛋白：蛋白酪氨酸激酶ETV6/NTRK3（激酶）。 
甲状腺乳头状癌：嵌合肿瘤蛋白是RET/PTC（激酶）。 
前列腺癌：嵌合肿瘤蛋白是TMRSS/ERG（激酶）。 
引起致癌融合蛋白和其相关肿瘤形成的人类肿瘤中移位的其他示例： 
Figure 2010800581508100002DEST_PATH_IMAGE001
实施例4.邻近介导的免疫分析用于检测致癌融合蛋白的总水平和活化水平。 
导言
癌基因BCR-ABL由定位在9号染色体长臂上的正常ABL基因移位到定位于22号染色体长臂上的BCR基因的N末端部分形成，产生费城染色体。根据移位的ABL基因剪接在BCR基因N末端的位置，可产生不同长度的BCR-ABL基因产物，最普遍的是p210BCR-ABL基因产物，其为引起CML和ALL亚组的癌基因。还产生其他额外基因产物例如p185和p230BCR-ABL。具体地，p210BCR-ABL基因产物引起AML。该蛋白含1790个氨基酸并由来自BCR N末端的寡聚化结构域（OLI）组成，然后是正常BCR中不存在的BCR氨基酸序列插入物-BCR的S/T激酶结构域，然后是来自ABL的SH3,SH2和Y激酶结构域以及ABL的C末端富含脯氨酸的结构域。 
临床背景
虽然大多数慢性髓性白血病（CML）患者在慢性期对伊马替尼响应良好，但一些患者没有获得所需终点，且其他可能最终失去响应或不耐受。关于400mg/天伊马替尼(Gleevec)治疗:70-80%的患者中有完全细胞遗传反应(CCyR)；在头三天每年以4-7%的比率丧失CCyR且之后每年1–2%；7年后总体存活率为90%，7年后无事件存活率为81%；5年内复发率约为30%。对800mg/天伊马替尼(Gleevec)治疗响应更好（CCyR=95%；释放率=5%），但该剂量的伊马替尼毒性也更强。尼洛替尼与800mg/天伊马替尼有相似的功效，但其比伊马替尼毒性更强。 
完全BCR-ABL抑制对Gleevec产生更好的响应，但不完全BCR-ABL抑制导致Gleevec复发。因此，通过将剂量调整为有效抑制所述靶标且毒性最小的靶向治疗，BCR-ABL的表达水平和活化程度的实时检测对CML患者有益。例如，不完全失活并摄取400mg/天Gleevec的那些患者可尽快给予较高剂量（如800mg/天）以确保响应。 
诊断刺激
全长BCR和ABL的高基线水平使其很难检测丰度相对较低的BCR-ABL融合蛋白。此外，检测BCR-ABL磷酸化水平的当前试验没有检测临床血液样品中磷酸化的灵敏度。此外，针对融合蛋白如BCR-ABL的抗体对所述融合蛋白的多种变体特异性不高。 
新BCR-ABL检测试验
图3A表示用于检测致癌融合蛋白如BCR-ABL(310)存在（总水平）和/或活化状态（磷酸化水平）的示例性邻近试验（300）。图3B显示用连接抗体检测BCR-ABL(410)的存在（总水平）和/或活化状态（磷酸化水平）的本发明邻近试验的一个替代实施方式(400)。 
适用于如图3A-3B所示测量BCR-ABL总蛋白和/或活化蛋白水平方法的抗体的非限制性示例包括上表1中所列的那些。 
结果
图4显示用偶联珠的全长BCR羧基末端区域的特异性抗体按照图3A所述示例性邻近试验移除游离的全长BCR后，K562细胞（即人慢性髓细胞性白血病细胞系的细胞）中的BCR-ABL信号。具体地，图4证明用本发明的新邻近试验移除患者样品中的游离BCR对BCR-ABL的信号没有影响。 
图5显示用偶联珠的全长BCR羧基末端区域的特异性抗体按照图3A所述示例性邻近试验移除游离BCR后，K562细胞中的BCR信号。如图5所示，10,000个细胞的BCR信号降低证明本发明的新邻近试验仅移除BCR。 
图6显示永图3A所述示例性邻近试验对K562细胞中BCR-ABL的总水平和磷酸化水平的检测。 
结论
本实施例证明图3A和3B中所示用于检测BCR-ABL的存在和/或活化状态的示例性邻近试验是有优势的，原因至少如下：(1)可使用BCR C末端区域特异性消耗标签将全长BCR蛋白从患者样品如血液或骨髓抽吸物中移除；(2)一旦全长BCR蛋白从患者样品中移除，BCR N末端区域特异性捕获抗体可捕获BCR-ABL融合蛋白；和(3)一旦BCR-ABL融合蛋白被捕获，可通过邻近沟道效应以高灵敏度检测其表达水平和活化水平，其中关联总或活化BCR-ABL蛋白水平的单一可检测信号仅在所有三种抗体都结合时生成，使试验特异性增加、背景降低并简化检测。 
实施例5.在无全长BCR和/或ABL干扰时检测BCR-ABL总水平和活化水平。 
本实施例提供额外的实验数据，证明图3A和3B中所述示例性邻近试验用于检测BCR-ABL的存在（总水平）和/或活化状态（磷酸化水平）的优点。在具体实施方式中，使用BCR C末端区域特异性消耗标签将全长BCR蛋白从获自患者样 品的细胞提取物（如恶性肿瘤白细胞如白血病细胞）中或从获自细胞系（如白血病细胞系）的细胞提取物中移除。一旦全长BCR从细胞提取物中移除，BCR N末端区域特异性捕获抗体可捕获BCR-ABL融合蛋白。一旦BCR-ABL融合蛋白被捕获，可通过邻近沟道效应以高灵敏度检测其表达水平和活化水平，其中关联总或活化BCR-ABL蛋白水平的单一可检测信号仅在所有三种抗体都结合时生成，有利地使试验特异性增加、背景降低并简化检测。 
图7显示用偶联珠的全长BCR羧基末端区域特异性抗体按照图3A所述示例性邻近试验移除游离的全长BCR后，K562细胞（即人慢性髓细胞性白血病细胞系的细胞）中检测的BCR-ABL的磷酸化水平（“磷酸BCR-ABL”）和总量（“总BCR-ABL”）。具体地，图7A和7B显示在K562细胞提取物接触偶联珠的全长BCR C末端特异性抗体以用本发明的新邻近试验移除BCR蛋白后，磷酸化和总BCR-ABL信号没有变化。图7C显示游离的全长BCR在用BCR C末端抗体偶联的珠处理后确实从细胞提取物中移除。 
图8进一步表明用偶联珠的全长BCR羧基末端区域特异性抗体按照图3A所述示例性邻近试验移除游离BCR后，K562细胞中的磷酸化BCR-ABL信号。具体地，图8A提供移除或不移除全长BCR（(“非珠处理”=BCR未移除与“珠处理”=BCR用含全长BCR C末端特异性抗体偶联的珠移除）的K562细胞裂解物中检测的磷酸化BCR-ABL信号的微阵列比较。图8B提供微阵列数据的图形描绘，相对荧光单位(RFU)随着细胞数量而变化。这些图证明在K562细胞提取物中用本发明新邻近试验移除全长BCR后磷酸BCR-ABL信号没有变化。 
图9进一步表明用偶联珠的全长BCR羧基末端区域特异性抗体按照图3A所述示例性邻近试验移除游离BCR后，K562细胞中的总BCR-ABL信号。具体地，图9A提供移除或不移除全长BCR（(“非珠处理”=BCR未移除与“珠处理”=BCR用含全长BCR C末端特异性抗体偶联的珠移除）的K562细胞裂解物中检测的总BCR-ABL信号的微阵列比较。图9B提供微阵列数据的图形描绘，相对荧光单位(RFU)随着细胞数量而变化。这些图证明在K562细胞提取物中用本发明新邻近试验移除全长BCR后总BCR-ABL信号没有变化。 
图10进一步显示K562细胞提取物与偶联BCR C末端抗体的珠接触后从所述细胞提取物中移除游离的全长BCR。具体地，图10A提供移除或不移除全长BCR （(“非珠处理”=BCR未移除与“珠处理”=BCR用含全长BCR C末端特异性抗体偶联的珠移除）的K562细胞裂解物中检测的总BCR信号的微阵列比较。图10B提供微阵列数据的图形描绘，相对荧光单位(RFU)随着细胞数量而变化。这些图证明用含全长BCR C末端特异性抗体的珠处理时，全长BCR从细胞提取物中基本消除。事实上，在用BCR C末端抗体偶联珠孵育时，含例如少于1000细胞的细胞提取物不产生显著高于背景（0细胞）的BCR信号。 
图11显示白细胞(WBC)中存在游离的全长BCR和ABL蛋白，但没有BCR-ABL融合蛋白。图12显示K562细胞提取物中掺入WBC提取物时，WBC中存在的游离全长BCR抑制所述K562细胞提取物中的磷酸BCR-ABL信号。图13显示用偶联珠的全长BCR羧基末端区域特异性抗体移除游离BCR后，掺入WBC提取物的K562细胞中的总BCR-ABL信号。具体地，K562细胞提取物中掺入WBC提取物时，图13A显示游离BCR信号饱和。用偶联BCR C末端抗体的珠处理后，所述游离BCR被移除。图13B显示在相同实验中用或不用珠处理情况下，BCR-ABL信号没有变化。 
在一些实施方式中，在捕获并检测BCR-ABL表达和/或活化前使用ABL氨基末端区域特异性消耗标签可额外地或替代地将全长ABL蛋白从获自患者样品的细胞提取物（如恶性肿瘤白细胞如白血病细胞）中或从获自细胞系（如白血病细胞系）的细胞提取物中移除。该消耗标签的非限制性示例是结合全长ABL N末端区域特异性抗体的珠。 
实施例6.用BCR-ABL激酶活性抑制剂处理的细胞中检测BCR-ABL总水平和活化水平。 
本实施例证明BCR-ABL抑制剂如伊马替尼 
Figure BDA00001789353400881
尼洛替尼 
Figure BDA00001789353400882
和达沙替尼 在K562细胞（即人慢性髓细胞性白血病细胞系）中剂量依赖性抑制BCR-ABL蛋白的活化（即磷酸化），而非其表达（即总水平）。具体地，图14A和14B显示BCR-ABL抑制剂伊马替尼 
Figure BDA00001789353400884
在K562细胞中剂量依赖性抑制BCR-ABL蛋白的活性（即磷酸化），而非其表达（即总水平）。图14C显示伊马替尼抑制后的BCR-ABL的磷酸化/总水平之比，其关联伊马替尼处理的磷酸BCR-ABL信号的抑制百分比。 
图15A和15B显示BCR-ABL抑制剂尼洛替尼 在K562细胞中剂 量依赖性抑制BCR-ABL蛋白的活性（即磷酸化），而非其表达（即总水平）。图15C显示尼洛替尼抑制后的磷酸化/总BCR-ABL之比，其关联尼洛替尼处理的磷酸BCR-ABL信号的抑制百分比。 
图16A和16B显示BCR-ABL抑制剂达沙替尼 
Figure BDA00001789353400891
在K562细胞中剂量依赖性抑制BCR-ABL蛋白的活性（即磷酸化），而非其表达（即总水平）。图16C显示达沙替尼抑制后的磷酸化/总BCR-ABL之比，其关联达沙替尼处理的磷酸BCR-ABL信号的抑制百分比。 
实施例7.检测各种癌细胞系中BCR-ABL底物CRKL的总水平和活化水平。 
本实施例显示用夹心ELISA测定的BCR-ABL底物CRKL的总水平和活化（磷酸化）水平。在其他实施方式中，可用邻近试验如2010年7月15日提交的PCT申请号PCT/US2010/042182、以及美国专利公开号20080261829、20090035792和20100167945中所述协同邻近免疫试验（COPIA）检测BCR-ABL底物如CRKL的存在和/或活化状态，所述公开通过引用全文纳入本文用于所有目的。 
图17显示CRKL在K562细胞（即人慢性髓细胞性白血病细胞系的细胞）中存在并被活化（即磷酸化）。图18显示CRKL在A431细胞（即人表皮样癌细胞系的细胞）中存在并在EGF处理后活化（即磷酸化）。图19显示CRKL在T47D细胞（即人乳腺导管上皮肿瘤细胞系的细胞）中存在，但在EGF处理后未活化（即磷酸化）。图20显示CRKL在T47D细胞中存在并在调蛋白（HRG）处理后低水平活化（即磷酸化）。图21显示CRKL在MCF-7细胞（人乳腺癌细胞系的细胞）中存在并在调蛋白（HRG）处理后低水平活化（即磷酸化）。图22表示供体间活化水平不同的患者样品的白细胞(WBC)中存在活化（即磷酸化）的CRKL。 
实施例8.检测各种癌细胞系中BCR-ABL底物JAK2的总水平和活化水平。 
本实施例显示用夹心ELISA测定的BCR-ABL底物JAK2的活化（磷酸化）水平。在其他实施方式中，可用邻近试验如2010年7月15日提交的PCT申请号PCT/US2010/042182、以及美国专利公开号20080261829、20090035792和20100167945中所述协同邻近免疫试验（COPIA）检测BCR-ABL底物如JAK2的存在和/或活化状态，所述公开通过引用全文纳入本文用于所有目的。 
图23显示JAK2在K562细胞（即人慢性髓细胞性白血病细胞系的细胞）和A431细胞（即人表皮样癌细胞系的细胞）中被活化（即磷酸化）。 
实施例9.从血液中分离细胞而不稀释抗癌药。 
通过使用磁珠捕获抗CD45抗体，然后制备K562细胞裂解物并测定一种或多种致癌融合蛋白（如BCR-ABL）、其底物、其途径或其组合的表达和/或活性状态，本实施例显示了从掺有K562细胞的血液中回收K562细胞（即人慢性髓细胞性白血病细胞系）。通过使用磁珠捕获抗CD45或抗CD15抗体，然后制备细胞裂解物并测定一种或多种致癌融合蛋白（如BCR-ABL）、其底物、其途径或其组合的表达和/或活化状态，本实施例还显示从患者血液样品中回收白细胞。由于细胞分离后不需要任何清洗步骤，本文所述方法具有优势，因为感兴趣的细胞可从血液中回收，而不改变抗癌药如酪氨酸激酶抑制剂的胞内浓度。因此，本实施例所述的方法与本领域接受的细胞分离后清洗细胞的实践（如清洗结合珠的细胞）相反，并提供回收细胞的细胞提取物而不需大量稀释细胞内的抗癌药如酪氨酸激酶抑制剂(如 
Figure BDA00001789353400901
等)。 
用CD45Dynabeads从1ml血液中回收K562细胞
1.制备缓冲液1 
1.1在500ml PBS中添加500mg BSA 
1.2添加2ml 0.5M EDTA 
2.制备血液并掺入K562细胞 
2.1从供体中获取10ml全血 
2.2用缓冲液1以1:1稀释血液 
2.3用自动细胞计数器（CellCounter）计数K562细胞 
2.4分别添加5e6、1e6、0.1e6、和0个K562细胞到1ml稀释血液中形成各浓度 
3.清洗DynaBeads(英杰公司目录号111.53D) 
3.1每1e7细胞转移100μl珠到1.5ml EP（eppendorf）管中 
3.2添加1ml缓冲液1并温和混合 
3.3将所述管放在磁体上1分钟 
3.4移除上清 
3.5从所述磁体上移去管并用与起始珠转移体积等量的缓冲液1重悬 
4.细胞分离 
4.1掺入K562的各血液样品中添加100μl清洗的珠。 
4.2在冷的屋子中（或室温）于旋转器上孵育样品20分钟、2小时或1小时。 
4.3将样品放在磁体上并移去上清 
5.制备细胞裂解液 
5.1在结合5e6K562细胞的珠中添加1ml冷裂解缓冲液 
5.2在结合1e6K562细胞的珠中添加500μl裂解缓冲液 
5.3在结合0.1e6K562细胞的珠中添加100μl裂解缓冲液 
5.4涡旋并置于冰上20’；间歇涡旋 
5.5最大速度4℃离心15’ 
5.6将上清转移到EP管中运行微阵列，例如通过进行本文所述邻近介导的免疫试验 
用CD45和/或CD15Dynabeads从患者血液样品中分离CML细胞
1.制备缓冲液1 
1.1在500ml PBS中添加500mg BSA 
1.2添加2ml 0.5M EDTA 
2.制备患者血液 
2.1获取2-3ml患者全血，用EDTA（或肝素）作为抗凝剂 
2.2添加或不添加蛋白酶抑制剂 
3.清洗DynaBeads(英杰公司目录号111.53D) 
3.1每1ml血液样品转移100μl(200μl、300μl)珠到1.5ml EP管中 
3.2添加1ml缓冲液1并温和混合 
3.3将所述管放在磁体上1分钟 
3.4移除上清 
3.5从所述磁体上移去管并用与起始珠转移体积一样的100μl缓冲液1重悬 
4.细胞分离 
4.1在1.5ml EP管中的1ml血液样品中添加100μl清洗珠 
4.2在冷的屋子中（或室温）于旋转器上孵育样品20分钟、2小时或1小时。 
4.3将样品放在磁体上并移去上清 
5.制备细胞裂解液 
5.1在结合细胞的珠中添加100μl冷冻裂解液 
5.2涡旋并置于冰上20’；间歇涡旋 
5.3最大速度4℃离心15’ 
5.4将上清转移到EP管中运行微阵列，例如通过进行本文所述邻近介导的免疫试验 
图24表示在用抗CD45磁珠从血液中分离的K562细胞所制备的细胞裂解物中可检测并测量磷酸化的BCR-ABL。具体地，采用与融合蛋白Abl部分中磷酸化酪氨酸残基结合的4G10抗体（密理博（Millipore））检测磷酸化BCR-ABL水平。可用抗CD45和/或抗CD15磁珠在分离自患者样品血液的白细胞（如慢性髓性白血病（CML）细胞）制备的细胞裂解物上进行相似的试验以检测并测量磷酸化BCR-ABL的水平。 
实施例10.检测患者样品中总致癌融合蛋白和总天然全长蛋白水平 
本实施例显示同时检测致癌融合蛋白以及含所述致癌融合蛋白内发现的序列或结构域的一种或两种天然全长蛋白的总量和/或活化状态的方法。在一个具体实施方式中，本方法可用于检测和/或测量生物样品如血液或骨髓抽吸物样品中两种总BCR-ABL水平以及总天然全长BCR和/或ABL水平。 
在某些实施方式中，天然蛋白水平（如全长BCR和/或ABL水平）与致癌融合蛋白水平（如BCR-ABL水平）在单板上以多重方法一起检测。在这些实施方式中，天然全长蛋白可优选与致癌融合蛋白一起分离，从而在同一板上确定这些分子的水平。 
图25显示当针对天然全长BCR C末端的抗体（BCR-ABL中不存在其C末端结构域）与针对BCR-ABL N末端区域的抗体点样在同一板的同一玻片上时，总BCR-ABL水平不变化。图26显示当针对天然BCR C末端的抗体点样在同一板的同一玻片上时，用N末端特异性BCR抗体检测到的游离天然BCR信号下降。 
在具体的实施方式中，本实施例所述方法可用于检测和/或测量总BCR-ABL水平以及总天然全长BCR或ABL水平，并可计算总BCR-ABL水平与天然全长BCR或ABL水平之比。在一些情况中，计算BCR-ABL水平与天然全长BCR或ABL水平之比以提供响应指示剂例如主要分子响应、完全分子响应、完全细胞遗传反应及其组合的更精确测定。在其他情况中，本实施例所述方法可用于监控 BCR-ABL相对对照如天然全长BCR或ABL的表达变化（例如通过计算总BCR-ABL水平与天然全长BCR或ABL水平之比），其随着治疗而变化（如酪氨酸激酶抑制剂治疗）。 
本说明书引用的所有发表物和专利申请通过引用纳入本文，就好像各发表物或专利申请特定和单独地通过引用纳入本文那样。虽然出于阐明目的已经通过说明和举例的方式详细描述了本发明，但本领域普通技术人员根据本发明的教导不难了解，可以在不背离所附权利要求书的构思或范围的情况下作出某些改变和修改。 

Claims (100)

1.一种测定致癌融合蛋白水平或活化状态的方法，所述方法包括：
(a)将细胞提取物与对第一全长蛋白的第一结构域特异的第一结合部分在适于将所述细胞提取物中存在的第一全长蛋白转变为含所述第一全长蛋白和所述第一结合部分的复合物的条件下接触，其中所述第一全长蛋白的第一结构域在对应的致癌融合蛋白中不存在，所述融合蛋白包含与第二不同全长蛋白的第一结构域融合的第一全长蛋白的第二不同结构域；
(b)将步骤(a)中的复合物从细胞提取物中移除以形成不含所述第一全长蛋白的细胞提取物；
(c)将步骤(b)中的细胞提取物与对所述第一全长蛋白的第二不同结构域特异的第二结合部分在适于将所述细胞提取物中存在的致癌融合蛋白转变为含所述致癌融合蛋白和所述第二结合部分的复合物的条件下接触；和
(d)测定步骤(c)中复合物的水平或活化状态，从而测定所述致癌融合蛋白的水平或活化状态。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞提取物含分离自样品的细胞的提取物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述样品选自下组：全血、血清、血浆、尿液、痰、支气管灌洗液、泪液、乳头抽吸物、淋巴、唾液、细针抽吸物（FNA）、和其组合。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述样品获自癌症患者。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述癌症由癌细胞中染色体移位形成的致癌融合蛋白引起。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述癌症是血液恶性肿瘤、成骨肉瘤或软组织肉瘤。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述血液恶性肿瘤是白血病或淋巴瘤。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述白血病是慢性髓细胞性白血病(CML)。 
9.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分离细胞选自下组：循环肿瘤细胞、白细胞、及其组合。
10.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分离细胞用生长因子体外刺激。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述分离细胞在生长因子刺激前与抗癌药孵育。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述分离细胞在生长因子刺激后裂解以产生细胞提取物。
13.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述分离细胞在裂解前未清洗以产生细胞提取物。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述致癌融合蛋白选自下组：BCR-ABL、DEK-CAN、E2A-PBX1、RARα-PML、IREL-URG、CBFβ-MYH11、AML1-MTG8、EWS-FLI、LYT-10-Cα1、HRX-ENL、HRX-AF4、NPM-ALK、IGH-MYC、RUNX1-ETO、TEL-TRKC、TEL-AML1、MLL-AF4、TCR-RBTN2、COL1A1-PDGF、E2A-HLF、PAX3-FKHR、ETV6-NTRK3、RET-PTC、TMRSS-ERG、TPR-MET和其组合。
15.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述致癌融合蛋白是BCR-ABL。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述第一全长蛋白是BCR。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述第一全长蛋白的第一结构域包括BCR的羧基末端区域（BCR-C）。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述第一全长蛋白的第二不同结构域包括BCR的氨基末端区域（BCR-N）。
19.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述第二不同全长蛋白是ABL。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述第二不同全长蛋白的第一结构域包括ABL的羧基末端区域（ABL-C）。
21.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述第一全长蛋白是ABL。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述第二不同全长蛋白是BCR。
23.如权利要求1-22中任一项所述的方法，其特征在于，所述活化状态选自下 组：磷酸化状态、泛素化状态、复合状态和其组合。
24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其特征在于，所述致癌融合蛋白是BCR-ABL且所述活化状态是磷酸化状态。
25.如权利要求1-24中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包含测定一种或多种信号转导分子的水平或活化状态。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述一种或多种信号转导分子是BCR-ABL底物。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述BCR-ABL底物选自下组：CRKL、JAK2、STAT5、VAV、BAP-1、和其组合。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一结合部分包含第一抗体。
29.如权利要求28所述的方法，其特征在于，所述第一抗体连接固相支持物。
30.如权利要求29所述的方法，其特征在于，所述固体支持物选自下组：玻璃、塑料、芯片、钉、滤器、珠、纸、膜、纤维束和其组合。
31.如权利要求1-30中任一项所述的方法，其特征在于，所述第二结合部分包含第二抗体。
32.如权利要求31所述的方法，其特征在于，所述第二抗体连接固相支持物。
33.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述固体支持物选自下组：玻璃、塑料、芯片、钉、滤器、珠、纸、膜、纤维束和其组合。
34.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述第二抗体限制在可寻址阵列的固相支持物上。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(c)和(d)包括酶联免疫吸附实验(ELISA)、流式细胞分析试验、标签分选试验。
36.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述ELISA包括夹心ELISA。
37.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述流式细胞分析试验包括荧光激活细胞分选(FACS)试验。
38.如权利要求35所述的方法，其特征在于，所述标签分选试验包括 
Figure FDA00001789353300031
试验。
39.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(c)和(d)包括邻近 双重检测试验。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，步骤（c）还包括：
(c’)将步骤(b)中的细胞提取物与第三结合部分和第四结合部分在适于转化细胞提取物中存在的致癌融合蛋白成为含所述致癌融合蛋白与所述第二、第三和第四结合部分的复合物的条件下接触，
其中所述第三结合部分用辅助部分标记并对下述之一特异：(i)所述第二不同全长蛋白的第一结构域;(ii)所述第一全长蛋白的第二不同结构域;或(iii)所述第一全长蛋白的第二不同结构域和所述第二不同全长蛋白的第一结构域的融合位置，
其中所述第四结合部分用信号放大对的第一元件标记，且对所述第二不同全长蛋白的第一结构域特异，和
其中所述协助部分生成传至信号放大对的第一元件并与之反应的氧化剂；和
其中步骤(d)还包括：
(d’)用信号放大对的第二元件孵育步骤(c’)中的复合物，生成放大的信号；和
(d”)检测信号放大对第一和第二元件产生的放大信号。
41.如权利要求40所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)的细胞提取物与所述第二结合部分稀释系列接触，形成多种含所述致癌融合蛋白和所述第二结合部分的复合物。
42.如权利要求40或41所述的方法，其特征在于，所述第三和第四结合部分分别包括第三和第四抗体。
43.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述第三和第四抗体均为活化状态非依赖性抗体。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述信号放大对的第一和第二元件与致癌融合蛋白的总量相关。
45.如权利要求42所述的方法，其特征在于，所述第三抗体是活化状态非依赖性抗体且所述第四抗体是活化状态依赖性抗体。
46.如权利要求45所述的方法，其特征在于，所述信号放大对的第一和第二元件产生的放大信号与活化的致癌融合蛋白量相关。
47.如权利要求40-46中任一项所述的方法，其特征在于，所述第三结合部分直接标记有所述辅助部分。 
48.如权利要求40-47中任一项所述的方法，其特征在于，所述第四结合部分直接标记有所述信号放大对的第一元件。
49.如权利要求40-47中任一项所述的方法，其特征在于，所述第四结合部分通过偶联第二检测抗体的结合对第一元件和偶联所述信号放大对第一元件的结合对第二元件之间的结合而标记有所述信号放大对的第一元件。
50.如权利要求49所述的方法，其特征在于，所述结合对的第一元件是生物素。
51.如权利要求49或50所述的方法，其特征在于，所述结合对的第二元件是链霉亲和素。
52.如权利要求40-51中任一项所述的方法，其特征在于，所述辅助部分是葡萄糖氧化酶。
53.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶和所述第三结合部分偶联巯基活化的右旋糖苷分子。
54.如权利要求53所述的方法，其特征在于，所述巯基活化的右旋糖苷分子的分子量为500kDa。
55.如权利要求52所述的方法，其特征在于，所述氧化剂是过氧化氢(H2O2)。
56.如权利要求55所述的方法，其特征在于，所述信号放大对的第一元件是过氧化物酶。
57.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述过氧化物酶是辣根过氧化物酶(HRP)。
58.如权利要求56所述的方法，其特征在于，所述信号放大对的第二元件是酪酰胺试剂。
59.如权利要求58所述的方法，其特征在于，所述酪酰胺试剂是生物素-酪酰胺。
60.如权利要求59所述的方法，其特征在于，所述放大信号由生物素-酪胺的过氧化物酶氧化产生活化的酪胺而生成。
61.如权利要求60所述的方法，其特征在于，所述活化的酪酰胺被直接检测。
62.如权利要求60所述的方法，其特征在于，所述活化的酪胺在添加信号检测剂后检测。
63.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述信号检测试剂是链霉亲和素 标记的荧光团。
64.如权利要求62所述的方法，其特征在于，所述信号检测试剂是链霉亲和素标记的过氧化物酶和生色试剂的组合。
65.如权利要求64所述的方法，其特征在于，所述生色试剂是3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)。
66.如权利要求1-65中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：
(e)将细胞提取物与对所述第二不同全长蛋白的第二结构域特异的第五结合部分在适于将所述细胞提取物中存在的第二不同全长蛋白转化为含所述第二不同全长蛋白和所述第五结合部分的复合物的条件下接触，其中所述第二不同全长蛋白的第二结构域在所述致癌融合蛋白中不存在;和
(f)将步骤(e)中的复合物从细胞提取物中移除以形成不含所述第二不同全长蛋白的细胞提取物；
其中步骤(e)在步骤(a)之前、之中或之后进行。
67.如权利要求66所述的方法，其特征在于，所述第五结合部分包括第五抗体。
68.如权利要求67所述的方法，其特征在于，所述第五抗体连接固相支持物。
69.如权利要求68所述的方法，其特征在于，所述固体支持物选自下组：玻璃、塑料、芯片、钉、滤器、珠、纸、膜、纤维束和其组合。
70.一种给患癌并接受癌症治疗疗程的对象最佳化治疗和/或降低毒性的方法，所述方法包括：
(a)给予抗癌药后分离癌细胞；
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物；
(c)按照权利要求1-69中任一项所述的方法测量所述细胞提取物中的致癌融合蛋白的表达和/或活化水平；和
(d)将所测致癌融合蛋白的表达和/或活化水平与疗程早期所测的致癌融合蛋白的表达和/或活化水平作比较；和
(e)基于步骤(d)的比较确定所述对象疗程的后续剂量或是否需给予对象不同的疗程。
71.如权利要求70所述的方法，其特征在于，所述致癌融合蛋白是BCR-ABL。
72.如权利要求70或71所述的方法，其特征在于，所述对象在接受所述疗程 前确定具有表达所述致癌融合蛋白的癌细胞。
73.如权利要求72所述的方法，其特征在于，所述对象为BCR-ABL阳性。
74.如权利要求70-73中任一项所述的方法，其特征在于，所述致癌融合蛋白的表达水平和活化水平均在所述细胞提取物中测量。
75.如权利要求74所述的方法，其特征在于，步骤(c)还包括计算活化的致癌融合蛋白水平与总致癌融合蛋白水平之比。
76.如权利要求75所述的方法，其特征在于，步骤(d)包括对比所计算的活化与总致癌融合蛋白水平之比和所述对象早期计算的活化与总致癌融合蛋白水平之比。
77.如权利要求75或76所述的方法，其特征在于，所计算的活化与总致癌融合蛋白水平之比与抗癌药处理后活化致癌融合蛋白的抑制百分比关联。
78.如权利要求75-77中任一项所述的方法，其特征在于，所述计算的活化与总致癌融合蛋白水平之比与对照蛋白水平相关。
79.如权利要求75-78中任一项所述的方法，其特征在于，所述计算的活化与总致癌融合蛋白水平之比包括磷酸/总BCR-ABL蛋白水平之比。
80.如权利要求78或79所述的方法，其特征在于，所述对照蛋白包括含所述致癌融合蛋白内发现的序列或结构域的天然全长蛋白。
81.如权利要求78-80中任一项所述的方法，其特征在于，所述对照蛋白选自下组：全长BCR、全长ABL、和其组合。
82.如权利要求70-81中任一项所述的方法，其特征在于，所述致癌融合蛋白活化水平的抑制低于约50％表明需要增加所述疗程的后续剂量或给予不同疗程。
83.如权利要求70-81中任一项所述的方法，其特征在于，所述致癌融合蛋白活化水平的抑制低于约50％表明所述对象未依从所述疗程、存在与所述疗程相关的可能的副作用或毒性、或其组合。
84.如权利要求70-81中任一项所述的方法，其特征在于，所述致癌融合蛋白活化水平的抑制高于约80％表明所述患者在以正确的剂量进行正确的疗程。
85.如权利要求70-84中任一项所述的方法，其特征在于，所述癌症是慢性髓细胞性白血病（CML）。
86.如权利要求70-85中任一项所述的方法，其特征在于，所述抗癌药选自下组：单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂、化疗剂、激素治疗剂、放疗剂、疫苗、和其 组合。
87.如权利要求86所述的方法，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂选自下组：甲磺酸伊马替尼 
Figure FDA00001789353300081
尼洛替尼 
Figure FDA00001789353300082
达沙替尼 
Figure FDA00001789353300083
博舒替尼(SKI-606)、和其组合。
88.如权利要求70-87中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(c)和(e)替代地包括：
(c’)测量所述细胞提取物中的致癌融合蛋白和途径中一种或多种信号转导分子的表达和/或活化水平；和
(d’)将所测致癌融合蛋白和信号转导分子的表达和/或活化水平与疗程早期所测的致癌融合蛋白和信号转导分子的表达和/或活化水平作比较；和
(e’)基于步骤(d’)的比较确定所述对象疗程的后续剂量或是否需给予对象不同的疗程。
89.一种选择用于治疗癌症的合适抗癌药的方法，所述方法包括：
(a)给予抗癌药之后或用抗癌药孵育前分离癌细胞；
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物；
(c)按照权利要求1-69中任一项所述的方法测量所述细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化水平；和
(d)通过对比所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与没有所述抗癌药时产生的参比水平和/或活化分布，测定所述抗癌药适合或是不适合用于治疗癌症。
90.一种鉴定癌症对抗癌药治疗响应的方法，所述方法包括：
(a)给予抗癌药之后或用抗癌药孵育前分离癌细胞；
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物；
(c)按照权利要求1-69中任一项所述的方法测量所述细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化水平；和
(d)通过对比所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与没有所述抗癌药时产生的参比水平和/或活化分布来鉴定所述癌症对所述抗癌药治疗响应或是不响应。
91.一种预测患癌对象响应抗癌药治疗的方法，所述方法包括：
(a)给予抗癌药之后或用抗癌药孵育前分离癌细胞； 
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物；
(c)按照权利要求1-69中任一项所述的方法测量所述细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化水平；和
(d)通过对比所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与没有所述抗癌药时产生的参比水平和/或活化分布来预测所述对象响应抗癌药治疗的可能性。
92.一种测定患癌对象是否耐受抗癌药治疗的方法，所述方法包括：
(a)给予抗癌药之后或用抗癌药孵育前分离癌细胞；
(b)裂解所述分离细胞产生细胞提取物；
(c)按照权利要求1-69中任一项所述的方法测量所述细胞提取物中致癌融合蛋白的表达和/或活化水平；和
(d)通过对比所述致癌融合蛋白测得的表达和/或活化水平与没有所述抗癌药时或早期存在抗癌药时产生的参比水平和/或活化分布来测定所述对象对所述抗癌药治疗耐受或是敏感。
93.如权利要求89-92中任一项所述的方法，其特征在于，所述癌症是慢性髓细胞性白血病（CML）。
94.如权利要求89-93中任一所述的方法，其特征在于，所述抗癌药选自下组：单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂、化疗剂、激素治疗剂、放疗剂、疫苗、和其组合。
95.如权利要求94所述的方法，其特征在于，所述单克隆抗体选自下组：曲妥珠单抗 
Figure FDA00001789353300091
阿来组单抗 
Figure FDA00001789353300092
贝伐单抗 西妥昔单抗 吉姆单抗 帕尼单抗(VectibixTM)、利妥昔单抗 
Figure FDA00001789353300096
和托西莫单抗 
Figure FDA00001789353300097
和其组合。
96.如权利要求94所述的方法，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂选自下组：甲磺酸伊马替尼 
Figure FDA00001789353300098
尼洛替尼 达沙替尼 
Figure FDA000017893533000910
博舒替尼(SKI-606)、吉非替尼 
Figure FDA000017893533000911
舒尼替尼 
Figure FDA000017893533000912
埃罗替尼 
Figure FDA000017893533000913
拉帕替尼 
Figure FDA000017893533000914
卡纽替尼(CI 1033)、塞马悉尼(SU5416)、瓦他拉尼(PTK787/ZK222584)、索拉非尼(BAY 43-9006)、来氟米特(SU101)、凡德他尼(ZACTIMATM；ZD6474)、和其组合。
97.如权利要求94所述的方法，其特征在于，所述酪氨酸激酶抑制剂选自下组：甲磺酸伊马替尼 
Figure FDA000017893533000915
尼洛替尼 达沙替尼 
Figure FDA000017893533000917
博舒替尼 (SKI-606)、和其组合。
98.如权利要求94所述的方法，其特征在于，所述化疗剂选自下组：培美曲塞 
Figure FDA00001789353300101
吉西他滨 
Figure FDA00001789353300102
西罗莫司(雷帕霉素)、雷帕霉素类似物、铂化合物、卡铂、顺铂、沙铂、紫杉醇 
Figure FDA00001789353300103
多西他赛 
Figure FDA00001789353300104
坦西莫司(CCI-779)、依维莫司(RAD001)、和其组合。
99.如权利要求94所述的方法，其特征在于，所述激素治疗剂选自下组：芳香酶抑制剂、选择性雌激素受体调节剂、类固醇、非那雄胺、促性腺激素释放激素激动剂、其药学上可接受的盐、其立体异构体、其衍生物、其类似物、和其组合。
100.如权利要求94所述的方法，其特征在于，所述放疗剂选自下组：47Sc、 64Cu、67Cu、89Sr、86Y、87Y、90Y、105Rh、111Ag、111In、117mSn、149Pm、153Sm、166Ho、 177Lu、186Re、188Re、211At、和212Bi、和其组合。 
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