KR20120110168A - 종양원성 융합 단백질을 검출하기 위한 근접-매개 검정법 - Google Patents

종양원성 융합 단백질을 검출하기 위한 근접-매개 검정법 Download PDF

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KR20120110168A
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샬렛 싱
신준 리우
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Abstract

본 발명은 전혈 또는 종양 조직과 같은 생물학적 샘플 내의 일 또는 다수의 종양원성 융합 단백질의 활성화 상태 및/또는 전체 양을 검출하기 위한 항체-기반 어레이 및 그것의 사용 방법을 제공한다. 특정 예에서, 샘플 내에 존재하는 종양원성 융합 단백질(들)의 활성화 상태 및/또는 전체 양은 일 또는 다수의 신호 전달 분자와 조합하여 측정될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 효소-결합 면역학적 검정법과 관련된 특이성, 신호 증폭과 관련된 민감성, 및 마이크로어레이와 관련된 고속 멀티플렉싱의 이점을 가진다.

Description

종양원성 융합 단백질을 검출하기 위한 근접-매개 검정법{PROXIMITY-MEDIATED ASSAYS FOR DETECTING ONCOGENIC FUSION PROTEINS}
관련 출원의 상호-참조
본 출원은 2009년 10월 20일에 출원된 미국 가특허출원 제61/253,393호, 2010년 2월 16일에 출원된 미국 가특허출원 제61/305,084호, 2010년 4월 23일에 출원된 미국 가특허출원 제61/327,487호, 및 2010년 9월 15일에 출원된 미국 가특허출원 제61/383,037호를 우선권으로 주장하며, 상기 출원의 전체 개시내용은 모든 목적을 위하여 참조로서 본 명세서에 통합된다.
키메라 단백질로도 알려진, 융합 단백질은 본래 상이한 단백질들을 코드화하는 2 또는 그 이상의 유전자들의 결합을 통해 생성되는 단백질이다. 이 융합 유전자의 전사에 의해 각각의 본래 단백질들로부터 유래된 기능적 특성을 가지는 단일의 폴리펩티드가 발생된다. 대-규모의 돌연변이, 통상적으로 염색체 전좌(translocation)가 두개의 다른 유전자들로부터의 코딩 염기서열의 일부를 함유하는 신규한 코딩 염기서열을 생성할 때, 키메라 돌연변이체 유전자가 발생한다. 자연적으로-발생하는 융합 단백질들은 그들이 종양형성단백질(oncoprotein)로서 기능을 할 경우, 암에서 중요하다.
BCR-ABL 융합 단백질은 종양원성 융합 단백질의 공지된 예이다. 그것은 만성 골수 백혈병(chronic myelogenous leukemia, CML)의 주요 종양원성 전달자로 여겨지고 있긴 하지만, 급성 림프구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia, ALL)과도 관련있다. 사실, CML의 세포유전학적 특징은 필라델피아 염색체(Philadelphia chromosome, Ph)로서, 210 kDa 단백질을 코드화하는 BCR-ABL 융합 유전자를 형성한다. 실제, 생성된 BCR-ABL 융합 단백질은 CML의 발병에 중요한, 활성 타이로신 키나제이다. 이마티니브(Gleevec®)가 현재 새로 진단받은 CML 환자들에게 일차적 치료방법으로 존재하고 있지만, 약 20-25%의 환자들이 영속적이고 완전한 세포유전학적 반응을 달성하지 못하고 있다. 지속적인 이마티니브 치료의 존재시, BCR-ABL 신호전달의 재활성화는 내성의 주요 원인인 것으로 보고되고 있다. 대부분의 환자들에서, 재활성화는 이마티니브 결합을 손상시키고 약물 내성의 유도를 야기하는 BCR-ABL 키나제 도메인 내의 돌연변이를 초래한다. 그따라서, BCR-ABL 활성의 측정은 이마티니브와 같은 타이로신 키나제 억제제로의 치료에 대한 반응을 예측할 뿐만 아니라 상기 억제제에 대한 내성을 나타내는 환자들을 확인함에 있어서 유용하다.
현재, BCR-ABL 활성을 측정함에 있어서 유용한 방법들은 인산화된 CRKL (pCRKL), BCR-ABL 기질을 측정하는 것에 의존한다. 예를 들면, 문헌 [La Rosee et al. (Haematologica, 93:765-9 (2008))]는 pCRKL의 수준을 측정하기 위하여 BCR-ABL 활성의 대용물(surrogate)로서 전체 백혈구 분해물에 대한 웨스턴 블롯 분석을 기술한다 (또한, 문헌 [Hochhaus et al., Leukemia, 16:2190-6 (2002); White et al, J. Clin. Oncol, 25:4445-51 (2007)] 참고). 마찬가지로, 문헌 [Khorashad et al. (Haematologica, 94:8 1-4 (2009))]는 BCR-ABL 활성을 평가하기 위하여 pCRKL의 수준을 유세포 분석기를-기반으로 하는 측정 방법을 기술한다 (문헌 [Hamilton et al., Leukemia, 20: 1035-9 (2006)] 참고). 그러나 이러한 방법들은 대용 단백질의 인산화 검출에 의존하는 단일 항체 검정법으로 인해, 샘플 내의 BCR-ABL 활성의 존재 또는 수준을 측정함에 있어 요구되는 특이성 및 민감성이 부족하다. 따라서, 진단적, 예방적, 및 치료적 목적을 위하여, BCR-ABL 활성 뿐만 아니라 다른 종양원성 융합 단백질의 활성을 측정할 수 있는 특이적이고 민감한 방법들이 요구된다. 본 발명은 이러한 요구를 만족시킬 뿐만 아니라 관련 이점들도 제공한다.
본 발명은 전혈 (예를 들면, 단리된 희귀 순환 세포 또는 백혈구로부터 제조된 분해물) 또는 종양 조직 (예를 들면, 미세침 흡인물)과 같은 생물학적 샘플 내의 일 또는 복수개의 종양원성 융합 단백질들의 활성화 상태 및/또는 전체 양을 측정하기 위한 항체-기반 어레이 및 그것의 사용 방법을 제공한다. 특정 예에서, 샘플 내에 존재하는 종양원성 융합 단백질(들)의 활성화 상태 및/또는 전체 양은 일 또는 복수개의 신호 전달 분자들과 조합하여 측정될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법은 효소-결합 면역학적 검정법과 관련된 특이성, 신호 증폭과 관련된 민감성, 및 마이크로어레이와 관련된 고속(high-throughput) 멀티플렉싱의 이점을 가진다.
일 측면에서, 본 발명은 종양원성 융합 단백질의 수준 또는 활성화 상태를 측정하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 세포 추출액을 세포 추출액 내에 존재하는 제1 전장 단백질을 제1 전장 단백질과 제1 결합 모이어티를 포함하는 복합체로 전환(transform)하기에 적합한 조건 하에 제1 전장 단백질의 제1 도메인에 특이적인 제1 결합 모이어티와 접촉시키는 단계, 여기서 상기 제1 전장 단백질의 제1 도메인은 제2의, 다른 전장 단백질의 제1 도메인에 융합된 제1 전장 단백질의 제2의, 다른 도메인을 포함하는 상응 종양원성 융합 단백질이 부재하고;
(b) 상기 세포 추출액에서 단계 (a)로부터의 복합체를 제거함으로써 제1 전장 단백질이 없는 세포 추출액을 형성하는 단계;
(c) 단계 (b)로부터의 세포 추출액을 세포 추출액 내에 존재하는 종양원성 융합 단백질을 종양원성 융합 단백질과 제2 결합 모이어티를 포함하는 복합체로 전환하기에 적합한 조건 하에 제1 전장 단백질의 제2의, 다른 도메인에 특이적인 제2 결합 모이어티와 접촉시키는 단계; 및
(d) 단계 (c)로부터의 복합체의 수준 또는 활성화 상태를 측정함으로써, 종양원성 융합 단백질의 수준 또는 활성화 상태를 측정하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 상기 종양원성 융합 단백질의 수준 또는 활성화 상태를 측정하는 단계는 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, 세포 추출액 내)의 발현 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 수준 (예를 들면, 농도)을 측정하는 단계를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 방법 중 단계 (c) 및 (d)는 본 명세서에 기술된 효소-결합 면역학적 검정법 (ELISA), 유세포 검정법, 태그-분류 검정법 또는 근접 이중 검출 검정법을 포함한다.
상기 근접 이중 검출 검정법의 일 특정 구현예에서, 본 발명은 종양원성 융합 단백질의 수준 또는 활성화 상태를 측정하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 세포 추출액을 종양원성 융합 단백질에 특이적인 포획 항체의 연속된 희석물(dilution series)과 함께 인큐베이션함으로써, 다수의 포획된 종양원성 융합 단백질을 형성하는 단계, 여기서 상기 포획 항체는 고체 지지체 상에 고정되고, 여기서 상기 종양원성 융합 단백질은 제1 단백질에 대응되는 제1 도메인 및 제2의, 다른 단백질에 대응되는 제2 도메인을 포함하고, 그리고 여기서 상기 포획 항체는 융합 단백질의 제1 도메인에 특이적이고;
(b) 상기 다수의 포획된 종양원성 융합 단백질을 종양원성 융합 단백질의 제2 도메인에 특이적인 적어도 2 종류의 검출 항체와 인큐베이션함으로써, 다수의 검출가능한 포획된 종양원성 융합 단백질을 형성하는 단계, 여기서 상기 검출 항체는:
(1) 촉진 모이어티(facilitating moiety)로 표지된 다수의 활성화 상태-비의존성 항체, 및
(2) 신호 증폭쌍의 제1 일원으로 표지된 다수의 활성화 상태-의존성 항체를 포함하고,
여기서 상기 촉진 모이어티는 신호 증폭쌍의 제1 일원에 채널링하고 이와 반응하는 산화제를 발생시키고;
(c) 다수의 검출가능한 포획된 종양원성 융합 단백질을 신호 증폭쌍의 제2 일원과 인큐베이션함으로써, 증폭된 신호를 발생시키는 단계; 및
(d) 신호 증폭쌍의 제1 및 제2 일원들로부터 발생된 증폭된 신호를 검출하는 단계를 포함한다.
상기 근접 이중 검출 검정법의 다른 특정 구현예에서, 본 발명은 종양원성 융합 단백질의 수준 또는 활성화 상태를 측정하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 세포 추출액을 종양원성 융합 단백질에 특이적인 포획 항체의 연속된 희석물과 인큐베이션함으로써, 다수의 포획된 종양원성 융합 단백질을 형성하는 단계, 여기서 상기 포획 항체는 고체 지지체 상에 고정되고, 여기서 상기 종양원성 융합 단백질은 제1 단백질에 대응되는 제1 도메인 및 제2의, 다른 단백질에 대응되는 제2 도메인을 포함하고, 그리고 여기서 상기 포획 항체는 융합 단백질의 제1 도메인에 특이적이고;
(b) 상기 다수의 포획된 종양원성 융합 단백질을 적어도 2 종류의 검출 항체와 인큐베이션함으로써, 다수의 검출가능한 포획된 종양원성 융합 단백질을 형성하는 단계, 여기서 상기 검출 항체는:
(1) 촉진 모이어티로 표지된 다수의 활성화 상태-비의존성 항체, 여기서 상기 활성화 상태-비의존성 항체는 상기 융합 단백질의 제1 도메인에 특이적이고, 및
(2) 신호 증폭쌍의 제1 일원으로 표지된 다수의 활성화 상태-의존성 항체를 포함하고, 여기서 상기 활성화 상태-의존성 항체는 상기 융합 단백질의 제2 도메인에 특이적이고, 여기서 상기 촉진 모이어티는 신호 증폭쌍의 제1 일원에 채널링하고 이와 반응하는 산화제를 발생시키고;
(c) 다수의 검출가능한 포획된 종양원성 융합 단백질을 신호 증폭쌍의 제2 일원과 인큐베이션함으로써, 증폭된 신호를 발생시키는 단계; 및
(d) 상기 신호 증폭쌍의 제1 및 제2 일원들로부터 발생된 증폭된 신호를 검출하는 단계를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 암을 갖는 피검체에서 치료요법을 최적화시키는 방법 및/또는 독성을 경감시키는 방법 및 암 치료를 위한 치료요법 과정을 수여하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 항암 약물의 투여 이후에 암 세포를 단리하는 단계;
(b) 상기 단리된 세포를 용해시킴으로써, 세포 추출액을 생성하는 단계;
(c) 본 명세서에 기술된 검정법을 사용하여 세포 추출액 내의 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 수준을 측정하는 단계; 및
(d) 상기 측정된 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 수준을 치료요법 과정 동안 이른 시간(earlier time)에 측정된 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 수준과 비교하는 단계; 및
(e) 단계 (d)로부터의 비교결과를 바탕으로, 피검체에서 치료 과정의 후속 용량(subsequent dose) 또는 다른 투여요법 과정을 피검체에 투여해야 하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 세포 추출액 내에서 일 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질 외에도 일 또는 그 이상의 신호 전달 분자가 검출된다. 신호 전달 분자의 예로는 수용체 타이로신 키나제, 비-수용체 타이로신 키나제, 타이로신 키나제 신호전달 캐스케이트 성분 및/또는 일 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질의 기질 (예를 들면, BCR-ABL 기질)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 예로서, 상기 신호 전달 분자는 검정법에 따라, 2개의 항체 (즉, 포획 항체 및 검출 항체) 또는 3개의 항체 (즉, 포획 항체 및 2개의 검출 항체)가 동일한 단백질에 대한 것임을 제외하고는, 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 검출된다. 다른 예로서, 상기 신호 전달 분자는 당해 기술분야에서 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 검출된다. 특정 구현예에서, 세포 추출액 내에 존재하는 일 또는 그 이상의 신호 전달 분자는 분 명세서에 기술된 검정법 (예를 들면, 면역검정법)을 사용하여 일 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질과 함께 검출된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 근접 이중 검출 검정법을 수행하기 위한 키트를 제공하는 것으로, 상기 키트는: (a) 고체 지지체 상에 고정된 하나 또는 복수개의 포획 항체의 연속된 희석물, 여기서 상기 포획 항체는 일 또는 그 이상의 목적 분석물 (예를 들면, 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자)에 특이적이고; 및 (b) 각각의 목적 분석물을 위한 복수개의 (예를 들면, 적어도 2 종의) 검출 항체를 포함한다. 상기 키트는 선택적으로 예를 들면, 신호 증폭쌍의 제1 및 제2 일원과 같은 다른 시약을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 목적, 특징, 및 이점은 하기의 상세한 설명 및 도면으로부터 당해 기술분야에 있는 당업자에게 자명할 것이다.
도면의 상세한 설명
도 1은 본 발명의 어레이 포맷의 일 구현예를 나타내는 것으로, 이는 각각의 결합된 종양원성 융합 단백질의 후속의 채널링 현상에서 효소와 링크된 2개의 추가적인 검출기 항체의 공동-국소화에 의존한다.
도 2는 암 치료 과정 요법 과정 동안 약물 선별을 위한 본 발명의 어레이의 적용을 도식적으로 나타낸다.
도 3A-D는 BCR-ABL과 같은 종양원성 융합 단백질의 발현 및 활성화 수준을 검출하기 위한 본 발명의 검정법 포맷의 다양한 구현예를 나타낸다.
도 4는 유리 BCR의 제거 이후 K562 세포 내의 BCR-ABL 신호를 나타낸다.
도 5는 유리 BCR의 제거 이후 K562 세포 내의 BCR 신호를 나타낸다.
도 6은 K562 세포 내의 BCR-ABL의 전체 및 인산화 수준의 검출을 나타낸다.
도 7은 BCR C-말단 항체-커플링된 비드를 사용하여 유리 BCR의 디플레이션 유무에 따른 K562 인간 만성 골수 백현병에서 검출된 BCR-ABL의 인산화 수준 ("인산 BCR-ABL") 및 전체 양 ("전체 BCR-ABL")을 나타낸다.
도 8은 BCR C-말단 항체-커플링된 비드를 사용하여 유리 BCR의 제거 유무에 따른 K562 세포 내의 인산화된 BCR-ABL 신호를 나타낸다. 특히, 도 8A는 전장 BCR의 제거 유무에 따른 K562 세포 분해물에서 검출된 인산화된 BCR-ABL 신호의 마이크로어레이 비교를 제공한다 ("무-비드 처리" = BCR가 제거되지 않음 대 "비드 처리" = BCR가 거기에 컨쥬게이트된 전장 BCR에 특이적인 항체를 함유하는 비드로 제거됨). 도 8B는 세포 수의 함수로서 상대 형광 단위(RFU)로 마이크로어레이 데이타의 그래픽 묘사를 제공한다.
도 9는 BCR C-말단 항체-커플링된 비드를 사용하여 유리 BCR의 제거 유무에 따른 K562 세포 내의 전체 BCR-ABL 신호를 나타낸다. 특히, 도 9A는 전장 BCR의 제거 유무에 따른 K562 세포 분해물에서 검출된 전체 BCR-ABL 신호의 마이크로어레이 비교를 제공한다 ("무-비드 처리" = BCR가 제거되지 않음 대 "비드 처리" = BCR가 거기에 컨쥬게이트된 전장 BCR에 특이적인 항체를 함유하는 비드로 제거됨). 도 9B는 세포 수의 함수로서 상대 형광 단위(RFU)로 마이크로어레이 데이타의 그래픽 묘사를 제공한다.
도 10은 세포 추출액을 BCR C-말단 항체-커플링된 비드와 접촉시킨 이후의 K562 세포의 추출물로부터 유리 전장 BCR의 제거를 나타낸다. 특히, 도 10A는 전장 BCR의 제거 유무에 따른 K562 세포 분해물에서 검출된 전체 BCR 신호의 마이크로어레이 비교를 제공한다 ("무-비드 처리" = BCR가 제거되지 않음 대 "비드 처리" = BCR가 거기에 컨쥬게이트된 전장 BCR에 특이적인 항체를 함유하는 비드로 제거됨). 도 10B는 세포 수의 함수로서 상대 형광 단위(RFU)로 마이크로어레이 데이타의 그래픽 묘사를 제공한다.
도 11은 BCR-ABL 융합 단백질이 아닌, 유리 전장 BCR 및 ABL 단백질이 백혈구(WBC) 내에 존재함을 나타낸다.
도 12는 K562 세포가 WBC 추출물로 스파이크될 때 WBC 내에 존재하는 유리 전장 BCR이 K562 세포 추출물 내의 인산 BCR-ABL 신호를 억제함을 나타낸다.
도 13은 BCR C-말단 항체-커플링된 비드를 사용하여 유리 BCR의 제거 이후에 WBC 추출물로 스파이크된 K562 세포 내의 전체 BCR-ABL 신호를 나타낸다. 특히, 도 13A는 K562 세포 추출물이 WBC 추출물로 스파이크될 때 유리 BCR 신호가 포화됨을 나타낸다. BCR C-말단 항체-커플링된 비드로 처리한 이후에, 유리 BCR이 제거되었다. 도 13B는 BCR-ABL 신호가 동일한 실험에서 비드 처리의 유모에 따라 바뀌지 않음을 나타낸다.
도 14는 BCR-ABL 억제제 이마티니브 (Gleevec®)가 K562 세포 내의 BCR-ABL 단백질의 활성화 (즉, 인산화)를 용량-의존적으로 억제하나, 발현 (즉, 전체 수준)은 그렇지 않음을 나타낸다.
도 15는 BCR-ABL 억제제 니오티니브 (Tasigna®)가 K562 세포 내의 BCR-ABL 단백질의 활성화 (즉, 인산화)는 용량-의존적으로 억제하나 발현 (즉, 전체 수준)은 그렇지 않음을 나타낸다.
도 16은 BCR-ABL 억제제 다사티니브(Sprycel®)가 K562 세포 내의 BCR-ABL 단백질의 활성화 (즉, 인산화)를 용량-의존적으로 억제하지만, 발현 (즉, 전체 수준)은 그렇지 않음을 나타낸다.
도 17은 CRKL가 K562 세포 내에 존재할 뿐만 아니라 활성화 (즉, 인산화)됨을 나타낸다.
도 18은 CRKL 이 A431 인간 표피양 암종 세포 내에 존재하고 EGF 처리시 활성화 (즉, 인산화) 됨을 나타낸다.
도 19는 CRKL이 T47D 유관 유방 상피 종양 세포 내에 존재하지만 EGF 처리시 활성화 (즉, 인산화) 되지 않음을 나타낸다.
도 20은 CRKL가 T47D 세포에 존재하지만, 헤레굴린 (HRG) 처리시 낮은 수준으로 활성화 (즉, 인산화) 됨을 나타낸다.
도 21은 CRKL가 MCF-7 인산 유선암 세포 내에 존재하고 헤레굴린 (HRG) 처리시 낮은 수준에서 활성화 (즉, 인산화) 됨을 나타낸다.
도 22는 다른 공여자의 백혈구 (WBC) 내에서 활성화 (즉, 인산화)된 CRKL의 존재를 나타낸다.
도 23은 JAK2가 K562 세포 및 A431 세포 내에서 활성화 (즉, 인산화) 됨을 예시한다.
도 24는 인산화된 BCR-ABL가 항--CD45 자석 비드를 사용하여 혈액으로부터 단리된 K562 세포로부터 제조된 세포 분해물 내에서 검출되고 측정될 수 있음을 예시한다.
도 23는 천연 전장 BCR (C-말단 도메인이 BCR-ABL내에 존재하지 않음)의 C-말단에 결합된 항체가 BCR-ABL의 N-말단 영역에 결합된 항체와 동일한 패드 내에서 동일한 슬라이드 상에 스폿될 때 전체 BCR-ABL 수준이 바뀌지 않음을 예시한다.
도 40은 천연 BCR의 C-말단에 결합된 항체가 동일한 패드 내의 동일한 슬라이드 상에 스폿될 때 N-말단-특이적 BCR 항체로 검출된 유리 천연 BCR 신호가 감소되지 않음을 예시한다.
발명의 상세한 설명
1. 서문
악성혈액 종양(hematological malignancies)은 혈액, 골수, 및 림프절에 영향을 미치는 암의 종류이다. 상기 세개는 면역 시스템을 통해 친밀하게(intimately) 연결되는 것으로서, 상기 세개 중 하나에 영향을 미치는 질병은 종종 다른 곳에도 영향을 미칠 것이다. 예를 들면, 림프종은 기술적으로 림프절 질병에 해당하지만, 그것은 골수 및 혈액에도 퍼지곤 한다. 2개의 다른 유전자로부터의 코딩 염기서열의 일부를 함유하는 신규한 코딩 염기서열을 갖는 융합 단백질을 생성하는, 염색체 전좌는 이러한 질병의 공통 원인이지만, 드믈게 고형 종양의 원인이도 하다. 이와 같이, 이러한 종류의 암을 갖는 환자를 위한 적절한 예후법 및 치료법을 제공하기 위하여, 악성혈액 종양에 관여하는 종양원성 융합 단백질의 존재 및/또는 활성을 확인하는 것은 중요하다.
예를 들면, BCR-ABL 융합 단백질은 만성 골수 백혈병 (CML) 뿐만 아니라 급성 림프구 백혈병(ALL)에도 관여한다. 특히, BCR-ABL 단백질은 암 발병에 중요한 활성 타이로신 키나제이다. 비록, 이마티니브 (Gleevec®)가 현재 새롭게 진단된 CML 환자에게 1차 치료법으로 사용되고 있지만, 약 20-25%의 환자들은 영속적인 세포유전학적 반응을 획득하지 못한다. 계속된 이마티니브 치료의 존재시 BCR-ABL 키나제 활성의 재활성화는 내성의 주요 원인임이 보고되어 있다. 이와 같이, BCR-ABL 활성의 측정은 이마티니브와 같은 타이로신 키나제 억제제로 치료요법에 대한 반응을 예측함에 있어서 뿐만 아니라 그러한 억제제에 대한 내성이 길러진 환자를 확인함에 있어서 유용할 것이다.
본 발명은 항체-기반 어레이 검정 시스템을 사용하여 단리된 세포 내의 하나 또는 복수개의 융합 단백질 (단독 또는 하나 또는 복수개의 신호 전달 분자와의 조합)의 활성화 상태 및/또는 전체 양을 검출하는 방법을 제공한다. 단리된 백혈구, 순환 세포, 또는 다른 세포 종으로부터 제조된 세포 추출액은 특히 본 명세서에 기술된 방법에 유용하다. 몇몇 구현예에서, 본 발명의 멀티플렉스, 고-속 면역검정법은 단일 세포 수준에서 일 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질 및/또는 신호 전달 분자의 활성화 상태를 검출할 수 있다. 사실, EGFR과 같은 신호 전달 분자는 약 100 젭토몰(zeptomole)의 민감도 및 약 100 젭토몰 내지 약 100 펨토몰(femtomole)의 선형 동작 범위로 검출될 수 있다. 이와 같이, 일 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질 및/또는 신호 전달 분자의 활성화 상태의 단일-세포 검출은 암 예후 및 진단 뿐만 아니라 개인화된, 표적 치료요법의 디자인을 용이하게 한다.
도 1은 BCR-ABL와 같은 종양원성 융합 단백질이 하나의 포획 항체 및 2개의 검출 항체 (즉, 활성화 상태-비의존성 항체 및 활성화 상태-의존성 항체)에 결합된 것에서의 본 발명의 예시적인 근접 검출 검정법을 나타낸다. 포획 항체(1)는 그것의 활성화 상태에 비의존적인 융합 단백질의 BCR 부분에 결합한다. 활성화 상태-비의존성 항체(2)가 그것의 활성화 상태에 비의존적인 융합 단백질의 ABL 부분에 결합하는 반면, 활성화 상태-의존성 항체(3)는 그것의 활성화 상태에 의존하는 융합 단백질의 ABL 부분에 결합한다 (예를 들면, 활성화 상태-의존성 항체는 인산화된 잔기를 갖는 BCR-ABL의 활성화된 형태에만 결합할 것이다). 활성화 상태-비의존성 항체는 촉진 모이어티(4) ("효소 A")로 표지되고, 그리고 활성화 상태-의존성 항체는 신호 증폭쌍(5)의 제1 일원 ("효소 B")으로 표지된다. 두 검출 항체의 융합 단백질의 ABL 부분로의 결합은 촉진 모이어티에 의해 발생된 신호가 신호 증폭쌍의 제1 일원에 채널링 할 수 있도록, 신호 증폭쌍의 제1 일원에 충분히 근접하게 촉진 모이어티를 제공함으로써, 검출가능한 및/또는 증폭가능한 신호를 발생시킨다. 접근 채널링을 위한 다양한 방법들이 본 명세서에 기술되어 있고 또한 당해 기술분야에 공지되어 있는바, FRET, 시간-분해 형광-FRET, LOCI, 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 방법에서 사용되는, 근접 채널링의 이점은 단일의 검출가능한 신호가 3개의 항체 모두에 결합하는 분석물 (예를 들면, 융합 단백질 또는 신호 전달 분자)에서만 발생됨으로써, 분석 특이성을 증가시키고, 백그라운드(background)을 낮추며 그리고 검출을 단순화시킨다.
본 명세서에서 더욱 자세히 설명된 바와 같이, 개개의 환자를 위한 잠재적인항암 치료요법을 평가하기 위하여, 단리된 세포들은 투여량을 변경시키면서 일 또는 그 이상의 항암 약물과 인큐베이션될 수 있다. 그 다음, 성장 인자 자극이 수 분 (예를 들면, 약 1-5분) 또는 수 시간 (예를 들면, 약 1-6시간) 동안 수행될 수 있다. 항암 약물의 존재 및 부존재시 신호전달 경로의 다른 활성화는 각 개개의 환자를 위한 적당한 투여량으로 적합한 암 치료요법의 선택을 도울 수 있다. 치료요법에서의 변경이 이행되어야 하는지 여부를 결정하기 위하여, 세포는 또한 항암 약물 치료 동안 환자로부터 단리될 수 있고 일 또는 그 이상의 성장 인자로 자극될 수 있다. 이와 같이, 도 2는 본 발명의 방법이 의사가 모든 환자에게 최적의 시점에 최적의 용량으로 최적의 항암 약물을 제공할 수 있도록 유리하게 돕는다.
II . 정의
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 하기의 용어들은 달리 설명되어 있지 않는한 하기의 의미를 가진다.
용어 "암(cancer)"은 이상 세포의 비정상 성장을 특징으로 하는 질병 부류의 임의의 일원을 포함한다. 상기 용어는 악성, 양성, 연성 조직, 또는 고형임을 특징으로 하거나 그렇지 않든 간에, 모든 공지된 암 및 신생물 상태, 및 전-이전 및 후-이전 암을 포함하는 모든 단계 및 등급을 갖는 암을 포함한다. 다양한 유형의 암의 비-제한적 예는 악성혈액 종양 (예를 들면, 백혈병, 림프종); 골육종 (예를 들면, 유잉 육종); 연조직 육종 (예를 들면, 융기성 피부섬유육종 (DFSP), 횡문근육종); 다른 연조직 종양, 갑상선 유두암; 전립선암; 위암 (예를 들면, 위); 유방암; 폐암 (예를 들면, 비-소세포성 폐암); 소화기암 및 위장암 (예를 들면, 결장암, 위장관 간질 종양, 위장관 카르시노이드 종양, 대장암, 직장암, 항문암, 담관암, 및 소장암); 식도암; 쓸개암; 간암; 췌장암; 맹장암; 난소암; 신장암 (예를 들면, 신세포암); 중추신경계암; 피부암; 융모막암종; 두경부암을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는, "종양(tumor)"은 일 또는 그 이상의 암 세포를 포함한다.
"악성혈액 종양(hematological malignancy)"은 혈액, 골수 및/또는 림프절에 영향을 미치는 임의의 암 종류를 포함한다. 악성혈액 종양의 예는 백혈병, 림프종, 및 다발성 골수종을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다양한 유형의 백혈병d의 비-제한적인 예는 만성 골수 백혈병 (CML), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 및 거대 과립 림프구성 백혈병을 포함한다. CML의 소분류는 예를 들면, 만성 단핵구성 백혈병을 포함한다. ALL의 소분류는 예를 들면, 전구체 B-세포 급성 림프구성 백혈병, 전-B-세포 급성 림프구성 백혈병, 전구체 T-세포 림프구성 백혈병, 및 급성 혼합성 백혈구를 포함한다. CLL의 소분류는 예를 들면, B-세포 전림프구성 백혈병을 포함한다. AML의 소분류는 예를 들면, 급성 전골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 및 급성 거핵아구성 백혈병을 포함한다. 다양한 유형의 림프종은 예를 들면, 소세포 림프구성 림프종 (SLL), 미만성 거대 B-세포 림프종 (DLBCL), 여포성 림프종 (FL), 외투막 세포 림프종 (MCL), 모발상 세포 백혈병 (HCL), 변연부 세포 림프종 (MZL), 버킷 림프종 (BL), 장기 이식-후 림프증식 질환 (PTLD), T-세포 전림프구성 백혈병 (T-PLL), B-세포 전림프구성 백혈병 (B-PLL), 반델스트룀 거대글로불린혈증 (림프형질세포 림프종으로도 알려짐), 및 다른 NK- 또는 T-세포 림프종과 같은 호지킨 림프종 (4개의 소분류), 및 비-호지킨 림프종을 포함하나, 이에 제한되는 것을 아니다.
용어 "분석물(analyte)"은 그것의 존재, 양 및/또는 동일성이 결정되는 임의의 목적 분자, 통상적으로 폴리펩티드와 같은 거대분자를 포함한다. 특성 예에서, 상기 분석물은 암 세포의 세포 성분, 바람직하기는 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자이다.
용어 "전환(transform)" 또는 "전환하는(transforming)"은 분석물 또는 분석물을 추출하기 위한 또는 본 명세서에 정의된 바와 같이 분석물을 변화시키거나 변경하기 위한 샘플의 물리적 및/또는 화학적 변화를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 분석물 또는 분석물의 수준 또는 농도 또는 활성화 상태를 측정하기 위한 샘플의 추출, 조작, 화학적 침전법, ELISA, 합성법(complexation), 면역-추출, 물리적 또는 화학적 변경은 모두 전환을 구성한다. 즉, 분석물 또는 샘플이 전환 단계 전 후가 동일하지 않은 한, 변화 또는 변경은 전환이다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "연속된 희석물(dilution series)"는 특정 샘플 (예를 들면, 세포 분해물) 또는 시약 (예를 들면, 항체)의 농도를 감소시키는 시리즈를 포함한다. 연속된 희석물은 통상적으로 샘플 또는 시약의 출발 농도의 측정된 양을 희석제 (예를 들면, 희석 완충액)과 혼합함으로써 보다 낮은 농도의 샘플 또는 시약을 생성하고, 그리고 상기 과정을 충분한 횟수로 반복함으로써 원하는 수의 연속 희석물을 수득하는 공정에 의해 생산된다. 상기 샘플 또는 시약은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 500, 또는 1000-배로 연속적으로 희석됨으로써 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50의 감소된 농도의 샘플 또는 시약을 포함하는 연속된 희석물을 생산할 수 있다. 예를 들면, 1 mg/ml 출발 농도의 포획 항체 시약의 2-배 연속 희석물을 포함하는 연속된 희석물은 포획 항체의 출발 농도의 양을 동일한 양의 희석 완충제와 혼합함으로써 0.5 mg/ml 농도의 포획 항체를 생성하고, 그리고 상기 과정을 반복함으로써 0.25 mg/ml, 0.125 mg/ml, 0.0625 mg/ml, 0.0325 mg/ml 등의 포획 항체의 농도를 수득하는 것에 의해 생산될 수 있다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "우수한 동적 범위(superior dynamic range)"는 1개의 세포 만큼의 적은 수 또는 1000개의 세포 만큼의 많은 수에서 특정 분석물을 검출할 수 있는 검정 능력을 의미한다. 예를 들면, 본 명세서에 기술된 면역검정법은 포획 항체 농도의 연속된 희석물을 이용하여 약 1-10,000 세포 (예를 들면, 약 1, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500, 750, 1000, 2500, 5000, 7500, 또는 10,000 세포)에서 목적의 특정 종양원성 융합 단백질 또는 신경 전달 분자를 유리하게 검출하기 때문에, 우수한 동적 범위를 가진다.
용어 "융합 단백질(fusion protein)" 또는 "키메라 단백질(chimeric protein)"은 각각의 단백질을 원래 코드화하는 2 또는 그 이상의 유전자의 결합을 통하여 생성되는 단백질을 포함한다. 그러한 유전자 융합은 통상적으로 염색체 전좌가 제1 유전자의 말단 엑손을 제2 유전자로부터의 완전한 엑손으로 치환하는 경우 발생된다. 이것은 기능성 융합 단백질을 생산하기 위하여 전사되고, 스프라이싱되고, 그리고 번역될 수 있는 단일의 유전자를 생성한다. 특정 구현예에서, 융합 단백질은 종양원성 융합 단백질, 즉 종양형성에 관여하는 융합 단백질이다. 종양원성 융합 단백질은 예를 들면, BCR-ABL, DEK-CAN, E2A-PBX1, RARα-PML, IREL-URG, CBFβ-MYH11, AML1-MTG8, EWS-FLI, LYT-10-Cα1, HRX-ENL, HRX-AF4, NPM-ALK, IGH-MYC, RUNX1-ETO, TEL-TRKC, TEL-AML1, MLL-AF4, TCR-RBTN2, COL1A1-PDGF, E2A-HLF, PAX3-FKHR, ETV6-NTRK3, RET-PTC, TMRSS-ERG, 및 TPR-MET를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "신호 전달 분자(signal transduction molecule)" 또는 "신호 전달인자(signal transducer)"는 세포외 신호 또는 자극을, 통상적으로 세포내에서의 정연한 순서의 생화학 반응을 포함하는 반응으로 전환시키는 세포에 의한 과정을 수행하는 단백질 및 기타 분자를 포함한다. 신호 전달 분자는 예를 들면, EGFR (예를 들면, EGFR/HER-1/ErbB 1, HER-2/Neu/ErbB2, HER-3/ErbB3, HER-4/ErbB4), VEGFR-l/FLT-1, VEGFR-2/FLK-l/KDR, VEGFR-3/FLT-4, FLT-3/FLK-2, PDGFR (예를 들면, PDGFRA, PDGFRB), c-Met, c-KIT/SCFR, INSR (인슐린 수용체), IGF-IR, IGF-IIR, IRR (인슐린 수용체-관련 수용체), CSF-1R, FGFR1-4, HGFR 1-2, CCK4, TRK A-C, MET, RON, EPHA 1-8, EPHB 1-6, AXL, MER, TYR03, TIE 1-2, TEK, RYK, DDR 1-2, RET, c-ROS, V-cadherin, LTK (백혈구 타이로신 키나제), ALK (역형성 림프종 키나제), ROR 1-2, MUSK, AATYK 1-3, RTK 106와 같은 수용체 타이로신 키나제 및 p95ErbB와 같은 수용체 타이로신 키나제의 절단된 형태; Src, Frk, Btk, Csk, Abl, Zap70, Fes/Fps, Fak, Jak, Ack, 및 LIM와 같은 비-수용체 타이로신 키나제; Akt, MAPK/ERK, MEK, RAF, PLA2, MEKK, JNKK, INK, p38, She (p66), PI3K, Ras (예를 들면, K-Ras, N-Ras, H-Ras), Rho, Racl, Cdc42, PLC, PKC, p70 S6 키나제, p53, 사이클린 Dl, STAT1, STAT3, PIP2, PIP3, PDK, mTOR, BAD, p21, p27, ROCK, IP3, TSP-1, NOS, PTEN, RSK 1-3, INK, c-Jun, Rb, CREB, Ki67, 및 파실린과 같은 타이로신 키나제 신호전달 캐스캐이드 성분; 에스트로겐 수용체 (ER), 프로게스테론 수용체 (PR), 안드로겐 수용체, 글루코코르티코이드 수용체, 미네랄코르티코이드 수용체, 비타민 A 수용체, 비타민 D 수용체, 레티노이드 수용체, 티로이드 호르몬 수용체, 및 오판 수용체 같은 핵 호르몬 수용체, 핵 수용체 보조활성인자 및 억제제; 및 그것의 조합물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "샘플(sample)"은 환자로부터 수득된 임의의 생물학적 표본을 포함한다. 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 유관 세척액(ductal lavage fluid), 유두 흡인물, 림프 (예를 들면, 림프절의 분포된 종양 세포), 골수 흡인물, 타액, 소변, 대변 (즉, 배설물), 담(sputum), 기관지 세정액, 눈물, 미세침 흡인물 (예를 들면, 무작위 유륜 미세침 흡인에 의해 채취됨), 임의의 다른 체액, 종양 생검 (예를 들면, 침 생검)과 같은 조직 샘플 (예를 들면, 종양 세포) 또는 림프절 (예를 들면, 감시(sentinel) 림프절 생검), 및 그것의 세포 추출액을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 몇몇 구현예에서, 샘플은 혈장, 혈청, 적혈구와 같은 전혈 또는 이의 분획 성분, 말초 혈액 단핵 세포와 같은 백혈구 및/또는 희귀 순환 세포이다. 특정 구현예에서, 상기 샘플은 전혈 또는 그것의 세포 분획물로부터 임의의 공지된 기술을 사용하여 고형 종양의 백혈구 또는 순환 세포를 단리함으로써 수득된다. 다른 구현예에서, 상기 샘플은 예를 들면, 고형 종양으로부터의 포르말린 고정 파라핀 포매(formalin fixed paraffin embedded, FFPE) 종양 조직 샘플이다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "순환 세포(circulating cell)"는 고형 종양으로부터 전이되거나 미소전이된 외부형 종양을 포함한다. 예를 들면, 순환 세포는 순환 종양 세포, 암 줄기 세포, 및/또는 종양으로 전이하는 세포 (예를 들면, 순환 내피 선조세포, 순환 내피 세포, 순환 전-혈관형성(pro-angiogenic) 골수 세포, 순환 수지상 세포 등)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
"생검(biopsy)"은 진단 또는 예후 평가를 위한 조직 샘플을 제거하는 과정, 및 조직 견본 그 자체를 의미한다. 당업계에 알려진 임의의 생검 기술이 본 발명의 방법 및 조성물에 적용될 수 있다. 적용되는 생검 기술은 다른 잊다 중에서, 일반적으로 평가될 조직의 유형 및 종양의 크기 및 종류 (즉, 고형 또는 현탁형 (즉, 혈액 또는 복수(ascites)))에 의존한다. 대표적인 생검 기술은 절제 생검(excisional biopsy), 절개 생검(incisional biopsy), 침 생검 (예를 들면, 중심 침 생검(core needle biopsy), 미세-침 흡인 생검(fine-needle aspiration biopsy) 등), 외과 생검, 및 골수 생검을 포함한다. 생검 기술은 예를 들면, 문헌 [Harrison's Principles of Internal Medicine, Kasper, et al, eds., 16th ed., 2005, Chapter 70]과 상기 문헌의 제5장에 논의되어 있다. 당해 기술분야의 당업자들은 생검 기술이 제공된 조직 세포 내의 암(cancerous) 및/또는 전암(precancerous)을 확인하기 위해 수행될 수 있을 것임을 이해할 것이다.
용어 "피검체(subject)" 또는 "환자(patient)" 또는 "개체(individual)"는 통상적으로 인간을 포함하지만, 예를 들면, 다른 영장류, 설치류, 개과, 고양이과, 말과, 양과, 돼지과 등과 같은 기타 동물도 포함할 수 있다.
"어레이(array)" 또는 "마이크로어레이(microarray)"는 구체 지지체 예를 들면, 유리 (예를 들면, 유리 슬라이드), 플라스틱, 칩, 핀, 필터, 비드 (예를 들면, 자석 비드, 폴리스티렌 비드 등), 종이, 막 (예를 들면, 나일론, 니트로셀룰로오스, 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 등), 섬유 다발, 또는 임의의 다른 적합한 기질 상에 고착되거나 고정되는 포획 항체의 별개의 세트 및/또는 연속된 희석물을 포함한다. 상기 포획 항체들은 일반적으로 공유 또는 비공유 결합 (예를 들면, 이온 결합, 소수성 결합, 수소 결합, 반데르발스 힘, 쌍극자-쌍극자 결합)을 통해 고체 지지체 상에 고착되거나 고정된다. 특정 예에서, 상기 포획 항체는 고체 지지체와 결합하는 포획 제제와 상호작용하는 포획 태그(tag)를 포함한다. 본 발명의 검정법에서 사용되는 어레이는 통상적으로 다른 공지된/어드레스가능 위치에서 고체 지지체의 표면에 커플링되는 다수의 다른 포획 항체 및/또는 포획 항체 농축물을 포함한다.
용어 "포획 항체(capture antibody)"는 백혈구 또는 희귀 순환 세포의 세포 추출액과 같은 샘플 내의 일 또는 그 이상의 목적 분석물에 특이적인 (즉, 이러한 분석물에 결합하거나, 이에 의해 결합되거나, 이와 함께 복합체를 형성하는) 고정된 항체를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 포획 항체는 어레이 내의 고체 지지체 상에 고정된다. 고체 지지체 상의 임의의 다양한 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자를 고정하기에 적합한 포획 항체는 Upstate (Temecula, CA), Biosource (Camarillo, CA), Cell Signaling Technologies (Danvers, MA), R&D Systems (Minneapolis, MN), Lab Vision (Fremont, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Sigma (St. Louis, MO), 및 BD Biosciences (San Jose, CA)로부터 이용가능하다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "검출 항체(detection antibody)"는 샘플 내의 일 또는 그 이상의 목적 분석물에 특이적인 (즉, 이러한 분석물에 결합하거나, 이에 의해 결합되거나, 이와 함께 복합체를 형성하는) 검출가능한 표지를 포함하는 항체를 포함한다. 상기 용어는 또한 일 또는 그 이상의 목적 분석물에 특이적인 항체를 포함하는 것으로, 여기서 상기 항체는 검출가능한 표지를 포함하는 다른 종에 의해 결합될 수 있다. 예를 들면, 검출가능한 표지는 비오틴/스트렙타비딘 표지, 핵산 (예를 들면, 뉴클레오티드) 표지, 화학적 반응성 표지, 형광 표지, 효소 표지, 방사선 표지, 및 그것의 조합물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 임의의 다양한 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 활성화 상태 및/또는 전체 양을 검출하기에 적합한 검출 항체는 Upstate (Temecula, CA), Biosource (Camarillo, CA), Cell Signaling Technologies (Danvers, MA), R&D Systems (Minneapolis, MN), Lab Vision (Fremont, CA), Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), Sigma (St. Louis, MO), 및 BD Biosciences (San Jose, CA)로부터 이용가능하다. 비-제한적인 예로서, EGFR, c-KIT, c-Src, FLK-1, PDGFRA, PDGFRB, Akt, MAPK, PTEN, Raf, 및 MEK와 같은 신호 전달 분자의 다양한 인산화된 형태에 대한 인산-특이적 항체는 Santa Cruz Biotechnology로부터 이용가능하다.
용어 "활성화 상태-의존성 항체(activation state-dependent antibody)"는 샘플 내의 일 또는 그 이상의 목적 분석물의 특정 활성화 상태에 특이적인 (즉, 이러한 분석물에 결합하거나, 이에 의해 결합되거나, 이와 함께 복합체를 형성하는) 검출 항체를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 활성화 상태-의존성 항체는 일 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자와 같은 일 또는 그 이상의 분석물의 인산화, 유비퀴틴화, 및/또는 복합체 상태를 검출한다. 몇몇 구현예에서, BCR-ABL 융합 단백질의 ABL 키나제 도메인의 인산화는 활성화 상태-의존성 항체를 사용하여 검출된다. 다른 구현예에서, 수용체 타이로신 키나제의 EGFR 패밀리의 일원의 인산화 및/또는 EGFR 패밀리 일원 사이의 이종이합체 복합체의 형성은 활성화 상태-의존성 항체를 이용하여 검출된다.
활성화 상태-의존성 항체로 검출하기에 적합한 종양원성 융합 단백질의 활성화 상태의 비-제한적인 예는 인산화된 형태의 BCR-ABL, DEK-CAN, E2A-PBX1, RARα-PML, IREL-URG, CBFβ-MYH11, AMLl-MTG8, EWS-FLI, LYT-10-Cα1, HRX-ENL, HRX-AF4, NPM-ALK, IGH-MYC, RUNX1-ETO, TEL-TRKC, TEL-AMLl, MLL-AF4, TCR-RBTN2, COL1A1-PDGF, E2A-HLF, PAX3-FKHR, ETV6-NTRK3, RET-PTC, TMRSS-ERG, 및 TPR-MET를 포함한다. 활성화 상태-의존성 항체로 검출하기에 적합한 신호 전달 분자의 활성화 상태의 예 (괄호 내에 나열됨)는 EGFR (EGFRvIII, 인산화 (p-) EGFR, EGFR: Shc , 유비퀴틴화된 (u-) EGFR, p-EGFRvIII); ErbB2 (p95: 절단된 (Tr)-ErbB2, p-ErbB2, p95:Tr-p-ErbB2, HER-2:Shc, ErbB2:PI3K, ErbB2:EGFR, ErbB2:ErbB3, ErbB2:ErbB4); ErbB3 (p-ErbB3, ErbB3:PI3K, p-ErbB3:PI3K, ErbB3:Shc); ErbB4 (p-ErbB4, ErbB4:Shc); c-Met (p-c-Met 또는 c-Met/HGF 복합체), ER (p-ER (S118, S167); IGF-1R (p-IGF-lR, IGF-1R:IRS, IRS:PI3K, p-IRS, IGF-1R:PI3K); INSR (p-INSR); KIT (p-KIT); FLT3 (p-FLT3); HGFRI (p-HGFRI); HGFR2 (p-HGFR2); RET (p-RET); PDGFRa (p-PDGFRa); PDGFRP (p-PDGFRP); VEGFRI (p-VEGFRI, VEGFRLPLCg, VEGFRI:Src); VEGFR2 (p-VEGFR2, VEGFR2:PLCy, VEGFR2:Src, VEGFR2:헤파린 설페이트, VEGFR2:VE-카드헤린); VEGFR3 (p-VEGFR3); FGFR1 (p-FGFR1); FGFR2 (p-FGFR2); FGFR3 (p-FGFR3); FGFR4 (p-FGFR4); Tiel (p-Tiel); Tie2 (p-Tie2); EphA (p-EphA); EphB (p-EphB); NFKB 및/또는 1KB (p-IK (S32), p-NFKB (S536), p-P65:IKBa); Akt (p-Akt (T308, S473)); PTEN (p-PTEN); Bad (p-Bad (S112, S136), Bad: 14-3-3); mTor (p-mTor (S2448)); p70S6K (p-p70S6K (T229, T389)); Mek (p-Mek (S217, S221)); Erk (p-Erk (T202, Y204)); Rsk-1 (p-Rsk-1 (T357, S363)); Jnk (p-Jnk (T183, Y185)); P38 (p-P38 (T180, Y182)); Stat3 (p-Stat-3 (Y705, S727)); Fak (p-Fak (Y576)); Rb (p-Rb (S249, T252, S780)); Ki67; p53 (p-p53 (S392, S20)); CREB (p-CREB (SI 33)); c-Jun (p-c-Jun (S63)); cSrc (p-cSrc (Y416)); 및 파실린 (p-파실린 (Y118))을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "활성화 상태-비의존성 항체(activation state-independent antibody)"는 그것들의 활성화 상태와 무관한 샘플 내의 일 또는 그 이상의 목적 분석물에 특이적인 (즉, 이러한 분석물에 결합하거나, 이에 의해 결합되거나, 이와 함께 복합체를 형성하는) 검출 항체를 포함한다. 예를 들면, 활성화 상태-비의존성 항체는 일 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 인산화 뿐만 아니라 비인산화 형태를 검출할 수 있다.
용어 "핵산(nucleic acid)" 또는 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"는 예를 들면, DNA 및 RNA와 같은 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그것의 중합체를 포함한다. 핵산은 합성, 천연 발생, 및 비-천연 발생하고, 참조 핵산과 유사한 결합 특징을 갖는, 공지된 뉴클레오티드 유사체 또는 변형된 골격 잔기 또는 결합을 함유하는 핵산을 포함한다. 상기 유사체의 예는 포스포로티오에이트, 포르포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2'-0-메틸 리보뉴클레오티드, 및 펩티드-핵산 (PNA)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특별히 제한하지 않는 한, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 갖는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 언급하지 않는 한, 특정 핵산 염기서열은 암묵적으로 또한 그것의 보조적으로 변형된 변형체 및 상보적 염기서열 뿐만 아니라 명백히 표시된 염기서열을 포함한다.
상기 용어 "올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)"는 RNA, DNA, RNA/DNA 혼성화의 단일-가닥 올리고머 또는 폴리머, 및/또는 그것의 모방체(mimetic)를 의미한다. 특정 예에서, 올리고뉴클레오티드는 천연-발생 (즉, 비변형) 핵염기, 당, 및 뉴클레오시드간 (골격) 결합으로 구성된다. 특정 다른 예에서, 올리고뉴클레오티드는 변형된 핵염기, 당, 및/또는 뉴클레오시드간 결합을 포함한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "미스매치 모티프(mismatch moptif)" 또는 "미스매치 영역(mismatch region)"은 그것의 상보적인 염기서열과 100% 상보성을 갖지 않는 올리고뉴클레오티드의 부분을 의미한다. 올리고뉴클레오티드는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 미스매치 영역을 가질 수도 있다. 상기 미스매치 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 그 이상의 뉴클레오티드에 의해 분리될 수도 있다. 미스매치 모티프 또는 영역은 단일의 뉴클레오티드를 포함할 수도 있고 또는 2, 3, 4, 5, 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수도 있다.
구문 "엄격한 혼성화 조건(stringent hybrization condition)"은 올리고뉴클레오티드가 그것의 상보적인 염기서열과는 혼성화 되지만, 다른 염기서열에는 혼성화 되지 않는 조건을 의미한다. 엄격한 조건은 염기서열-의존적이며, 다양한 환경에서 다양하게 존재한다. 긴 염기서열은 보다 높은 온도에서 특이적으로 혼성화된다. 핵산의 혼성화에 대한 광범위한 안내는 문헌 [Tijssen, Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" (1993)]에 기재되어 있다. 일반적으로, 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 pH에서 특이적인 염기서열에 대해 열 용융점(Tm) 보다 약 5-10℃ 낮도록 선택된다. 상기 Tm은 평형에서 표적에 상보적인 프로브의 50%가 표적 염기서열에 혼성화 (규정된 이온 강도, pH, 및 핵 농도 하에서)되는 온도이다 (표적 서열은 Tm에서 과량으로 존재하고, 프로브의 50%가 평형에서 점유되어 있다). 엄격한 조건은 또한 포름아미드와 같은 불안정화제의 첨가로 달성될 수도 있다. 선택적 또는 특이적 혼성화를 위해, 양성 신호는 백그라운드의 적어도 두배, 바람직하기는 백그라운드의 10배의 혼성화이다.
2 또는 그 이상의 핵산과 관련된, 용어 "실질적으로 동일한(substantially identical)" 또는 "실질적 동일(substantial identity)"은 염기서열 비교 알고리즘을 이용하거나 수작업 정렬 및 시각 검사에 의해 측정된 비교 윈도우(window) 또는 지정된 영역에 걸쳐 최대 일치를 비교하거나 정렬하는 경우, 동일하거나, 동일한 뉴클레오티드의 특정 백분율 (즉, 특정 영역에 걸쳐 적어도 약 60%>, 바람직하게는 적어도 약 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 동일성)을 지니는 2 또는 그 이상의 염기서열 또는 부서열(subsequence)를 의미한다. 이러한 정의는 또한, 문맥에서 사용되는 경우, 유사하게 염기서열의 상보체를 의미한다. 바람직하게는, 실질적인 동일성은 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 또는 100의 뉴클레오티드 길이의 영역에 걸쳐 존재한다.
용어 "타이로신 키나제 억제제(tyrosine kinase inhibitor)"는 수용체의 선택적 또는 비-선택적 억제제 및/또는 비-수용체 타이로신 키나제로 작용하는 임의의 다양한 치료제 또는 약물을 포함한다. 임의의 특정 이론에 구속됨이 없어, 타이로신 키나제 억제제는 일반적으로 효소의 ATP-결합 부위에 결합함으로써 표적 타이로신 키나제를 억제한다. 예를 들면, 상기 타이로신 키나제 억제제는 이마티니브 (Gleevec®; STI571), 니로티니브 (Tasigna®), 다사티니브 (Sprycel®), 보수티니브 (SKI-606), 게피티니브 (Iressa®), 수니티니브 (Sutent®; SU11248), 엘로티니브 (Tarceva®; OSI-1774), 라파티니브 (GW572016; GW2016), 카넬티니브 (CI 1033), 세막시니브 (SU5416), 바타라니브 (PTK787/ZK222584), 소라페니브 (BAY 43-9006), 리플루노마이드 (SU101), 반데타니브 (Zactima™; ZD6474), 그것의 유도체, 그것의 유사체, 및 그것의 조합물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 추가적인 타이로신 키나제 억제제는 예를 들면, 미국 특허 제5,618,829로, 제5,639,757호, 제5,728,868호, 제5,804,396호, 제6,100,254호, 제6,127,374호, 제6,245,759호, 제6,306,874호, 제6,313,138호, 제6,316,444호, 제6,329,380호, 제6,344,459호, 제6,420,382호, 제6,479,512호, 제6,498,165호, 제6,544,988호, 제6,562,818호, 제6,586,423호, 제6,586,424호, 제6,740,665호, 제6,794,393호, 제6,875,767호, 제6,927,293호, 및 제6,958,340호에 기술되어 있다. 당해 기술분야의 당업자는 본 발명에서 사용하기에 적합한 다른 타이로신 키나제 억제제에 대해 알고 있을 것이다. 특정 예에서, 상기 타이로신 키나제 억제제는 알루미늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 포타슘, 소듐, 또는 아연 염과 같은 알칼리 또는 알칼리 토금속 염; 3차 아민 또는 4차 암모늄 염과 같은 암모늄 염; 및 숙시네이트, 타르타레이트, 비타르타레이트, 디히드로클로라이드, 할리시레이트, 헤미숙시네이트, 시트레이트, 이소시트레이트, 말레이트, 말리에이트, 마실레이트, 메실레이트, 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포르페이트, 아세테이트, 카프바메이트, 설페이트, 니트레이트, 포르메이트, 락테이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 파이루베이트, 옥살레이트, 푸마레이트, 프로피오네이트, 아스팔테이트, 글루타메이트, 또는 벤조에이트 염과 같은 산 염을 포함하는 약제학적으로 허용가능한 형태로 투여되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
용어 "인큐베이트하는(incubating)"은 "접촉시키는(contacting)" 및 "노출시키는(exposing)"과 동일하게 사용되고, 달리 지시되지 않으면 임의의 구체적인 시간 또는 온도 필요조건을 수반하지 않는다.
용어 "완전한 세포유전학적 반응(complete cytogenetic response)", "완전한 세포유전학적 회복(complete cytogenetic remission)", "CCyR" 및 "CCgR"는 골수로부터 단리된 세포의 염색체 결합에 의해 측정되는, 중기(metaphase)에 있는 적어도 20개의 세포의 집단 중에, 중기에 있는 필라델피아 염색체-양성 세포가 없는 것으로 정의되는 임상적으로 허용된 기준을 포함한다. 특정 예에서, 골수로부터 단리된 중기 세포가 염색체 결합에 의해 수득되거나 평가될 수 없는 경우, 상기 용어는 혈액 세포의 간기(interphase) 형광 인 시추 혼성화 (fluorescent in situ hybridization, FISH)에 의해 점수화되는 적어도 200 핵의 것으로부터 < 1% BCR-ABL 양성 핵의 존재로 정의될 수도 있다. 간기 FISH는 예를 들면, BCR-ABL 엑스트라신호, 이중 색상, 이중 융합, 또는 인 시추 혼성화 프로브로 수행될 수도 있다. 이러한 용어의 추가적인 설명은 예를 들면, 문헌 [O'Brien et al, N. Engl. J. Med., 348:994-1004 (2003); Hughes et al, N. Eng.U. Med., 349: 1423-1432 (2003); 및 Bacarani et al, J. Clin. Oncol, 27:6041-6051 (2009)]에 나와있다.
"주요 분자 반응(major molecular response)" "주요 분자 회복(major molecular remission)" 또는 "MMR"은 BCR-ABL와 같은 종양원성 융합 단백질의 수준이 전장 BCR 및/또는 전장 ABL와 같은 일 또는 그 이상의 조절 단백질 수준 보다 적어도 약 2-3 로그까지 감소될 때 달성된다. 특정 구현예에서, 주요 분자 반응은 항암 약물 (예를 들면, 타이로신 키나제 억제제) 치료요법 동안 조절 단백질 수준 (예를 들면, BCR 또는 ABL 수준)에 대한 종양원성 융합 단백질 수준 (예를 들면, BCR-ABL 수준)의 비율이 항암 약물 치료요법 이전의 동일한 단백질의 비율에 대해 적어도 약 2-3 로그까지 감소될 때 달성된다. mRNA 전자 수준의 검출에 의존하는 주요 단백질 반응의 정의와 반대로, 본 발명의 상기 항체-기반 근접 이중 검출 검정법은 유리하게는 건강한 공여자로부터의 약 100,000 세포의 백그라운드 하에 하나의 암 (예를 들면, CML) 세포를 검출할 수 있는 능력을 제공함으로써 BCR-ABL, BCR, 및/또는 ABL 단백질 수준을 측정하고 비교하는 것에 의해 주요 분자 반응의 측정을 가능하게 한다. 다른 구현예에서, 주요 분자의 반응은 ABL 또는 BCR mRNA 전사 수준의 백분율로 표현되는 ABL 또는 BCR mRNA 전사체에 대한 BCR-ABL mRNA 전사체의 비율을 로그 (기본 10)상의 표준화된 기저 수준 이하의 적어도 3-로그의 감소로 정의된 임상적 분류이다. 특정 예에서, mRNA 전사체의 수준은 실-시간 정량 RT-PCR (qPCR) 방법을 사용하여 측정된다. 추가 구현예에서, 주요 단백질 반응은 ABL, BCR 또는 대조 mRNA 전사체에 대한 BCR-ABL의 비율이 qPCR에 의해 측정할 때 국제 크기(IS)로 ≤0.1% 로 정의되는 수치를 가질 때의 상태이다. 상기 IS는 International Randomized Study of Interferon versus STI571 (IRIS) 임상 연구에서 참여 연구소에 의해 확립된 로그 감소 크기에 관한 것이다. 예를 들면, 문헌 [Hughes et al, N. Engl J. Med., 349:1423-1432 (2003); Hughes et al, Blood, 108:28-37 (2006), Brand et al, Blood, 112:3330-3338 (2008); 및 Baccarani et al, J. Clin. Oncol, 27:6041-6051 (2009)] 참고.
"완전한 분자 반응(complete molecular response)", "완전한 분자 회복(complete molecular remission)" 또는 "CMR"는 BCR-ABL와 같은 종양원성 융합 단백질의 수준이 전장 BCR 및/또는 전장 ABL와 같은 일 또는 그 이상의 대조 단백질 수준 보다 적어도 약 3-4 로그까지 감소할 때 달성된다. 특정 구현예에서, 완전한 단백질 반응은 항암 약물 동안 대조 단백질 수준 (예를 들면, BCR 또는 ABL 수준)에 대한 종양원성 융합 단백질 수준 (예를 들면, BCR-ABL 수준)의 비율이 항암 약물 (예를 들면, 타이로신 키나제 억제제) 치료 전에 동일한 단백질의 비율에 대해 적어도 약 3-4 로그 까지 감소할 때 달성된다. mRNA 전사체 수준의 검출에 의존하는 완전한 분자 반응의 정의와 반대로, 본 발명의 항체-기반 근접 이중 검정법은 건강한 공여자로부터의 약 1,000,000 세포의 백그라운드 하에 하나의 암 (예를 들면, CML) 세포를 측정할 수 있는 능력을 제공함으로써, BCR-ABL, BCR, 및/또는 ABL 단백질 수준을 측정하고 비교하는 것에 의해 완전한 분자 반응의 측정을 가능하게 한다. 다른 구현예에서, 완전한 단백질 반응은 BCR-ABL mRNA 전사체가 BCR-ABL mRNA 수준이 4.0-4.5-로그 하락까지 측정가능하도록 적당한 품질의 적어도 2개의 연속적인 혈액 샘플에서 qPCR 및/또는 네스티드 PCR에 의해 측정불가능한 임상적 분류이다. 특정 예에서, 완전한 분자 반응은 백분율로서 표현되는 ABL, BCR 또는 대조 mRNA 전사체에 대한 BCR-ABL의 비율을 로그 크기로 표준화된 기저 수준 이하로 적어도 4.5-로그의 감소로 정의될 수도 있다. 예를 들면, 문헌 [Press et ah, Blood, 107:4250-4256 (2006); Muller et ah, Leukemia., 23:1957-1963 (2009); 및 Baccarani et ah, J. Clin. Oncol., 27:6041-6051 (2009)] 참고.
용어 "치료 과정(course of therapy)"은 악성혈액 종양 (예를 들면, 백혈병, 림프종 등)과 같은 암과 관련된 일 또는 그 이상의 증후를 경감시키거나 예방하기 위해 수행되는 임의의 치료학적 접근법을 포함한다. 상기 용어는 암을 갖는 개체의 건강을 향상시키기에 유용한 임의의 화합물, 약물, 과정, 및/또는 요법을 투여하는 것을 포함하고 본 명세서에서 기술된 임의의 치료제를 포함한다. 당업자는 치료 과정이나 치료의 현재 과정의 투여가 본 발명의 방법을 사용하여 측정된 일 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질 및/또는 신호 전달 분자의 발현 및/또는 활성화 수준을 바탕으로 바뀔 수 있음(예를 들면, 증가되거나 감소될 수 있음)을 이해할 것이다.
III . 구체예에 대한 설명
본 발명은 세포 추출액 또는 분해물과 같은 생물학적 샘플 내의 일 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질 및/또는 신호 전달 분자의 활성화 상태 및/또는 전체 양을 측정하기 위한 항체-기반 어레이를 제공한다. 본 발명은 또한 암 예후 및 진단, 약물 치료에 대한 내성의 예측 또는 확인, 및 개인 맞춤 디자인, 표적 치료요법를 용이하게 하기 위한 상기 어레이의 사용 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 유리하게도 표적 단백질 키나제 (예를 들면, BCR-ABL)에서의 돌연변이, 치료 요법과의 비-순응, 및/또는 최적이하 약물 투여에 의한 이마티니브와 같은 타이로신 키나제 억제제로 치료요법에 대해 내성을 갖는 환자를 확인한다.
일 특정 구현예에서, 본 발명은 BCR-ABL, 그것의 기질, 및/또는 세포 추출액 또는 분해물과 같은 생물학적 샘플 내의 다른 신호 전달 분자의 발현 수준 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 정도의 실-시간 검출을 위한 예를 들면, 면역검정법과 같은 검정법을 제공한다. 이와 같이, 본 발명은 유리하게도 치료의 전체 과정을 스크리닝하고 관찰하고, 그들이 니로티니브 (Tasigna®)와 같은 선택적인 표적 약물로 이동되어야 하는지 여부를 평가하여 최소한의 독성을 갖는 표적 분자 (예를 들면, BCR-ABL)를 효과적으로 억제함으로써 일 또는 그 이상의 표적 치료를 공급받고 있는 CML과 같은 악성혈액 종양을 갖는 환자에게 이점을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 BCR-ABL과 같은 종양원성 융합 단백질의 검출에 우수한 민감도 영역을 갖는 방법을 제공한다. 세포 추출액 내의 BCR-ABL 단백질을 검출하기 위한 현재 면역검정법은 일반적으로 10-0.001%의 검출 민감도와 동일한, 10-100,000 보통 세포에서 하나의 BCR-ABL-양성 백혈병 세포를 검출할 수 있다 (예를 들면, 문헌 [Jilani et al, Leuk. Res., 32:936-943 (2008); Weerkamp et al, Leukemia, 23: 1 106-1117 (2009); Raponi et al, Haematologica, 94: 1767-1770 (2009)]; 및 미국 특허 공개 제2006/0172345호 참고). 본 명세서에 기술된 근접 검정법은 약 1:100,000-10,000,000 세포 (즉, 약 100,000-10,000,000 보통 세포에 대한 하나의 백혈병 세포; 약 0.001-0.00001%의 검출 민감도와 동일함) 또는 약 1:1,000,000-10,000,000 세포 (즉, 1,000,000-10,000,000 보통 세포에 대한 하나의 백혈병 세포; 약 0.0001-0.00001%의 검출 민감와과 동일함)에 대해 증가된 검출 민감도를 나타내고, 예를 들면, 약 1:100,000 세포, 1:200,000 세포, 1:300,000 세포, 1:400,000 세포, 1:500,000 세포, 1:600,000 세포, 1:700,000 세포, 1:800,000 세포, 1:900,000 세포, 1:1,000,000 세포, 1:2,000,000 세포, 1:3,000,000 세포, 1:4,000,000 세포, 1:5,000,000 세포, 1:6,000,000 세포, 1:7,000,000 세포, 1:8,000,000 세포, 1:9,000,000 세포, 1:10,000,000 세포, 1:100,000-500,000 세포, 1:100,000-1,000,000 세포, 1:500,000-1,000,000 세포, 1:100,000-5,000,000 세포, 1:500,000-10,000,000 세포, 1:2,000,000-10,000,000 세포, 1:5,000,000-10,000,000 세포, 1:1,000,000-7,500,000 세포, 1:1,000,000-5,000,000 세포, 및 본 명세서 내의 임의의 다른 범위를 포함한다. 본 명세서에 기술된 방법의 민감도는 표준 핵산-기반 BCR-ABL 검정법 (예를 들면, qPCR 또는 네스티드 PCR)의 것과 동일하거나 그 이상으로, 10,000-1,000,000 보통 세포에 대한 1개의 백혈병 세포의 검출 범위 내로 떨어진다. 핵산-기반 BCR-ABL 검정법의 민감도 범위의 추가적인 설명은 예를 들면, 문헌 [Press et al, Blood, 107:4250-4256 (2006) 및 Radish JP, Blood, 114:3376-3381 (2009)] 참고.
특정 구현예에서, 본 발명의 항체-기반 근접 검정법은 BCR-ABL 검출을 위한 현재의 면역검정법 및 핵산-기반 검정법에 비해, BCR-ABL와 같은 종양원성 융합 단백질의 존재, 수준, 및/또는 활성화 상태의 검출에서 민감도 및/또는 특이성의 보다 높은 정도를 가능하게 함으로써, 예를 들면, 완전한 세포유전학적 반응, 주요한 분자 반응, 완전한 분자 반응, 및 그것의 조합과 같은 반응 표지자의 보다 정확한 측정을 제공한다. 비-제한적 예로서, 현재 핵산-기반 검정법은 현재 핵산-기반 검정법을 사용하는 완전한 분자 반응의 측정이 환자가 BCR-ABL-매개 질병 (예를 들면, CML)이 치료되거나 더 이상 갖지 않음을 반드시 의미하지 않도록, 환자 샘플 내의 BCR-ABL 전사체의 매우 적은 양을 검출하기에 충분히 민감한 것은 아니다.
일 측면에서, 본 발명은 종양원성 융합 단백질의 수준 또는 활성화 상태를 측정하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 세포 추출액을 세포 추출액 내에 존재하는 제1 전장 단백질을 제1 전장 단백질 및 제1 결합 모이어티를 포함하는 복합체로 전환하기에 적합한 조건 하에 제1 전장 단백질의 제1 도메인에 특이적인 제1 결합 모이어티와 점촉시키는 단계, 여기서 상기 제1 전장 단백질의 제1 도메인은 제2의, 다른 전장 단백질의 제1 도메인에 융합된 제1 전장 단백질의 제2의, 다른 도메인을 포함하는 대응 종양원성 융합 단백질이 부재하고;
(b) 상기 세포 추출액에서 단계 (a)로부터의 복합체를 제거함으로써, 제1 전장 단백질이 없는 세포 추출액을 형성하는 단계;
(c) 단계 (b)로부터의 세포 추출액을 세포 추출액 내에 존재하는 종양원성 융합 단백질을 종양원성 융합 단백질 및 제2 결합 모이어티를 포함하는 복합체로 전환하기에 적합한 조건 하에 제1 전장 단백질의 제2의, 다른 도메인에 특이적인 제2 결합 모이어티와 접촉시키는 단계;
(d) 단계 (c)로부터의 복합체의 수준 또는 활성화 상태를 측정함으로써, 상기 종양원성 융합 단백질의 수준 또는 활성화 상태를 판단하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 세포 추출액은 샘플로부터 단리된 세포의 추출물을 포함한다. 특정 예에서, 상기 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 미세 침 흡인물 (FNA), 소변, 담, 기관지 세정액, 눈물, 유두 흡인물, 림프, 타액, 및 그것의 조합물로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 상기 샘플은 암을 갖는 환자로부터 수득된다. 일부 예에서, 상기 암은 암 세포 내의 염색체 전좌로 인한 종양원성 융합 단백질의 형성에 의해 야기될 수도 있다. 예를 들면, 상기 암은 악성혈액 종양, 골육종, 연조직 육종, 및 그것의 조합을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 구현예에서, 상기 악성혈액 종양은 백혈병 또는 림프종이다. 일 바람직한 구현예에서, 상기 백혈병은 만성 골수 백혈병(CML)이다. 다른 구현예에서, 세포 추출액 또는 분해물이 제조된 것으로부터 단리된 세포는 순환 암 세포, 백혈구, 또는 그것의 조합을 포함할 수도 있다. 특정 구현예에서, 상기 단리된 세포는 성장 인자로 인 비트로에서 자극된다. 일부 예에서, 상기 단리된 세포는 성장 인자 자극 이전에 항암 약물로 인큐베이션. 다른 예에서, 상기 단리된 세포는 성장 인자 자극 이후에 용해되어 세포 추출액을 생산한다.
일부 구현예에서, 상기 세포 추출액은 신선하게 수거되거나 동결된 골수 또는 전혈 샘플로부터 제조된다. 비-제한적 예로서, 항응고제 (예를 들면, EDTA, 헤파린 및/또는 산-시트레이트-덱스트로스(ACD))로 처리된 전혈 샘플은 우선 혈장 또는 혈구 분획물 및 세포 분획물로 분리된다. 상기 세포 분획물은 혈액 샘플로부터 백혈구를 단리하기 위하여 암모늄 클로라이드 및/또는 Ficoll-HyPaque 밀도-구배 원심분리를 사용하여 적혈구 세포의 저장성 용해(hypotonic lysis)에 의해 가공될 수도 있다. 상기 세포 분획물 내에 존재하는 단리된 세포는 용해됨으로써, 문헌 [Raponi et al., LeukRes, 32:923-43 (2008); Weerkamp et al., Leukemia, 23: 1106-1117 (2009)]; 및 미국 특허 제6,610,498호 및 제6,686,165호에 기술된 방법과 같은, 당업계에 공지된 임의의 기술을 사용하여 세포 추출액으로 전환될 수도 있다.
몇몇 예에서, 상기 단리된 백혈구는 용해되기 이전에 일 또는 그 이상의 세포-투과성 프로테아제 억제제로 처리될 수도 있다. 세포-투과성 프로테아제 억제제는 디이소프로필 플루오로포스페이트(DFP), 4-(2-아미노에틸)벤젠술포닐 플루오라이드 하이드로클로라이드(AEBSF), 페닐메탄술포닐 플로오라이드(PMSF) 및 그것의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 비-제한적 예로서, 단리된 백혈구는 PBS 내의 20mM AEBSF 및 ImM PMSF를 함유하는 완충액에서 아이스로 10-30분 동안 인큐베이션된다. 상기 세포는 4℃에서 520g으로 5분 동안 온화하게 원심분리됨으로써, 상층액과 단리된 백혈구로 분리된다. 프로테아제 억제제로의 단리된 백혈구의 처리는 예를 들면, 문헌 [Weerkamp et al., Leukemia, 23:1106-1117 (2009)]에 기술되어 있다.
몇몇 예에서, 상기 단리된 백혈구는 일 또는 그 이상의 프로테아제 억제제를 함유하는 RIPA 용해 완충액에서 아이스로 30분 까지 인큐베이션될 수도 있다. RIPA 완충액은 50 mM 트리스 HC1, pH7.5, 150 mM NaCl, 1% NP40, 및 0.1% 소듐 도데실 설페이트를 포함하거나 상기를 필수성분으로 하여 구성된다. 특정 다른 예에서, RIPA 완충액은 소듐 소데실코레이트를 함유하지 않는다. 인큐베이션 이후에, 상기 세포 혼합물은 4℃에서 1-10분 동안 > 18,000g로 원심분리됨으로써 세포 추출액과 세포 잔해물로 분리된다. 세포 용해 프로토콜의 추가적인 상세설명은 예를 들면, 문헌 [Raponi et al., Haematologica, 94:1767-1770 (2009); Weerkamp et al, Leukemia 23: 1106-1117 (2009)]; 및 미국 특허공개 제2006/0172345 참고.
몇몇 예에서, 혈장은 문헌 [Jilani et al., Leuk. Res., 32:936-943 (2008)]에 기술되어 있는 바와 같이, 수거되어 일 또는 그 이상의 항응고제 (예를 들면, EDTA, 헤파린 또는 ACD)로 처리된 신선한 말초 전혈 샘플로부터 제조된다. 비-제한적 예로서, 혈액 샘플은 혈장 또는 혈구 분획물과 세포 분획물로 분리될 수도 있다. 상기 혈장은 분석될 때까지 또는 혈액 샘플의 수거의 96 시간 내에 분석될 때까지 -70-80℃에서 저장될 수도 있다.
특정 구현예에서, 상기 종양원성 융합 단백질은 BCR-ABL, DEK-CAN, E2A-PBX1, RARα-PML, IREL-URG, CBFβ-MYH11, AML1-MTG8, EWS-FLI, LYT-10-Cαl, HRX-ENL, HRX-AF4, NPM-ALK, IGH-MYC, RUNX1-ETO, TEL-TRKC, TEL-AML1, MLL-AF4, TCR-RBTN2, COL1A1-PDGF, E2A-HLF, PAX3-FKHR, ETV6-NTRK3, RET-PTC, TMRSS-ERG, TPR-MET, 및 그것의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 상기 종양원성 융합 단백질은 BCR-ABL이다. 특정 예에서, 제1 전장 단백질은 BCR이고, 제1 전장 단백질의 제1 도메인은 BCR의 카르복실-말단 영역 (BCR-C)을 포함하고, 그리고 제1 전장 단백질의 제2의, 다른 도메인은 BCR의 아미노-말단 영역 (BCR-N)을 포함한다. 특정 다른 예에서, 제2의, 다른 전장 단백질은 ABL이고, 다른 전장 단백질의 제1 도메인은 ABL의 카르복실-말단 영역 (ABL-C)을 포함하고, 그리고 제2의, 다른 전장 단백질의 제2의, 다른 도메인은 ABL의 아미노-말단 영역(ABL-N)을 포함한다. 일 선택적인 구현예에서, 제1 전장 단백질은 ABL이고, 제2의, 다른 전장 단백질은 BCR이다.
몇몇 구현예에서, 활성화 상태는 인산화 상태, 유비퀴틴화 상태, 복합화 상태, 및 그것의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 바람직한 구현예에서, 상기 종양원성 융합 단백질은 BCR-ABL이고, 상기 활성화 상태는 인산화 상태이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 검정 방법은 일 또는 그 이상의 신호 전달 분자의 수준 또는 활성화 상태를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 일 또는 그 이상의 신호 전달 분자는 예를 들면, CRKL, JAK2, STAT5, Src, FAK, c-ABL, c-CBL, SHC, SHP-2, VAV, BAP-1, 및 그것의 조합물과 같은 BCR-ABL 기질을 포함한다.
일 특정 구현예에서, 제1 결합 모이어티는 제1 항체를 포함한다. 몇몇 예에서, 제1 항체는 고체 지지체에 부착된다. 고체 지지체의 비-제한적 예는 유리, 플라스틱, 칩, 핀, 필터, 비드, 종이, 막, 섬유 다발, 및 그것의 조합물을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 제1 항체가 비드 (예를 들면, 자석 비드, 폴리스티렌 비드, 등) 및 디플레이션 태그와 같은 비드 분획물에 부착됨으로써, 세포 추출액으로부터 제1 전장 단백질이 제거된다.
다른 특정 구현예에서, 제2 결합 모이어티는 제2 항체를 포함한다. 몇몇 예에서, 제1 항체는 고체 지지체에 부착된다. 고체 지지체의 비-제한적 예는 유리, 플라스틱, 칩, 핀, 필터, 비드, 종이, 막, 섬유 다발, 및 그것의 조합물을 포함한다. 일 바람직한 구현예에서, 제2 항체는 어드레스가능한 어레이 내의 막 (예를 들면, 나일론, 니트로셀룰로오스, PVDF, 등)과 같은 고체 지지체 상에 고정된다. 다른 구현예에서, 제2 항체는 비드 (예를 들면, 자석 비드, 폴리스티렌 비드, 등)에 부착되는 것으로, 여기서 상기 비드는 선택적으로 형광물질 (예를 들면, 색채 비드)와 같은 염료을 함유할 수도 있다. 예로서, 다수의 비드가 사용되는 경우, 상기 비드는 다른 강도를 갖거나 다른 여기(excitation) 및/또는 방출 스펙트라를 갖는 형광물질 (예를 들면, 붉은색 또는 적외선 형광물질)과 같은 독립적으로 선택된 염료를 함유할 수도 있다.
바람직한 구현예에서, 단계 (c) 및 (d)는 본 명세서에 기술된 근접 이중 검출 검정법 (협력 근접 면역검정법, COllaborative Proixity ImmunoAssay, COPIA로도 알려짐)을 포함한다. 다른 구현예에서, 단계 (c) 및 (d)는 본 명세서에 기술된 효소-결합 면역검정법(ELISA), 유세포 검정법, 또는 태그-분류 검정법을 포함한다.
구현예에서, 단계 (c) 및 (d)가 근접 이중 검출 검정법을 포함하는 경우, 단계 (c)는:
(c') 단계 (b)로부터의 세포 추출액을 세포 추출액 내에 존재하는 종양원성 융합 단백질을 종양원성 융합 단백질 및 제2의, 제3의, 및 제4의 결합 모이어티로 전환하기에 적합한 조건 하에 제3 결합 모이어티 및 제4 결합 모이어티와 접촉시키는 단계를 추가로 포함할 수도 있고,
여기서 상기 제3의 결합 모이어티는 촉진 모이어티로 표지되고, 하기의 도메인 또는 염기서열:: (i) 제2의, 다른 전장 단백질의 제1 도메인; (ii) 제1 전장 단백질의 제2의, 다른 도메인; 또는 (iii) 제1 전장 단백질의 제2의, 다른 도메인과 제2의, 다른 전장 단백질의 제1 도메인 사이의 융합 부위에 존재하는 일 또는 그 이상의 에피토프에 특이적이고 (예를 들면, 상기에 특이적으로 결합하고),
여기서 상기 제4의 결합 모이어티는 신호 증폭쌍의 제1 일원으로 표지되고, 제2의, 다른 전장 단백질의 제1 도메인에 특이적이고, 그리고
여기서 상기 촉진 모이어티는 신포 증폭쌍의 제1 일원에 채널링하고 상기와 반응하는 산화제를 발생시킨다.
다른 구현예에서, 단계 (c) 및 (d)가 근접 이중 검출 검정법을 포함하는 경우, 단계 (d)는:
(d') 단계 (c')로부터의 복합체를 신호 증폭쌍의 제2 일원과 인큐베이션함으로써 증폭된 신호를 발생하는 단계; 및
(d") 상기 신호 증폭쌍의 제1 및 제2 일원으로부터 발생된 증폭된 신호를 검출하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.
특정 구현예에서, 단계 (b)로부터의 세포 추출액은 제2의 결합 모이어티의 연속된 희석물과 접촉됨으로써 종양원성 융합 단백질 및 제2의 결합 모이어티를 포함하는 다수의 복합체를 형성할 수도 있다. 몇몇 구현예에서, 제3의 및 제4의 결합 모이어티는 각각 제3의 및 제4의 항체를 포함할 수도 있다. 몇몇 예에서, 상기 제3의 및 제4의 항체는 둘다 활성화 상태-비의존성 항체일 수 있다. 그러한 예에서, 신포 증폭쌍의 제1 및 제2 일원으로부터 발생된 증폭된 신호는 종양원성 융합 단백질의 전체 양과 상관관계에 있을 수 있다. 다른 예에서, 제3의 항체는 활성화 상태-비의존성 항체이고 제4의 항체는 활성화 상태-의존성 항체이다. 그러한 예에서, 상기 신호 증폭쌍의 제1 및 제2 일원으로부터 발생된 증폭된 신호는 활성화된 (예를 들면, 인산화된) 종양원성 융합 단백질의 양과 상관관계에 있다.
다른 예에서, 제3의 결합 모이어티는 촉진 모이어티로 직접 표지될 수도 있다. 다른 구현예에서, 제4의 결합 모이어티는 신호 증폭쌍의 제1 일원으로 직접 표지된다. 선택적인 구현예에서, 제4의 결합 모이어티는 제2 검출 항체에 컨쥬게이트된 결합쌍의 제1 일원과 신호 증폭쌍의 제1 일원에 쥬게이트된 결합쌍의 제2 일원 사이의 결합을 통해 신호 증폭쌍의 제1 일원으로 표지된다. 이러한 구현예에서, 결합쌍의 제1 일원은 비오틴이고 그리고/또는 결합쌍의 제2 일원은 스트렙타비딘이다.
추가의 구현예에서, 촉진 모이어티는 글루코스 옥시다제이다. 특정 예에서, 글루코스 옥시다제 및 제3의 결합 모이어티는 술프히드릴-활성화된 덱스트란 분자에 컨쥬게이트된다. 그러한 예에서, 상기 슬프히드릴-활성화 덱스트란 분자는 약 500kDa의 분자량을 가진다. 다른 예에서, 상기 산화제는 하이드로겐 퍼옥시다제 (H202)이다. 상기 예에서, 신호 증폭쌍의 제1 일원은 예를 들면, 호스라디시 퍼옥시다제 (HRP)와 같은 퍼옥시다제이고, 그리고/또는 신호 증폭쌍의 제2 일원은 예를 들면, 비오틴-티라미드와 같은 티라미드 시약이다. 특정 구현예에서, 증폭된 신호는 비오틴-티라미드의 퍼옥시다제 산화에 의해 발생됨으로써, 활성화 티라미드를 생산한다. 특정 예에서, 상기 활성화 티라미드는 직접 검출된다. 특정의 다른 예에서, 활성화 티라미드는 단일-검출 시약의 첨가에 의해 검출된다. 단일-검출 시약의 비-제한적 예는 스트렙타비딘-표지 형광물질 및 스트렙타비딘-표지 퍼옥시다제와 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)과 같은 색소형성 시약의 조합을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 분석 방법은:
(e) 세포 추출액을 세포 추출액 내에 존재하는 제2의, 다른 전장 단백질을 제2의, 다른 전장 단백질과 제5의 결합 모이어티를 포함하는 복합체로 전환하기에 적합한 조건 하에 제2의, 다른 전장 단백질의 제2 도메인에 특이적인 제5의 결합 모이어티와 접촉시키는 단계, 여기서 상기 제2의, 다른 전장 단백질의 제2 도메인은 종양원성 융합 단백질이 없고; 및
(f) 세포 추출액에서 단계 (e)로부터의 복합체를 제거함으로써 제2의, 다른 전장 단백질이 없는 세포 추출액을 형성하는 단계를 추가로 포함하는 것으로, 여기서 단계 (e)는 단계 (a) 전, 동안 또는 후에 수행된다.
일 특정 구현예에서, 상기 제5 결합 모이어티는 제5 항체를 포함한다. 몇몇 예에서, 상기 제5 항체는 고체 지지체에 부착된다. 고체 지지체의 비-제한적 예는 유리, 플라스틱, 칩, 핀, 필터, 비드, 종이, 막, 섬유 다발, 및 그것의 조합을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 제5 항체는 비드 (예를 들면, 자석 비드, 폴리스티렌 비드, 등)에 부착되고, 상기 비드는 디플레이션 태그로서 기능을 함으로써 세포 추출액으로부터 제2의, 다른 전장 단백질을 제거한다.
도 3A는 BCR-ABL(310)와 같은 종양원성 융합 단백질의 존재 (전체 수준) 및/또는 활성화 상태 (인산화 수준)을 측정하기 위한 예시적인 근접 검정법(300)을 도시한다. 키메라 BCR-ABL 유전자에 의해 코드화되는 종양원성 융합 단백질은 BCR 유전자 내의 브레이크 포인트(breakpoint)에 의존하여, 크기가 변화한다. BCR-ABL 융합체 유전자는 염색체(9)의 장완(long arm)에 위치하는 ABL 유전자와 염색체(22)의 장완에 위치하는 BCR 유전자의 상호 전좌에 의해 발생됨으로써, 필라델피아 염색체로도 알려진, 염색체 22q-상에 종양원성 융합체 유전자를 형성한다. 예를 들면 문헌 [Kurzock et ah, N. Engl. J. Med. 319:990-8 (1988); Rosenberg et ah, Adv. hn Virus Res. 35:39-81 (1988)] 참조. ABL 유전자를 BCR 유전자의 N-말단 상에 전좌시키는 염색체 브레이크 포인트에 따라, 다른 길이를 갖는 BCR-ABL 융합체 유전자가 형성된다. 상기 ABL 유전자 내의 브레이크 포인트는 엑손 lb와 a2 사이에서 대략적으로 200kb를 걸쳐 분배되는 것으로 측정되고, BCR 유전자 브레이크 포인트는 3개의 영역; 엑손 13-15 (b2-b4) 사이의 메이저 브레이크 포인트 (M-BCR); 선택적으로 엑손 1과 2 (el 및 e2) 사이의 마이너 브레이트 포인트 (m-BCR); 및 인트론 19 (el9) 내의 마이크로 브레이크 포인트 (mu-BCR) 내부에 응집된다. 따라서, BCR-ABL 유전자의 재배열에 의존하여, 유일한 BCL-ABL 단백질이 형성된다. 예를 들면, 문헌 [Konopka et ah, Cell 37: 1035-42 (1984); van Dongen, ΠΜ, Leukemia 19:1292-5 (2005)] 참조.
상기 p210 BCR-ABL 단백질은 CML 경우와 ALL의 하부세트의 95% 이상으로 검출되는, b3a2 (el4a2) 및/또는 b2a2 (el3a2) 유전자 전사로부터 발생된다. 이 단백질은 1790개의 아미노산을 함유하고, N-말단에서 BCR로부터 올리고머화 도메인(OLI), 그 다음 BCR로부터 S/T 키나제 도메인, 보통의 BCR 내에 존재하지 않는 BCR로부터 아미노산 염기서열 삽입체, 그 다음 ABL로부터의 SH3, SH2 및 Y 키나제도메인 뿐만 아니라 ABL의 C-말단 프롤린-풍부 도메인으로 구성된다. p190 BCR-ABL 융합 단백질은 Ph-양성 ALL과 주로 관계되는 ela2 융합체 유전자 전사에 의해 코드화된다. CML의 희귀한 경우는 pl90-형 BCR-ABL 유전자 전좌로 인한 것이고, 이 경우, 질병은 만성 골수단핵구성 백혈병(CMML)과 유사한, 현저한 단핵구 성분을 갖는 경향이 있다. p230 BCR-ABL 단백질은 호중구-CML, 전형적으로 CML 및 AML과 관련된 el9a2 유전자 전사체로부터 형성된다. 예를 들면, 문헌 [Konopka et ah, Cell 37: 1035-42 (1984); van Dongen, JJM, Leukemia 19:1292-5 (2005)] 참고. 예외적인 CML 경우는 상기 세개의 정의된 응집 영역 외부의 BCR 브레이크 포인트, 또는 ABL 내의 예외적인 브레이트 포인트로 기술된다 (예를 들면, 문헌 [Melo, Baillieres Clin. Haematol., 10:203-22 (1997)] 참고). 본 명세서에 기술된 근접 검정법은 BCR 유전자 내부의 임의의 위치에 있는 브레이크 포인트를 갖는 키메라 BCR-ABL 유전자에 의해 코드화되는 BCR-ABL 단백질의 전체 수준 뿐만 아니라 활성화 수준을 검출할 수 있다.
도 3A에 예시한 바와 같이, 전장 BCR 단백질은 우선 전장 BCR (331)의 카르복실-말단 영역에 특이적인 디플레이션 태그를 사용하는 것에 의해 환자 샘플로부터 제거될 수 있다. 그러한 디플레이션 태그의 비-제한적 예는 전장 BCR의 카르복실-말단 영역에 특이적인 항체가 부착된 비드(321b)이다. 전장 BCR가 상기 샘플로부터 제거되면, BCR의 아미노-말단 영역(BCR-N)에 특이적인 포획 항체가 사용됨으로써 BCR-ABL 융합 단백질이 포획된다. BCR-ABL이 BCR-N과 BCR-N에 특이적인 포획 항체 사이의 결합을 통해 포획되면, BCR-ABL의 전체 농도가 측정되고(340), 활성화된 BCR-ABL(350) 또한 측정된다. 몇몇 구현예에서, 촉진 모이어티 (예를 들면, GO)는 ABL의 카르복실-말단 영역 (ABL-C)에 특이적인 항체에 커플링되고, 신호 증폭쌍의 제1 일원 (예를 들면, HRP)은 촉진 모이어티-결합 항체에 의해 인식되는 것과는 다른 에피토프에서 ABL-C에 특이적인 항체에 커플링된다. 특정 예에서, 신호 증폭쌍-커플링 항체는 그것의 활성화 상태와 무관하게 ABL-C에 결합하는 활성화 상태-비의존성 항체이고, 그것에 의해 BCR-ABL(340)의 전체 농도가 측정된다. 특정 다른 예에서, 상기 신호 증폭쌍-커플링 항체는 인산-ABL-C (예를 들면, pY245, pY412)에 결합하는 활성화 상태-의존성 항체이고, 그것에 의해 활성화된 BCR-ABL (350)가 측정된다. 일 선택적인 구현예에서, 상기 촉진 모이어티 (예를 들면, GO)는 BCR-ABL 포획 항체에 의해 인식되는 것과는 다른 에피토프에서 BCR-N에 특이적인 항체에 커플링되고, 신호 증폭쌍의 제1 일원 (예를 들면, HRP)은 ABL-C에 특이적인 항체에 커플링된다. 신호 증폭쌍-커플링 항체는 본 명세서에 기술된 활성화 상태-비의존성 항체 또는 활성화 상태-의존성 항체일 수 있다.
몇몇 구현예에서, 전장 ABL 단백질은 부가적으로 또는 선택적으로 전장 ABL (330)의 아미노-말단 영역에 특이적인 디플레이션 태그를 사용함으로써 BCR-ABL 발현 및/또는 활성화의 포획 및 검출 이전에 환자 샘플로부터 제거될 수 있다. 그러한 디플레이션 태그의 비-제한적 예는 전장 ABL의 아미노-말단 영역에 특이적인 항체가 부착된 비드(32la)이다. 이러한 구현예에서, BCR-ABL가 ABL-C와 ABL-C에 특이적인 포획 항체 사이의 결합에 의해 포획되면, BCR-ABL의 전체 농도가 측정되고(360), 그리고 활성화된 BCR-ABL (370) 또한 측정된다. 몇몇 구현예에서, 상기 촉진 모이어티 (예를 들면, GO)는 BCR-ABL 포획 항체에 의해 인식되는 것과는 다른 에피토프에서 ABL-C에 특이적인 항체에 커플링되고, 신호 증폭쌍의 제1 일원 (예를 들면, HRP)은 BCR-N에 특이적인 항체에 커플링된다. 특정 예에서, 상기 촉진 모이어티-커플링 항체는 그것의 활성화 상태와 무관하게 ABL-C에 결합하는 활성화 상태-비의존성 항체이고, 그것에 의해 BCR-ABL (360)의 전체 농도가 측정된다. 특정 다른 예에서, 촉진 모이어티-커플링 항체는 인산-ABL-C (예를 들면, pY245, pY412)에 결합하는 활성화 상태-의존성 항체이고, 그것에 의해 활성화된 BCR-ABL (370)가 측정된다.
구현예에서, 촉진 모이어티가 GO이고, 신호 증폭쌍의 제1 일원이 HRP인 경우, GO-커플링 항체와 HRP-커플링 항체의 결합은 GO 모이어티 (즉, H202)에 의해 발생된 신호가 HRP 모이어티에 채널링된 수 있도록, HRP 모이어티에 충분히 근접한 내부에 GO 모이어티를 제공함으로써, 검출가능한 및/또는 증폭가능한 신호를 발생시킨다. 본 명세서에 기술된 방법에서 사용된 바와 같이, 근접 채널링의 이점은 전체 또는 활성화된 BCR-ABL 단백질 수준과 상관관계에 있는 단일의 검출가능한 신호가 모든 3개의 항체 (예를 들면, 포획 항체, 촉진 모이어티-결합 항체, 및 신호 증폭쌍-결합 항체)의 결합에 의해서만 발생하는 것이므로, 증가된 검정 특이성, 낮은 백그라운드 및 단순화된 검출을 제공한다.
접합 항체를 사용하는 BCR-ABL (410)의 존재 (전체 수준) 및/또는 활성화 상태 (인산화 수준)을 검출하는 다른 구현예(400)는 도 3B에 예시되어 있다. 다시, 비드 (421a 및/또는 421b)는 전장 및/또는 ABL 단백질을, 예를 들면, 각각 그들의 카복실- 및 아미노-말단까지 전장를 제거하기 위해 사용된다. 따라서, 고체 지지체 상에 고정된 특이 결합 모이어티를 사용하여 BCR-ABL의 N-말단 부분을 포획함으로써, BCR-ABL의 전체 농도가 측정되고(440), 그리고 활성화된 BCR-ABL(450)가 또한 측정된다. 전체 BCR-ABL (460) 및 활성화된 단백질 (470)은 또한 전체 BCR-ABL 수준을 측정하기 위한 접합 항체를 사용하거나 활성화된 BCR-ABL 수준을 측정하기 위한 ABL 인산화-특이적 항체를 사용하여 ABL-C를 포획함으로써 측정될 수 있다.
특히, 도 3B(440)는 혈청과 같은 생물학적 샘플 내에 존재하는 BCR-ABL의 전체 양이 (i) BCR의 아미노-말단 영역(BCR-N)과 ABL의 카르복실-말단 영역(ABL-C) 사이의 융합체 부위 또는 지점에 특이적인 제1 검출 항체 (즉, 접합 항체), 및 (ii) ABL-C에 특이적인 제2 검출 항체와 포획된 분석물을 접촉시킴으로써 검출될 수 있음을 나타낸다. 제1 및 제2 검출 항체는 모두 그것의 활성화 상태에 비의존적인 BCR-ABL에 결합한다. 제1 검출 항체 (즉, 접합 항체)는 글루코스 옥시다제 (GO)로 표지되고 제2 검출 항체는 호스라디시 퍼옥시다제 (HRP)로 표지된다. BCR-ABL 융합 단백질에 제1 및 제2 검출 항체의 결합은 GO 모이어티 (즉, H202)에 의해 발생된 신호가 HRP 모이어티에 채널링될 수 있도록, HRP 모이어티에 충분히 근접한 내부에 GO 모이어티를 제공함으로써, 검출가능하고 및/또는 증폭가능한 신호를 발생시킨다.
도 3B(450)는 혈청과 같은 생물학적 샘플 내에 존재하는 활성화된 BCR-ABL의 양이 (i) BCR-N와 ABL-C 사이의 융합제의 부위 또는 지점에 특이적인 제1 검출 항체 (즉, 접합 항체), 및 (ii) BCR-ABL의 활성화된 (예를 들면, 인산화된) 형태에 특이적인 제2 검출 항체와 포획된 분석물을 접촉시키는 것에 의해 검출될 수 있음을 나타낸다. 제1 검출 항체는 그것의 활성화 상태와 비의존적으로 BCR-ABL에 결합하는 반면, 제2 검출 항체는 융합 단백질의 ABL-C 도메인 상에 존재하는 활성화 (예를 들면, 인산화) 지점에 결합한다. 제1 검출 항체 (즉, 접합 항체)는 글루코스 옥시다제 (GO)로 표지되고, 그리고 제2 검출 항체는 호스라디시 퍼옥시다제 (HRP)로 표지된다. BCR-ABL 융합 단백질에 제1 뿐만 아니라 제2 검출 항체의 결합은 GO 모이어티 (H202) 에 의해 발생된 신호가 HRP 모이어티에 채널링될 수 있도록 HRP 모이어티에 충분히 근접한 내부에 GO 모이어티를 제공함으로써, 검출가능하고 및/또는 증폭가능한 신호를 발생시킨다.
구현예에서, 단계 (c) 및 (d)가 ELISA를 포함하는 경우, 상기 ELISA는 샌드위치 ELISA를 포함할 수도 있다. 임의의 적합한 항체쌍이 샌드위치 ELISA 내의 항체를 포획하고 검출하기 위하여 사용될 수도 있다. 당해 기술분야의 당업자는 상기 검정법에 적당한 항체쌍을 어떻게 선택해야 하는지 이해할 것이다. 일반적으로,제1 (포획) 항체의 결합이 제2 (검출) 항체의 결합을 방해하지 않도록, 다른 에피토프에서, 목적 표적물질, 예를 들면 BCR-AB에 결합하는, 2개의 항체가 선택된다. 바람직한 구현예에서, 제1 (포획) 항체는 제1 전장 단백질의 제2의, 다른 도메인 (예를 들면, BCR-N)에 결합하고 그리고 제2 (검출) 항체는 제2의, 다른 전장 단백질의 제1 도메인 (예를 들면, ABL-C)에 결합한다. 특정 예에서, 검출 항체는 복합체의 검출에 도움을 주는 효소, 예를 들면 호스라디시 퍼옥시다제 (HRP) 또는 알칼리성 포스파타제(AP)에 컨쥬게이트될 것이다. 다른 구현예에서, 검출 항체에 결합하는, 효소 (예를 들면, HRP 또는 AP)에 컨쥬게이트되는 제2 항체가 상기 분석법에서 사용될 수도 있다. 일반적으로, 상기 복합체는 그 다음 발광 기질, 예를 들면 Ultra LITE™ (NAG Research Laboratories); SensoLyte® (AnaSpec); SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Scientific); SuperSignal ELISA Pico Chemiluminescent (Thermo Scientific); 및 CPSD (디소듐 3-(4-메톡시스피로(l,2-디옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트리시클로[3.3.1.13,7]데칸}-4-일)페닐 포스페이트; Tropix, Inc)의 사용에 의해 검출될 것이다. 상기 CPSD 기질은 예를 들면, ELISA-Light™ System (Applied Biosystems)와 같은 화학발광 검출 시스템에서 발견될 수 있다. 일 바람직한 구현예에서, 상기 BCR-ABL 샌드위치 ELISA는 포획 항체로서 항-BCR-N 항체 및 검출 항체로서 HRP-컨쥬게이트된 항-ABL-C 항체의 사용을 포함하는 것으로, 여기서 상기 포획 항체는 마이크로플레이트 웰과 같은 고체 지지체 상에 고정되고, 여기서 상기 검출 항체는 활성화 상태-비의존성 항체 또는 활성화 상태-의존성 (예를 들면, 인산-특이적) 항체를 포함할 수도 있다.
도 3C는 BCR-ABL (510)의 존재 (전체 수준) 및/또는 활성화 상태 (인산화 수준)을 검출하기 위한 예시적인 샌드위치 ELISA 구현예(500)을 나타낸다. 비드 (521a 및/또는 521b)가 전장 BCR 및/또는 ABL 단백질을 예를 들면, 각각 그들의 카르복실- 및 N-말단 까지 제거하기 위하여 사용된다. 따라서, ELISA를 사용하고, 특이적 결합 모이어티를 이용하여 BCR-ABL의 N-말단 부분을 포획함으로써, BCR-ABL의 전체 농도가 측정되고(540), 그리고 활성화된 BCR-ABL(550)가 또한 측정된다. 전체 BCR-ABL (560) 및 활성화된 단백질(57)은 또한 ABL-C을 포획한 후 상기 포획된 BCR-ABL 융합 단백질을 ELISA을 사용하여, 각각 BCR-N에 특이적인 검출 항체 또는 ABL-C 상의 인산화 지점에 특이적인 검출 항체와 접촉시킴으로써 측정될 수 있다.
구현예에서, 단계 (c) 및 (d)가 유세포 검정법(FCM)을 포함하는 경우, 상기 FCM 검정법은 형광-활성 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting, FACS) 검정법을 포함할 수도 있다. 유세포 분석기는 액체의 흐름에서 미세크기 입자들을 부유시키고, 전기 검출 장치에 의해 그것들을 통과시킴으로써, 세포와 같은 미세크기 입자들을 덧셈하고 조사하기 위한 기술이다. 유세포 분석기는 2개당 수천개의 입자들까지의 물리적 및/또는 화학적 특성을 동시에 다중파라미터 분석을 가능하게 한다. 유세포 분석기에서, 단일 파장의 라이트 (일반적으로 레이저 빛) 빔은 액체의 유체역학적으로-집중되는 흐름을 향한다. 많은 검출기들은 흐름이 라이트 빔:라이트 빔에 수평한 하나 (전방 산란 또는 FSC) 및 그것에 수직인 여러개 (사이드 산란 (SSC) 및 일 또는 그 이상의 형광 검출기)를 통과하는 지점을 목표로 한다. 빔을 통과하는 약 0.2 내지 150 마이크로미터의 각각의 부유된 입자는 광산을 산란하고, 그리고 입자 내에서 발견되거나 입자에 부착되는 형광 화학물질은 라이트 소스 보다 긴 파장에서 발광 라이트로 여기될 수도 있다. 산란된 및 형광 라이트의 조합은 검출기에 의해, 그리고 각각의 검출기에서 밝은 변동을 분석하는 것에 의해 선택되고, 그리고 각각의 개별적인 입자의 물리적 및 화학적 구조에 대한 다양한 종류의 정보를 도출가능하다. FSC는 세포 부피와 상관관계가 있고, SSC는 입자의 내부 복잡성에 의존한다. 몇몇의 유세포 분석기는 형광의 필요성이 제거되어 측정을 위해 라이트 산란 만을 사용하는 반면, 다른 유세포 분석기는 각각의 개별적인 입자의 형광, 산란된 라이트, 및 전이된 빛을 형성한다.
FACS는 특수화된 유세포 분석기의 종류이다. 그것은 입자들의 이종 혼합물을 각 입자의 특이적 라이트 산란 및 형광 특징을 바탕으로, 동시에 한 입자를 2 또는 그 이상의 용기 내로 분류하기 위한 방법을 제공한다. 그것은 개별적인 입자들로부터의 형광 신호에 대해 신속하고, 객관적이고 정량적인 기록 뿐만 아니라 특정의 관심 입자의 물리적 분리를 제공하기 때문에, 유용한 과학적 기구이다. 입자 부유물은 액체의 좁고, 빠르게 흐르는 흐름의 중심에서 부유된다. 상기 흐름은 그것들이 그것들의 직경에 대한 입자 사이에서 크게 분리되도록 정렬된다. 진공 매카니즘은 입자들의 흐름을 개별적인 액적으로 분해시킨다. 상기 시스템은 액적 당 하나 이상의 입자의 낮은 가능성이 존재하도록 조절된다. 흐름이 액적으로 분해되기 바고 직전에, 각각의 입자의 목적 형광 특성이 측정되는, 형광 측정 스테이션을 통과한다. 전기 전하 링은 흐름이 액적으로 분해되는 지점에 바로 위치된다. 전하는 형광 강도 측정 직전을 기준으로 링에 위치되고, 그리고 반대 전하는 그것이 흐름으로부터 분해될 때 액적으로 포획된다. 하전된 액적은 그것들의 전하를 기준으로 용기 내로 액적을 전환시키는 정전기 편향 시스템을 통하여 떨어진다. 몇몇 시스템에서, 전하는 직접 상기 흐름에 적용되고, 그리고 분해된 액적은 흐름과 동일한 신호의 전하를 보유한다. 그 다음, 상기 흐름은 액적이 분해된 이후에 중성으로 다시 되돌아간다. FACS 검정법은 BD Biosciences (San Jose, CA)로부터 이용가능한 FACS Calibur 유세포 분석기를 사용하여 수행될 수도 있다.
특정 구현예에서, FACS 분석기는 제1 (포획) 항체가 제2 (검출) 항체를 방해하지 않도록, 다른 에피토프에서, 목적 표적, 예를 들면 BCR-ABL에 결합하는 2개의 항체를 사용하여 수행된다. 바람직한 구현예에서, 상기 제1 (포획) 항체는 제1 전장 단백질의 제2의, 다른 도메인 (예를 들면, BCR-N)에 결합하고, 그리고 제2 (검출) 항체는 제2의, 다른 전장 단백질의 제1 도메인 (예를 들면, ABL-C)에 결합한다. 특정 구현예에서, 상기 포획 항체는 폴리스티렌 비드와 같은 비드에 부착되고, 그리고 상기 비드는 내부가 형광물질로 염색된다. 몇몇 구현예에서, 검출 항체는 복합체의 검출을 돕기 위하여, 형광물질 또는 효소에 컨쥬게이트된다. 상기 검출 항체는 활성화 상태-비의존성 항체 또는 활성화 상태-의존성 (예를 들면, 인산-특이적) 항체를 포함할 수도 있다. 다른 구현예에서, 검출 항체에 결합하는, 형광물질, 효소, 또는 다른 검출 모이어티가 상기 검정법에서 사용될 수도 있다. 일반적으로, 상기 복합체는 그 다음 상기 기술한 바와 같이 검출될 수도 있다.
구현예에서, 단계 (c) 및 (d)가 태그-분류 검정법을 포함하는 경우, 상기 태그-분류 검정법은 Luminex® 검정법을 포함할 수도 있다. Luminex® 검정법은 예를 들면, Invitrogen Corporation (Carlsbad, CA)로부터 이용가능하다. 몇몇 예에서, 상기 태그-분류 검정법은 멀티플렉스 Luminex® 검정법 포맷을 포함한다. 일반적으로, 제1 (포획) 항체의 결합이 제2 (검출) 항체를 방해하지 않도록, 다른 에피토프에서, 목적 표적, 예를 들면 BCR-ABL에 결합하는, 2개의 항체가 선택된다. 바람직한 구현예에서, 제1 (포획) 항체는 제1 전장 단백질 (예를 들면, BCR-N)의 제2의, 다른 도메인에 결합하고, 그리고 제2 (검출) 항체는 제2의, 다른 전장 단백질의 제1 도메인 (예를 들면, ABL-C)에 결합한다. 특정 구현예에서, 상기 포획항체는 폴리스티렌 비드에 부착되고, 그리고 상기 비드는 내부가 적색 및 다른 강도를 갖는 적외선 형광물질로 염색된다. 몇몇 구현예에서, 검출 항체는 복합체의 검출을 돕기 위하여, 형광물질 또는 효소에 컨쥬게이트된다. 상기 검출 항체는 활성화 상태-비의존성 항체 또는 활성화 상태-의존성 (예를 들면, 인산-특이적) 항체를 포함할 수도 있다. 다른 구현예에서, 검출 항체에 결합하는, 형광물질, 효소, 또는 다른 검출 모이어티가 상기 검정법에서 사용될 수도 있다. 일반적으로, 상기 복합체는 그 다음 Luminex® 100™ 또는 200™ 검출 시스템과 같은 검출 시스템의 사용에 의해 검출될 수 있는 것으로, 여기서 상기 비드는 각각의 분석물의 분류화 및 정량화를 위한 이중 레이저에 의해 단일-파일 내에서 판독될 수 있다.
도 3D는 BCR-ABL (610)의 존재 (전체 수준) 및/또는 활성화 상태 (인산화 수준)를 검출하기 위한 예시적인 유세포 분석기 및 태그-분류 구현예 (600)를 나타낸다. 비드 (621a 및/또는 621b)는 전장 BCR 및/또는 ABL 단백질을 각각, 그들의 카르복실- 및 N-말단까지 제거하기 위해 사용된다. 따라서, 특이적 포획 모이어티를 사용하여 BCR-ABL의 N-말단 부분을 포획하기에 특이적인 비드 및 ABL의 C-말단에 특이적인 비드가 사용된다. 전체 단백질 (640)은 2개의 특이적 태그 또는 색채 비드로 분자를 덧셈하는 것에 의해 측정된다. 마찬가지로, 단백질의 활성화된 양은 ABL의 인산화된 부분 및 BCR-ABL의 N-말단에 특이적인 포획 항체로 비드를 사용하는 것에 의해 측정될 수 있다. 이러한 2개의 특이적 색채 비드 또는 태그를 덧셈함으로써, 활성화된 BCR-ABL의 양이 측정된다 (65). 전체 BCR-ABL (660) 및 활성화된 단백질 (670)은 또한 특이적 포획 비드로 ABL의 C-말단을 포획하고, 포획된 BCR-ABL 융합 단백질를 BCR-N에 특이적인 비드 또는 ABL의 인산화된 부분에 특이적인 비드로 접촉시키는 것에 의해 측정될 수 있다. 이러한 2개의 특이적 색채 비드 또는 태그를 덧셈하는 것에 의해, 전체 (660) 또는 활성화된 (670) BCR-ABL 단백질의 양이 측정된다.
도 3A-3D에 나타낸 바와 같이 BCR-ABL 전체 및/또는 활성화된 단백질 수준을 측정하는 방법에서 사용하기에 적합한 항체의 비-제한 예는 하기의 표 1에 설명된 것들을 포함한다.
표 1: 본 발명의 BCR-ABL 분석법을 위한 예시적인 항체
Figure pct00001
종양-특이적 BCR-ABL 융합 단백질 뿐만 아니라 비-종양원성 천연 전장 BCR 또는 ABL 단백질에 결합하는 항체의 추가적인 예는 문헌 [Dhut et al, Oncogene, 3:561-6 (1988)]에 기술된 b2a2 p210 BCR-ABL, b3a2 p210 BCR-ABL, pl60 BCR, 및 pl30 BCR 단백질을 인식하는 BCR b2-에피토프 특이적 모노클로날 항체 7C6; 미국 특허 제5,369,008호 및 제6,610,498호에 기술된 ela2 pl90 BCR-ABL, b2a2, b3a2, 및 pl45 ABL 단백질을 인식하는 SH2 도메인-특이적 항체 8E9; 미국 특허 제6,107,457호에 기술된 BCR-특이적 항체의 아미노-말단; 및 Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA)로부터의 ABL-특이적 (24-11) 마우스 모노클로날 항체 #SC-23의 카르복실-말단을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
BCR-ABL 키메라 단백질 내부의 융합체 지점 또는 부위에 결합하기에 적합한 접합 항체의 예는 Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA)로부터 이용가능한 BCR-ABL b2a2 접합-특이적 (L99H4) 마우스 모노클로날 항체 #3908 , 미국 특허 공개 제20050214301호에 기술된 p210 BCR-ABL 융합 단백질-특이적 단리된 항체, 문헌 [van Denderen et al. , Leukemia, 6:1107-12 (1992)]에 기술된 BCR-ABL b3a2 접합-특이적 폴리클로날 항체 BP-2, 및 문헌 [van Denderen et al, Leukemia, 8:1503-9 (1994)]에 기술된 BCR-ABL ela2 접합-특이적 모노클로날 항체 (ER-FP1)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. BCR-ABL 접합 항체는 Ph-양성 백혈병에 관여하는 BCR-ABL 융합 단백질의 검출에 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 구현예에서, 백혈구 (예를 들면, 만성 골수 백혈병 (CML) 세포)와 같은 목적의 세포를 회수하거나 단리하고, 세포 회수 또는 단리 이후의 임의의 세척 단계 없이, 항-CD45 항체 및/또는 항-CD 15 항체로 자석 비드 포획을 사용하는 것에 의해, 신선하게 수거되거나 동결된 골수 (예를 들면, 골수 흡인물) 또는 전혈 샘플로부터의 세포 추출액을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 따라서, 상기 수득된 세포 추출액은 BCR-ABL, 그것의 기질, 그것의 경로, 또는 그것의 조합과 같은 일 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 수준을 위해 분석될 수 있다. 특정 이론에 구애됨이 없이, 세포 단리 이후의 임의의 세척 단계의 요구를 제거하는 것은 목적 세포가 타이로신 키나제 억제제와 같은 항암 약물의 세포내 농도를 변화시킴이 없이 혈액 또는 골수 샘플로부터 회수될 수 있기 때문에 유리하다. 하기의 실시예 9에서 설명할 바와 같이, 본 명세서에 기술된 임의의 세척 단계 없이 세포 단리는 단리 이후에 세포를 세척 (예를 들면, 비드-결합 세포의 세척)하는 기술-수용 관행과 대조되고 세포 내부의 타이로신 키나제 억제제 (예를 들면, Gleevec®, Tasigna®, Sprycel®, 등)와 같은 항암 약물의 실질적인 희석 없이 회수된 세포로부터의 세포 추출액을 제공한다.
선택적인 구현예에서, 본 발명의 방법은 종양원성 융합 단백질의 내부에서 발견된 염기서열 또는 도메인을 함유하는 천연 전장 단백질 (예를 들면, 전장 BCR 및/또는 ABL) 중 하나 또는 모두와 조합된 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL)의 전체 양 및/또는 활성화 상태의 연속적 검출을 제공한다. 일 특정 구현예에서, 본 발명은 혈액 또는 골수 흡인물 샘플과 같은 생물학적 샘플 내의 전체 BCR-ABL 수준 뿐만 아니라 전체 천연 전장 BCR 및/또는 ABL 수준의 검출 및/또는 측정을 가능하게 한다. 특정 구현예에서, 천연 단백질 (예를 들면, 전장 BCR 및/또는 ABL) 수준은 단일 패드 상의 멀티플렉스된 방법으로 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL) 수준과 함께 측정된다. 이러한 구현예에서, 천연-전장 단백질은 이러한 분자의 수준이 동일한 패드 상에서 측정될 수 있도록, 종양원성 융합 단백질과 함께 유리하게 단리될 수 있다.
하기의 실시예 10에서 설명될 바와 같이, 본 발명의 방법에 대한 대체적인 구현예는 전체 BCR-ABL 수준 뿐만 아니라 전체 천연 전장 BCR 또는 ABL 수준을 검출하고 그리고/또는 측정하기 위해 사용될 수 있고, 그리고 전체 천연 전장 BCR 또는 ABL 수준에 대한 전체 BCR-ABL 수준의 비율은 계산될 수 있다. 몇몇 예에서, 천연 전장 BCR 또는 ABL 수준에 대한 BCR-ABL 수준의 비율은 예를 들면, 주요 분자 반응 (MMR), 완전한 분자 반응 (CMR), 완전한 세포유전학적 반응 (CCyR), 및 그것의 조합과 같은 반응 지시자의 보다 정확한 측정을 제공한다. 다른 예에서, 본 발명의 방법에 대한 이러한 대체적인 구현예는 치료요법의 기능 (예를 들면, 타이로신 키나제 억제제 치료요법)으로서 천연 전장 BCR 또는 ABL (예를 들면, 전장 BCR 또는 ABL 수준에 대한 전체 BCR-ABL 수준의 비율을 계산함으로써)과 같은 대조군에 대한 BCR-ABL의 발현에서의 변화를 관찰하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 특히 악성혈액 종양과 같은 암 (예를 들면, 백혈병, 림프종, 등)이 발전되고, 암을 가질 것으로 의심될 위험에 있거나 암으로 진단된 환자 내의 BCR-ABL과 같은 일 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질의 활성화 (예를 들면, 인산화) 상태를 측정하기에 유용하다. 특정 예에서, 본 발명의 방법은 환자가 종양원성 융합 단백질의 활성화된 형태를 나타내는지 여부를 측정하기 위하여 (예를 들면, BCR-ABL-양성 환자) 활성화된 (예를 들면, 인산화된) 종양원성 융합 단백질 수준을 측정함으로써 환자 내의 암의 진단을 보조하거나, 돕거나, 또는 용이하게 한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 치료를 최적화하고, 독성을 경감시키고, 그리고/또는 치료학적 치료의 효능을 관찰하기 위하여 종양원성 융합 단백질의 활성화 형태를 나타내는 것으로 이미 측정된 환자에서 수행된다. 이러한 구현예의 일 특정 측면에서, 활성화된 BCR-ABL 단백질의 수준은 치료를 최적화하거나, 독성을 경감시키거나 그리고/또는 치료학적 치료의 효능을 관찰하기 위하여 치료 과정 동안 (예를 들면, 환자가 Gleevec®, Tasigna®, Sprycel®, 등과 같은 항암 약물 치료를 받는 동안) BCR-ABL-양성 환자에서 측정될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 전체 및 활성화된 (예를 들면, 인산화된) 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL) 수준은 본 발명의 항체-기반 검정법에 따라 측정되고, 그리고 전체 종양원성 융합 단백질 수준에 대한 활성화된 것의 비율 (예를 들면, 인산/전체 BCR-ABL 단백질 수준)은 환자에 대한 치료요법 과정을 평가하기 위하여, 예를 들면 인산/전체 종양원성 융합 단백질 수준의 비율을 이른 시간 (예를 들면, 항암 약물 치료 동안의 이른 시간 또는 항암 약물 치료 이전의 시점)에 환자로부터 동일하게 계산된 비율과 비교함으로써 계산되고 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 전체 종양원성 융합 단백질 수준에 대한 활성화된 것의 비율 (예를 들면, 인산/전체 BCR-ABL 단백질 수준의 비율)은 종양원성 융합 단백질 내부에서 발견되는 염기서열 또는 도메인을 함유하는 천연 전장 단백질 (예를 들면, BCR-ABL 융합 단백질에 대한 BCR 및/또는 ABL) 중 하나 또는 모두와 같은 일 또는 그 이상의 조절 단백질의 수준에 대해 계산될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 조절 단백질의 전체 수준은 항암 약물 치료에 의해 영향을 받거나 실질적으로 바뀌지 않는다.
본 발명의 방법은 또한 악성혈액 종양 (예를 들면, 백혈병, 림프종, 등)과 같은 암으로 발전될 위험에 있거나, 상기 암을 가질 것으로 의심되거나, 상기 암으로 진단된 환자에서 BCR-ABL와 같은 종양원성 융합 단백질에 관여하는 하나 또는 다중의 경로 내의 일 또는 그 이상의 신호 전달 분자의 활성화 (예를 들면, 인산화) 상태를 측정하기에 특히 유용하다. 예시적인 신호 전달 분자는 예를 들면, CRKL, JAK2, STAT5, Src, FAK, c-ABL, c-CBL, SHC, SHP-2, VAV, BAP-1, 및 그것의 조합물과 같은 BCR-ABL 기질을 포함한다. 특정 예에서, 본 발명의 방법은 환자가 종양원성 융합 단백질의 활성화된 형태 (예를 들면, BCR-ABL-양성 환자) 및/또는 상기 경로에서 일 또는 그 이상의 신호 전달 분자의 활성화된 형태를 나타내는지 여부를 측정하기 위하여, 활성화된 (예를 들면, 인산화된) 종양원성 융합 단백질 수준 (예를 들면, 인산-BCR-ABL 수준) 및 활성화된 (예를 들면, 인산화된) 신호 전달 분자 수준 (예를 들면, 인산-CRKL, 인산-JAK2, 인산-STAT5, 등의 수준)을 측정함으로써 환자 내의 암의 진단을 보조하거나, 돕거나, 또는 촉진시킨다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 치료를 최적화하거나, 독성을 경감시키거나, 그리고/또는 치료학적 치료의 효능을 관찰하기 위하여 종양원성 융합 단백질의 활성화된 형태를 나타내는 것으로 이미 결정된 환자에서 수행된다. 이러한 구현예의 일 특정 측면에서, 활성화된 BCR-ABL 단백질 및 일 또는 그 이상의 신호 전달 경로 성분 (예를 들면, CRKL, JAK2, STAT5, Src, FAK, 등)의 수준은 치료요법을 최적화하고, 독성을 겸감시키고, 및/또는 치료학적 치료의 효능을 관찰하기 위하여, 치료 과정 동안 (환자가 예를 들면, Gleevec®, Tasigna®, Sprycel®, 등과 같은 항암 약물 치료요법을 받는 동안) BCR-ABL-양성 환자에서 측정될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 전체 및 활성화된 (예를 들면, 인산화된) 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR- ABL) 수준은 본 발명의 항체-기반 검정법에 따라 측정되고, 그리고 전체 종양원성 융합 단백질 수준 (예를 들면, 인산/전체 BCR-ABL 단백질 수준)에 대한 활성화된 것의 비율은 환자에 대한 치료요법 과정을 평가하기 위하여, 예를 들면, 인산/전체 종양원성 융합 단백질 수준의 비율을 이른 시간 (예를 들면, 항암 약물 치료요법 동안 이른 시간 또는 항암 약물 치료 요법 이전의 시점)에 환자에 대해 동일하게 계산된 비율과 비교하는 것에 의해, 계산되고 (예를 들면, 일 또는 그 이상의 조절 단백질의 수준에 대하여) 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 전체 및 활성화된 신호 전달 경로 성분 수준은 측정되고, 전체 신호 전달 경로 성분 수준에 대한 활성화된 것의 비율 (예를 들면, 인산/전체 CRKL, JAK2, 또는 STAT5 단백질 수준의 비율)이 계산될 수 있고 (예를 들면, 일 또는 그 이상의 조절 단백질의 수준에 대하여) 그리고 예를 들면, 신호 전달 경로 성분 수준의 인산/전체 비율을 이른 시간 (예를 들면, 항암 약물 치료요법 동안의 이른 시간 또는 항암 약물 치료요법 이전의 시점)에 환자에 대해 동일하게 계산된 비율을 비교함으로써, 환자를 위한 치료 과정을 평가하기 위하여 사용될 수 있다. 특정 예에서, 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL)의 발현 수준은 CRKL, JAK2, STAT5, Src, FAK, 등과 같은 하류(downstream) 신호 전달 성분의 활성화 (예를 들면, 인산화)의 수준과 상관관계에 있거나 또는 관련된다.
일 특정 측면에서, 본 발명은 치료요법을 최적화하고 및/또는 암을 갖는 환자에서 독성을 경감시키고 그리고 암의 치료를 위한 치료요법 과정을 공급받는 방법을 제공하는바, 상기 방법은:
(a) 항암 약물 (예를 들면, Gleevec®, Tasigna®, Sprycel®, 등과 같은 일 또는 그 이상의 타이로신 키나제 억제제)의 투여 이후에 암 세포를 단리하는 단계;
(b) 상기 단리된 암세포를 용해시킴으로써 세포 추출액을 생산하는 단계;
(c) 본 명세서에 기술된 분석법을 사용하여 세포 추출액 내의 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 수준을 측정하는 단계; 및
(d) 종양원성 융합 단백질의 측정된 발현 및/또는 활성화 수준을 치료요법 과정 중 이른 시간에 측정된 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 수준과 비교하는 단계; 및
(e) 단계 (d)로부터의 비교를 바탕으로 환자에게 치료요법 과정의 후속 용량 또는 치료요법의 다른 과정을 환자에게 투여해야 하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 종양원성 융합 단백질의 발현 수준 및 활성화 수준은 세포 추출액에서 예를 들면, 본 명세서에 기술된 근접 검정법 중 하나를 수행함으로써 측정된다. 특정 바람직한 구현예에서, 종양원성 융합 단백질은 BCR-ABL를 포함한다. 특정 다른 바람직한 구현예에서, 피검체는 종양원성 융합 단백질의 활성화된 형태를 나타낸다. 특정 바람직한 구현예에서, 피검체는 BCR-ABL-양성 (예를 들면, 피검체는 항암 약물의 투여 이전에 인산-BCR-ABL의 검출가증한 수준을 갖는 것으로 측정되었다)이다.
몇몇 구현예에서, 전체 및 활성화된 (예를 들면, 인산화된) 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL) 수준은 본 발명의 항체-기반 검정법에 따라 세포 추출액 내에서 측정되고, 전체 종양원성 융합 단백질 수준에 대한 활성화된 것의 비율 (예를 들면, 인산/전체 BCR-ABL 단백질 수준의 비율)을 계산하여 예를 들면, 종양원성 융합 단백질의 인산/전체 수준을 이른 시간 (예를 들면, 항암 약물 치료요법 중 이른 시간 또는 항암 약물 치료요법 이전의 시점)에 상기 환자에서 동일하게 계산된 비율과 비교함으로써, 환자에 대한 치료요법 과정을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 하기의 실시예 6에 예시되어 있는 바와 같이, 항암 약물 억제시 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL) 수준의 인산/전체 비율은 항암 약물 치료시의 활성화된 (예를 들면, 인산화된) 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, 인산-BCR-ABL)의 억제 백분율과 상관관계에 있다 (예를 들면, 도 14C, 15C, 및 16C 참고). 다른 구현예에서, 전체 종양원성 융합 단백질 수준에 대한 활성화된 것의 비율 (예를 들면, 인산/전체 BCR-ABL 단백질 수준의 비율)은 예를 들면, 종양원성 융합 단백질 내부에서 발견되는 염기서열 또는 도메인을 함유하는 천연 전장 단백질 (예를 들면, BCR-ABL에 대한 BCR 및/또는 ABL) 중 하나 또는 모두와 일 또는 그 이상의 조절 단백질의 수준에 따라 계산될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 조절 단백질의 전체 수준은 항암 약물 치료요법에 의해 영향을 받거나 실질적으로 바뀌는 것은 아니다.
치료요법을 최적화하기 위하여 본 명세서에 기술된 방법의 특정 측면에서, 환자내 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL)의 약 50% 미만의 활성화 (예를 들면, 인산화) 억제는 피검체 내에서 병이 재발하는 것으로부터 암의 위험을 예방하거나 경감시키기 위하여, 치료요법 과정의 후속 용량을 증가시키거나 다른 치료요법 과정 (예를 들면, 현재 치료요법 과정을 다른 항암 약물로 대체함으로써 변경함)을 투여해야할 필요성을 나타낸다. 비-제한적 예로서, 예를 들면, 피검체는 Gleevec® 치료요법을 받을 수 있고, BCR-ABL 융합 단백질의 인산화 수준 중 약 50% 미만의 억제는 Gleevec®의 후속 용량을 증가시키거나 피검체를 Tasigna® 치료요법으로 대체할 것이 필요함을 나타낸다. 예를 들면, 환자에서 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL)의 활성화 (예를 들면, 인산화)의 약 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만의 억제는 치료요법 과정의 후속 용량을 증가시키거나 현재 치료요법 과정을 변경할 것이 필요함을 나타낸다. 몇몇 구현예에서, 종양원성 융합 단백질 수준의 활성화에 대한 백분율 억제는 전체 종양원성 융합 단백질 수준에 대한 활성화된 것의 비율 (예를 들면, 인산/전체 BCR-ABL 단백질 수준)을, 선택적으로 일 또는 그 이상의 조절 단백질 (예를 들면, BCR-AB의 경우 전장 BCR 및/또는 ABL)의 수준과 관련하여 계산하고, 그리고 상기 종양원성 융합 단백질 수준의 인산/전체 비율을 이른 시간 (예를 들면, 항암 약물 치료요법 동안 이른 시간 또는 항암 약물 치료 이전의 시점)에 피검체에 대해 동일하게 계산된 비율과 비교함으로써 측정될 수 있다. 당업자는 현재 치료요법 과정이 예를 들면, 현재 투여 보다 적어도 약 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 100-배 이상 또는 이하의 후속 용량으로 최적화될 수 있도록, 현재 치료요법 과정을 조절하기에 적합한 더욱 높거나 더욱 낮은 용량에 대해 알고 있을 것이다.
치료요법을 최적화하기 위한 방법의 특정 다른 측면에서, 피검체에서 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL) 수준의 약 50% 미만의 활성화 (예를 들면, 인산화) 억제는 현재 치료요법에 대한 환자의 순응 부족 (예를 들면, 환자는 항암 약물을 규칙적으로 또는 의사의 지시에 따라 받아들이지 못함) 및/또는 치료요법 과정과 관련된 부작용 또는 독성의 존재 가능성을 나타낸다. 이러한 구현예에서, 현재 치료요법 과정은 순응을 증가시키거나 그리고/또는 부작용의 위험을 경감시키기 위하여, 순응을 위하여 조심스럽게 관찰 (예를 들면, 의사 또는 다른 도우미에 의해)되거나 다른 치료요법 과정이 투여되어야 할 것 (예를 들면, 현재 치료요법 과정은 다른 항암 약물로 대체됨으로써 변경된다)이 요구된다. 특정 예에서, 피검체 내의 종양원성 융합 단백질의 약 9%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만의 활성화 억제는 치료요법 과정에 대한 환자의 순응 부족 및/또는 치료요법 과정과 관련된 부작용 또는 독성의 가능성을 나타낸다. 몇몇 구현예에서, 종양원성 융합 단백질 수준의 활성화 억제 백분율은 전체 종양원성 융합 단백질 수준 (예를 들면, 인산/전체 BCR-ABL 단백질 수준의 비율)을, 선택적으로 일 또는 그 이상의 조절 단백질 (예를 들면, BCR-ABL의 경우 전장 BCR 및/또는 ABL)의 수준에 대하여 계산하고, 그리고 상기 인산/전체 종양원성 융합 단백질 수준의 비율을 이른 시간 (예를 들면, 항암 약물 치료요법 동안 이른 시간 또는 항암 약물 치료요법 이전의 시점)에서 상기 환자에 대해 동일하게 계산된 비율과 비교함으로써 측정될 수 있다.
치료요법을 최적화하기 위하여 본 명세서에 기술된 방법의 다른 측면에서, 피검체에서 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL)의 약 80%를 초과하는 활성화 (예를 들면, 인산화) 억제는 환자가 정확한 용량에서 정확한 치료요법을 받고 있음을 나타낸다. 특정 예에서, 환자 내의 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL) 수준의 약 81%를 초과하는, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 활성화 (예를 들면, 인산화) 억제는 환자가 정확한 용량에서 정확한 항암 약물 치료요법을 받고 있음을 나타낸다. 몇몇 구현예에서, 종양원성 융합 단백질 수준의 활성화 억제 백분율은 전체 종양원성 융합 단백질 수준에 대한 활성화된 것의 비율 (예를 들면, 인산/전체 BCR-ABL 단백질 수준), 선택적으로 일 또는 그 이상의 조절 단백질 (예를 들면, BCR-ABL의 경우 전장 BCR 및/또는 ABL)에 따라 계산하고, 그 다음 상기 인산/전체 종양원성 융합 단백질 수준의 비율을 이른 시간 (예를 들면, 항암 약물 치료요법 동안 이른 시간 또는 항암 약물 치료요법 이전의 시점)에 상기 피검체에서 동일하게 측정된 비율과 비교함으로서 계산될 수 있다.
관련 측면에서, 본 발명은 치료요법을 최적화시키고, 그리고 또는 암을 갖는 환타 내의 독성을 경감시키고, 그리고 암의 치료 동안 치료 과정을 공급받는 방법을 제공하는바, 상기 방법은:
(a) 항암 약물(예를 들면, Gleevec®, Tasigna®, Sprycel®, 등과 같은 일 또는 그 이상의 타이로신 키나제 억제제)의 투여 이후에 암 세포를 단리하는 단계;
(b) 상기 단리된 세포를 용해함으로써 세포 추출액을 생산하는 단계;
(c) 본 명세서에 기술된 검정법을 사용하여 세포 추출액 내의 종양원성 융합 단백질 및 그것의 경로에서 일 또는 그 이상의 신호 전달 분자의 발현 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 수준을 측정하는 단계; 및
(d) 상기 측정된 종양원성 융합 단백질 및 신호 전달 분자의 발현 및/또는 활성화 수준을 치료요법 과정 동안 이른 시간에 측정된 종양원성 융합 단백질 및 신호 전달 분자의 발현 및/또는 활성화 수준과 비교하는 단계; 및
(e) 단계 (d)로부터의 비교를 바탕으로 환자에 치료요법 과정의 후속 용량또는 환자에게 다른 치료요법 과정을 투여해야 하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
특정 구현에에서, 종양원성 융합 단백질 및 일 또는 그 이상의 신호 전달 분자의 발현 수준 뿐만 아니라 활성화 수준은 예를 들면, 본 명세서에 기술된 근접 검정법을 수행하는 것에 의해, 세포 추출액에서 측정된다. 특정 바람직한 구현예에서, 상기 종양원성 융합 단백질은 CR-ABL를 포함한다. 특정 다른 바람직한 구현예에서, 상기 신호 전달 분자는 예를 들면, CRKL, JAK2, STAT5, Src, FAK, c-ABL, c-CBL, SHC, SHP-2, VAV, BAP-1, 및 그것의 조합과 같은 BCR-ABL 기질을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 피검체는 종양원성 융합 단백질의 활성화된 형태를 나타낸다. 특정 바람직한 구현예에서, 피검체는 BCR-ABL-양성 (예를 들면, 피검체는 항암 약물의 투여 이전에 인산-BCR-ABL의 검출가능한 수준을 갖는 것으로 측정됨)이다.
몇몇 구현예에서, 전체 및 활성화된 (예를 들면, 인산화) 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL) 수준 및 신호 전달 경로 성분 (예를 들면, CRKL, JAK2, STAT5) 수준은 본 발명의 항체-기반 검정법에 따라 세포 추출액에서 측정되고 전체 종양원성 융합 단백질 수준에 대한 활성화된 것의 비율 (예를 들면, 인산화/전체 BCR-ABL 단백질 수준의 비율) 및 전체 신호 전달 경로 성분 수준에 대한 활성화된 것의 비율 (예를 들면, 인산/전체 CRKL, JAK2, 또는 STAT5 단백질 수준)은 예를 들면, 인산/전체 종양원성 융합 단백질 및 신호 전달 경로 성분 수준의 비율을 이른 시간 (예를 들면, 항암 약물 치료요법 동안 이른 시간 또는 항암 약물 치료요법 이전의 시점)에 상기 피검체에서 동일하게 측정된 비율과 비교함으로써, 피검체에 대한 치료요법 과정을 평가하기 위하여 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 전체 종양원성 융합 단백질 수준에 대한 활성화된 것의 비율 (예를 들면, 인산/전체 BCR-ABL 단백질 수준의 비율) 및 전체 신호 전달 분자 수준에 대한 활성화된 것의 비율 (예를 들면, 인산/전체 CRKL, JAK2, 또는 STAT5 단백질 수준의 비율)은 예를 들면, 종양원성 융합 단백질 내에서 발견되는 염기서열 또는 도메인을 함유하는 천연 전장 단백질 (예를 들면, BCR-ABL의 경우 BCR 및/또는 ABL) 중 하나 또는 모두와 같은 일 또는 그 이상의 조절 단백질의 수준에 따라 계산될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 조절 단백질의 전체 수준은 항암 약물 치료요법에 의해 영향을 받거나 실질적으로 변경되는 것은 아니다.
치료요법을 최적화하기 위하여 본 명세서에 기술된 방법의 특정 측면에서, 피검체 내의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL) 수준 및/또는 신호 전달 경로 성분 (예를 들면, CRKL, JAK2, STAT5) 수준의 약 50% 미만의 활성화 (예를 들면, 인산화) 억제는 치료요법 과정의 후속 용량 증가시키거나 피검체의 병의 재발로부터 암의 위험을 예방하거나 경감시키기 위하여 다른 치료요법 과정 (예를 들면, 현재 치료요법 과정을 다른 항암 약물로 대체함으로써 변경함)을 투여해야할 필요성을 나타낸다. 비-제한적 예로서, 예를 들면 환자가 Gleevec® 치료요법을 받는 경우, BCR-ABL 융합 단백질 및/또는 CRKL, JAK2, 및/또는 STAT5과 같은 신호 전달 경로 성분의 50% 미만의 인산화 수준 억제는 Gleevec®의 후속 용량을 증가시키거나 피검체에게 Tasigna® 치료요법으로 변경해야할 필요성이 있음을 나타낸다. 특정 예에서, 피검체 내의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL) 수준 및/또는 신호 전달 경로 성분 (예를 들면, CRKL, JAK2, STAT5) 수준의 약 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%), 15%, 10%, 또는 5% 미만의 활성화 (예를 들면, 인산화) 억제는 치료요법 과정의 후속 용량을 증가시키거나 현재 치료요법 과정을 변경해야 할 필요성을 나타낸다. 몇몇 예에서, 종양원성 융합 단백질 및/또는 신호 전달 분자 수준의 활성화 억제 백분율은 전체 종양원성 융합 단백질 수준에 대한 활성화된 것의 비율 (예를 들면, 인산/전체 BCR-ABL 단백질 수준의 비율) 및/또는 전체 신호 전달 경로 성분 수준에 대한 활성화된 것의 비율 (예를 들면, 인산/전체 CRKL, JAK2, 또는 STAT5 단백질 수준의 비율)을, 임의적으로 일 또는 그 이상의 조절 단백질의 수준 (예를 들면, BCR-ABL의 경우 전장 BCR 및/또는 ABL)에 따라 계산하고, 그리고 상기 계산된 포스포 전체 비율을 이른 시간 (예를 들면, 항암 약물 치료요법 동안 이른 시간 또는 항암 약물 치료요법 이전의 시점)에서 상기 환자에 대해 동일하게 계산된 비율과 비교함으로써 측정될 수 있다. 당해 기술분야에 있는 당업자는 약물 치료요법이 최적화될 수 있도록, 현재 치료요법 과정이 예를 들면, 현재 투여 보다 적어도 약 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 100-배 이상 또는 이하의 후속 용량으로 최적화될 수 있도록, 현재 치료요법 과정을 조절하기에 적합한 더욱 높거나 더욱 낮은 용량에 대해 알고 있을 것이다.
치료요법을 최적화화기 위한 방법의 특정 다른 측면에서, 환자 내의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL) 수준 및/또는 신호 전달 경로 성분 (예를 들면, CRKL, JAK2, STAT5) 수준의 약 50% 미만의 활성화 억제는 치료요법 과정에 대한 환자의 순응의 부족 (예를 들면, 상기 환자는 항암 약물을 정규적으로 또는 의사의 처방에 따라 흡수하지 않는다) 및/또는 치료요법 과정과 관련된 부작용 또는 독성의 존재 가능성을 나타낸다. 이러한 구현예에서, 순응을 증가시키고 그리고/또는 부작용의 위험을 예방하거나 경감시키기 위하여, 현재 치료요법 과정을 순응을 위하여 조심스럽게 관찰 (예를 들면, 의사 또는 다른 도우미에 의해)하거나 다른 치료요법 과정을 투여할 것이 (예를 들면, 현재 치료요법 과정을 다른 항암 약물로 대체함으로써 변경함) 요망된다. 특정 예에서, 환자 내의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL) 수준 및/또는 신호 전달 경로 성분 (예를 들면, CRKL, JAK2, STAT5) 수준의 약 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 또는 5% 미만의 활성화 억제는 치료요법 과정에 대한 환자의 순응 부족 및/또는 치료요법 과정과 관련된 부작용 또는 독성의 존재 가능성을 나타낸다. 몇몇 구현예에서, 종양원성 융합 단백질 및/또는 신호 전달 분자 수준의 활성화 억제 백분율은 전체 종양원성 융합 단백질 수준에 대한 활성화된 것의 비율 (예를 들면, 포스포/전체 BCR-ABL 단백질 수준의 비율) 및/또는 전체 신호 전달 경로 성분 수준에 대한 활성화된 것의 비율 (예를 들면, 인산/전체 CRKL, JAK2, 또는 STAT5 단백질 수준의 비율)을, 임의적으로 일 또는 그 이상의 조절 단백질 (예를 들면, BCR-ABL의 경우 전장 BCR 및/또는 ABL)의 수준에 따라 계산하고, 그리고 상기 계산된 인산/전체 수준을 이른 시간 (예를 들면, 항암 약물 치료요법 동인 이른 시간 또는 항암 약물 치료요법 이전의 시점)에 피검체에 대해 동일하게 특정된 비율과 비교함으로써 측정될 수 있다.
치료요법을 최적화하기 위하여 본 명세서에 기술된 방법의 추가 측면에서, 피검체 내에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상의 이른 시간 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL) 수준 및/또는 신호 전달 경로 성분 (예를 들면, CRKL, JAK2, STAT5) 수준의 약 80%를 초과하는 활성화 (예를 들면, 인산화) 억제는 상기 환자가 정확한 투여로 정확히 치료받고 있음을 나타낸다. 특정 예에서, 피검체 내에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL) 수준 및/또는 신호 전달 경로 성분 (예를 들면, CRKL, JAK2, STAT5) 수준의 약 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%을 초과하는 활성화 (예를 들면, 인산화) 억제는 상기 환자가 정확한 용량으로 정확한 항암 약물 치료를 받고 있음을 나타낸다. 몇몇 구현예에서, 종양원성 융합 단백질 및/또는 신호 전달 분자 수준의 활성화 억제 백분율은 전체 종양원성 융합 단백질 수준에 대한 활성화된 것의 비율 (예를 들면, 인산/전체 BCR-ABL 단백질 수준의 비율) 및/또는 전체 신호 전달 경로 성분 수준에 대한 활성화된 것의 비율 (예를 들면, 인산/전체 CRKL, JAK2, 또는 STAT5 단백질 수준의 비율)을, 임의적으로, 일 또는 그 이상의 조절 단백질 (예를 들면, BCR-ABL의 경우 전장 BCR 및/또는 ABL)의 수준에 따라 계산하고, 그 다음 상기 계산된 인산/전체 비율을 이른 시간 (예를 들면, 항암 약물 치료요법 동안 이른 시간 또는 항암 약물 치료요법 이전의 시점)에서 상기 피검체에 동일하게 계산된 비율과 비교함으로써 측정될 수 있다.
치료요법을 최적화하기 위하여 본 명세서에 기술된 방법의 다른 측면에서, 대체적인 신호 전달 경로의 활성화는 현재 치료요법 과정을 바꾸거나 조절해야할 (예를 들면, 다른 항암 약물로의 대체)필요성을 나타낸다. 비-제한적 예로서, 예를 들면 환자가 Gleevec® 치료요법을 받고 있는 경우, Src과 같은 대체적인 신호 전달 경로의 활성화 (예를 들면, 인산화)는 상기 환자가 Sprycel® 또는 Tasigna®를 사용하는 치료요법으로 대체될 필요성을 나타낸다.
다른 측면에서, 본 발명은 암의 치료에 적합한 항암 약물을 선별하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 항암 약물의 투여 이후에, 또는 항암 약물의 인큐베이션 이전에 암 세포를 단리하는 단계;
(b) 상기 단리된 세포를 용해시킴으로써 세포 추출액을 생산하는 단계;
(c) 본 명세서에 기술된 검정법을 사용하여 세포 추출액 내의 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 수준을 측정하는 단계; 및
(d) 종양원성 융합 단백질에서 검출된 발현 및/또는 활성화 수준을 항암 약물의 부재시 발생된 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교함으로써 암의 치료에 상기 항암 약물이 적합한지 또는 부적합한지 여부를 판단하는 단계를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 암의 치료에 적합한 항암 약물을 선별하는 방법은:
(a) 항암 약물 투여 이후에, 또는 항암 약물로 인큐베이션 이전에, 암 세포를 단리하는 단계;
(b) 상기 단리된 세포를 용해함으로써 세포 추출액을 생산하는 단계;
(c) 검정법을 사용하여 종양원성 융합 단백질에 특이적인 포획 항체의 연속된 희석물을 포함하는 세포 추출액 내의 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 수준을 측정하는 단계, 여기서 상기 포획 항체는 고체 지지체 상에 고정되고;
(d) 상기 종양원성 융합 단백질에서 검출된 발현 및/또는 활성화 수준을 항암 약물의 부재시 발생되는 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하는 단계; 및
(d) 종양원성 융합 단백질에서 검출된 발현 및/또는 활성화 수준이 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하여 바뀌었을 때 (예를 들면, 실질적으로 감소되었을 때), 상기 항암 약물이 암의 치료에 적합함을 나타내는 단계를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 방법은 예를 들면, 악성혈액 종양과 같은 암의 치료에 적합한 항암 약물을 선별할 수 있도록 보조하거나 도와줌에 있어서 유용할 수도 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 예를 들면, 악성혈액 종양과 같은 암의 치료에 적합한 항암 약물의 선별을 개선함에 있어서 유용할 수도 있다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 종양원성 융합 단백질에서 검출된 발현 및/또는 활성화 수준이 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하여 바뀌지 않았을 때 (예를 들면, 실질적으로 감소하지 않을 때), 상기 항암 약물은 암의 치료에 부적합함을 나타내는 단계를 더욱 또는 선택적으로 포함한다. 추가 구현예에서, 세포 추출액 내에 존재하는 일 또는 그 이상의 신호 전달 분자는 일 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질과 함께 검출되고, 그리고 상기 항암 약물은 상기 "분자 프로파일"을 바탕으로 적합하거나 부적합한 것으로 판단된다.
여전히 다른 측면에서, 본 발명은 항암 약물로 치료에 대한 암의 반응을 확인하는 방법을 제공하는바, 상기 방법은:
(a) 항암 약물의 투여 이후에, 또는 항암 약물의 인큐베이션 이전에 암 세포를 단리하는 단계;
(b) 상기 단리된 세포를 용해함으로써 세포 추출액을 생산하는 단계;
(c) 본 명세서에 기술된 검정법을 사용하여 세포 추출액 내의 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 수준을 측정하는 단계; 및
(d) 상기 종양원성 융합 단백질에서 검출된 발현 및/또는 활성화 수준을 항암 약물의 부재시에 발생되는 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교함으로써 항암 약물로 치료에 대한 반응성 또는 비-반응성으로 암을 확인하는 단계를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 항암 약물로 치료에 대한 암의 반응을 확인하는 방법은:
(a) 항암 약물의 투여 이후에, 또는 항암 약물로 인큐베이션 이전에 암 세포를 단리하는 단계;
(b) 상기 단리된 세포를 용해함으로써 세포 추출액을 생산하는 단계;
(c) 분석법을 사용하여 종양원성 융합 단백질에 특이적인 포획 항체의 연속된 희석물을 포함하는 세포 추출액 내의 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 수준을 측정하는 단계, 여기서 상기 포획 항체는 고체 지지체 상에 고정되고;
(d) 상기 종양원성 융합 단백질에서 검출된 발현 및/또는 활성화 수준을 항암 약물 부재시 발생되는 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하는 단계; 및
(e) 상기 종양원성 융합 단백질의 검출된 발현 및/또는 활성화 수준이 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하여 바뀌었을 때 (예를 들면, 실질적으로 감소되었을 때), 상기 암을 항암 약물로 치료에 대해 반응성이 있는 것으로 나타내는 단계를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 방법은 항암 약물로 치료하기 위하여, 예를 들면 악성혈약 종양과 같은 암에 대한 반응을 확인하는 경우 보조하거나 돕는데 유용할 수도 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 항암 약물로의 치료에, 예를 들면 악성혈액 종양과 같은 암에 대한 반응의 확인을 증가시킴에 있어서 유용한다. 특정 구현에에서, 본 발명은 종양원성 융합 단백질에서 검출된 발현 및/또는 활성화 수준이 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하여 바뀌지 않았을 때 (예를 들면, 실질적으로 감소되지 않았을 때), 상기 암은 항암 약물로의 치료에 비-반응성임을 나타내는 단계를 더욱 또는 선택적으로 포함한다. 추가 구현예에서, 세포 추출액 내에 존재하는 일 또는 그 이상의 신호 전달 분자는 일 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질과 함께 검출되고, 그리고 암은 상기 "분자 프로파일"을 바탕으로 치료에 대해 반응성 또는 비-반응성으로 확인된다.
여전히 다른 측면에서, 본 발명은 항암 약물로의 치료에 암을 갖는 환자의 반응성을 예측하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 항암 약물의 투여 이후에 또는 항암 약물로 인큐베이트 이전에, 암 세포를 단리하는 단계;
(b) 상기 단리된 세포를 용해함으로써, 세포 추출액을 생산하는 단계;
(c) 본 명세서에 기술된 검정법을 사용하여 세포 추출액 내의 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 수준을 측정하는 단계; 및
(d) 상기 종양원성 융합 단백질에서 검출된 발현 및/또는 활성화 수준을 항암 약물의 부재시 발생하는 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교함으로써, 환자가 항암 약물로의 치료에 반응할 가능성을 예측하는 단계를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 항암 약물로 치료에 암을 갖는 환자의 반응을 예측하는 방법은:
(a) 항암 약물의 투여 이후에 또는 항암 약물로 인큐베이트 이전에, 암 세포를 단리하는 단계;
(b) 상기 단리된 세포를 용해함으로써, 세포 추출액을 생산하는 단계;
(c) 검정을 사용하여 종양원성 융합 단백질에 특이적인 포획 항체의 연속된 희석물을 포함하는 세포 추출액 내의 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 수준을 측정하는 단계, 여기서 상기 포획 항체는 고체 지지체 상에 고정되고;
(d) 상기 종양원성 융합 단백질에서 검출된 발현 및/또는 활성화 수준을 항암 약물의 부재시 발생하는 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하는 단계; 및
(e) 종양원성 융합 단백질에서 검출된 발현 및/또는 활성화 수준이 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하여 바뀌었을 때 환자가 항암 약물로의 치료에 반응성이 있는 것으로 나타내는 단계를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 방법은 예를 들면, 환자가 악성혈액 종양과 같은 암에서 항암 약물로 치료에 반응할 가능성을 예측함에 있어서 보조하거나 도와주기에 유용할 수도 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 환자가 암, 예를 들면 악성혈액 종양에서 항암 약물로 치료시 반응할 가능성의 예측을 개선하기에 유용할 수도 있다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 종양원성 융합 단백질에서 검출된 발현 및/또는 활성화 수준이 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하여 바뀌지 않았을 때 (예를 들면, 실질적으로 감소되지 않을 때), 환자가 항암 약물로 치료에 반응성이 없는 것으로 나타내는 단계를 더욱 또는 선택적으로 포함한다. 추가 구현예에서, 세포 추출액 내에 존재하는 일 또는 그 이상의 신호 전달 분자는 일 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질과 함께 검출되고, 그리고 환자가 치료에 반응할 가능성은 상기 "분자 프로파일"을 바탕으로 예측된다.
추가 구현예에서, 암을 갖는 환자가 항암 약물로 치료에 내성이 있는지 여부를 측정하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 항암 약물의 투여 이후에 또는 항암 약물로 인큐베이션 이전에 암 세포를 단리하는 단계;
(b) 상기 단리된 세포를 용해함으로써, 세포 추출액을 생산하는 단계;
(c) 본 명세서에 기술된 검정법을 사용하여 세포 추출액 내의 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 수준을 측정하는 단계; 및
(d) 상기 종양원성 융합 단백질에서 검출된 발현 및/또는 활성화 수준을 항암 약물의 부재시 또는 이른 시간에 항암 약물의 존재시 발생하는 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교함으로써, 환자가 항암 약물로 치료에 내성이 있거나 민감한지 여부를 측정하는 단계를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 암을 갖는 환자가 항암 약물로 치료에 내성이 있는지 여부를 측정하는 방법은:
(a) 항암 약물의 투여 이후에 또는 항암 약물로 인큐베이트 이전에 암 세포를 단리하는 단계;
(b) 상기 단리된 세포를 용해함으로써, 세포 추출액을 생산하는 단계;
(c) 검정법을 사용하여 종양원성 융합 단백질에 특이적인 포획 항체의 연속된 희석물을 포함하는 세포 추출액 내의 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 수준을 측정하는 단계, 여기서 상기 포획 항체는 고체 지지체 상에 고정되고;
(d) 상기 종양원성 융합 단백질에서 검출된 발현 및/또는 활성화 수준을 항암 약물의 부재시 또는 이른 시간 항암 약물의 존재시 발생하는 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하는 단계; 및
(e) 종양원성 융합 단백질에서 검출된 발현 및/또는 활성화 수준이 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하여 바뀌지 않았을 때 (예를 들면, 실질적으로 감소되지 않았을 때) 환자가 항암 약물로 치료에 내성이 있는 것으로 나타내는 단계를 포함한다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 방법은 항암 약물로 치료에 내성이 있는 암을 갖는 환자를 확인함에 있어서 또는 암을 갖는 환자가 항암 약물로 치료에 내성이 있는지 여부에 대해 판단함에 있어서 보조하거나 도움을 주기에 유용할 수도 있는 것으로, 여기서 상기 환자는 암, 예를 들면 악성혈액 종양을 가진다. 다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 항암 약물로 치료에 내성이 있는 암을 갖는 환자의 확인 또는 암을 갖는 환자가 항암 약물로 치료에 내성이 있는지 여부에 대한 판단을 향상시키기에 유용할 수도 있는 것으로, 여기서 상기 환자는 예를 들면, 악성혈액 종양과 같은 암을 가진다.
특정 구현예에서, 상기 방법은 종양원성 융합 단백질에서 검출된 발현 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 수준이 참조 발현 또는 활성화 프로파일과 비교하여 바뀌었을 때 (예를 들면, 실질적으로 감소될 때) 환자가 항암 약물로 치료에 민감한 것으로 나타내는 단계를 더욱 또는 선택적으로 포함한다. 암을 갖는 환자가 항암 약물로 치료에 내성을 나타내는 비-제한적인 예는 목적 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL) 내의 일 또는 그 이상의 돌연변이의 존재, 치료학적 요법에의 비-순응, 및/또는 최적 이하의 약물 용량의 투여를 포함한다. 항암 약물의 최적 이하의 약물 용량과 관련하여, 본 발명은 환자에게 투여될 항암 약물의 다음의 또는 후속 용량을 증가시키는 단계를 추가로 포함한다. 추가 구현예에서, 세포 추출액 내에 존재하는 일 또는 그 이상의 신호 전달 분자는 일 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질과 함께 검출되고, 그리고 환자는 상기 "분자 프로파일"을 바탕으로 치료에 내성이 있는지 또는 민감한지가 확인된다.
특정 구현예에서, 상기 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 발현 (예를 들면, 전체) 수준 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 수준은 항암 약물의 존재시, 그것이 항암 약물의 부재시에 비해 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 또는 이하로 발현되거나 또는 활성화될 때, "변화"된 것이라고 간주된다. 일 구현예에서, 상기 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 발현 (예를 들면, 전체) 수준 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 수준은 항암 약물의 존재시, 그것이 항암 약물의 부재시에 비해 적어도 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95% 이상 또는 이하로 발현되거나 또는 활성화될 때, "실질적으로 감소"된 것으로 간주된다. 추가 구현예에서, 상기 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 발현 (예를 들면, 전체) 수준 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 수준은 항암 약물의 존재시 (1) 항암 약물 없이 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 높거나 강한 발현 및/또는 활성화로부터 항암 약물로 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 중간, 약한, 낮은 또는 매우 낮은 발현 및/또는 활성화까지의 변화가 존재하는 경우, 또는 (2) 항암 약물 없이 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 중간 발현 및/또는 활성화로부터 항암 약물로 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 약한, 낮은, 또는 매우 약한 발현 및/또는 활성화까지의 변화가 존재하는 경우, "실질적으로 감소"된 것으로 간주된다.
몇몇 구현예에서, 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 발현 수준 및/또는 활성화 수준은 본 명세서에 기술된 예를 들면, 협력 근접 면역검정법(COPIA)과 같은 근접 검정법을 사용하여 측정되는, 특정의 목적 분자에서 신호 강도에 대응되는 상대 형광 단위(relative fluorescence unit, RFU) 수준으로 표현된다. 다른 구현에에서, 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 발현 수준 및/또는 활성화 수준은 예를 들면, COPIA와 같은 근접 검정법을 사용하여 측정되는 특정의 목적 분석물에서의 신호 강도의 증가에 대응하여, "_", "±", "+", "++", "+++", 또는 "++++"로 표현된다. 몇몇 예에서, 예를 들면, COPIA와 같은 근접 검정법을 사용하여 측정되는 특정의 목적 분석물의 발현 또는 활성화의 검출 불가능하거나 최소한으로 검출가능한 수준은 "-" 또는 "±"로 표현될 수도 있다. 다른 예에서, 예를 들면, COPIA와 같은 근접 검정법을 사용하여 측정되는 특정의 목적 분석물의 낮은 발현 또는 활성화 수준은 "+"로 표현될 수도 있다. 또 다른 예에서, 예를 들면, COPIA와 같은 근접 검정법을 사용하여 측정되는 특정의 목적 분석물의 보통의 발현 또는 활성화 수준은 "++"로 표현될 수도 있다. 또 다른 예에서, 예를 들면, COPIA와 같은 근접 검정법을 사용하여 측정되는 특정의 목적 분석물의 높은 발현 또는 활성화 수준은 "+++"로 표현될 수도 있다. 추가의 예에서, COPIA와 같은 근접 검정법을 사용하여 측정되는 특정의 목적 분석물의 매우 높은 발현 또는 활성화 수준은 "++++"로 표현될 수도 있다
다른 구현예에서, 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 발현 수준 및/또는 활성화 수준은 특정의 목적 분석물에서 발생되는 표준 커브에 대하여, 예를 들면 COPIA와 같은 근접 검정법을 사용하여 측정되는 RFU 수준을 조정(calibrating)하거나 표준화함으로써 정량화된다. 특정 예에서, 컴퓨터 단위 (CU) 수준은 표준 곡선을 바탕으로 계산될 수 있다. 다른 예에서, CU 수준은 신호 강도에서의 상기 설명에 따라 "_", "±", "+", "++", "+++", 또는 "++++"로 표현될 수 있다.
특정 구현에에서, 특정의 목적 분석물의 발현 또는 활성화 수준이 "_", "±", "+", "++", "+++", 또는 "++++"로 표현될 때, 참조 발현 수준 또는 활성화 수준에 비해, IgG 대조군과 같은 음성 대조군과 비교하여, 목적 분석물에서 발현되는 표준 곡선과 비교하여, pan-CK 대조군과 같은 양성 대조군과 비교하여, 항암 약물의 존재시 측정되는 발현 또는 활성화 수준에 비교하여, 및/또는 항암 약물의 부재시 측정되는 발현 또는 활성화 수준과 비교하여, 적어도 약 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 100-배 이상 또는 이하 (예를 들면, 약 1.5-3, 2-3, 2-4, 2-5, 2-10, 2-20, 2-50, 3-5, 3-10, 3-20, 3-50, 4-5, 4-10, 4-20, 4-50, 5-10, 5-15, 5-20, 또는 5-50-배 이상 또는 이하)의 발현 또는 활성화 수준에 대응할 수도 있다. 몇몇 예에서, COPIA와 같은 근접 검정법을 사용하여 측정되는 "+" 발현 또는 활성화 수준은 일 분석물의 발현 또는 활성화에서 2-배 증가 및 참조 발현 또는 활성화 수준과 비교할 때 다른 분석물에서의 5-배 증가에 대응할 수도 있다.
특정 구현예에서, 전체 및 활성화된 (예를 들면, 인산화된) 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL) 또는 신호 전달 분자 수준은 본 발명의 항체-기반 검정법에 따라 세포 추출액에서 측정되고, 그리고 전체 종양원성 융합 단백질 수준에 대한 활성화된 것의 비율 (예를 들면, 인산/전체 BCR-ABL 단백질 수준의 비율) 또는 활성화된 전체 신호 전달 분자 수준 (예를 들면, 인산/전체 CRKL, JAK2, 또는 STAT5 단백질 수준의 비율)이 계산되고, 그 다음 항암 약물의 부재시 발생되는 참조 발현 및 활성화 프로파일을 바탕으로 동일하게 계산된 것과 비교될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 단계 (c)에서 측정된 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 참조 발현 또는 활성화 수준은 악성혈액 종양과 같은 암을 갖지 않는 건강한 개체로부터의 비-암성 세포와 같은 보통의 세포로부터 수득된다. 특정의 다른 구현예에서, 단계 (c)에서 측정되는 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 참조 발현 또는 활성화 수준은 백혈병 또는 림프종과 같은 암을 갖는 환자로부터의 샘플 (예를 들면, 세포 추출액) 내의 종양 세포로부터 수득된다.
몇몇 구현예에서, 단계 (c)에서 측정된 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 참조 발현 또는 활성화 수준은 항암 약물로 치료받지 않은 세포 (예를 들면, 환자 샘플로부터 수득된 종양 세포)로부터 수득된다. 특정 구현예에서, 항암 약물로 치료받지 않은 세포는 세포 추출액을 생산하기 위하여 사용되는 단리된 세포 (예를 들면, 의문의 시험 세포)가 수득되는 동일한 샘플로부터 수득된다. 특정 예에서, 참조 발현 또는 활성화 수준 보다 낮은 수준의 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 발현 또는 활성화는 항암 약물이 암 (예를 들면, 항암 약물에 반응할 가능성이 높은 종양)의 치료에 적합함을 나타낸다. 특정의 다른 예에서, 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 참조 발현 또는 활성화 수준에 비해 동일하거나, 유사하거나, 또는 높은 수준 발현 또는 활성화는 항암 약물이 암 (예를 들면, 항암 약물에 반응할 가능성이 감소된 종양)의 치료에 부적합함을 나타낸다.
선택적인 구현예에서, 단계 (c)에서 측정된 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 참조 발현 또는 활성화 수준은 항암 약물로 치료받은 항암 약물에 민감한 세포로부터 수득된다. 그러한 구현예에서, 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 발현 또는 활성화 수준이 참조 발현 또는 활성화 수준에 비해 동일하거나, 유사하거나, 또는 낮은 수준으로의 존재는 항암 약물이 암 (예를 들면, 항암 약물에 반응할 가능성이 증가된 종양)의 치료에 적합함을 나타낸다. 특정의 다른 선택적인 구현예에서, 단계 (c)에서 측정된 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 참조 발현 또는 활성화 수준은 항암 약물로 치료받은 항암 약물에 내성이 있는 세포로부터 수득된다. 그러한 구현예에서, 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 발현 또는 활성화 수준이 참조 발현 또는 활성화 수준에 비해, 동일하거나, 유사하거나, 또는 더 높게 존재함은 항암 약물이 암 (예를 들면, 항암 약에 반응할 가능성이 감소된 종양)의 치료에 부적합함을 나타낸다.
특정 구현예서, 단계 (c)에서 측정된 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 더 높은 발현 또는 활성화 수준은 발현 또는 활성화 수준이 항암 약물로 치료받지 않은 세포 (예를 들면, 환자 샘플로부터 수득된 암 세포)에서, 항암 약물로 치료받은 항암 약물-민감 세포에서, 또는 항암 약물로 치료받은 항암 약물-내성 세포에서, 대응 분석물의 참조 발현 또는 활성화 수준에 비해 적어도 약 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 100-배 높을 때 (예를 들면, 약 1.5-3, 2-3, 2-4, 2-5, 2-10, 2-20, 2-50, 3-5, 3-10, 3-20, 3-50, 4-5, 4-10, 4-20, 4-50, 5-10, 5-15, 5-20, 또는 5-50-배 높을 때) 세포 추출액 내에 존재하는 것으로 고려된다.
다른 구현예에서, 단계 (c)에서 측정된 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 낮은 수준의 발현 또는 활성화는 항암 약물로 치료받지 않은 세포 (예를 들면, 환자 샘플로부터 수득된 암 세포)에서, 항암 약물로 치료받은 항암 약물-민감성 세포에서, 또는 항암 약물로 치료받은 항암 약물-내성 세포에서 대응 분석물의 참조 발현 또는 활성화 수준에 비해, 적어도 약 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 100-배 낮을 때 (예를 들면, 약 1.5-3, 2-3, 2-4, 2-5, 2-10, 2-20, 2-50, 3-5, 3-10, 3-20, 3-50, 4-5, 4-10, 4-20, 4-50, 5-10, 5-15, 5-20, 또는 5-50-배 낮음) 세포 추출액 내에 존재하는 것으로 간주한다.
A. 항체 어레이
일 측면에서, 본 발명은 세포 추출액 내의 일 또는 그 이상의 분석물에 특이적인 포획 항체의 다수의 연속된 희석물을 포함하는 우수한 동적 범위를 갖는 어레이를 제공하는 것으로, 여기서 상기 고체 항체는 고체 지지체 상에 고정된다.
몇몇 구현예에서, 상기 세포 추출물은 전혈, 소변, 담, 기관지 세정액, 눈물, 유두 흡인물, 림프, 타액 및/또는 미세침 흡인물 (FNA) 샘플로부터 제조된다. 비-제한적 예로서, 전혈 샘플은 우선 혈장 또는 혈청 분획물 및 세포 분획물 (즉, 세포 펠렛)으로 분류된다. 세포 분획물을 통상적으로 적혈구 세포, 백혈구 세포(백혈구), 및/또는 순환 종양 세포(CTC), 순환 내피 세포(CEC), 순환 내피 전구세포(CEPC), 암 줄기세포(CSC), 및 그것의 조합물과 같은 고형 종양의 순환 세포를 함유한다. 세포 분획물 내에 존재하는 단리된 세포는 용해됨으로써 당해 기술분야에 공지된 임의의 기술에 의해 단리된 세포를 세포 추출액으로 전환시킨다.
몇몇 예에서, 상기 세포 추출액은 고형 종양의 순환 세포의 추출액을 포함한다. 순환 세포는 통상적으로 예를 들면, 면역자기 분리 (예를 들면, 문헌 [Rcila et al, Proc. Natl. Acad. Set USA, 95:4589-4594 (1998); Bilkenroth et al, Int. J. Cancer, 92:577-582 (2001)] 참고), 미세유체 분리 (예를 들면, 문헌 [Mohamed et al, IEEE Trans. Nanobiosci., 3:251-256 (2004); Lin et al, Abstract No. 5147, 97th AACR Annual Meeting, Washington, D.C. (2006)] 참고), FACS (예를 들면, 문헌 [Mancuso et al, Blood, 97:3658-3661 (2001)] 참고), 밀도 구배 원심분리 (예를 들면, 문헌 [Baker et al, Clin. Cancer Res., 13:4865-4871 (2003)] 참고), 및 디플레이션 방법 (예를 들면, 문헌 [Meye et al, Int. J. Oncol, 21 :521-530 (2002)] 참고)를 포함하는 일 또는 그 이상의 분리 방법을 사용하여 환자의 샘플로부터 단리된다.
다른 예에서, 상기 세포 추출액은 예를 들면, 호중구, 호염기구, 및 호산구를 포함하는 과립구 (다형핵 백혈구); 예를 들면, 임파구 및 단핵구, 및 다식세포 및 거대세포와 같은 말초 혈액 단핵 세포를 포함하는, 무과립구 (단핵 백혈구); 및 그것의 조합과 같은 백혈구 추출액을 포함한다. 백혈구는 예를 들면, Ficoll-HyPaque 밀도-구배 원심분리, 적혈구 세포의 저장성 용해, 및 Lymphoprep™ 및 Polymorphprep™ (Axis-Shield; Oslo, Norway)와 같은 밀도 구배 매체의 사용을 포함하는 공지된 임의의 분리 방법을 사용하여 전혈로부터 단리될 수 있다.
특정 구현예에서, 단리된 백혈구, 순환 세포, 또는 다른 세포 (예를 들면, 미세 침 흡인물을 통한 고형 종양으로부터 수득된 세포)는 목적의 일 또는 그 이상의 항암 약물로 인큐베이션 전, 인큐베이션 동안, 및/또는 인큐베이션 이후에 일 또는 그 이상의 성장 인자로 인 비트로에서 자극될 수 있다. 자극 성장 인자는 상피 성장 인자(EGF), 헤레귤린(HRG), TGF-α, PIGF, 안지오포이어틴(Ang), NRG1, PGF, TNF-α, VEGF, PDGF, IGF, FGF, HGF, 사이토카인, 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다른 예에서, 상기 단리된 세포는 당해 기술분야에 공지된 임의의 기술을 사용하여 성장 인자 자극 및/또는 항암 약물 치료 이후에 용해됨으로써 세포 추출액 (예를 들면, 세포 분해물)을 생산할 수 있다. 바람직하게는 세포 용해는 성장 인자 자극 이후의 약 1-360 분 사이에, 더 바람직하기는 2개의 다른 기간 간격: (1) 성장 인자 자극 이후의 약 1-5분에; 및 (2) 성장 인자 자극 이후의 약 30-180분에 개시된다. 대체적으로, 상기 분해분은 사용시까지 약 -80℃에서 저장될 수 있다. 순환 세포의 단리, 자극, 및 용해를 위한 프로토콜은 PCT 공보 WO 2008/036802에 기술되어 있고, 상기의 전체 개시내용은 모든 목적을 위하여 참조로서 본 명세서에 통합된다. 조직, 생검, 또는 주요 배지로부터의 종양 세포 추출물의 제조를 위한 프로토콜은 PCT 공보 WO 2009/108637에 기술되어 있고, 상기의 전체 개시내용은 모든 목적을 위하여 참조로서 본 명세서에 통합된다.
특정 구현예에서, 상기 항암 약물은 모노클로날 항체 또는 타이로신 키나제 억제제와 같은 항-신호전달제 (즉, 세포증식억제 약물); 항-증식제; 화학요법제 (즉, 세포독성 약물); 호르몬 치료제; 방사선치료제; 백신; 및/또는 암 세포와 같은 비정상 세포의 비조절 성장을 경감시기거나 없애는 능력을 가진 임의의 다른 화합물을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 단리된 세포는 일 또는 그 이상의 항-신호전달제, 항증식제, 및/또는 호르몬 치료제와 적어도 하나의 화학치료제와 조합하여 치료된다.
예를 들면, 항-신호전달제는 트라스투주마브 (Herceptin®), 알레투주마브 (Campath®), 베바시주마브 (Avastin®), 세투시마브 (Erbitux®), 겜투주마브 (Mylotarg®), 파니투무마브 (Vectibix™), 리투시마브 (Rituxan®), 및 토시투모마브 (BEXXAR®)과 같은 모노클로날 항체; 이마티니브 메실레이트 (Gleevec®), 니로티니브 (Tasigna®), 다사티니브 (Sprycel®), 보수티니브 (SKI-606), 게피티니브 (Iressa®), 수니티니브 (Sutent®), 어로티니브 (Tarceva®), 라파티니브 (GW-572016; Tykerb®), 카넬티니브 (CI 1033), 세막시니브 (SU5416), 바타라니브 (PT 787/ZK222584), 소파레니브 (BAY 43-9006; Nexavar®), 레프루노마이드 (SU101), 및 반데타닙 (ZACTEVIA™; ZD6474); 및 그것의 조합물과 같은 타이로신 키나제 억제제를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예시적인 항-증식작용제는 시로리무스(라파마이신), 템시로리무스 (CCI-779), 및 에베로리무스 (RAD001)와 같은 mTOR 억제제; lL6-히드록시메틸-카이로-이노지톨-2-(R)-2-0-메틸-3-0-옥타데실-sn-글리서로카바네이트, 9-메톡시-2-메틸엘리프티시늄 아세테이트, 1,3-디히드록시-1-(1-((4-(6-페닐-lH-이미다조[4,5-g]퀴녹살린-7-일)페닐)메틸)-4-피페리디닐)-2H-벤즈이미다졸-2-온, 10-(4'-(N-디에틸아미노)부틸)-2-클로로페녹사진, 3-포르밀크로몬 티오세미카르바존 (Cu(II)Cl2 복합체), API-2, 원-종양 유전자 TCL1의 아미노산 10-24로부터 유래된 15-머 펩티드 문헌 [Hiromura et al, J. Biol. Chem., 279:53407-53418 (2004), KP372-1, and the compounds described in Kozikowski et al, J. Am. Chem. Soc, 125: 1 144-1145 (2003) 및 Kau et al, Cancer Cell, 4:463-476 (2003)]와 같은 Akt 억제제; 및 그것의 조합을 포함한다.
화학치료제의 비-제한적 예는 백금-기반 약물 (예를 들면, 옥살리플라틴, 시스플라틴, 마르보플라틴, 스피로플라틴, 이프로플라틴, 사트라플라틴, 등), 알칼화제 (예를 들면, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 클로람부실, 부술판, 멜팔란, 메클로르에타민, 우라부스틴, 티오테파, 니트로소우레아, 등), 항-대사물질 (예를 들면, 5-플루오로우라실, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린, 메토트렉사이드, 류코보린, 카페시타빈, 시타라빈, 플록스우리딘, 플루다라빈, 겜시타빈 (Gemzar®), 페메트렉세드 (ALDVITA®), 랄티트렉세드, 등), 식물 알칼로이드 (예를 들면, 빈크리스틴, 빈클라스틴, 빈오렐빈, 빈데신, 포도필로톡신, 파클리탁셀 (Taxol®), 도세탁셀 (Taxotere®), 등), 국소화이성효소 억제제 (예를 들면, 이리노데칸, 토포테칸, 암사크린, 에토포시드 (VP 16), 에토포시드 포스페이트, 테니포시드, 등), 항종양 항생제 (예를 들면, 독소루비신, 아드리아마이신, 다우노루비신, 에피루비신, 악티노마이신, 블레오마이신, 미토마이신, 미톡산트론, 플리카마이신, 등), 그것의 약제학적으로 허용가능한 염, 그것의 입체이성질체, 그것의 유도체, 그것의 유사체, 및 그것의 조합을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
호르몬 치료제의 예는 아로마타제 억제제 (예를 들면, 아미노글루테티미드, 아나스트로졸 (Arimidex®), 레트로졸 (Femara®), 보로졸, 엑세메스탄 (Aromasin®), 4-안드로스텐-3,6,17-트리온 (6-OXO), l,4,6-안드로스트리엔-3,17-디온 (ATD), 포르메스탄 (Lentaron®), 등), 선택적 에스트로겐 수용체 분자 (예를 들면, 바제독시펜, 클로미펜, 풀베스트란트, 라소포시펜, 라록시펜, 타모시펜, 토레미펜, 등), 스테로이드 (예를 들면, 덱사메타손), 피나스테리드, 및 고세렐린과 같은 고나도트로핀-방출 호르몬 아고니스트 (GnRH), 그것의 약제학적으로 허용가능한 염, 그것의 입체이성질체, 그것의 유도체, 그것의 유사체, 및 그것의 조합을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
암 백신의 비-제한적 예는 Active Biotech로부터의 ANYARA, Northwest Biotherapeutics로부터의 DCVax-LB, TDM Pharma로부터의 EP-2101, Pharmexa로부터의 GV1001, Idera Pharmaceuticals로부터의 IO-2055, Introgen Therapeutics로부터의 INGN 225 및 Biomira Merck로부터의 Stimuvax을 포함한다.
방사선치료제의 예는 임의적으로 종양 항원과 직접 관련된 항체에 컨쥬게이트 되는, 47Sc, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 86Y, 87Y, 90Y, 105Rh, 111Ag, 111In, 117 mSn, 149Pm, , 153Sm, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, 및 212Bi와 같은 방사선 핵종을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 구현예에서, 세포 추출액 내에 존재하는 일 또는 그 이상의 분석물은 하나 또는 복수개의 종양원성 융합 단백질을 단독으로 또는 하나 또는 복수개의 신호 전달 분자와의 조합하여 포함한다. 종양원성 융합 단백질 및 목적 신호 전달 분자의 비-제한적 예는 상기 기술되어 있다.
몇몇 구현예에서, 포획 항체들의 각각의 연속된 희석물은 감소하는 포획 항체 농도 시리즈를 포함한다. 특정 예에서, 상기 포획 항체는 적어도 2-배 (예를 들면, 2, 5, 10, 20, 50, 100, 500, 또는 1000-배) 연속 희석됨으로써, 어레이로 스폿(spot)되는 감소하는 포획 항체의 세트 수 (예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 또는 그 이상)를 생산한다. 바람직하게는, 각각의 포획 항체 희석의 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 복제물이 어레이로 스폿된다.
다른 구현예에서, 상기 고체 지지체는 유리 (예를 들면, 유리 슬라이드), 플라스틱, 칩, 핀, 필터, 비드, 종이, 막 (예를 들면, 나일론, 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF), 등), 섬유 다발, 또는 임의의 다른 적합한 기질을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 포획 항체는 Whatman Inc.로부터 상업적으로 이용가능한 FAST® Slides (Florham Park, NJ)와 같은 니트로셀룰로오스 폴리머로 코팅된 유리 슬라이드 상에 (예를 들면, 공유 또는 비-공유 상호작용을 통해) 고정된다.
비-제한적 예로서, 본 발명의 어드레스가능한 마이크로어레이는 포획 항체가 BCR-ABL 융합 단백질의 BCR 도메인에 결합되고 검출 항체 (예를 들면, 활성화 상태-의존성 및 활성화 상태-비의존성 항체)가 ABL 도메인에 결합되는, 세포 추출액 내의 BCR-ABL의 활성화 상태를 측정하기 위하여 포획 항체 연속된 희석물을 포함할 수도 있다. 선택적인 구현예에서, 포획 뿐만 아니라 활성화 상태-비의존성 항체는 BCR-ABL 융합 단백질의 BCR 도메인에 결합되지만 활성화 상태-의존성 항체는 ABL 도메인에 결합된다. 어레이는 감소하는 농도의 시리즈 (즉, 연속 희석물)에서 추가의 융합 단백질 및/또는 신호 전달 분자에 결합되는 다수의 다른 포획 항체를 추가로 포함할 수도 있는 것으로, 여기서 포획 항체는 다른 어드레스가능한 위치에서 고체 지지체의 표면에 결합된다.
당업자들은 본 검정법이 각각의 활성화된 종양원성 융합 단백질 및/또는 신호 전달 분자의 이산 신호가 검출가능하도록 임의의 형상으로 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들면, 상기 검정법은 각각의 영역이 다른 포획 항체 또는 포획제 (즉, 포획 항체 내에 존재하는 포획 태그를 결합시키기 위함)를 함유하는 경우, 지지체 표면 상의 별개의 영역의 라인 또는 그리드 (예를 들면, 도트 또는 스팟)로 존재할 수 있다. 어레이는 다수의 종양원성 융합 단백질 및/또는 신호 전달 분자의 활성화 상태가 단일의, 멀티플렉스 검정법에서 검출되는 방법에서 사용하기 위하여 형성될 수 있다. 다양한 구현예에서, 대다수는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질 및/또는 신호 전달 분자를 포함한다. 특정 구현예에서, 대다수는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 그 이상의 추가적인 종양원성 융합 단백질 및/또는 신호 전달 분자와 조합하여 BCR-ABL 융합 단백질을 포함한다.
B. 근접 이중 검출 검정법
특정 측면에서, 백혈구 또는 고형 종양의 순환 세포와 같은 다른 세포 유형의 세포 추출액 내의 특정의 목적 분석물의 활성화 상태를 검출하기 위한 본 발명의 검정법은 우수한 동적 범위를 갖는 멀티플렉스, 고속 근접 (즉, 3-항체) 검정법이다.
비-제한적 예로서, 분석물이 단일 단백질 (예를 들면, EGFR)인 상황에서, 근접 검정법에서 사용되는 3개의 항체는 (1) 분석물에 특이적인 포획 항체; (2) 분석물의 활성화된 형태에 특이적인 검출 항체 (즉, 활성화 상태-의존성 항체); 및 (3) 분석물의 전체 양을 검출하는 검출 항체 (즉, 활성화 상태-비의존성 항체)를 포함할 수 있다. 활성화 상태-의존성 항체는, 예를 들면 분석물의 인산화, 유비퀴틴화, 및/또는 복합체 상태를 검출할 수 있다. 활성화 상태-비의존성 항체는 일반적으로 분석물의 활성화된 형태 뿐만 아니라 비-활성화된 형태를 검출할 수 있다.
다른 비-제한적 예로서, 분석물이 다른 단백질 (예를 들면, ABL)에 대응되는 제2 도메인에 융합된 한 단백질 (예를 들면, BCR)에 대응되는 제1 도메인을 함유하는 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL)인 상황에서, 근접 검정법에서 사용되는 3개의 항체는: (1) 융합 단백질의 제1 도메인에 특이적인 포획 항체; (2) 융합 단백질의 제2 도메인의 활성화된 형태에 특이적인 검출 항체 (즉, 활성화 상태-의존성 항체); 및 (3) 그것의 활성화 상태에 무관하게 (즉, 활성화 상태-비의존성 항체) 융합 단백질의 제2 도메인에 특이적으로 결합하는 것에 의해 융합 단백질의 전체 양을 검출하는 검출 항체를 포함할 수 있다. 활성화 상태-의존성 항체는 예를 들면, 융합 단백질의 인산화, 유비퀴틴화, 및/또는 복합화 상태를 검출할 수 있다. 활성화 상태-비의존성 항체는 일반적으로 융합 단백질의 활성화된 형태 뿐만 아니라 비-활성화된 형태를 검출할 수 있다.
바람직한 측면에서, 본 발명은 우수한 동적 범위를 갖는 멀티플렉스, 고속 면역검정법을 수행하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 세포 추출액을 일 또는 그 이상의 융합 단백질에 특이적인 포획 항체의 하나 또는 복수개의 연속된 희석물과 인큐베이션함으로써, 다수의 포획된 융합 단백질을 형성하는 단계, 여기서 각각의 융합 단백질은 제1 단백질에 대응되는 제1 도메인 및 제2의, 다른 단백질에 대응되는 제2 도메인을 포함하고, 그리고 여기서 상기 포획 항체는 융합 단백질의 제1 도메인에 특이적이고;
(b) 다수의 포획된 융합 단백질을 융합 단백질의 제2 도메인에 특이적인 검출 항체와 인큐베이션함으로써, 다수의 검출가능한 포획된 융합 단백질을 형성하는 단계, 여기서 상기 검출 항체는:
(1) 촉진 모이어티로 표지된 다수의 활성화 상태-비의존성 항체, 및
(2) 신호 증폭쌍의 제1 일원으로 표지된 다수의 활성화 상태-의존성 항체를 포함하고, 여기서 상기 촉진 모이어티는 신호 증폭쌍의 제1 일원에 채널링하고 상기와 반응하는 산화제를 발생시키고;
(c) 다수의 검출가능한 포획된 융합 단백질을 신호 증폭쌍의 제2 일원과 인큐베이션함으로써 증폭 신호를 발생시키는 단계; 및
(d) 신호 증폭쌍의 제1 및 제2 일원으로부터 발생된 증폭된 신호를 검출하는 단계를 포함한다.
일 선택적인 측면에서, 우수한 동적 범위를 갖는 멀티플렉스, 고속 면역검정법을 수행하는 방법은:
(a) 세포 추출액을 일 또는 그 이상의 융합 단백질에 특이적인 하나 또는 복수개의 포획 항체의 연속된 희석물과 인큐베이션함으로써, 다수의 포획 융합 단백질을 형성하는 단계, 여기서 상기 포획 항체는 고체 지지체 상에 고정되고, 여기서 각각의 융합 단백질은 제1 단백질에 대응되는 제1 도메인 및 제2의, 다른 단백질에 대응되는 제2 도메인을 포함하고, 그리고 여기서 상기 포획 항체는 융합 단백질의 제 도메인에 특이적이고;
(b) 다수의 포획된 융합 단백질을 검출 항체와 인큐베이션함으로써, 다수의 검출가능한 포획된 융합 단백질을 형성하는 단계, 여기서 상기 검출 항체는:
(1) 촉진 모이어티로 표지된 다수의 활성화 상태-비의존성 항체, 여기서 상기 활성화 상태-비의존성 항체는 융합 단백질의 제1 도메인에 특이적이고, 및
(2) 신호 증폭쌍의 제1 일원으로 표지된 다수의 활성화 상태-의존성 항체를 포함하고, 여기서 상기 활성화 상태-의존성 항체는 융합 단백질의 제2 도메인에 특이적이고, 여기서 상기 촉진 모이어티는 신호 증폭쌍의 제1 일원에 채널링하고 상기와 반응하는 산화제를 발생시키고;
(c) 다수의 검출가능한 포획된 융합 단백질을 신호 증폭쌍의 제2 일원과 인큐베이션함으로써 증폭된 신호를 발생시키는 단계; 및
(d) 신호 증폭쌍의 제1 및 제2 일원으로부터 발생된 증폭된 신호를 검출하는 단계를 포함한다.
다른 선택적인 측면에서, 우수한 동적 범위를 갖는 멀티플렉스, 고속 면역검정법을 수행하는 방법은:
(a) 세포 추출액을 일 또는 그 이상의 융합 단백질에 특이적인 포획 항체의 하나 또는 복수개의 연속 희석물과 인큐베이션함으로써, 다수의 포획 융합 단백질을 형성하는 단계, 여기서 상기 포획 항체는 고체 지지체 상에 고정되고, 여기서 각각의 융합 단백질은 제1 단백질에 대응되는 제1 도메인 및 제2의, 다른 단백질에 대응되는 제2 도메인을 포함하고, 그리고 여기서 포획 항체는 융합 단백질의 제1 도메인에 특이적이고;
(b) 다수의 포획된 융합 단백질을 검출 항체와 인큐베이션함으로써 다수의 검출가능한 포획된 융합 단백질을 형성하는 단계, 여기서 상기 검출 항체는:
(1) 촉진 모이어티로 표지된 다수의 활성화 상태-비의존성 항체, 여기서 상기 활성화 상태-비의존성 항체는 융합 단백질 (즉, 접합 항체)의 제2 도메인과 제2 도메인 사이의 융합 염기서열, 지점 또는 위치에 특이적이고, 및
(2) 신호 증폭쌍의 제1 일원으로 표지된 다수의 활성화 상태-의존성 항체를 포함하고, 여기서 상기 활성화 상태 의존성 항체는 융합 단백질의 제2 도메인에 특이적이고, 여기서 상기 촉진 모이어티는 신호 증폭쌍의 제 1일원에 채널링하고 상기에 결합하는 산화제를 발생시키고,
(c) 다수의 검출가능한 포획된 융합 단백질을 신호 증폭쌍의 제2 일원과 인큐베이션시킴으로써 증폭된 신호를 발생시키는 단계; 및
(d) 신호 증폭쌍의 제1 및 제2 일원으로부터 발생된 증폭된 신호를 검출하는 단계를 포함한다.
특정 구현예에서, 세포 추출액 내에 존재하는 일 또는 그 이상의 신호 전달 분자는 일 또는 그 이상의 융합 단백질과 함께 검출된다. 목적의 신호 전달 분자의 예는 상기에 기술되어 있고, 수용체 타이로신 키나제, 비-수용체 타이로신 키나제, 및/또는 타이로신 키나제 신호전달 케스케이드 성분을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 신호 전달 분자는 모든 3개의 항체 (즉, 포획 항체 및 2개의 검출 항체)가 동일한 단백질에 대한 것임을 제외하고는, 본 명세서에 기술된 방법을 사용하거나, 또는 당업자에게 공지된 임의의 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 게다가, 신호 전달 분자는 PCT 공보 WO 2008/036802에 기술된 단일 검출 (즉, 2-항체) 검정법을 사용하여 검출될 수 있으며, 상기의 전체 개시내용은 모든 목적을 위해 참조로서 본 명세서에 통합된다. 특정 구현예에서, 세포 추출액 내에 존재하는 일 또는 그 이상의 신호 전달 분자는 면역검정법 및 본 명세서에 기술된 검정법을 사용하여 일 또는 그 이상의 융합 단백질에 접합된 상태로 검출된다.
몇몇 예에서, 세포 추출액은 고체 지지체 상에 이미 고정된 포획 항체와 함께 인큐베이션된다. 다른 예에서, 세포 추출액은 용액 내의 포획 항체와 함께 우선 인큐베이션되고, 그 다음 고체 지지체에 접촉됨으로써 포획 분석물 예를 들면, 고체 지지체에 결합된 포획제와 작용하는 포획 항체 상에 존재하는 포획 태그를 통해 고정된다.
몇몇 구현예에서, 검출 항체는 용액 내의 포획 항체에 결합되거나 고체 지지체 상에 고정되는 분석물과 함께 인큐베이션된다. 특정 예에서, 다수의 분석물을 포함하는 세포 추출액은 우선 용액 내의 포획 항체 및 검출 항체와 인큐베이션되고 그 다음 고체 지지체에 접촉함으로써, 예를 들면 고체 지지체에 결합된 포획제와 작용하는 포획 항체 또는 검출 항체 상에 존재하는 포획 태그를 통해, 항체-분석물 복합체를 고착화시킨다. 검출 단계 이전에, 고착화된 복합체는 비복합화된 항체를 제거하기 위하여 세척될 수 있고, 상기 세척된 복합체는 연속적으로 지지체 표면으로부터 방출될 수 있으며, 그리고 분석되고 있는 각각의 분석물의 근접 채널링이 본 명세서에 기술된 적합한 방법에 의해 검출될 수 있다.
구현예에서, 지지체 표면이 어레이 내에 고정된 포획제를 포함하는 경우, 인큐베이션 단계는 용액 내의 다수의 분석물을 포함하는 세포 추출액의 반응을 완료시키기 위하여 과잉의 모든 3개의 항체를 사용하여, 포획 항체 및 검출 항체와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법의 일 변형에서, 생성된 항체-분석물 복합체는 고체상에 부착되고 세척됨으로써 비결합 항체가 제거된다. 그것의 전체 개시내용이 모든 목적을 위하여 참조로서 본 명세서에 통합되는, PCT 공보 2008/036802의 도 2에 설명된 바와 같이, 포획 항체(1)는 포획 태그(10)을 포함할 수 있다. 복합체는 고체상에 달라붙고 포획 태그에 결합하는 포획제(11)을 통해 고체상(12)에 결합됨으로써 복합체를 고착화시킨다. 고착화된 복합체는 적합한 완충제로 세척된 후, 방출제(13)의 첨가에 의해 고체상으로부터 방출된다. 상기 방출제는 세척된 복합체를 방출시키는 임의의 메카니즘에 의해 작용할 수도 있다. 일 구현예에서, 포획 태그는 방출제에 의해 인식되어 절단되는 절단가능한 부위를 포함한다. 도 2에 설명된, 다른 구현예에서, 방출제는 포획제에 결합하기 위한 포획 태그와 경쟁한다. 예를 들면, 포획제는 포획 항체 (즉, 포획 태그)에 부착하는 부분적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드와 혼성화되는 제1 올리고뉴클레오티드 일 수도 있고; 그리고 상기 방출제는 가닥 치환 및 고체상으로부터 세척된 복합체의 방출을 초래하는, 포획제에 전체적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드일 수도 있다. 사용되기에 적합한 포획 태그/포획제/방출제의 다른 예는 2,4-디니트로페놀 (DNP)/항-DNP 항체/2,4-DNP 라이신; T2/항-T3 항체/T3; 우아바인/항-디곡신 항체/디곡신; 및 데티오비오틴/스트렙타비딘/비오틴 (예를 들면, 문헌 [Ishikawa et al., J. Clin. Lab Anal, 12:98-107 (1998)] 참고)를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
세척된 복합체가 고체상으로부터 방출된 이후에, 그것은 (1) 포획 항체 상의 포획 태그를 특이적으로 결합하는 어레이에서 고정된 포획 분자를 포함하는 지지체 표면과 접촉하거나, 또는 (2) 분리되고, 상기 분리된 검출 항체는 검출 항체 상의 포획 태그를 특이적으로 결합하는 포획제를 포함하는 지지체 표면과 접촉된다. PCT 공보 WO 2008/036802의 도 2는 세척된 복합체가 분리되고, 분리된 검출 항체가 지지체 표면(14)에 접촉되는 경우의 구현예를 설명한다. 지지체 표면은 "어드레스가능" 또는 "지프 코드" 어레이에 고정된 다수의 포획 분자를 포함한다. 어레이의 각각의 별개의 영역은 활성화 상태-비의존성 검출 항체(2) 또는 활성화 상태-의존성 항체(3) 상에 존재하는 포획 태그(8)을 특이적으로 결합시키는 유일한 포획제(9)를 포함함으로써 태그된 검출 항체를 어레이 내로 고정시키고 분류한다. 바람직한 구현예에서, 포획제 또는 포획 태그는 서로 특이적으로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드이다. 올리고뉴클레오티드 포획 분자를 포함하는 어드레스가능한 어레이는 당업계에 공지되어 있다 (예를 들면, 문헌 [Keramas et al., Lab Chip, 4:152-158 (2004); Delrio-Lafreniere et al., Diag. Microbiol. Infect. Dis., 48:23-31 (2004)] 참조).
어레이의 각각의 별개의 영역에서의 검출 항체의 존재는 촉진 모이어티와 같은 모이어티 또는 신포 증폭쌍의 제1 일원으로 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있다. 직접적으로 검출될 수 있는 모이어티의 예는 형광물질, 착색제, 콜로이달 골드, 색채 라텍스 등을 포함한다. 일 구현예에서, 모든 모이어티는 비의존적으로 선택된 형광물질이다. 서로 가깝게 근접하는 동안 식별가능한 판독을 제공하는 예를 들면, Cy3/Cy5, Cy5/피코에르트린, 등과 같은 임의의 형광물질의 쌍이 사용될 수 있다. 선택적으로, 올리고뉴클레오티드 어드레스가능한 어레이가 사용되면, 두 모이어티는 다른 지프 코드로 전달되는 동일한 형광물질 일 수 있다. 레이저 스캔 공초점 현미경이 어레이 상에 달라붙는 형광물질 모이어티를 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 복합체가 가닥 치환에서와 같이, 검출 이전에 어레이로부터 방출되는 검정법에서, 형광물질 모이어티를 검출하기에 적합한 방법은 모세관 유동 공초점 레이저 유도화된 형광,나노-HPLC, 마이크로-모세관 전기영동, 등을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 활성화 상태-비의존성 항체는 검출가능한 모이어티를 추가로 포함한다. 그러한 예에서, 검출가능한 모이어티의 양은 세포 추출액 내의 일 또는 그 이상의 분석물의 양과 상관관계에 있다. 검출가능한 모이어티의 예는 형광 라벨, 화학적 반응성 라벨, 효소 라벨, 방사성 라벨, 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 검출가능한 모이어티는 Alexa Fluor® 염료 (예를 들면, Alexa Fluor® 647), 플루오레세인, 플루오레세인, 이소티오시아네이트 (FITC), Oregon Green™; 로다민, Texas 레드, 테트라로다민 이소티오시아네이트 (TRITC), CyDye™ 플루오르 (예를 들면, Cy2, Cy3, Cy5), 등과 같은 형광물질이다. 검출가능한 모이어티는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 활성화 상태-비의존성 항체에 직접적으로 또는 간접적으로 커플링될 수 있다.
특정 예에서, 활성화 상태-비의존성 항체는 촉진 모이어티로 직접 표지된다. 촉진 모이어티는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 활성화 상태-비의존성 항체에 커플링될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 촉진 모이어티는 촉진 모이어티에 급접한 (즉, 공간적으로 근접하거가 가까운) 다른 분자에 채널링 (즉, 결합)되고 상기와 반응하여 (즉, 이러한 분석물에 결합하거나, 이에 의해 결합되거나, 이와 합께 복합체를 형성하는) 산화제를 발생시킬 수 있는 임의의 분자를 포함한다. 촉진 모이어티의 예는 글루코스 옥시다제(GO)와 같은 효소, 전자 수용체와 같은 분자 산소 (02)를 포함하는 산화/환원 반응을 촉진시키는 임의의 다른 효소, 메틸렌 블루, 로스 벤갈, 폴피린, 스부아레이트 염료, 프탈로시아닌, 등과 같은 광감작제를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 산화제의 비-제한적 예는 하이드로겐 퍼옥시다제 (H202), 일중 산소, 및 산소 원자를 전달하거나 산화/환원 반응에서 전자를 얻는 임의의 다른 화합물을 포함한다. 바람직하게는, 적합한 기질 (예를 들면, 글루코스, 라이트, 등)의 존재시, 촉진 모이어티 (예를 들면, 글루코스 옥시다제, 광감작제, 등)은 두개의 모이어티가 서로 근접할 경우, 신호 증폭쌍의 제1 일원 (예를 들면, 호스라디시 퍼옥시다제 (HRP), 보호기에 의해 보호되는 합텐, 효소 억제제에 티오에테르 결합에 의해 비활성화되는 효소, 등)에 채널링하고 상기와 반응하는 산화제 (예를 들면, 하이드로겐 퍼옥시다제 (H202), 단일 산소, 등)을 발생시킨다.
항체와 글루코스 옥시다제(GO)와 같은 촉진 모이어티 사이에 컨쥬게이트를 만들 경우 술프히드릴-변경 덱스트란 분자의 제조 및 그들의 사용은 그것의 전체 개시내용이 모든 목적을 위해 참조로서 본 명세서에 병합되는, PCT 공보 WO 2009/108637에 기술되어 있다.
특정 다른 예에서, 활성화 상태-비의존성 항체는 활성화 상태-비의존성 항체에 컨쥬게이트되는 올리고뉴클레오티드 링커와 촉진 모이어티에 컨쥬게이트되는 상보적인 올리고뉴클레오티드 링커 사이의 혼성화를 통해 촉진 모이어치로 간접적으로 표지된다. 올리고뉴클레오티드 링커는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 촉진 모이어티 또는 활성화 상태-의존성 항체에 결합될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 촉진 모이어티에 컨쥬게이트되는 올리고뉴클레오티드 링커는 활성화 상태-비의존성 항체에 컨쥬게이트되는 올리고뉴클레오티드 링커에 100% 상보성이 있다. 다른 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 링커 쌍은 예를 들면, 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화되는 경우, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 그 이상의 미스매치 영역을 포함한다. 당업자들은 다른 분석물에 특이적인 활성화 상태-비의존성 항체가 동일한 올리고뉴클레오티드 링커 또는 다른 올리고뉴클레오티드 링커에 컨쥬게이트될 수 있음을 이해할 것이다.
촉진 모이어티 또는 활성화 상태-비의존성 항체에 컨쥬게이트하는 올리고뉴클레오티드 링커의 길이는 변경될 수 있다. 일반적으로, 링커의 염기서열은 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 또는 100개의 뉴클레오티드 길이로 존재할 수 있다. 통상적으로, 무작위 핵산 염기서열이 발생하여 연결될 수 있다. 비-제한적 예로서, 올리고뉴클레오티드 링커의 라이브러리는 3개의 별개의 연속 도메인; 스페이서 도메인; 시그네쳐 도메인; 및 컨쥬게이션 도메인을 갖도록 고안될 수 있다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오티드 링커는 그들이 컨쥬게이트되는 촉진 모이어티 또는 활성화 상태-비의존성 항체의 기능을 파괴함이 없이 효율적으로 결합하기 위해 고안된다.
올리고뉴클레오티드 링커 염기서열은 다양한 분석 조건 하에 2차 구조를 예방하거나 최소화하기 위하여 고안될 수 있다. 용융 온도는 통상적으로 전체적인 분석 과정에서 그들이 침전되도록 링커 내부의 각각의 단편을 위해 조심스럽게 관찰될 수 있다. 일반적으로, 링커 염기서열의 단편의 용융 온도 범위는 5℃ 보다 높지 않다. 용융 온도, 2차 구조, 및 정의된 이온 농도 하의 헤어핀 구조를 측정하기 위한 컴퓨터 알고리즘 (예를 들면, OLIGO 6.0)이 각각의 링커 내부의 세개의 다른 도메인을 각각 분석하기 위하여 사용될 수 있다. 전체적으로 조합된 염기서열은 또한 그들의 구조적 특징 및 다른 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드 링커 염기서열에 대한 그들의 필적능력, 예를 들면 그들이 상보적인 올리고뉴클레오티드 링커에 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화할 것인지 여부가 측정될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 링커의 스페이서 영역은 올리고뉴클레오티드 교차결합 지점으로부터 컨쥬게이션 도메인의 적절한 분리를 제공한다. 컨쥬게이트 도메인은 핵산 혼성화를 통해 컨쥬게이션 도메인에 상보적인 올리고뉴클레오티드 링커로 표지된 분자를 결합합시키는 기능을 한다. 핵산-매개 혼성화는 항체-분석물 (즉, 항원) 복합물 형성 이전이나 이후에 수행됨으로써, 보다 유동적인 분석 포맷을 제공할 수 있다. 많은 직접적인 항체 컨쥬게이션 방법과 달리, 항체 또는 다른 분자에 상대적으로 작은 올리고뉴클레오티드를 연결하는 것은 그들의 표적 분석물에 대한 항체의 특이적 친화도와 컨쥬게이트된 분자의 기능에 작은 영향을 미친다.
몇몇 구현예에서, 올리고뉴클레오티드 링커의 시그네쳐(signature) 염기서열 도메인은 복합 먹티플렉스 단백질 검정법에서 사용될 수 있다. 다수의 항체는 다른 시그네쳐 염기서열로 올리고뉴클레오티드 링커와 컨쥬게이트될 수 있다. 멀티플렉스 면역검정법에서, 적당한 프로브로 표지된 리포터 올리고뉴클레오티드 염기서열은 멀티플렉스 분석법 포멧에서 항체와 그것의 항원 사이의 가교-혼성화를 검출하기 위하여 사용될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 링커는 몇몇의 다른 방법을 사용하여 항체 또는 다른 분자에 컨쥬게이트될 수 있다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 링커는 5' 또는 3' 말단상의 티올기로 합성될 수 있다. 상기 티올기는 환원제 (예를 들면, TCEP-HC1)를 사용하여 비보호(deprotect) 될 수 있고, 생성된 링커는 탈염 스핀 컬럼을 사용하여 정제될 수 있다. 생성된 비보호 올리고뉴클레오티드 링커는 SMCC와 같은 헤테로이기능성 가교제를 사용하여 항체 또는 다른 유형의 단백질 상의 1차 아민에 컨쥬게이트될 수 있다. 대체적으로, 올리고뉴클레오티드 상의 5'-인산기는 수용성 카보디이미드 EDC로 처리됨으로써 아민-함유 분자에 포스페이트 에스테르를 형성한 후 아민-함유 분자에 결합될 수 있다. 특정 예에서, 3'-리보스 잔기 상의 디올은 산화됨으로써 알데히드기로 산화된 후 환원성 아민화를 사용하여 항체 또는 다른 유형의 단백질의 아민기에 컨쥬게이트될 수 있다. 특정 다른 예에서, 상기 올리고뉴클레오티드 링커는 3' 또는 5'상의 비오틴 변형으로 합성된 후 스트렙타비딘-표지 분자에 컨쥬게이트될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 링커는 문헌 [Usman et al. , J. Am. Chem. Soc, 109:7845 (1987); Scaringe et al, Nucl. Acids Res., 18:5433 (1990); Wincott et al, Nucl. Acids Res., 23:2677-2684 (1995); 및 Wincott et al, Methods Mol Bio., 74:59 (1997)]에 기술된 바와 같이, 공지된 임의의 다양한 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드의 합성은 5'-말단에서 디메톡시트리틸 및 3'-말단에서 포스포르아미디티와 같은 공통의 핵산 보호기 및 결합기를 사용한다. 올리고뉴클레오티드 합성을 위한 적합한 시약, 핵산 비보호를 위한 방법, 및 핵산 정제를 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다.
전체 및 인산화 분석물의 동시 검출을 위한 올리고뉴클레오티드-컨쥬게이트된 항체의 제조 및 사용은 PCT 공보 WO 2008/036802에 기술되어 있다, 상기 전체 개시내용은 본 목적을 위하여 참조로서 본 명세서에 통합된다.
특정 예에서, 활성화 상태-의존성 항체는 신호 증폭쌍의 제1 일원으로 표지된다. 상기 신호 증폭쌍의 일원은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 활성화 상태-의존성 항체에 결합될 수 있다. 특정의 다른 예에서, 활성화 상태-의존성 항체는 활성화 상태-의존성 항체에 컨쥬게이트된 결합쌍의 제1 일원과 신호 증폭쌍의 제1 일원에 컨쥬게이트된 결합쌍의 제2 일원 사이의 결합을 통해 신호 증폭쌍의 제1 일원으로 간접적으로 표지된다. 결합쌍 일원들 (예를 들면, 비오틴/스트렙타비딘)은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 신호 증폭쌍 일원 또는 활성화 상태-의존성 항체에 결합될 수 있다. 신호 증폭쌍 일원의 예는 호스라디시 퍼옥시다제 (HRP), 카탈라아제, 클로로퍼옥시다제, 사이토크롬 c 퍼옥시다제, 호산구 퍼욱시다제, 글루타티온 퍼옥시다제, 락토퍼옥시다제, 미엘로퍼옥시다제, 갑상선 퍼옥시다제, 탈이온효소 등과 같은 퍼옥시다제를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 신호 증폭쌍 일원의 다른 예는 보호기에 의해 보호된 합텐 및 효소 억제제로의 티오에테르 결합에 의해 비활성화된 효소를 포함한다.
포획 항체, 활성화 상태-비의존성 항체, 및 활성화 상태-의존성 항체는 통상적으로 분석물 결합에 대한 그들 사이의 경쟁 (즉, 모든 항체들은 그들의 대응되는 융합 단백질 또는 신호 전달 분자에 동시에 결합할 수 있다)이 최소화되도록 선택된다.
근접 채널링의 일 예에서, 촉진 모이어티는 글루코스 옥시다제 (GO)이고 신호 증폭쌍의 제1 일원은 호스라디시 퍼옥시다제 (HRP)이다. GO가 글루코스와 같은 기질에 접촉되면, 그것은 산화제 (즉, 하이드로겐 퍼옥시다제 (¾02)를 발생시킨다. HRP가 GO에 근접한 채널링 내에 존재하면, GO에 의해 발생된 H202는 신호 증폭쌍의 제2 일원 (예를 들면, 루미놀 또는 이소루미놀과 같은 화학발광 기질 또는 티라미드 (예를 들면, 비오틴-티라미드), 호모바닐산, 또는 4-히드록시페닐 아세트산과 같은 형광 기질)이 증폭된 신호를 발생시키는, HRP-H202 복합체를 형성하기 위하여 채널링되고, HRP로 복합체를 형성한다. 근접 검정법에서 GO 및 HRP를 사용하는 방법은 예를 들면, 문헌 [Langry et al, U.S. Dept. of Energy Report No. UCRL-ID- 136797 (1999)]에 기술되어 있다. 비오틴-티라미드가 신호 증폭쌍의 제2 일원으로 사용될 때, HRP-H202 복합체는 티라미드를 산화시킴으로써 친핵성 잔기 근처에서 공유 결합하는 반응성 타리미드 라디칼을 발생시킨다. 활성화된 티라미드는 바로 검출되거나 예를 들면, 스트렙타비딘-표지된 형광물질 또는 스트렙타비딘-표지된 퍼옥시다제와 발색 시약의 조합과 같은 신호-검출 시약을 첨가하여 검출된다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 형광물질의 예는 Alexa Fluor® 염료 (예를 들면, Alexa Fluor® 555), 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC), Oregon Green™; 로다민, Texas 레드, 테트라로다민 이소티오시아네이트 (TRITC), CyDye™ 플루오 (예를 들면, Cy2, Cy3, Cy5), 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 스트렙타비딘 표지는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 형광물질 또는 퍼옥시다제에 직접적으로 또는 간접적으로 결합될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 발색 시약의 비-제한적 예는 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 (TMB), 3,3'-디아미노벤지딘 (DAB), 2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산) (ABTS), 4-클로로-1 -납톨 (4CN), 및/또는 플피리노겐을 포함한다.
근접 채널링의 다른 예에서, 촉진 모이어티는 광감작제이고 신포 증폭쌍의 제1 일원은 특이적 결합 파트너 (예를 들면, 리간드, 항체, 등)에 합텐의 결합을 방지하는 보호기로 보호된 다수의 합텐으로 표지된 거대 분자이다. 예를 들면, 신호 증폭쌍 일원은 보호 비오틴, 코우마린, 및/또는 플루오레세인 분자로 표지된 덱스트란 분자일 수 있다. 적합한 보호기는 페녹시-, 아날리노-, 올레핀-, 티오에테르-, 및 셀레노에테르-보호기를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 근접법에 사용하기에 적합한 추가의 광감작제 및 보호 합텐 분자는 미국 특허 제5,807,675호에 기술되어 있다. 광감작제가 빛을 방출하면, 산화제 (즉, 일중 산소)가 발생된다. 합텐 분자가 광감작제 근처의 채널링 내에 존재하면, 광감작제에 의해 발생된 일중 산소는 카보닐기 (켑톤 또는 알데히드) 및 술폰산을 생산하기 위하여 합텐의 보호기 상의 티오에테르에 채널링하여 반응함으로써 합텐으로부터 보호기를 방출시킨다. 그 다음, 비보호 합텐은 신호 증폭쌍의 제2 일원 (검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 특이적 결합 파트너)에 특이적으로 결합하도록 이용가능하다. 예를 들면, 합텐이 비오틴일 때, 특이적 결합 파트너는 효소-표지된 스트렙타비딘일 수 있다. 예시적인 효소는 알칼린 포스파타제, β-갈락토시다제, HRP, 등을 포함한다. 비결합 시약의 제거를 위한 세척 이후에, 상기 검출가능한 신호는 효소의 검출가능한 기질을 첨가하는 것에 의해 발생되고, 당업계에 공지된 적당한 방법 및 기구를 사용하여 검출될 수 있다. 대체적으로, 검출가능한 신호는 티라미드 신호 증폭을 사용하여 증폭되고, 직접적으로 검출되거나 또는 상기 기술된 신호-검출 시약을 첨가하여 검출될 수 있다.
근접 채널링의 다른 예에서, 촉진 모이어티는 광감작제이고, 신호 증폭쌍의 제1 일원은 효소-억제제 복합체이다. 상기 효소 및 억제제 (예를 들면, 포스포닌산-표지 덱스트린)는 절단성 링커 (예를 들면, 티오에테르)에 의해 함께 링크된다. 광감작제가 빛을 방출하면, 산화제 (즉, 일중 산호)가 발생된다. 효소-억제제 복합체가 광감작제에 근접한 채널내에 존재해면, 광감작제에 의해 발생된 일중 산호는 절단성 링커에 채널링하고 상기에 반응함으로써 효소로부터 억제제를 방출하고 효소를 활성화시킬 수 있다. 효소 기질을 첨가하여 검출가능한 신호를 발생시키거나 또는 대체적으로 증폭 시약을 첨가하여 증폭된 신호를 발생시킨다.
근접 채널링의 추가 예에서, 촉진 모이어티는 HRP이고, 신호 증폭쌍의 제1 일원은 상기 기술된 바와 같이 합텐 또는 효소-억제제를 보호하고, 보호기는 p-알콕시 페놀을 포함한다. 페닐렌디아민 및 H202의 첨가는 비보호 합텐 또는 효소-억제제 복합체에 채널링하여 p-알콕시 페놀 보호기와 반응하는, 반응성 페닐렌 디이민을 발생시킴으로써, 노출된 합텐 또는 반응성 효소를 생성한다. 증폭된 신호는 상기 기술된 바와 같이 발생하고 검출된다 (예를 들면, 미국 특허 제5,532,138호 및 제5,445,944호 참고).
당업자들은 항체 보다는 결합 파트너가 본 명세서에 기술된 근접 (즉, 3-항체) 검정법에 따라 세포 추출액으로부터 일 또는 그 이상의 분석물을 고착화시키고 그리고/또는 검출하기 위하여 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 그러한 결합 파트너의 비-제한적 예는 분석물의 리간으 또는 수용체, 분석물의 기질, 결합 도메인 (예를 들면, (예를 들면, PTB, SH2, 등), 압타머, 등을 포함한다.
본 명세서에 기술된 근접 검정법을 수행하기 위한 예시적인 프로토콜은 실시예 1에 제공되어 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 (a) 고체 지지체 상에 고정된 다수의 포획 항체의 연속된 희석물; 및 (b) 다수의 검출 항체 (예를 들면, 활성화 상태-비의존성 항체 및 활성화 상태-의존성 항체를 포함하는 상기 기술된 근접 검정법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 몇몇 예에서, 키트는 하나 또는 복수개의 융합 단백질 및/또는 신호 전달 분자의 활성화 상태를 검출하기 위한 키트의 사용 방법에 관한 지시서를 더욱 함유한다. 키트는 또한 예를 들면, 신호 증폭쌍의 제1 및 제2 일원, 티라미드 신호 증폭 시약, 촉진 모이어티용 기질, 세척 완충제 등과 같은 본 발명의 특이적 방법을 수행과 관련되는 상기 기술된 임의의 추가적인 시약을 함유한다.
IV . 항체 어레이의 제작
특정 측면에서, 본 발명은 고체 지지체 상에 고정된 포획 항체의 연속된 희석물을 사용하여 세포 추출액 내의 하나 또는 복수개의 융합 단백질의 활성화 상태를 검출하기 위한 항체-기반 어레이를 제공한다. 본 발명의 검정법에서 사용되는 어레이는 통상적으로 다른 어드레스가능한 위치에서 고체 지지체의 표면에 결합되는 광범위한 포획 항체 농도에서 다수의 일 또는 그 이상의 다른 포획 항체를 포함한다.
고체 지지체는 단백질을 고착화하기 위한 임의의 적합한 기질을 포함할 수 있다. 고체 지지체의 예는 유리 (예를 들면, 유리 슬라이드), 플라스틱, 칩 핀, 필터, 비드 (예를 들면, 자석 비드, 폴리스티렌 비드, 등), 종이, 막, 섬유 다발, 젤, 금속, 세라믹, 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 나일론 (Biotrans™, ICN Biomedicals, Inc. (Costa Mesa, CA); Zeta-Probe®, Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA)), 니트로실룰로오스 (Protran®, Whatman Inc. (Florham Park, NJ)), 및 PVDF (Immobilon™, Millipore Corp. (Billerica, MA))과 같은 막들이 본 발명의 어레이에서 고체 지지체로 사용하기에 적합하다. 바람직하게는, 포획 항체는 니트로셀룰로오스 폴리머, 예를 들면 Whatman inc. (Florham Park, NJ)로부터 상업적으로 이용가능한, FAST® Slides로 코팅된 유리 슬라이드상에 고정된다.
요망되는 고체 지지체의 특정 측면은 다량의 포획 항체를 결합시키는 능력, 최소한의 변성으로 포획 항체를 결합시키는 능력, 및 다른 단백질을 결합시키지 않은 능력을 포함한다. 다른 적합한 측면은 포획 항체를 함유하는 항체 용액이 지지체에 적용될 때 고체 지지체가 최소한의 "위킹(wicking)"을 나타내는 것이다. 최소한의 위킹을 갖는 고체 지지체는 적은 분취량의 포획 항체 용액이 지지체에 적용되는 것을 가능하게 하여, 작은, 규정된 스폿의 고정 포획 항체를 생성시킨다.
포획 항체는 통상적으로 공유 또는 비-공유 결합 (예를 들면, 이온 결합, 소수성 결합, 수소 결합, 반 데르 발스 힘, 쌍극자-쌍극자 결합)을 통해 고체 지지체 상에 직접적으로 또는 간접적으로 (예를 들면, 포획 태그를 통해) 고정된다. 몇몇 구현예에서, 포획 항체는 표준 가교결합 방법 및 조건을 이용하여 동종이기능성 또는 이종이기능성 가교제를 사용하여 고체 지지체에 교차 부착된다. 적합한 가교체는 예를 들면, Pierce Biotechnology (Rockford, IL)와 같은 업체로부터 상업적으로 이용가능하다.
본 발명의 어레이를 발생시키는 방법은 단백질 또는 핵산 어레이를 제작하기 위해 사용되는 임의의 기술을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 몇몇 구현예에서, 포획 항체는 통상적으로 스프릿 핀(split pin), 블런트 핀(blunt pin), 또는 잉크젯 프린팅이 장착된 로봇 프린터인, 마이크로스포터(microspotter)를 사용하여 어레이 상에 스폿된다. 본 명세서에 기술된 항체 어레이를 프린팅하기에 적합한 로봇 시스템은 ChipMaker2 스프릿 핀 (TeleChem International; Sunnyvale, CA)을 지닌 PixSys 5000 로봇 (Cartesian Technologies; Irvine, CA) 뿐만 아니라 BioRobics (Woburn, MA)로부터 이용가능한 다른 로봇 프린터 및 Packard Instrument Co. (Meriden, CT)를 포함한다. 바람직하기는, 각각의 포획 항체 희석의 적어도 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 복제물이 어레이 상에 스폿된다.
본 발명의 항체 어레이를 발생시키기 위한 다른 방법은 정의된 부피의 액체를 지지체 상에 그리기에 유효한 조건 하에 고체 지지체 상에 모세 디스펜서를 접촉시킴으로써 각각의 선택된 어레이 위치에 공지된 부피의 포획 항체 희석을 분배시키는 것을 포함하고, 여기서 상기 공정은 각각의 선택된 어레이 위치에서 선택된 포획 항체 희석을 사용하여 반복됨으로써 완성된 어레이를 생성한다. 상기 방법은 용액-증착 단계가 각각의 반복 사이클에서 각각의 다수의 고체 지지체 상에 선택된 위치에 적용되는 경우, 다수의 그러한 어레이를 형성하기에 실용적일 수도 있다. 그러한 방법의 더욱 구체적인 설명은 예를 들면, 미국 특허 제5,807,522호에서 찾아볼 수 있다.
특정 예에서, 종이에 프린팅하기 위한 장치가 본 발명의 항체 어레이를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 요망하는 포획 항체 희석이 데스크탑 제트 프린터의 프린트헤드로 로딩될 수 있고, 적합한 고체 지지체 상에 프린트될 수 있다 (예를 들면, 문헌 [Silzel et al., Clin. Chem., 44:2036-2043 (1998)] 참고).
몇몇 구현에에서, 고체 지지체 상에서 발생되는 어레이는 적어도 약 5 스폿/cm2, 바람직하게는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000 또는 9000, 또는 10,000 스폿/cm2의 밀도를 가진다.
특정 예에서, 고체 지지체 상의 스폿들은 각각 다른 포획 항체를 나타낸다. 특정의 다른 예에서, 고체 지지체 상의 다수의 스폿들은, 예를 들면 감소하는 포획 항체 농도의 시리즈를 포함하는 연속된 희석물과 동일한 포획 항체를 나타낸다.
고체 지지체 상의 항체 어레이를 제조하고 건설하기 위한 방법의 추가적인 예는 미국 특허 제6,197,599호, 제6,777,239호, 제6,780,582호, 제6,897,073호, 제7,179,638호, 및 제7,192,720호; 미국 특허 공보 제20060115810호, 제20060263837호, 제20060292680호, 및 제20070054326호; 및 문헌 [Varnum et al., Methods Mol. Biol., 264: 161-172 (2004)]에 기술되어 있다. .
항체 어레이를 스캐닝하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 단백질 또는 핵산 어레이를 스캐닝하는데 사용되는 임의의 기술을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 사용하기에 적합한 마이크로어레이 스캐너는 PerkinElmer (Boston, MA), Agilent Technologies (Palo Alto, CA), Applied Precision (Issaquah, WA), GSI Lumonics Inc. (Billerica, MA), 및 Axon Instruments (Union City, CA)로부터 이용가능하다. 비-제한적 예로서, 형광 검출을 위한 GSI ScanArray3000가 정량을 위한 ImaGene 소프트웨어와 함께 사용될 수 있다.
V. 암 치료를 위한 약물 선택 및 최적화
특정 측면에서, 본 발명은 일 또는 그 이상의 비조절된 신호전달 경로를 하향-조절하거나 중단시키기에 적합한 치료의 선택을 위한 방법을 제공한다. 특정의 다른 측면에서, 본 발명은 암을 갖고 암의 치료를 위한 치료요법 과정을 공급받고 있는 환자에서 치료를 최적화시키고 그리고/또는 독성을 경감시키기 위한 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 제공된 환자의 암 또는 종양에서 활성화된 종양원성 융합 단백질 및/또는 신호 전달 단백질의 수거에 의해 제공되는 특정 분자 시그네쳐를 바탕으로 개인화된 치료요법의 설계를 촉진시키기 위해 사용될 수도 있다.
따라서, 일 특정 측면에서, 본 발명은 암을 갖고 있으며 암의 치료를 위한 치료요법 과정을 공급받고 있는 환자에서 치료를 최적화시키고 그리고/또는 독성을 경감시키기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방볍은:
(a) 항암 약물의 투여 이후에 암 세포를 단리하는 단계 (예를 들면, Gleevec®, Tasigna®, Sprycel®, 등과 같은 일 또는 그 이상의 타이로신 키나제 억제제);
(b) 상기 단리된 세포를 용해함으로써, 세포 추출액을 생산하는 단계;
(c) 본 명세서에 기술된 검정법을 사용하여 세포 추출액 내의 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 수준을 측정하는 단계;
(d) 상기 측정된 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 수준을 치료요법 과정 동안 이른 시간에 측정된 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 수준과 비교하는 단계; 및
(e) 단계 (d)로부터의 비교를 바탕으로 환자에 치료요법 과정의 후속 용량 또는 환자에게 치료요법의 다른 과정을 투여해야 하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
특정 예에서, 전체 및 활성화된 (예를 들면, 인산화된) 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL) 수준은 본 발명의 항체-기반 검정법에 따라 세포 추출액에서 측정되고, 그리고 전체 종양원성 융합 단백질 수준에 대한 활성화된 것의 비율 (예를 들면, 인산/전체 BCR-ABL 단백질 수준의 비율)이 계산되어, 예를 들면 인산/전체 종양원성 융합 단백질 수준의 비율을 이른 시간 (예를 들면, 항암 약물 치료요법 동안 이른 시간 또는 항암 약물 치료요법 이전의 시점)에서 피검체에서 동일하게 계산된 비율과 비교함으로써 피검체를 위한 치료요법 과정을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
관련 측면에서, 본 발명은 암을 갖고 있고 암의 치료를 위한 치료요법 과정을 수여받고 있는 피검체에서 치료요법을 최적화시키고 그리고/또는 독성을 경감시키니 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 항암 약물의 투여 이후에 암 세포를 단리하는 단계 (예를 들면, Gleevec®, Tasigna®, Sprycel®, 등과 같은 일 또는 그 이상의 타이로신 키나제 억제제)
(b) 상기 단리된 세포를 용해함으로써, 세포 추출액을 생산하는 단계;
(c) 본 명세서에 기술된 검정법을 사용하여 종양원성 융합 단백질 및 그것의 경로에 있는 일 또는 그 이상의 신호 전달 분자의 발현 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 수준을 측정하는 단계; 및
(d) 상기 측정된 종양원성 융합 단백질 및 신호 전달 분자의 발현 및/또는 활성화 수준을 치료요법 과정 동안 이른 시간에 측정된 종양원성 융합 단백질 및 신호 전달 분자의 발현 및/또는 활성화 수준과 비교하는 단계; 및
(e) 단계 (d)로부터의 비교를 바탕으로 피검체를 위한 치료요법 과정의 후속 용량 또는 피검체에게 치료요법의 다른 과정을 투여해야 하는지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
특정 구현에에서, 전체 및 활성화된 (예를 들면, 인산화된) 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL) 수준 및 전달 경로 성분 (예를 들면, CRKL, JAK2, STAT5) 수준은 본 발명의 항체-기반 검정법에 따라 세포 추출액 내에서 측정되고, 전체 종양원성 융합 단백질 수준에 대한 활성화된 것의 비율 (예를 들면, 인산화/전체 BCR-ABL 단백질 수준의 비율) 및 전체 신호 전달 경로 성분 수준에 대한 활성화된 것의 비율 (예를 들면, 인산화/전체 CRKL, JAK2, 또는 STAT5 단백질 수준의 비율)은 피검체에서 치료요법 과정을 평가하기 위하여, 예를 들면 인산/전체 종양원성 융합 단백질 및 신호 전달 경로 성분 수준의 비율을 이른 시간 (예를 들면, 항암 약물 치료요법 동안 이른 시간 또는 항암 약물 치료요법 이전의 시점)에 상기 피검체에서 동일하게 측정된 비율과 비교함으로써 계산되고 사용될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 암의 치료에 적합한 항암 약물을 선택하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 항암 약물의 투여 이후에 또는 항암 약물과 인큐베이션 이전에 암 세포를 단리하는 단계;
(b) 상기 단리된 세포를 용해함으로써, 세포 추출액을 생산하는 단계;
(c) 본 명세서에 기술된 검정법을 사용하여 세포 추출액 내의 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 수준을 측정하는 단계;
(d) 상기 종양원성 융합 단백질의 검출된 발현 및/또는 활성화 수준을 항암 약물의 부재시 발생하는 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교함으로써, 항암 약물이 암의 치료에 적합하거나 부적합한지 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 암의 치료에 적합한 항암 약물을 선별하기 위한 방법은:
(a) 항암 약물의 투여 이후에 또는 항암 약물과 인큐베이션 이전에 암 세포를 단리하는 단계;
(b) 상기 단리된 세포를 용해함으로써, 세포 추출액을 생산하는 단계;
(c) 검정법을 사용하여 종양원성 융합 단백질에 특이적인 포획 항체의 연속된 희석물을 포함하는 세포 추출액 내의 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 수준을 측정하는 단계, 여기서 상기 포획 항체는 고체 지지체 상에 고정되고;
(d) 상기 종양원성 융합 단백질의 검출된 발현 및/또는 활성화 수준을 항암 약물의 부재시 발생하는 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하는 단계; 및
(e) 종양원성 융합 단백질에서 검출된 발현 및/또는 활성화 수준이 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하여 바뀔 때 (예를 들면, 실질적으로 감소될 때) 상기 항암 약물이 암의 치료에 적합하다고 나타내는 단계를 포함한다.
특정 예에서, 바람직한 구현예는 종양원성 융합 단백질에서 검출된 발현 및/또는 활성화 수준이 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하여 바뀌지 않았을 때 (예를 들면, 실질적으로 감소되지 않을 때) 항암 약물이 암의 치료에 부적합함을 나타내는 단계를 즉, 단계 (f)로서 포함하거나, 대체적으로 즉, 단계 (e)로서 포함한다. 다른 예에서, 세포 추출액 내에 존재하는 일 또는 그 이상의 신호 전달 분자는 일 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질과 함께 검출되고, 항암 약물은 상기 "분자 프로파일"을 바탕으로 적합한지 부적합지가 측정된다.
특정 구현예에서, 전체 또는 활성화된 (예를 들면, 인산화된) 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL) 수준은 본 발명의 항체-기반 검정법에 따라 세포 추출액에서 측정되고, 전체 종양원성 융합 단백질 수준에 대한 활성화된 것의 비율 (예를 들면, 인산/전체 BCR-ABL 단백질 수준의 비율)은 항암 약물이 암의 치료에 적합한지 부적합한지 여부를 측정하기 위하여, 예를 들면, 인산/전체 종양원성 융합 단백질 수준의 비율을 항암 약물의 부재시 발생되는 참조 발현 및 활성화 프로파일을 바탕으로 동일하게 계산된 비율과 비교함으로써, 계산되고 사용될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 항암 약물로 치료에 대한 암의 반응을 확인하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 항암 약물의 투여 이후에 또는 항암 약물로 인큐베이션 이전에 암 세포를 단리하는 단계;
(b) 상기 단리된 세포를 용해함으로써, 세포 추출액을 생산하는 단계;
(c) 본 명세서에 기술된 검정법을 사용하여 세포 추출액 내의 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 수준을 측정하는 단계; 및
(d) 상기 종양원성 융합 단백질에서 검출된 발현 및/또는 활성화 수준을 항암 약물의 부재시 발생하는 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교함으로써 항암 약물로 치료에 반응성 또는 비-반응성으로 암을 확인하는 단계를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 항암 악물로 치료에 암의 반응성을 확인하기 위한 방법은:
(a) 항암 약물의 투여 이후에 또는 항암 약물로 인큐베이션 이전에 암 세포를 단리하는 단계;
(b) 상기 단리된 세포를 용해함으로써, 세포 추출액을 생산하는 단계;
(c) 검정법을 사용하여 종양원성 융합 단백질에 특이적인 포획 항체의 연속된 희석물을 포함하는 세포 추출액 내의 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 수준을 측정하는 단계, 여기서 상기 포획 항체는 고체 지지체 상에 고정되고;
(d) 상기 종양원성 융합 단백질의 검출된 발현 및/또는 활성화 수준을 항암 약물의 부재시 발생하는 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하는 단계; 및
(e) 종양원성 융합 단백질의 검출된 발현 및/또는 활성화 수준이 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하여 바뀔 때 (예를 들면, 실질적으로 감소될 때) 암이 항암 약물로 치료에 반응성이 있는 것으로 나타내는 단계를 포함한다.
특정 예에서, 바람직한 구현예는 종양원성 융합 단백질에서 검출된 발현 및/또는 활성화 수준이 참조 발현 및/또는 활성화에 비해 바뀌지 않을 때 (예를 들면, 실질적으로 감소되지 않을 때) 암이 항암 약물로 치료에 비-반응성인 것으로 나타내는 단계를 즉, 단계 (f)로서, 또는 대체적으로 즉, 단계 (e)로서 추가로 포함할 수도 있다. 다른 예에서, 세포 추출액 내에 존재하는 일 또는 그 이상의 신호 전달 분자는 일 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질과 함께 검출되고, 암은 상기 "분자 프로파일"을 바탕으로 치료에 반응성 또는 비-반응성으로 확인된다.
특정 구현에에서, 전체 및 활성화된 (예를 들면, 인산화된) 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL) 수준은 본 발명의 항체-기반 검정법에 따라 세포 추출액에서 측정되고, 전체 종양원성 융합 단백질 수준에 대한 활성화된 것의 비율 (예를 들면, 인산/전체 BCR-ABL 단백질 수준의 비율)은 계산되고, 암이 항암 약물로 치료에 반응성 또는 비-반응성인지 여부를, 예를 들면 인산/전체 종양원성 융합 단백질 수준의 비율을 항암 약물의 부재시 발생되는 참조 발현 및 활성화 프로파일을 바탕으로 동일하게 계산된 비율과 비교함으로써, 확인하기 위하여 사용될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 항암 약물로 치료에 암을 갖는 환자의 반응을 예측하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은:
(a) 항암 약물의 투여 이후에 또는 항암 약물로 인큐베이션 이전에 암 세포를 단리하는 단계;
(b) 상기 단리된 세포를 용해함으로써, 세포 추출액을 생산하는 단계;
(c) 본 명세서에 기술된 검정법을 사용하여 세포 추출액 내의 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 수준을 측정하는 단계;
(d) 상기 종양원성 융합 단백질의 검출된 발현 및/또는 활성화 수준을 항암 약물의 부재시 발생하는 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교함으로써, 환자가 항암 약물로의 치료에 반응할 가능성을 예측하는 단계를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 항암 약물로 치료에 암을 갖는 환자의 반응을 예측하는 방법은:
(a) 항암 약물의 투여 이후에 또는 항암 약물로 인큐베이션 이전에 암 세포를 단리하는 단계;
(b) 상기 단리된 세포를 용해함으로써, 세포 추출액을 생산하는 단계;
(c) 검정법을 사용하여 종양원성 융합 단백질에 특이적인 포획 항체의 연속된 희석물을 포함하는 세포 추출액 내의 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 수준을 측정하는 단계, 여기서 상기 포획 항체는 고체 지지체 상에 고정되고;
(d) 상기 종양원성 융합 단백질의 검출된 발현 및/또는 활성화 수준을 항암 약물의 부재시 발생하는 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하는 단계; 및
(e) 종양원성 융합 단백질의 검출된 발현 및/또는 활성화 수준이 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하여 바뀌었을 때 (예를 들면, 실질적으로 감소될 때) 환자가 항암 약물로의 치료에 반응하는 것으로 나타내는 단계를 포함한다.
특정 예에서, 바람직한 구현예는 종양원성 융합 단백질에서 검출된 발현 및/또는 활성화 수준이 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하여 비뀌지 않을 때 (예를 들면, 실질적으로 감소되지 않을 때) 환자가 항암 약물로 치료에 반응성이 없는 것으로 나타내는 단계를 즉, 단계 (f)로서, 또는 대체적으로 즉, 단계 (e)로서 추가로 포함할 수도 있다. 다른 예에서, 세포 추출액 내에 존재하는 일 또는 그 이상의 신호 전달 분자는 일 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질과 함께 검출되고, 환자가 치료에 반응할 가능성은 상기 "분자 프로파일"을 바탕으로 예측된다.
특정 구현예에서, 전체 및 활성화된 (예를 들면, 인산화된) 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL) 수준은 본 발명의 항체-기반 검정법에 따라 세포 추출액 내에서 측정되고, 전체 종양원성 융합 단백질 수준에 대한 활성화된 것의 비율 (예를 들면, 인산화/전체 BCR-ABL 단백질 수준의 비율)은 환자가 항암 약물로 치료에 반응할 가능성을 가지는지 여부를 예측하기 위하여, 예를 들면 인산/전체 종양원성 융합 단백질 수준의 비율을 항암 약물의 부재시 발생되는 참조 발현 및 활성화 프로파일을 바탕으로 동일하게 계산된 것의 비율과 비교함으로써, 계산되어 사용될 수 있다.
추가적인 측면에서, 본 발명은 암을 갖는 환자가 항암 약물로 치료에 내성이 있는지 여부를 측정하기 위한 방법을 제공하는 것으로바, 상기 방법은:
(a) 항암 약물의 투여 이후에 또는 항암 약물로 인큐베이션 이전에 암 세포를 단리하는 단계;
(b) 상기 단리된 세포를 용해함으로써, 세포 추출액을 생산하는 단계;
(c) 본 명세서에 기술된 검정법을 사용하여 세포 추출액 내의 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 수준을 측정하는 단계;
(d) 종양원성 융합 단백질에 검출된 발현 및/또는 활성화 수준을 항암 약물의 부재시 또는 이른 시간에 항암 약물의 존재시 발생되는 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교함으로써 환자가 항암 약물로 치료에 내성이 있거나 민감한지 여부를 측정하는 단계를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 암을 갖는 환자가 항암 약물로 치료에 내성이 있는지 여부를 측정하는 단계는:
(a) 항암 약물의 투여 이후에 또는 항암 약물로 인큐베이션 이전에 암 세포를 단리하는 단계;
(b) 상기 단리된 세포를 용해함으로써, 세포 추출액을 생산하는 단계;
(c) 검정법을 사용하여 종양원성 융합 단백질에 특이적인 포획 항체의 연속된 희석물을 포함하는 세포 추출액 내의 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 (예를 들면, 인산화) 수준을 측정하는 단계, 여기서 상기 포획 항체는 고체 지지체 상에 고정되고;
(d) 상기 종양원성 융합 단백질의 검출된 발현 및/또는 활성화 수준을 항암 약물의 부재시 또는 이른 시간 항암 약물의 존재시 발생하는 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하는 단계; 및
(e) 종양원성 융합 단백질에 검출된 발현 및/또는 활성화 수준이 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하여 바뀌지 않을 때 (예를 들면, 실질적으로 감소되지 않을 때) 환자가 항암 약물로 치료에 내성이 있는 것으로 나타내는 단계를 포함한다.
특정 예에서, 바람직한 구현예는, 종양원성 융합 단백질의 검출된 발현 및/또는 활성화 수준이 참조 발현 및/또는 활성화 프로파일과 비교하여 바뀔 때 (예를 들면, 실질적으로 감소될 때) 환자가 항암 약물로 치료에 민감한 것으로 나타내는 단계를 즉, 단계 (f)로서, 또는 대체적으로 즉, 단계 (e)로서 추가로 포함할 수도 있다. 다른 예에서, 세포 추출액 내에 존재하는 일 또는 그 이상의 신호 전달 분자는 일 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질과 함께 검출되고, 환자는 상기 "분자 프로파일"을 바탕으로 내성이 있거나 민감한 것으로 확인된다.
특정 구현예에서, 전체 및 활성화된 (예를 들면, 인산화된) 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL) 수준은 본 발명의 항체-기반 검정법에 따라 세포 추출액에서 측정되고, 전체 종양원성 융합 단백질 수준에 대한 활성화된 것의 비율 (예를 들면, 인산/전체 BCR-ABL 단백질 수준의 비율)은 환자가 항암 약물로 치료에 내성이 있거나 민감한지 여부를 측정하기 위하여, 예를 들면 인산/전체 종양원성 융합 단백질 수준의 비율을 항암 약물의 부재시 또는 이른 시간 항암 약물의 존재시 발생되는 참조 발현 및 활성화 프로파일을 바탕으로 계산된 것의 비율과 비교함으로써, 계산되고 사용될 수 있다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 방법은 단계 (d)의 결과를 의사에게, 예를 들면 종양학자 또는 일반 개업 의사에 보내거나 보고하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다. 다른 구현에에서, 본 발명의 방법은 단계 (d)의 결과를 컴퓨터, 예를 들면 실험실에서, 컴퓨터 데이타베이스 또는 정보 저장을 위한 기계 또는 장치에 입력하거나 저장하는 단계를 추가로 포함할 수도 있다.
몇몇 구현예에서, 본 발명의 방법은 단리된 암 세포와 같은 세포로부터 암을 갖는 환자의 샘플을 수득하는 단게를 추가로 포함할 수도 있다. 상기 샘플은 항암 약물의 치료 이전에 (예를 들면, 항암 약물로 인큐베이션 이전에) 또는 항암 약물 치료 이후에 (예를 들면, 암 치료의 과정을 통한 임의의 시점에) 환자로부터 수득될 수도 있다. 적합한 샘플은 전혈, 혈장, 혈청, 유관 세척액, 유두 흡인물, 림프 (예를 들면, 림프절의 분포된 종양 세포), 골수 흡인물, 타액, 소변, 대변 (즉, 배설물), 담, 기관지 세정액, 눈물, 미세침 흡인물 (예를 들면, 무작위 유두 미세침 흡인에 의해 채취됨), 임의의 다른 체액, 종양 조직과 같은 조직 샘플 (예를 들면, 종양 세포) (예를 들면, 침 생검) 또는 림프절 (예를 들면, 감시(sentinel) 림프절 생검), 및 그것의 세포 추출액을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 몇몇 구현예에서, 샘플은 혈장, 혈청, 적혈구와 같은 전혈 또는 이의 분획 성분, 말초 혈액 단핵 세포와 같은 백혈구 및/또는 희귀 순환 세포이다. 특정 구현예에서, 상기 샘플은 전혈 또는 그것의 세포 분획물로부터 임의의 공지된 기술을 사용하여 고형 종양의 백혈구 또는 순환 세포를 단리함으로써 수득된다. 단리된 세포가 항암 약물로 치료를 수여받지 않은 환자로부터 수득되는 경우, 단리된 세포는 단계 (c)에서 검출될 분석물의 일 또는 그 이상의 분석물을 표적하는 항암 약물 또는 그것의 칵테일로 적합한 조건 하에 인 비트로에서 인큐베이션될 수도 있다.
특정 구현예에서, 암은 악성혈액 종양 (예를 들면, 백혈병, 림프종),골육종 (예를 들면, 유잉육종), 연조직 육종 (예를 들면, 융기성 피부섬유육종 (DFSP), 횡문근육종), 다른 연조직 종양, 갑상선 유두암, 전립선암이다. 특정 구현예에서, 상기 암은 암 세포 또는 종양에서 염색체 전좌로 인해 종양원성 융합 단백질의 형성에 의해 야기된다.
몇몇 구현예에서, 단리된 세포는 본 명세서에 기술된 성장 인자로 인 비트로에서 자극된다. 다른 구현예에서, 항암 약물은 본 명세서에 기술된 일 또는 그 이상의 치료제를 포함할 수도 있는 것으로, 상기는 모노클로날 항테, 타이로신 키나제 억제제, 화학제료제, 호르몬 치료제, 방사능치료제, 및 백신을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
몇몇 구현예에서, 세포 추출액 내에 존재하는 종양원성 융합 단백질에서 검출된 활성화 상태는 예를 들면, 인산화 상태, 유비퀴틴화 상태, 복합화 상태, 또는 그것의 조합일 수도 있다. 다른 구현예에서, 상기 고체 지지체는 예를 들면, 유리, 플라스틱, 칩, 핀, 필터, 비드, 종이, 막, 섬유 다발, 및 그것의 조합을 포함할 수도 있다. 다른 구현예에서, 상기 포획 항체는 어드레스가능한 어레이내의 고체 지지체 상에 고정된다.
특정 구현예에서, 단계 (c)의 분석법은:
(i) 상기 세포 추출액을 포획 항체의 연속된 희석물과 인큐베이션 (예를 들면, 상기에 접촉)함으로써 다수의 포획 종양원성 융합 단백질을 형성하는 단계 (예를 들면, 세포 추출액 내에 존재하는 종양원성 융합 단백질을 종양원성 융합 단백질과 포획 항체를 포함하는 포획 종양원성 융합 단백질의 복합체로 전환시키는 단계);
(ii) 다수의 포획 종양원성 융합 단백질을 동일하거나 다른 종양원성 융합 단백질의 도메인에 특이적인 활성화 상태-비의존성 항체 및 활성화 상태-의존성 항체를 포함하는 검출 항체와 인큐베이션 (예를 들면, 상기에 접촉)함으로써 다수의 검출가능한 포획 종양원성 융합 단백질을 형성하는 단계 (예를 들면, 포획 종양원성 융합 단백질의 복합체를 포획 종양원성 융합 단백질 및 검출 항체를 포함하는 검출가능한 포획 종양원성 융합 단백질의 복합체로 전환하는 단계),
여기서, 상기 활성화 상태-비의존성 항체는 촉진 모이어티로 표지되고, 상기 활성화 상태-의존성 항체는 신포 증폭쌍의 제1 일원으로 표지되고, 그리고 촉진 모이어티는 신포 증폭쌍의 제2 일원에 채널링하여 이에 반응하는 산화제를 발생시키고;
(iii) 다수의 검출가능한 포획 분석물을 신호 증폭쌍의 제2 일원과 함께 인큐베이션 (예를 들면, 상기에 접촉)함으로써 증폭 신호를 발생하는 단계; 및
(iv) 신호 증폭쌍의 제1 및 제2 일원으로부터 발생된 증폭 신호를 검출하는 단계를 포함한다.
활성화 상태-비의존성 항체는 직접적으로 촉진 모이어티로 표지되거나, 예를 들면 활성화 상태-비의존성 항체에 컨쥬게이트된 올리고뉴클레오티드와 촉진 모이어티에 컨쥬게이트된 상보적인 올리고뉴클레오티드 사이의 혼성화를 통해, 간접적으로 표지될 수도 있다. 마찬가지로, 활성화 상태-의존성 항체는 신호 증폭쌍의 제1 일원으로 직접적으로 표지될 수도 있고, 또는 예를 들면, 활성화 상태-의존성 항체에 컨쥬게이트된 결합 쌍의 제1 일원과 신호 증폭쌍의 제1 일원에 컨쥬게이트된 결합 쌍의 제2 일원 사이의 결합을 통해 신포 증폭쌍의 제1 일원으로 간접적으로 표지될 수도 있다. 특정 예에서, 결합쌍의 제1 일원은 비오틴이고, 결합쌍의 제2 일원은 스트렙타비딘 또는 뉴트라비딘과 같은 아비딘이다.
몇몇 구현예에서, 촉진 모이어티는 예를 들면, 글루코스 옥시다제 (GO)일 수도 있다. 특정 예에서, 상기 GO 및 활성화 상태-비의존성 항체는 술프히드릴-활성화된 덱스트란 분자에 컨쥬게이트될 수 있다. 술프히드릴-활성화된 덱스트란 분자는 통상적으로 약 500kDa (예를 들면, 약 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 또는 750kDa)의 분자량을 가진다. 다른 구현예에서, 상기 산화제는 예를 들면, 하이드로겐 퍼옥시다제 (H202)일 수도 있다. 다른 구현예에서, 신호 증폭쌍의 제1 일원은 예를 들면, 호스라디시 퍼옥시다제 (HRP)과 같은 퍼옥시다제일 수도 있다. 추가 구현예에서, 신호 증폭쌍의 제2 일원은 예를 들면, 티라미드 시약 (예를 들면, 비오틴-티라미드) 일 수도 있다. 바람직하게는, 상기 증폭된 신호는 비오틴-티라미드의 퍼옥사다제 산화에 의해 발생됨으로써, 활성화된 티라미드를 생성한다 (예를 들면, 비오틴-티라미드를 활성화된 티라미드로 전환한다). 활성화된 티라미드는 직접적으로 검출되거나, 예를 들면 신호-검출 시약을 첨가하는 것에 의해 간접적으로 검출된다. 신호-검출 시약의 비-제한적 예는 스트렙타비딘-표지 형광물질, 및 스트렙타비딘-표지 허옥시다제와 예를 들면 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)과 같은 발색 시약의 조합을 포함한다.
특정 예에서, HRP 및 활성화 상태-의존성 항체는 술프히드릴-활성화된 덱스트란 분자에 컨쥬게이트될 수 있다. 슬프히드릴-활성화된 덱스트란 분자는 통상적으로 약 70kDa (예를 들면, 약 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 lOOkDa)의 분자량을 가진다.
VI . 항체의 보호
본 발명에 따른 세포 추출액 또는 분해물과 같은 생물학적 샘플 내의 종양원성 융합 단백질 또는 신호 전달 분자의 활성화 상태를 분석하기 위해 종래의 상업적으로 이용불가능한 항체의 생산 및 선택은 몇몇의 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들면, 일 방법은 당업계에 공지된 단백질 발현 및 정제 방법을 사용하여 목적 폴리펩티드 (즉, 항원)을 발현시키고/발현시키거나 정제하는 것인 반면, 다른 방법은 당업계에 공지된 고체상 펩티드 합성 방법을 사용하여 목적 폴피펩티드를 합성시키는 것이다. 예를 들면, 문헌 [Guide to Protein Purification, Murray P. Deutcher, ed., Meth. Enzymol., Vol. 182 (1990); Solid Phase Peptide Synthesis, Greg B. Fields, ed., Meth. Enzymol., Vol. 289 (1997); Kiso et al, Chem. Pharm. Bull., 38: 1192-99 (1990); Mostafavi et al, Biomed. Pept. 단백질s Nucleic Acids, 1 :255-60, (1995); 및 Fujiwara ei al, Chem. Pharm. Bull, 44: 1326-31 (1996)] 참고. 상기 정제되거나 합성된 폴리펩티드는 그 다음 예를 들면, 마우스 또는 래빗으로 주입됨으로써 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 생성할 수 있다. 당업자들은 항체를 생산에 예를 들면, 문헌 [Antibodies, A Laboratory Manual, Harlow and Lane, Eds., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1988)] 기술된 바와 같이 많은 과정들이 이용될 수 있을 것임을 이해할 것이다. 당업자들은 또한 항체를 모방하는 (예를 들면, 항체의 기능적 결합 영역을 보유하는) 결합 단편 또는 Fab 단편들이 다양한 과정에 의해 유전자 정보로부터 제조될 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들면, 문헌 [Antibody Engineering: A Practical Approach, Borrebaeck, Ed., Oxford University Press, Oxford (1995); and Huse et al., J. Immunol, 149:3914-3920 (1992)] 참고.
추가로, 다양한 간행물들은 선택될 표적 항체에 결합하기 위한 폴리펩티드의 라이브러리를 생산하고 스크리닝하기 위한 파지 디스플레이 기술의 사용을 보고하고 있다 [예를 들면, Cwirla et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6378-6382 (1990); Devlin et al, Science, 249:404-406 (1990); Scott et al, Science, 249:386-388 (1990); and Ladner et al, U.S. Patent No. 5,571,698) 참고). 파지 디스플레이 방법의 기본 개념은 파지 DNA에 의해 코드화되는 폴리펩티드와 표적 항원 사이의 물리적 연관관계의 성립이다. 이러한 물리적 연관관계는 폴리펩티드를 코드화하는 파지 게놈을 둘러싸는 캡시드의 일부로서, 폴리펩티드를 나타내는 파지 입자들에 의해 제공된다. 폴리펩티드와 그들의 게놈 물질을 사이의 물리적 연관관계의 성립은 다양한 폴리펩티드를 지니는 매우 많은 수의 파지의 동시적인 대규모 스크리닝을 가능하게 한다. 표적 항원에 친화성을 갖는 폴리펩티드를 나타내는 파지는 표적 항원에 결합하고, 이러한 파지는 표적 항원으로의 친화성 스크리닝에 의해 농축화된다. 이러한 파지로부터 나타내어진 폴리펩티드의 확인은 그들의 각각의 게놈으로부터 결정될 수 있다. 이러한 방법을 사용하여, 요망하는 표적 항원에 결합 친화도를 갖는 것으로 확인된 폴리펩티드는 그 다음 통상적인 수단 (예를 들면, 미국 특허 제6,057,098호 참고)에 의해 대규모로 합성될 수 있다.
이러한 방법에 의해 발생된 항체는 그 다음 목적의 정제된 폴리펩티드 항원으로 친화성 및 특이성에 대해 먼저 스크리닝되고, 필요에 따라 결합으로부터 배제되는 것이 바람직한 다른 폴리펩티드 항원으로 항체에 대한 친화성 및 특이성의 결과를 비교하는 것에 의해 선택될 수 있다. 스크리닝 과정은 미세역가 플레이트의 각각의 웰 내에서 정제된 폴리텝티드 항체의 고착화를 포함한다. 잠재적인 항체 또는 항체 그룹을 함유하는 용액은 그 다음 각각의 미세역가 웰 내로 배치되고, 약 30 분 내지 2 시간 동안 배양된다. 미세역가 웰은 그 다음 세척되고 표지된 제2 항체 (예를 들면, 생성되는 항체가 마우스 항체인 경우, 알칼리성 포스파타제에 컨쥬게이트된 항-마우스 항체)가 웰에 첨가되고 약 30분 동안 배양된 다음 세척된다. 기질이 웰에 첨가되고 고착화된 폴리펩티드 항원에 대한 항체가 존재하는 경우, 색 반응이 관찰될 것이다.
이렇게 확인된 항체는 그 다음 친화성 및 특이성에 대해 추가 분석될 수 있다. 표적 단백질의 면역검정법의 개발에서, 정제된 표적 단백질은 선택된 항체를 이용하는 면역검정법의 민감성 및 특이성을 판단하는 표준으로 작용한다. 다양한 항체의 결합 친화성이 다양할 수 있기 때문에, 예를 들면 특정 항체 조합은 다른 것을 입체적으로 방해할 수도 있기 때문에, 항체에 대한 분석 수행은 항체의 절대 친화성 및 특이성 보다 중요한 척도일 수도 있다.
당업자들은 항체 또는 결합 단편의 생성, 및 다양한 목적 폴리펩티드에 대한 친화성 및 특이성의 스크리닝 및 선택에서 다양한 접근법이 이용될 수 있으나, 이러한 접근법은 본 발명의 범위를 변경하지 않을 것임을 인지할 것이다.
A. 폴리클로날 항체
폴리클로날 항체는 바람직하게는 목적 폴리펩티드 및 애듀번트의 다수의 피하 (sc) 또는 복막내 (ip) 주사에 의해 동물에서 생성된다. 그것은 목적 폴리펩티드를 이작용성 또는 유도체화 작용제를 이용하여 면역화되는 종에서 면역원성인 단백직 담체, 예를 들면 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin), 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 대두 트립신 억제제에 컨쥬세이션하기에 유용할 수도 있다. 이기능성 또는 유도체화 작용제의 비-제한적 예는 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통해 컨쥬게이션), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통해 컨쥬게이션), 글루타르알데히드, 숙신 무수물, SOCl2 및 R1N=C=NR을 포함하고, 여기서 R 및 R1은 다른 알킬기이다
동물은, 예를 들어, 100 ㎍ (래빗) 또는 5 ㎍ (마우스)의 항원 또는 컨쥬게이트와 3 부피의 Freund 완전 애쥬번트를 조합시키고, 이 용액을 다수의 부위에 피내 주사함으로써 관심 폴리펩티드 또는 이의 면역원성 컨쥬게이트 또는 유도체에 대해 면역화된다. 1개월 후, 동물은 다수의 부위에서 피하 주사에 의해 Freund 불완전 애쥬번트 중의 본래 양의 약 1/5 내지 1/10의 폴리펩티드 또는 컨쥬게이트를 이용하여 부스팅(boosting)된다. 7 내지 14일 후, 상기 동물들은 채혈되고 혈청 역가를 위해 혈청이 분석된다. 동물들은 통상적으로 역가 안정기까지 부수팅된다. 바람직하게는, 동물은 동일한 폴리펩티드의 컨쥬게이트로 부스팅되지만, 다른 면역원성 단백질로 컨쥬게이션 될 수도 있고 그리고/또는 다른 가교-결합 시약을 통한 컨뷰게이션이 사용될 수도 있다. 컨쥬게이션은 또한 융합 단백질로서 재조합 세포 배양물에서 제조되 수 있다. 특정 예에서, 명반과 같은 응집 작용제가 면역반응을 향상시키기 위하여 사용될 수 있다.
B. 모노클로날 항체
모노클로날 항체는 일반적으로 실질적으로 동종성인 항체의 집단으로부터 수득되는 것으로, 즉 개별적 항체를 포함하는 집단은 소량으로 존재할 수도 있는 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 수식어구 "모노클로날"은 별개의 항체의 혼합물이 아닌 항체의 특성을 나타낸다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al.,Nature, 256:495 (1975)]에 기재된 하이브리도마 방법을 이용하거나, 당해 기술 분야에 공지된 임의의 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조)에 의해 제조될 수 있다.
하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 기타 적절한 숙주 동물 (예를 들면, 햄스터)은 상기 기재된 바와 같이 면역화됨으로써, 면역화에 사용되는 목적 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 생성하거나 생성할 수 있는 림프구를 유도한다. 대안적으로, 림프구는 인 비트로에서 면역화된다. 상기 면역화된 림프구는 그 다음 적절한 융합제, 예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 골수종 세포와 융합됨으로써, 하이브리도마 세포를 형성한다 (예를 들면, 문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986)] 참조). 이에 따라 제조된 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 모(parental) 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 일 또는 그 이상의 물질을 함유하는 적절한 배양 배지에 시딩되고 성장된다. 예를 들면, 모 골수종 세포가 효소 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제(HGPRT)가 결핍되어 있는 경우, 하이브리도마 세포를 위한 배양 배지는 통상적으로 HGPRT-결여 세포의 성장을 방지하는, 하이포잔틴, 아미놉테린 및 티미딘 (HAT 배지)를 포함할 것이다.
바람직한 골수종 세포는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생성 세포에 의한 안정적인 고-수준의 항체 생성을 지지하고, 그리고/또는 HAT 배지와 같은 배지에 민감하다. 인간 모노클로날 항체의 생성을 위한 바람직한 골수종 세포주의 예는 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 (Salk Institute Cell Distribution Center로부터 이용가능; San Diego, CA), SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포 (미국 미생물보존센터고부터 입수가능; Rockville, MD), 및 인간 골수종 또는 마우스-인간 이종골수종 세포주 (예를 들어, 문헌 [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); 및 Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc.,New York, pp. 51-63 (1987)] 참조)로부터 유래된 것과 같은 뮤린 골수종 세포주를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 목적 폴리펩티드에 특이적인 모노클로날 항체의 생성을 분석할 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 방사선면역측정법(RIA) 또는 효소면역측정법(ELISA)과 같은 면역침전법에 의해 또는 인 비트로 결합 분석법에 의해 측정된다. 모노클로날 항체의 결합 특이성은, 예를 들면, 문헌 [Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980)]의 스캐차드(Scatchard) 분석법을 이용하여 측정될 수 있다.
요망되는 특이성, 친화성 및/또는 활성을 갖는 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 확인된 후, 클론은 희석 과정을 제한함으로써 서브클로닝되고, 표준 방법에 의해 성장할 수 있다 (예를 들면, 문헌 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986)] 참조). 이러한 목적에 적합한 배지는, 예를 들면 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 게다가, 하이브리도마 세포는 동물 내의 복수 종양으로서 인 비보(in vivo)에서 성장될 수 있다. 서브클론에 의해 분비되는 모노클로날 항체는 통상적인 항체 정제 과정, 예를 들면 단백질 A-세파로오스, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피에 의해 배지, 복수 또는 혈청으로부터 분리될 수 있다.
모노클로날 항체를 코드화하는 DNA는 통상적인 절차를 이용하여 용이하게 단리되고 시퀀싱될 수 있다 (예를 들면, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코드화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함). 하이브리도마 세포는 상기 DNA의 바람직한 공급원으로 작용한다. 일단 단리된 후, DNA는 발현 벡터 내에 배치될 수 있고, 그 다음 대장균 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary, CHO) 세포, 또는 다른 항체를 생성하지 않는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 형질감염됨으로써, 재조합 숙주 세포에서 모노 클로날 항체의 합성이 유도된다 (예를 들면, 문헌 [Skerra et al., Curr. Opin. Immunol., 5:256-262 (1993); 및 Pluckthun, Immunol Rev., 130:151-188 (1992)] 참조). DNA는 또한, 예를 들어 동종성 뮤린 염기서열 대신 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 염기서열을 대체 (예를 들면, 미국 특허 제 4,816,567호; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)] 참조)하거나, 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 염기서열의 전부 또는 일부에 면역글로불린 코딩 서열을 공유적으로 연결시킴으로써 변형될 수 있다.
추가적 구현예에서, 모노클로날 항체 또는 항체 단편은, 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990); Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)]; 및 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 생성된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 사슬 셔플링(shuffling)에 의한 고 친화성(nM 범위) 인간 모노클로날 항체의 생성이 문헌 [Marks et al., BioTechnology, 10:779-783 (1992)]에 기재되어 있다. 매우 큰 파지 라이브러리를 제작하기 위한 방법으로서 조합 감염(Combinatorial infection) 및 인 비보 재조합의 이용이 문헌 [Waterhouse et al., Nuc. Acids Res., 21:2265-2266 (1993)]에 기재되어 있다. 따라서, 이러한 기술은 모노클로날 항체의 생성을 위한 전통적인 모노클로날 항체 하이브리도마 방법에 대한 실용적인 대안이다.
C. 인간화된 항체
비-인간 항체를 인간화시키기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 바람직하게는, 인간화된 항체는 비인간인 공급원으로부터 항체로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 가진다. 이러한 비-인간 아미노산 잔기는 종종 "유입(import)" 잔기로 언급되고, 이는 통상적으로 "유입" 가변 도메인으부터 취해진다. 인간화는 본질적으로 비-인간 항체의 초가변(hypervariable) 영역 염기서열을 인간 항체의 상응하는 염기서열로 치환하는 것에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); 및 Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)] 참조. 따라서, 이러한 "인간화된" 항체는 키메라 항체 (예를 들면, 미국 특허 제 4,816,567호 참조)로서, 여기서 실질적으로 무손상 인간 가변 도메인이 비-인간 종으로부터의 상응하는 염기서열에 의해 치환되는 것이 아니다. 실제로, 인간화된 항체는 통상적으로 몇몇 과가변 영역 잔기 및 몇몇 프레임워크 영역(FR) 잔기가 설치류 항체의 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환되는 인간 항체이다.
본 명세서에 기재된 인간화된 항체를 제조하는데 사용하기 위한, 경쇄 뿐만 아니라 중쇄의, 인간 가변 도메인의 선택은 항원성을 감소시키는데 있어서 중요한 고려사항이다. 소위 "가장-적합한(best-fit)" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 도메인의 염기서열은 공지된 인간 가변-도메인 염기서열의 전체 라이브러리에 대해 스크리닝된다. 설치류의 서열과 가장 근접한 인간 서열은 그 다음 인간화된 항체를 위한 인간 FR로서 수용된다 (예를 들면, 문헌 [Sims et al.,J. Immunol., 151:2296 (1993); 및 Chothia et al., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)] 참조). 또 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 모든 인간 항체의 콘센서스(consensus) 서열로부터 유래된 특정 FR을 이용한다. 여러 상이한 인간화된 항체에 대해 동일한 FR이 사용될 수도 있다 (예를 들면, 문헌 [Carter et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al., J. Immunol., 151 :2623 (1993)] 참조).
항체가 항원에 대한 높은 친화성 및 기타 바람직한 생물학적 특성을 보유하면서 인간화되는 것이 또한 중요하다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 인간화된 항체는 모(parental) 염기서열 및 인간화된 서열의 3차원 모델을 이용하여 모 서열 및 다양한 개념상의 인간화된 생성물의 분석 방법에 의해 제조될 수 있다. 3차원 면역글로불린 모델은 상업적으로 이용가능하고, 당해 기술분야의 당업자에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 염기서열의 예상적인 3차원 형태의 구조를 예시하고 전시하는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이러한 전시의 검사는 후보 면역글로불린 염기서열의 기능에 있어서 잔기의 가능한 역할의 분석, 즉 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식에서, FR 잔기가 선택될 수 있고, 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화성과 같은 원하는 항체 특성이 달성될 수 있도록, 수용체 및 유입 서열로부터 조합될 수 있다. 일반적으로, 과가변 영역 잔기는 항원 결합의 영향에 있어서 직접적이고 특이적으로 관련된다.
본 발명에 따른 다양한 형태의 인간화된 항체가 고려된다. 예를 들어, 인간화된 항체는 Fab 단편과 같은 항체 단편일 수 있다. 대안적으로, 인간화된 항체는 무손상 IgA, IgG 또는 IgM 항체와 같은 무손상 항체일 수 있다.
D. 인간 항체
인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체가 발생될 수 있다. 몇몇 구체예에서, 면역화 후 내인성 면역글로불린 생성물의 부재시 인간 항체의 전체 레퍼토리(repertoire)를 생성할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)이 생성될 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식-계열 돌연변이 마우스에서의 항체 중쇄 결합 영역(JH) 유전자의 동종접합 결실은 내인성 항체 생성의 완전한 억제를 야기시키는 것으로 기재되어 있다. 상기 생식-계열 돌연변이 마우스에서의 인간 생식-계열 면역글로불린 유전자 어레이의 이동은 항원 공격(challenge)시 인간 항체를 생성시킬 것이다. 예를 들면, 문헌 [Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immun., 7:33 (1993)]; 및 미국 특허 제 5,591,669호, 제 5,589,369호, 및 제 5,545,807호 참조.
대안적으로, 비면역화 공여체로부터의 면역글로불린 가변(V) 도메인 유전자 레퍼토리를 사용하여, 인 비트로에서 인간 항체 및 항체 단편을 생산하기 위하여 파지 전시 기술 (예를 들면, 문헌 [McCafferty et al.,Nature, 348:552-553 (1990)] 참조)이 이용될 수 있다. 이러한 기술에 따르면, 항체 V 도메인 유전자는 M13 또는 fd와 같은 섬유상 박테리오파지의 메이저(major) 및 마이너(minor) 코트 단백질 유전자로 인-프레임(inframe) 클로닝되고, 파지 입자의 표면 상에 기능적 항체 단편으로 전시된다. 섬유상 입자는 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 카피를 함유하므로, 항체의 기능적 특성에 기초한 선택은 또한 상기 특성을 나타내는 항체를 코드화하는 유전자의 선택을 초래한다. 따라서, 파지는 B 세포의 몇몇 특성을 모방한다. 파지 전시는 예를 들면, 문헌 [Johnson et al., Curr. Opin. Struct. Biol., 3:564-571 (1993)]에 기재된 바와 같이 다양한 포맷으로 수행될 수 있다. V-유전자 세그먼트의 여러 공급원이 파지 전시에 사용될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)] 참고. 비면역 인간 공여체로부터의 V 유전자의 레퍼토리가 작제될 수 있고, 다양한 어레이의 항원자가 항원(self-antigen)을 포함함)에 대한 항체가 본질적으로 문헌 [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Griffith et al., EMBO J., 12:725-734 (1993)]; 및 미국 특허 제 5,565,332호 및 제 5,573,905호에 기재된 기술에 따라 단리될 수 있다.
특정 예에서, 인간 항체는 예를 들면, 미국 특허 제 5,567,610호 및 제 5,229,275호에 기재된 바와 같이 인 비트로에서 활성화된 B 세포에 의해 생성될 수 있다.
E. 항체 단편
항체 단편을 생성하기 위한 다양한 기술이 개발되어 왔다. 전통적으로, 이러한 단편은 무손상 항체의 단백질분해성 분해를 통해 유래되었다 (예를 들면, 문헌 [Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Meth., 24: 107-117(1992); 및 Brennan et al., Science, 229:81 (1985)] 참조). 그러나, 이러한 단편은 재조합 숙주 세포를 이용하여 직접 생성될 수 있다. 예를 들면, 항체 단편은 상기 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, Fab'-SH 단편은 대장균 세포로부터 직접 회수되고 화학적으로 커플링되어 F(ab')2 단편을 형성할 수 있다 (예를 들면, 문헌 [Carter et al., BioTechnology, 10:163-167 (1992)] 참조). 다른 접근법에 따르면, F(ab')2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리될 수 있다. 항체 단편을 생성하기 위한 다른 기술은 당업자에게 명백할 것이다. 다른 구현예에서, 선택 항체는 단일 사슬 Fv 단편(scFv)이다. 예를 들면, PCT 공보 WO 93/16185호; 및 미국 특허 제5,571,894호 및 제 5,587,458호 참조. 항체 단편은 또한 예를 들면, 미국 특허 제 5,641,870호에 기재된 바와 같이 선형 항체일 수도 있다. 이러한 선형 항체 단편은 단일특이성이거나 이특이성일 수도 있다.
F. 이특이성 항체
이특이성 항체는 적어도 2개의 다른 에피토프에 대해 결합 특이성을 지니는 항체이다. 예시적인 이특이성 항체는 목적의 동일 폴리펩티드의 2개의 다른 에피토프에 결합할 수도 있다. 다른 이특이성 항체는 일 또는 그 이상의 추가 항원에 대한 결합 부위(들)을 갖는 목적의 폴리펩티드에 대한 결합 부위에 결합할 수도 있다. 이특이성 항체는 전장 항체 또는 항체 단편 (예를 들면, F(ab')2 이특이성 항체)로서 제조될 수 있다
이특이성 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전통적인 전장 이특이적 항체의 생산은 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동 발현을 기초로 하며, 여기서 상기 2개의 사슬은 상이한 특이성을 가진다 (예를 들면, 문헌 [Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)] 참조). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이러한 하이브리도마 (쿼드로마(quadromas))는 10개의 다른 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생성시키고, 그 중에서 단지 하나만이 올바른 이특이성 구조를 지닌다. 올바른 분자의 정제는 일반적으로 친화성 크로마토그래피에 의해 수행된다. 유사한 과정이 PCT 공보 WO 93/08829호 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659(1991)]에 기술되어 있다.
다른 접근법에 따르면, 원하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)를 갖는 항체 가변 도메인이 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합된다. 융합은 바람직하게는 힌지(hinge), CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는, 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 이용한다. 융합물의 적어도 하나에 존재하는 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역(CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 면역글로불린 중쇄 융합물 및 필요한 경우, 면역글로불린 경쇄를 코드화하는 DNA는 별개의 발현 벡터로 삽입되고, 적절한 숙주 유기체로 공동-형질감염된다. 이는 작제물에서 사용되는 동등하지 않은 비율의 3개의 폴리펩티드 사슬이 최적의 수율을 제공할 때, 구현예에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율의 조정에 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율의 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬의 발현이 높은 수율로 발생되거나 상기 비율이 특별한 유의성이 없는 경우, 2개 또는 3개 모두의 폴리펩티드 사슬에 대한 코딩 염기서열을 하나의 발현 벡터로 삽입시키는 것이 가능하다.
이러한 접근법의 바람직한 구체예에서, 이특이성 항체는 하나의 암(arm)에서 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄, 및 또 다른 암에서 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍(제2 결합 특이성을 제공함)으로 구성된다. 이러한 비대칭 구조는 이특이성 분자의 단지 절반에서의 면역글로불린 경쇄의 존재가 용이한 분리 수단을 제공함에 따라 원치않는 면역글로불린 사슬 조합으로부터 원하는 이특이성 화합물의 분리를 촉진한다. 예를 들면, PCT 공보 WO 94/04690호 및 문헌 [Suresh et al., Meth. Enzymol., 121:210 (1986)] 참조.
미국 특허 제 5,731,168호에 기재된 또 다른 접근법에 따르면, 항체 분자쌍 사이의 계면은 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 이종이합체의 백분율을 최대화시키기 위해 가공될 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 CH3 도메인 중 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 일 또는 그 이상의 작은 아미노산 측쇄는 보다 큰 측쇄 (예를 들면, 티로신 또는 트립토판)로 치환된다. 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 아미노산 측쇄 (예를 들면, 알라닌 또는 트레오닌)으로 치환함으로써 제2 항체 분자의 계면 상에 큰 측쇄(들)과 동일하거나 유사한 크기의 보충 "공동(cavity)"이 생성된다. 이는 동종이합체와 같은 다른 원치 않는 최종-생성물에 비해 이종이합체의 수율을 증가시키기 위한 메커니즘을 제공한다.
이특이성 항체는 가교-결합된 항체 또는 "헤테로컨쥬게이트(heteroconjugate)" 항체를 포함한다. 예를 들면, 헤테로컨쥬게이트된 항체 중 하나는 아비딘에 커플링될 수 있고, 나머지는 비오틴에 커플링될 수 있다. 헤테로컨쥬게이트 항체는 임의의 통상적인 가교-결합 방법을 이용하여 제조될 수 있다. 적절한 가교-결합제 및 기술은 당업계에 널리 공지되어 있고, 예를 들면 미국 특허 제 4,676,980호에 기재되어 있다.
항체 단편으로부터 이특이성 항체를 생성하기에 적절한 기술이 또한 당 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 이특이성 항체는 화학적 결합을 이용하여 제조될 수 있다. 특정 예에서, 이특이성 항체는 무손상 항체가 단백질분해적으로 분해됨으로써, F(ab')2 단편을 발생시키는 과정에 의해 생성될 수 있다 (예를 들면, 문헌 [Brennan et al.,Science, 229:81 (1985) 참조). 이러한 단편은 디티올 복합체 형성 작용제인 소듐 아르세나이트의 존재하에 환원되는 것에 의해, 인접한 디티올을 안정화시키고, 분자간 디술피드 형성을 방지한다. 생성된 Fab' 단편은 이후 티오니트로벤조에이트(TNB) 유도체로 전환된다. Fab'-TNB 유도체 중 하나는 이후 머캅토에틸아민으로 환원됨으로써 Fab'-티올로 재전환되고, 등몰량의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어, 이특이성 항체가 형성된다.
몇몇 구체예에서, Fab'-SH 단편은 대장균으로부터 직접적으로 회수될 수 있고 화학적으로 커플링됨으로써 이특이성 항체를 형성할 수 있다. 예를 들면, 완전히 인간화된 이특이성 항체 F(ab')2 분자는 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med.,175: 217-225 (1992)]에 기재된 방법에 의해 생성될 수 있다. 각각의 Fab' 단편은 대장균으로부터 개별적으로 분비되고, 인 비트로에서 직접벅으로 화학적 커플링에 적용되어, 이특이성 항체를 형성한다.
재조합 세포 배양물로부터 직접 이특이성 항체 단편을 제조하고 분리하기 위한 다양한 기술이 또한 기재되어 있다. 예를 들면, 이특이성 항체는 류신 지퍼(leucine zipper)를 이용하여 생성된다. 예를 들면, 문헌 [Kostelnyet al., J. Immunol, 148:1547-1553 (1992)] 참조. Fos 및 Jun 단백질로부터의 류신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의해 2개의 상이한 항체의 Fab' 부분에 링크된다. 항체 동종이합체는 힌지 영역에서 환원됨으로써, 모노머를 형성한 후 재산화되어, 항체 이종이합체를 형성한다. 이러한 방법은 또한 항체 동종이합체의 생성에 이용될 수 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디(diabody)" 기술은 이특이성 항체 단편을 제조하기 위한 대안적 메커니즘을 제공한다. 단편은 동일한 사슬 상의 2개의 도메인 사이에서 쌍(pairing)을 허용하기에는 너무 짧은, 링커에 의해 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인(VH)을 포함한다. 따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 도메인은 또 다른 단편의 상보적인 VL 및 VH 도메인과 쌍을 이루게 됨으로써, 2개의 항원 결합 부위를 형성한다. 단일-사슬 Fv (sFv) 이합체의 사용에 의해 이특이성 항체 단편을 제조하는 또 다른 방법은 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368(1994)]에 기재되어 있다.
2개 이상의 결합가를 갖는 항체가 또한 고려된다. 예를 들면, 삼특이성 항체가 제조될 수 있다. 예를 들면, 문헌 [Tutt et al., J. Immunol., 147:60 (1991)] 참조.
G. 항체 정제
재조합 기술을 이용하는 경우, 항체는 단리된 숙주 세포 내에서 또는 숙주 세포의 원형질막 주위공간 내에서 생성될 수 있거나, 숙주 세포로부터 배지로 직접 분비될 수 있다. 항체가 세포내에서 생성되는 경우, 특정 잔해물은 우선 예를 들면 원심분리 또는 초여과에 의해 제거된다. 문헌 [Carter et al., BioTech., 10:163-167 (1992)]에는 대장균의 원형질막 주위공간으로 분비되는 항체를 단리하는 과정이 기재되어 있다. 간단하게, 세포 페이스트가 아세트산 나트륨(pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드(PMSF)의 존재하에서 약 30분 동안 해동된다. 세포 잔해물은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 이러한 발현 시스템으로부터의 상층액은 일반적으로 이용가능한 단백질 농축 필터, 예를 들면 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 초여과 유닛을 이용하여 농축된다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제가 단백질분해를 억제하기 위해 상기 단계 중 어느 단계에 포함될 수도 있고, 항생제가 외래 오염물질의 성장을 방지하기 위해 포함될 수도 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은, 예를 들면 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 젤 전기영동, 투석 및 친화성크로마토그래피를 이용하여 정제될 수 있다. 친화성 리간드로서의 단백질 A의 적합성은 항체 내에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 동형(isotype)에 좌우된다. 단백질 A는 인간 γ1, γ2 또는 γ4 중쇄를 바탕으로 항체를 정제하는데 사용될 수 있다 (예를 들면, 문헌 [Lindmark et al., J. Immunol. Meth., 62:1-13(1983)] 참조). 단백질 G는 모든 마우스 동형 및 인간 γ3에 대해 권장된다 (예를 들면, 문헌 [Guss et al., EMBOJ., 5:1567-1575 (1986)] 참조). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 가장 흔하게는 아가로오스 이지만, 다른 매트릭스도 이용가능하다. 다공성 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로오스와 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로스를 이용하여 달성될 수 있는 것보다 빠른 유속 및 보다 짧은 처리 시간을 가능케 한다. 항체가 CH3도메인을 포함하는 경우, Bakerbond ABX™ 수지(J. T. Baker; Phillipsburg, N.J.)가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 다른 기술, 예를 들면 이온 교환 컬럼에서의 분획법, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의크로마토그래피, 헤파린 SEPHAROSE™에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지 (예를 들면, 폴리아스파르트산 컬럼)에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱(chromatofocusing), SDS-PAGE, 및 암모늄 설페이트 침전이 또한 회수될 항체에 따라 이용가능하다.
임의의 예비 정제 단계(들) 이후에, 목적의 항체 및 오염물질을 포함하는 혼합물은 바람직하게는 저염 농도 (예를 들면, 약 0-0.25M 염)에서 수행되는 약 2.5 내지 4.5의 pH에서 용리 완충용액을 이용하는 낮은 pH의 소수성 상호작용크로마토그래피에 적용될 수도 있다.
당해 기술 분야의 통상의 기술자는 항체와 유사한 기능을 갖는 임의의 결합 분자, 예를 들면 샘플 내의 일 또는 그 이상의 목적의 분석물에 특이적인 결합 분자 또는 결합 파트너가 또한 본 발명의 방법 및 조성물에 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 적절한 항체-유사 분자의 예는 도메인 항체, 유니바디(unibodies), 나노바디, 상어 항원 반응 단백질(shark antigen reative proteins), 애비머(avimers), 어드넥틴(adnectins), 안티캄스(anticalms), 친화성 리간드, 필로머((phylomers), 앱타머, 어피바디(affibodies), 트라이넥틴(trinectins) 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
VII . 투여 방법
본 발명의 방법에 따르면, 본 명세서에 기재된 항암 약물은 당해 기술 분야에 공지된 임의의 간편한 수단에 의해 피검체에게 투여된다. 본 발명의 방법은 피검체내 종양(예를 들어, 악성혈액 종양)의 치료에 적합한 항암 약물 또는 항암 약물의 조합물을 선별하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 항암 약물 또는 항암 약물의 조합물로의 치료에 대한 피검체내 종양 (예를 들어, 악성혈액 종양)의 반응을 확인하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 항암 약물 또는 항암 약물의 조합물로의 치료에 대한 종양 (예를 들면, 악성혈액 종양)을 갖는 피검체의 반응을 예측하기 위해 사용될 수 있다. 당해 기술 분야의 통상의 기술자는 본 명세서에 기술된 항암 약물이 단독으로 또는 종래의 화학치료, 방사능요법, 호르몬 요법, 면역요법, 및/또는 수술과 조합된 치료적 방법의 일부로서 투여될 수 있음을 이해할 것이다.
특정 구체예에서, 항암 약물은 모노클로날 항체 또는 티로신키나아제 억제제와 같은 항-신호전달제 (즉, 세포증식억제 약물); 항증식제; 화학치료제 (즉, 세포독성 약물); 호르몬 치료제; 방사선치료제; 백신; 및/또는 암 세포와 같은 이상 세포의 비조절 성장을 감소시키거나 제거하는 능력을 지닌 임의의 기타 화합물을 포함한다. 몇몇 구현예에서, 피검체는 적어도 하나의 화학치료제와 조합된 항-신호전달 작용제, 항-증식제, 및/또는 호르몬 치료제로 처리된다. 예시적인 모노클로날 항체, 티로신 키나아제 억제제, 항-증식제, 화학치료제, 호르몬 치료제, 방사선치료제, 및 백신은 상기에 기재되어 있다.
몇몇 구현예에서, 본 명세서에 기재된 항암 약물은 종래의 면역치료제와 함께 동시투여될 수 있는 것으로, 면역자극제 (예를 들면, 바실루스 칼메트-게렝(Bacillus Calmette-Guerin, BCG), 레바미솔, 인터루킨-2, 알파-인터페론 등), 면역독소 (예를 들어,항-CD33 모노클로날 항체-칼리케아미신 컨주게이트, 항-CD22 모노클로날 항체-슈도모나스 엑소톡신 컨주게이트, 등), 및 방사선면역치료제 (예를 들면, 111In, 90Y, 또는 131I 등에 컨주게이션된 항-CD20 모노클로날 항체, 등)을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
항암 약물은 필요에 따라 적합한 약제학적 부형제와 함께 투여될 수 있고 임의의 승인된 투여 모드를 통해 수행될 수 있다. 따라서, 투여는 예를 들면, 경구, 구강(buccal), 설하, 잇몸(gingival), 입천장(palatal), 정맥내( intravenous), 국소, 피하, 경피(transcutaneous), 경피(transdermal), 근내(intramuscular), 관절내(intra-joint), 비경구(parenteral), 소동맥내(intra-arteriole), 진피내(intradermal), 뇌실내(intraventricular), 두개내(intracranial), 복막내(intraperitoneal), 방광내(intravesical), 경막내(intrathecal), 병변내(intralesional), 비내(intranasal), 직장, 질내, 또는 흡입 투여일 수 있다. 용어 "동시-투여하다(co-administer)"는 항암 약물을 제2 약물(예를 들면, 또 다른 항암 약물, 항암 약물 치료제, 방사선치료제, 호르몬 치료제, 면역치료제 등과 관련된 부작용을 감소시키기 위해 사용되는 약물)과 동시에, 투여 직전, 또는 직후에 투여하는 것을 의미한다.
치료학적으로 유효량의 항암 약물은 예를 들면, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8회 또는 그 이상 반복적으로 투여되거나, 상기 용량은 연속 주입으로 투여될 수도 있다. 용량은 고체, 반-고체, 동결건조된 분말, 또는 액체 투여량 형태, 예를 들면, 정제, 환, 펠렛, 캡슐, 분말, 용액, 현탁제, 에멀젼, 좌제, 체류 관장제(retention enemas), 크림, 연고, 로션, 젤, 에어졸, 기포 등으로, 바람직하게는, 정확한 투여량의 단일 투여에 적합한 단위 투여량 형태를 가질 수도 있다.
본 명세서에 사용된, 용어 "단위 투여량 형태(unit dosage form)"는 인간 피검체 및 다른 포유동물을 위한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 유닛을 포함하며, 각각의 유닛은 적합한 약제학적 부형제 (예를 들면, 앰플)와 관련하여, 원하는 개시, 내성, 및/또는 치료적 효과를 생산할 수 있도록 계산된 미리결정된 양의 항암 약물을 함유한다. 또한, 더 농축된 투여량 형태가 제조될 수 있고, 그 이후에 더 희석된 단위 투여량 형태가 생산될 수 있다. 따라서 상기 더 농축된 투여량 형태는 예를 들면, 상기 항암 약물의 양의 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10배 이상 실질적으로 더 많은 양을 함유할 것이다.
그러한 투여량 형태를 제조하는 방법은 당해 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다 (예를 들면, 문헌 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18TH ED., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)] 참조). 투여량 형태는 전형적으로 종래의 약제학적 담체 또는 부형제를 포함하고, 추가적으로 다른 의약제(medicinalagents), 담체, 애주번트, 희석제, 조직 투과 증강제, 가용화제(solubilizers) 등을 포함할 수도 있다. 적절한 부형제는 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 방법으로 특정 투여량 형태 및 투여 경로에 따라 조절될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, supra] 참조).
적합한 부형제의 예는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 검 아카시아, 칼슘 포스페이트, 알기네이트, 트라가캔쓰, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 미세결정 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 살린, 시럽, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 및 카르보폴(Carbopols)과 같은 폴리아크릴산, 예를 들면, 카르보폴 941, 카르보폴 980, 카르보폴 981 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여량 형태는 추가적으로, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 미네알 오일과 같은 윤활제; 습윤제; 에멀젼화제; 현탁제; 메틸-, 에틸-, 및 프로필-히드록시-벤조에이트 (즉, 파라벤)과 같은 보존제; 무기 및 유기산 및 염기와 같은 pH 조절제; 감미제(sweetening agents); 및 착향제(flavoring agents)를 포함한다. 투여량 형태는 또한 생분해성 폴리머 비드, 덱스트란, 및 시클로덱스트린 포함 복합체를 포함할 수도 있다.
경구 투여 투여의 경우, 치료학적으로 유효 용량은 정제, 캡슐, 에멀젼, 현탁제, 용액, 시럽, 스프레이, 로젠지, 분말, 및 지연-방출 제형의 형태일 수 있다. 경구 투여에 적합한 부형제는 약제학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 탈컴, 셀룰로오스, 글루코스, 젤라틴, 수크로스, 마그네슘 카보네이트 등을 포함한다.
몇몇 구현예에서, 치료학적으로 유효 용량은 환, 정제, 또는 캡슐의 형태일 수 있으므로, 상기 투여량 형태는 항암 약물과 함께, 하기한 것들 중 임의의 것들을 함유할 수 있다: 락토오스, 수크로스, 디칼슘 포스페이트 등과 같은 희석제; 스타치 또는 이의 유도체와 같은 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 등과 같은 윤활제; 및 전분, 검 아카시아, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 셀룰로오스 및 이의 유도체와 같은 결합제(binder). 항암 약물은 또한 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 담체 중에 배치된 좌제로 제형화될 수 있다.
액체 투여량 형태는 예를 들면, 경구, 국소, 또는 정맥내 투여를 위한 용액 또는 현탁액을 형성시키기 위해, 예를 들면, 수성 살린 (예를 들면, 0.9% w/v 소듐 클로라이드), 수성 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등과 같은 담체 중에 항암 약물 및 임으로 일 또는 그 이상의 약제학적으로 허용가능한 애주번트를 용해 또는 분산시킴으로써 제조될 수 있다. 항암 약물은 또한 체류 관장제로 제형화될 수 있다.
국소 투여의 경우, 치료학적으로 유효 용량은 에멀젼, 로션, 젤, 기포, 크림, 젤리, 용액, 현탁액, 연고, 및 경피 패치의 형태일 수 있다. 흡입에 의한 투여의 경우, 항암 약물은 네뷸라이저들 통해 건조 분말 또는 액체 형태로 전달될 수 있다. 비경구 투여의 경우, 치료학적으로 유효 용량은 멸균 주사가능 용액 및 멸균 패키지된 분말의 형태일 수 있다. 바람직하게는, 주사가능 용액은 약 4.5 내지 약 7.5의 pH로 제형화된다.
치료학적으로 유효 용량은 또한 동결건조된 형태로 제공될 수 있다. 그러한 투여량 형태는, 투여 직전에 재구성을 위한, 완충액, 예를 들면 바이카보네이트를 포함할 수 있거나, 상기 완충액은 예를 들면, 물로의 재구성을 위한 동결건조된 투여량으로 포함될 수 있다. 동결건조된 투여량 형태는 적합한 혈관수축제 예를 들면, 에피네프린을 추가로 포함할 수 있다. 동결건조된 투여량 형태는 재구성된 투여량 형태가 즉시 피검체에게 투여될 수 있도록, 주사기, 임의로 재구성을 위한 완중액으로 조합되어 패키지되어 제공될 수 있다.
피검체는 또한 특정 치료 요법의 효능을 평가하기 위하여 주기적인 시간 간격으로 모니터링될 수 있다. 예를 들면, 특정 종양원성 융합 단백질 및/또는 신호 전달 분자의 전달 분자의 활성화 상태는 본 명세서에 기재된 일 또는 그 이상의 항암 약물을 사용하여 치료의 치료학적 효과를 바탕으로 바뀔 수도 있다. 피검체는 개별화된 방법으로 특정 약물 또는 치료제에 대한 반응을 평가하고 상기 약물 또는치료제의 효과를 이해하기 위해 모니터링될 수 있다. 추가적으로, 특이적 항암 약물 또는 항암 약물의 조합물에 대해 초기에 반응하는 피검체는 당해 약물 또는 약물 조합물에 대하여 난치성이 될 수도 있는 것으로, 이는 상기 피검체가 후천성 약물 내성으로 발전되었음을 나타낸다. 이러한 피검체는 이들의 현재 치료요법 및 본 발명의 방법에 따라 처방된 대안적인 치료제를 중단할 수 있다.
특정 측면에서, 본 명세서에 기술된 방법은 다양한 집단에서의 암 예후의 가능성 및/또는 재발의 가능성을 예측하는 유전자 발현 마커의 패널로 컨쥬게이션 시에 사용될 수 있다. 이러한 유전자 패널은 재발을 경험하지 않아서 애듀번트 화학치료법으로부터 이익이 없는 피검체를 확인하는데 유용할 수 있다. 발현 패널은 무-질병 및 전체적인 생존 결과에 부정적인 영향을 미침이 없이, 애듀번트 화학치료법을 안전하게 피하는 피검체를 확인하기 위하여 사용될 수 있다.
게다가, 특정 다른 측면에서, 본 명세서에 기술된 방법은 불명의 암(cancers of unknown primary, CUP)에서 원래의 종양을 확인하는 유전자 발현 마커의 패널로 컨쥬세이션할 때 사용될 수 있다. 이러한 유전자 패널은 암을 갖는 것으로 초기에 진단된 환자에 꾸준히 제공하는 치료요법의 이익을 갖는 전이 암을 갖는 환자를 확인할 때에 유용할 수 있다. 적합한 시스템은 Aviara CancerTYPE ID 분석법, 39개의 종양 유형에서 오리진의 주요 부위를 확인하기 위해 92개의 유전자를 측정하는 RT-PCR-기반 발현 분석법; 및 마이크로어레이 상에서 1600개의 유전자 이상의 발현을 측정하고, 15개의 공지된 조직 유형의 건에 대한 종양의 유전자 발현 "시그네쳐"를 비교하는, Origin Test의 Pathwork® Tissue를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
VIII . 실시예
하기의 실시예들이 청구된 발명을 예시하기 위하여 제공되지만, 청구된 발명을 제한하기 위한 것은 아니다.
실시예 1. 티라미드 신호 증폭으로 근접 이중 검출기 마이크로어레이 ELISA 를 사용한 단일 세포 검출
본 실시예는 단리된 세포로부터 제조된 세포 추출액 내의 융합 단백질 및 신호 전달 분자의 활성화 상태를 분석하기에 적합한 우수한 동적 범위를 갖는 멀티플렉스, 고속, 근접 이중 검출기 마이크로어레이 샌드위치 ELISA를 예시한다. 특정 구현예에서, 상기 근접 검정법은 어드레스가능한 마이크로어레이의 포맷이다.
1) 포획 항체를 1 mg/ml 내지 0.004 mg/ml의 연속 희석물로 16-패드 FAST 슬라이드 상에 프린팅하였다. 선택적으로, 각각의 포획 항체의 2-배 연속된 희석물 (0.25 mg/ml, 0.125 mg/ml, 및 0.0625 mg/ml)가 사용될 수 있고, 2배 및 4배 스폿이 각각의 항체 희석에서 제조될 수 있다. BCR-ABL 융합 단백질을 검출하기 위하여, 예시적인 포획 항체는 항-BCR 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 포함한다.
2) 하룻밤 건조시킨 후, 상기 슬라이드를 Whatman 차단 완충액으로 차단하였다.
3) 80 ㎕의 분해물을 10-배 연속 희석물을 사용하여 각각의 패드에 첨가하였다. 상기 슬라이드를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.
4) TBS-Tween로 6회 세척한 이후에, TBS-Tween/2% BSA/1% FBS에서 희석된 근접 검정법을 위한 검출 항체 80 ㎕를 상기 슬라이드에 첨가하였다. BCR-ABL 융합 단백질을 검출하기 위하여, 예시적인 검출 항체는 (1) 글루코스 옥시다제 (GO)에 직접적으로 컨쥬게이트된 항-ABL 모노클로날 또는 폴리클로날 항체; 및 (2) 호스라디시 퍼옥시다제 (HRP)에 직접적으로 컨쥬게이트된 인산화된 ABL를 인식하는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체를 포함한다. 상기 인큐베이션은 실온에서 2시간 동안 수행되었다.
5) 선택적으로, 검출 단계는 인산화된 ABL를 인식하는 항체의 비오틴-컨쥬게이트를 이용할 수 있다. 이러한 예에서, 6회 세척한 이후에, 추가적으로 2시간 동안 스트렙타비딘-HRP로 인큐베이션하는 순차적인 단계가 포함되었다.
6) 선택적으로, 검출 단계는 항-ABL 항체의 올리고뉴클레오티드-매개 GO 컨쥬게이트를 이용할 수 있다. 인산화된 ABL 항체에 직접 컨쥬게이트되거나 HRP의 비오틴-스트렙타비딘(SA) 링크된 컨쥬게이트가 사용될 수 있다.
6) 신호 증폭을 위하여, 5 μg/ml 농도의 비오틴-티라미드 80 ㎕를 첨가하고 15분 동안 반응시켰다. 상기 슬라이드를 TBS-Tween으로 6회, 20% DMSO/TBS-Tween으로 2회, 및 TBS로 1회 세척하였다.
7) SA-Alexa 555 80 ㎕를 첨가하여 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음, 상기 슬라이드를 2회 세척하고, 5분 동안 건조시킨 후, 마이크로어레이 스캐너(Perkin-Elmer, Inc.) 상에서 스캐닝하였다.
본 명세서에 기술된 상기 근접 검정법 마이크로어레이 포맷은 유리하게도 2개의 검출 항체 사이의 근접을 검출함으로써 얻어지는 증가된 특이성으로 인해, 매우 낮은 백그라운드 (예를 들면, 2-항체 분석법에 비해)를 나타낸다.
실시예 2. 약물 선별을 위한 활성화 프로파일의 발생
본 발명의 조성물 및 방법은 암 치료에서 약물 선별을 위해 적용될 수 있다. 비-제한적 예로서, 본 발명은 악성 혈액 종양과 관련된 하나 또는 복수개의 종양원성 융합 단백질의 존재 및/또는 활성을 확인함에 있어 유용성을 발견함으로써, 이러한 종류의 암을 갖는 환자에 적절한 치료를 제공하기 위함이다. 전형적인 프로토콜은 2개의 프로파일, 참조 활성화 프로파일 및 테스트 활성화 프로파일의 생성을 필요로 하고, 그 다음 특정 약물 치료 요법의 효능을 측정하기 위해 비교된다 (도 2 참고).
참조 활성화 프로파일
참조 활성화 프로파일을 유도하기 위하여, 혈액 샘플을 항암 약물 치료 이전에 특정 암 (예를 들면, CML와 같은 백혈병)을 갖는 환자로부터 수득하였다. 종양 세포를 혈액 샘플로부터 예를 들면, 본 명세서에 보다 상세히 기술된 임의의 기술을 사용하여 단리하였다. 상기 단리된 세포는 일 또는 그 이상의 성장 인자에 의해 인 비트로에서 자극받을 수 있다. 그 다음 자극받은 세포는 용해됨으로써 세포 추출액을 생산한다. 세포 추출액은 활성화 상태가 환자에서의 암의 종류에 따라 바뀔 수도 있는, 하나 또는 복수개의 종양원성 융합 단백질 (단독으로 또는 하나 또는 복수개의 신호 전달 분자와 조합하여)에 특이적인 포획 항체의 패널의 연속된 희석물을 함유하는 어드레스가능한 어레이에 적용된다. 단일 검출 또는 근접 검정법은 목적의 각각의 분석물의 활성화 상태를 측정하기 위하여 적당한 검출 항체 (예를 들면, 활성화 상태-비의존성 항체 및/또는 활성화 상태-의존성 항체)를 사용하여 수행된다. 따라서, 참조 활성화 프로파일은 임의의 항암 약물의 부재시 환자의 암내의 종양원성 융합 단백질과 같은 특이적 분석물의 활성화 상태를 제공하면서 발생된다.
테스트 활성화 프로파일
테스트 활성화 프로파일을 얻기 위하여, 제2의 혈액 샘플은 항암 약물 치료 이전에 또는 항암 약물의 투여 이후에 (예를 들면, 암 치료의 전 과정에서 임의의 시점) 특정 암 (예를 들면, CML과 같은 백혈병)을 갖는 환자로부터 수득된다. 종양 세포는 혈액 샘플로부터 단리된다. 단리된 세포가 항암 약물로 치료를 수여받지 않은 환자로부터 수득된 경우, 단리된 세포는 상기 기술된 참조 활성화 프로파일로부터 측정된 일 또는 그 이상의 활성화된 종양원성 융합 단백질 및/또는 신호 전달 분자와 인큐베이션된다. 예를 들면, BCR-ABL 융합 단백질이 활성화된 참조 활성화 프로파일로부터 측정된 경우, 그 다음 세포는 이마티니브 (Gleevec®)로 인큐베이션될 수 있다. 그 다음 상기 단리된 세포는 일 또는 그 이상의 성장 인자에 의해 인 비트로에서 자극받을 수 있다. 상기 단리된 세포는 그 다음 용해됨으로서 세포 추출액을 생산한다. 상기 세포 추출액은 어드레스가능한 어레이에 적용되고, 단일 검출 또는 근접 검정법이 수행되어 각각의 목적 분석물의 활성화 상태가 측정된다. 환자의 테스트 활성화 프로파일은 따라서 특이적 항암 약물의 존재시 환자의 암 내의 종양원성 융합 단백질과 같은 특정 분석물의 활성화 상태를 제공하면서 발생된다.
약물 선택
테스트 활성화 프로파일을 참조 활성화 프로파일과 비교함으로써, 항암 약물이 환자의 암의 치료에 적합한지 또는 부적합한지가 측정된다. 예를 들면, 약물 치료가 대부분의 종양원성 융합 단백질 및/또는 신호 전달 분자에서 약물의 부재시 보다 실질적으로 덜 활성화된 경우, 예를 들면, 약물 없이 매우 강한 활성화로부터 약물로 약하거나 매우 약한 활성화로 변화된 경우, 그 치료는 환자의 암에 적합한 것으로 판단된다. 그러한 예에서, 치료는 약물 치료요법울 수여받지 않은 환자에서 적합한 항암 약물로 개시되거나 후속 치료나 약물을 이미 수여받은 환자에서 적합한 항암 약물로 지속된다. 그러나, 약물 치료가 환자의 암의 치료에 부적합한 것으로 간주되면, 다른 약물이 새로운 테스트 활성화 프로파일을 발생시키기 위하여 선택되고 사용됨으로써, 참조 활성화 프로파일과 비교된다. 그러한 예에서, 치료는 약물 치료를 수여받지 않은 환자에서 적합한 항암 약물로 개시되거나 후속의 치료가 부적합 약물을 현재 수여받고 있는 환자에서 적합한 항암 약물로 변경된다.
본 실시예에 기술된 프로토콜은 또한 표적 단백질 키나제 (예를 들면, BCR-ABL)내의 돌연변이, 치료적 요법에 비-순응, 및/또는 차선적 약물 용량의 투여로 인해, 이마티니브와 같은 타이로신 키나제 억제제로 치료요법에 내성을 갖는 환자를 확인하기에 유용하다.
실시예 3. 암과 관련된 예시적인 종양원성 융합 단백질
본 실시예는 종양원성 융합 단백질 및 그들과 관련된 종양의 형성을 야기하는 인간 종양에서의 전좌의 비-전수 리스트를 제공한다.
Burkitt의 림프종: c-myc 유전자 전좌 t(8;14)(q24;q32). 가장 흔한 키메라 종양형성단백질은 c-myc/IGH이다.
AML: 염색체 21로 염색체 8의 일부의 전좌. 생성된 키메라 종양형성단백질은 RUNXl/ETO이다. 다른 전좌 t(12;15)(pl3;q25)는 TEL/TrkC (키나제) 키메라 종양형성단백질을 초래한다.
CML: 필라델피아 염색체가 BCR/ABL (키나제)를 초래하는 전좌이다.
유잉 육종(Ewing sarcoma): 염색체 11 및 22 사이의 전좌. 생성된 키메라 종양형성단백질은 EWS/FLI (전사 인자)이다.
모든: 키메라 종양원성 단백질:
Figure pct00002
DFSP: DFSP 종양의 95% 이상이 키메라 종양형성단백질 COL1 Al/PDGF (PDGFR를 결합 및 활성화시킴)를 초래하는, 염색체 전좌 t(17;22)를 가진다.
급성 전골수구성 백혈병: 전좌가 t(15;17)(q22;q 12)로 표시됨. 생성된 키메라 종양형성단백질은 RARo/PML (전사 복합체 단백질)이다.
전(pro)-B-세포 급성림프구성 백혈병: 키메라 종양형성단백질 E2A/HLF (세포사멸 억제제)를 초래하는, 전좌 t(17;19).
급성 프리(pre)-B-세포 백혈병: 전좌 t(l;19). 키메라 종양형성단백질은 E2A/Pbxl (키나제 기질)이다.
횡문근육종(Rhabdomyosarcoma) : 키메라 종양형성단백질 PAX3/FKHR (전사 인자)를 초래하는, t(2:13)(q35;ql4)의 전좌.
매우 어린 아이의 연조직 악성종양: 하기의 키메라 종양형성단백질: 단백질 타이로신 키나제 ETV6/NTRK3 (키나제)를 초래하는, t(12;15)(pl3;q25) 재배열.
유두 갑상선 암: 키메라 종양형성단백질은 RET/PTC (키나제)이다.
전립선 암: 키메라 종양형성단백질은 TMRSS/ERG (키나제)이다.
종양원성 융합 단백질 및 그들의 관련 종양의 형성을 야기하는 인간 종양 내의 전좌의 추가적인 예는 문헌 [G.M. Cooper, Oncogenes, 2nd ed. Boston and London: Jones and Bartlett, 1995]에서 선택될 수 있다.
Figure pct00003
실시예 4. 종양원성 융합 단백질의 전체 및 활성화된 수준의 검출을 위한 근접-매개 면역검정법.
도입
발암유전자 BCR-ABL는 필라델피아 염색체를 형성하기 위하여 염색체 22의 장완에 위치한 BCR 유전자의 N-말단 부위로의 염색체 9의 장완에 위치한 보통의 ABL 유전자의 전좌에 의해 형성된다. 전좌된 ABL 유전자가 BCR 유전자의 N-말단으로 스프라이싱 되는지 여부에 따라서, 다른 길이를 갖는 BCR-ABL 유전자 생성물이 생성되고, 여기서 CML 및 모든 서브세트를 야기하는 발암유전자로서 p210 BCR-ABL 유전자 생성물이 가장 우세하게 생산된다. p185 및 p230 BCR-ABL와 같은 다른 부가적인 유전자 생성물이 또한 생산된다, 특히, p210 BCR-ABL 유전자 생성물은 AML을 야기한다. 이 단백질은 1790개의 아미노산을 함유하고 N-말단에서 BCR로부터 올리고머화 도메인 (OLI), 그 다음 BCR로부터의 S/T 키나제 도메인, 보통의 BCR 내에 존재하지 않는 BCR로부터의 아미노산 염기서열 삽입물, 그 다음 ABL로부터의 SH3, SH2 및 Y 키나제 도메인 뿐만 아니라 ABL의 C-말단 프로린-풍부 도메인로 구성된다.
임상 백그라운드
만성 단계에 있는 만성 골수 백혈병 (CML)을 갖는 대부분의 환자들은 이마티니브에 반응하는 반면, 몇몇의 환자들은 원하는 종말점을 확득하지 못하고, 또 다른 환자들은 결국 반응성을 잃어버리거나 내성이 생긴다. 400 mg/day 이마티니브 (Gleevec) 치료과 관련하여; 70-80%의 환자에서 완전한 세포유전학적 반응 (CCyR)이 존재하였다; 처음 3년 내에 4 내지 7%/yr의 비율로 그 이후부터는 1 내지 2%/yr 비율로 CCyR 손실이 존재하였다; 7년 후에 전체적인 생존율은 90% 이었고, 심지어 7년 이후의 무 생존율은 81% 이었고, 그리고 재발율을 5년 내에 약 30% 이었다. 800 mg/day 이마티니브 (Gleevec) 치료 (CCyR = 95%; 재발율= 5%)에 더 많이 반응하였으나, 그러한 용량의 이마티니브는 또한 더 독성이 있었다. 니로티니브는 800 mg/day는 이나티니브와 유사한 효능을 가졌으나, 이마티니브 보다 더 많은 독성이 존재하였다.
완전한 BCR-ABL 억제 글리벡에 대해 더 많은 반응을 나타냈으나, 불완전한 BCR-ABL 억제는 글리벡에 대한 재발을 초래하였다. 따라서, BCR-ABL의 발현 수준 및 활성화 농도의 실-시간 검출은 약물 용량을 독성을 최소화시키면서 표적을 효과적으로 억제할 수 있도록 조절함으로써 표적 치료요법 하에 CML 환자에게 이점을 제공한다. 예를 들면, 글리벡 400 mg/day에 불완전한 비활성화를 갖는 환자들은 반응성을 증가시키기 위하여 곧 더 높은 용량 (예를 들면, 800 mg/day)을 제공받을 수 있었다.
진단학적 도전
전장 BCR 및 ABL의 높은 기저(baseline) 수준은 다량의 BCR-ABL 융합 단백질 내에서 상대적으로 낮은 농도에서의 검출을 어렵게 한다. 게다가, BCR-ABL 인산화 수준을 검출하는 현재 분석법은 임상적 혈액 샘플 내의 인산화를 검출하기에 민감성을 가지고 있지 않다. 또한, BCR-ABL와 같은 융합 단백질에 대한 항체는 융합 단백질의 다양한 변이체에 매우 특이적이지 않다.
신규한 BCR - ABL 검출 검정법
도 3A는 BCR-ABL(310)와 같은 종양원성 융합 단백질의 존재 (전체 수준) 및/또는 활성화 상태 (인산화 수준)을 검출하기 위한 예시적인 근접 검정법(300)을 나타낸다. 도 3B는 접합 항체를 이용하여 BCR-ABL(410)의 존재 (전체 수준) 및/또는 활성화 상태 (인산화 수준)을 검출하기 위한 본 발명의 근접 검정법의 대체적인 구현예(400)를 나타낸다.
도 3A-3B에서 나타낸 BCR-ABL 전체 및/또는 활성화된 단백질 수준을 측정하기에 적합한 항체의 비-제한적인 예는 상기 표 1에 설명된 것들을 포함한다.
결과
도 4는 도 3A에 설명된 예시적인 근접 검정법에 따른 비드에 컨쥬게이트된 전장 BCR의 카르복실-말단 영역에 특이적인 항체를 사용하여 유리 전장 BCR의 제거 이후의 K562 세포 (즉, 인간 만성 골수 백혈병 세포주로부터의 세포)에서의 BCR-ABL 신호를 나타낸다. 특히, 도 4는 BCR-ABL 신호가 본 발명의 신규한 근접 검정법을 사용하여 환자의 샘플로부터 유리 BCR의 제거에 의해 영향을 받지 않음을 입증한다.
도 5는 도 3A에 나타낸 예시적인 근접 검정법에 따른 비드에 컨쥬게이트된 전장 BCR의 카르복실-말단 영역에 특이적인 항체를 사용하여 프리 BCR의 제거 이후의 K562 세포에서의 BCR 신호를 나타낸다. 도 5에 나타낸 바와 같이, 10,000개의 세포에서 BCR 신호의 감소는 오직 BCR 만이 본 발명의 신규한 근접 검정법을 사용하여 제거되었음을 입증한다 .
도 6은 도 3A에 나타낸 예시적인 근접 검정법을 사용하여 K562 세포 내의 BCR-ABL의 전체 및 인산화 수준의 검출을 나타낸다.
결론
본 실시예는 BCR-ABL의 존재 및/또는 활성화 상태를 검출하기 위하여 도 3A 및 3B에 나타낸 예시적인 근접 검정법이 적어도 하기의 이유로 인해 유리함을 입증한다: (1) 전장 BCR 단백질은 BCR의 C-말단 영역에 특이적인 디플레이션-태그를 사용하여 혈액 또는 골수 흡인물과 같은 환자의 샘플로부터 제거될 수 있다; (2) 일단 전장 BCR이 환자의 샘플로부터 제거되면, BCR의 N-말단 영역에 특이적인 포획 항체는 BCR-ABL 융합 단백질을 포획 수 있다; 그리고 (3) 일단 BCR-ABL 융합 단백질이 포획되면, 그들의 발현 및 활성화 수준은 근접 채널링을 통해 높은 민감도로 검출될 수 있는 것으로, 여기서 전체 또는 활성화된 BCR-ABL 단백질 수준과 상관 관계에 있는 단일의 검출가능한 신호는 모두 3개의 항체의 결합 만으로 발생됨으로써, 분석 특이성이 증가되고, 백그라운드가 낮아지며, 검출이 단순화된다.
실시예 5. 전장 BCR 및/또는 ABL 로부터의 방해 없이 BCR - ABL 의 전체 및 활성화 수준의 검출.
본 실시예는 BCR-ABL의 존재 (전체 수준) 및/또는 활성화 상태 (인산화 수준)을 검출하기 위한 도 3A 및 3B에 나타낸 예시적인 근접 검정법의 이점을 입증하는 추가적인 실험 데이타를 제공한다. 일 특정 구현예에서, 전장 BCR 단백질은 환자 샘플로부터 또는 BCR의 C-말단 영역에 특이적인 디플레이션-태그를 사용하는 세포주 (예를 들면, 백혈병 세포주)로부터 수득된 세포의 추출물로부터 수득된다. 일단 전장 BCR가 세포 추출액으로부터 제거되면, BCR의 N-말단 영역에 특이적인 포획 항체는 BCR-ABL 융합 단백질을 포획할 수 있다. 일단 BCR-ABL 융합 단백질이 포획되면, 그들의 발현 및 활성화 수준은 근접 채널링을 통해 높은 민감도로 검출될 수 있는 것으로, 여기서 전체 또는 활성화된 BCR-ABL 단백질 수준과 상관관계에 있는 단일의 검출가능한 신호는 모든 3개의 항체의 결합 만으로 발생됨으로써, 이로인해 유리하게도 분석 특이성이 증가되고, 백그라운드가 낮아지며, 그리고 검출이 단순화된다.
도 7은 도 3A에 나타낸 예시적인 근접 검정법에 따른 비드에 컨쥬게이트된 전장 BCR의 카르복실-말단 영역에 특이적인 항체를 사용하여 유리 전장 BCR의 제거 이후의 K562 세포 (즉, 인간 만성 골수 백혈병 세포주)에서 검출된 BCR-ABL의 인산화 수준 ("인산 BCR-ABL") 및 전체 양 ("전체 BCR-ABL")를 나타낸다. 특히, 도 7A 및 7B는 K562 세포의 추출물이 본 발명의 신규한 근접 검정법을 이용하여 유리 BCR 단백질을 제거하기 위한 비드에 커플링된 전장 BCR의 C-말단에 특이적인 항체와 접촉한 후에도, 인산화 및 전체 BCR-ABL 신호가 변경되지 않았음을 나타낸다. 도 7C는 유리 전장 BCR가 BCR C-말단 항체-커플링된 비드로 처리 이후에 세포 추출액으로부터 실제 제거되었음을 나타낸다.
도 8은 도 3A에 설명된 예시적인 근접 검정법에 따른 비드에 컨쥬게이트된 전장 BCR의 카르복실-말단 영역에 특이적인 항체를 이용하여 유리 BCR의 제거 이후에 K562 내의 인산화된 BCR-ABL 신호의 다른 예를 제공한다. 특히, 도 8A는 전장 BCR의 제거 유무에 따라 K562 세포 분해물에서 검출된 인산화된 BCR-ABL 신호의 마이크로어레이 비교를 제공한다 ("무-비드 처리" = BCR가 제거되지 않음 대 "비드 처리" = BCR가 거기에 컨쥬게이트된 전장 BCR의 C-말단에 특이적인 항체를 함유하는 비드로 제거됨). 도 8B는 세포 수에 대한 함수로서 상대 형광 단위 (RFU)로 마이크로어레이 데이타에 대한 그래픽 묘사(graphical depiction)를 제공한다. 이러한 도면들은 인산 BCR-ABL 신호가 본 발명의 신규한 근접 검정법을 이용하여 K562 세포의 추출물로부터 전장 BCR의 제거시 변화되지 않았음을 입증한다.
도 9는 도 3A에 설명된 예시적인 근접 검정법에 따른 비드에 컨쥬게이트된 체-길이 BCR의 카르복실-말단 영역에 특이적인 항체를 사용하여 유리 BCR의 제거 이후에 K562 세포 내의 전체 BCR-ABL 신호의 다른 예를 제공한다. 특히, 도 9A는 전장 BCR의 제거 유무에 따라 K562 세포 분해물 내에 검출된 전체 BCR-ABL 신호의 마이크로어레이 비교를 제공한다 ("무-비드 처리" = BCR가 제거되지 않음 대 "비드 처리" = BCR가 거기에 컨쥬게이트된 전장 BCR의 C-말단에 특이적인 항체를 함유하는 비드로 제거됨). 도 9B는 세포 수에 대한 함수로서 상대 형광 단위 (RFU)로 마이크로어레이 데이타에 대한 그래픽 묘사를 제공한다. 이러한 도면들은 전체 BCR-ABL 신호가 본 발명의 신규한 근접 검정법을 이용하는 K562 세포의 추출물로부터 전장 BCR의 제거시에 변하지 않았음을 입증한다.
도 10은 BCR C-말단 항체-커플링된 비드로 세포 추출액을 접촉시킨 이후의 K562 세포의 추출물로부터 유리 전장 BCR의 제거에 대한 다른 예를 제공한다. 특히, 도 10A는 전장 BCR의 제거 유무에 따라 K562 세포 분해물에서 검출된 전체 BCR 신호에 대한 마이크로어레이 비교를 제공한다 ("무-비드 처리" = BCR이 제거되지 않음 대 "비드 처리" = BCR이 그것에 컨쥬게이트된 전장 BCR의 C-말단에 특이적인 항체를 함유하는 비드로 제거됨). 도 10B는 세포 수의 함수로서 상대 형광 단위 (RFU)로 마이크로어레이 데이타에 대한 그패릭 묘사를 제공한다. 이러한 도면들은 전장 BCR가 전장 BCR의 C-말단에 특이적인 항체를 함유하는 비드로 처리될 때 세포 추출액으로부터 사실상 고갈됨을 입증한다. 사실, 예를 들면, 1000개 미만의 세포를 함유하는 세포 추출액은 C-말단 항체-커플링된 비드로 인큐베이션될 때 유의적으로 상기 백그라운드 (0 세포)인 BCR 신호를 생산하지 않는다.
도 11은 BCR-ABL 융합 단백질이 아닌, 유리 전장 BCR 및 ABL 단백질이 백혈구 세포 (WBC)에 존재함을 입증한다. 도 12는 K562 세포 추출물이 WBC 추출물로 스파이크될 때, WBC 내에 존재하는 유리 전장 BCR가 K562 세포 추출물 내의 인산 BCR-ABL 신호를 억제함을 나타낸다. 도 13은 비드에 컨쥬게이트된 전장 BCR의 카르복실-말단 영역에 특이적인 항체를 사용하여 유리 BCR의 제거 이후에 WBC 추출물로 스파이크된 K562 세포에서의 전체 BCR-ABL 신호를 나타낸다. 특히, 도 13A는 K562 세포 추출물이 WBC 추출물로 스파이크 되었을 때, 유리 BCR 신호가 포화되었음을 나타낸다. BCR C-말단 항체-커플링된 비드로 처리 이후에, 유리 BCR은 제거되었다. 도 13B는 BCR-ABL 신호가 동일한 실험에서 비드 처리 또는 비드 무-처리에서 변화되지 않았음을 나타낸다.
몇몇 구현예에서, 전장 ABL 단백질은 환자의 샘플로부터 또는 전장 ABL의 아미노-말단 영역에 특이적인 디플레이션 태그를 사용함으로써 BCR-ABL 발현 및/또는 활성화의 포획 및 검출 이전에 세포주 (예를 들면, 백혈병 세포주)로부터 수득된 세포의 추출물로부터 수득된 세포 추출물 (예를 들면, 백혈병 세포와 같은 악성 백혈구 세포)로부터 부가적으로 또는 선택적으로 제거될 수 있다. 그러한 디플레이션 태그의 비-제한적 예는 전장 ABL의 N-말단에 특이적인 항체가 부착되는 비드이다.
실시예 6. BCR - ABL 키나제 활성화의 억제제로 처리된 세포 내의 BCR - ABL 의 전체 및 활성화 수준의 검출
본 실시예는 이마티니브 (Gleevec®), 니로티니브 (Tasigna®), 및 다사티니브 (Sprycel®)와 같은 BCR-ABL 억제제가 K562 세포 (인간 만성 골수 백혈병 세포주로부터의 세포) 내의 BCR-ABL 단백질의 활성화 (즉, 인산화)를 용량-의존적으로 억제하지만, 발현 (즉, 전체 수준)은 억제하지 않음을 나타낸다.
특히, 도 14A 및 14B는 BCR-ABL 억제제 이마티니브 (Gleevec®)가 K562 세포 내의 BCR-ABL 단백질의 활성화 (즉, 인산화)를 용량-의존적으로 억제하지만, 발현 (즉, 전체 수준)을 그렇지 않음을 나타낸다. 도 14C는 이마티니브 억제에 따른 인산/전체 BCR-ABL 비율을 나타내는 것으로, 이마티니브 처리로 인산 BCR-ABL 신호의 백분율 억제와 상관관계에 있다.
도 15A 및 15B는 BCR-ABL 억제제 니오티니브 (Tasigna®) 가 K562 세포 내의 BCR-ABL 단백질의 활성화 (즉, 인산화)를 용량-의존적으로 억제하였으나, 발현 (즉, 전체 수준)을 그렇지 않았음을 입증한다. 도 15C는 니오티니브 억제에 따른 인산/전체 BCR-ABL의 비율을 나타내는 거승로, 니오티니브 처리로 인산 BCR-ABL 신포의 백분율 억제와 상관관계에 있다.
도 16A 및 16B는 BCR-ABL 억제제 다사티니브(Sprycel®)가 K562 세포 내의 BCR-ABL 단백질의 활성화 (즉, 인산화)를 용량-의존적으로 억제하지만, 발현 (즉, 전체 수준)은 그렇지 않음을 나타낸다. 도 16C는 다사티니브 억제에 따른 인산/전체 BCR-ABL 비율을 나타내는 것으로, 다사티니브 처리로 인산 BCR-ABL 신호의 백분율 억제와 상관관계에 있다.
실시예 7. 다양한 암 세포주 내의 BCR - ABL 기질 CRKL 의 전체 및 활성화된 수준의 검출
본 실시예는 샌드위치 ELISA에 의해 측정된 BCR-ABL 기질 CRKL의 전체 및 활성화된 (인산화된) 수준의 검출을 입증한다. 다른 구현예에서, CRKL와 같은 BCR-ABL 기질의 존재 및/또는 활성화 상태는 2010년 7월 15일에 출원된, PCT 출원 PCT/US2010/042182, 및 US 특허 공보 제20080261829호, 제20090035792호, 및 제20100167945호에 기술된 협력 근접 면역검정법(COPIA)과 같은 근접 검정법을 사용하여 측정될 수 있는 것으로, 상기 전체 개시내용은 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참고로 통합된다.
도 17은 CRKL이 K562 세포 (즉, 인간 만성 골수 백혈병 세포주로부터의 세포)내에 존재할 뿐만 아니라 활성화됨 (인산화됨)을 입증한다. 도 18은 CRKL세포가 A431 세포 (즉, 인간 표피양 암종 세포주로부터의 세포)내에 존재하고, EGF 처리시 활성화됨 (즉, 인산화됨)을 나타낸다. 도 19는 CRKL이 T47D 세포 (즉, 인간 유관 유방 상피 종양 세포주로부터의 세포) 내에 존재하지만, EGF 처리에 의해 활성화 (즉, 인산화) 되지 않음을 나타낸다. 도 20은 CRKL이 T47D 세포 내에 존재하고 헤레굴린 HRG 처리에 의해 낮은 수준에서 활성화 (즉, 인산화) 됨을 나타낸다. 도 21은 CRKL가 MCF-7 세포 (즉, 인간 내에 존재하고 유선암 세포주로부터의 세포) 내에 존재하고 헤레굴린 (HRG) 처리에 의해 낮은 수준에서 활성화 (즉, 인산화) 됨을 나타낸다. 도 22는 활성화 수준이 공여자 마다 다른, 환자 샘플의 백혈구 세포 (WBC) 내의 활성화된 (즉, 인산화된) CRKL의 존재를 나타낸다.
실시예 8. 다양한 암 세포주 내의 BCR - ABL 기질 JAK2 의 전체 및 활성화된 수준의 검출
본 실시예는 샌드위치 ELISA의 의해 측정된 BCR-ABL 기질 JAK2의 활성화된 (인산화된) 수준의 검출을 입증한다. 다른 구현예에서, JAK2과 같은 BCR-ABL 기질의 존재 및/또는 활성화 상태는 2010년 7월 15일에 출원된 PCT 출원 PCT/US2010/042182호, 및 US 특허 공보 제20080261829호, 제20090035792호, 및 제20100167945호에 기술된 협력 근접 면역검정법 (COPIA)과 같은 근접 검정법을 사용하여 측정될 수 있는 것으로, 상기 전체내용은 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참고로서 통합된다.
도 23은 JAK2가 K562 세포 (즉, 인간 만성 골수 백혈병 세포주로부터의 세포) 및 A431 세포 (즉, 인간 표피양 암종 세포주로부터의 세포) 내에서 활성화 (즉, 인산화)됨을 입증한다.
실시예 9. 항암 약물의 희석 없이 혈액으로부터 세포의 단리
본 실시예는 항-CD45 항체로 자석 비드 포획을 사용하여 K562 세포로 스파이크된 혈액으로부터 K562 세포 (즉, 인간 만성 골수 백혈병 세포주로부터의 세포)를 회수한 후, K562 세포 분해물을 제조하고 일 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL), 그것의 기질, 그것의 경로, 또는 그것의 조합의 발현 및/또는 활성화 상태를 측정하는 것을 입증한다. 본 실시예는 또한 항-CD45 및/또는 항--CD 15 항체로 자석 비드 포획을 사용하여 환자 혈액 샘플로부터 백혈구 세포를 회수한 후, 세포 분해물을 제조하고, 일 또는 그 이상의 종양원성 융합 단백질 (예를 들면, BCR-ABL), 그것의 기질, 그것의 경로, 또는 그것의 조합의 발현 및/또는 활성화를 측정하는 것을 입증한다. 세포 단리 이후의 임의의 세척 단계의 필요성을 없애는 것에 의해, 본 명세서에 기술된 방법은 목적의 세포가 타이로신 키나제 억제제와 같은 항암 약물의 세포 내 농도가 변경됨이 없이 혈액으로부터 회수될 수 있기 때문에 유리하다. 그로서, 본 실시예에 기술된 방법은 단리 이후의 세포 세척 (예를 들면, 비드-결합 세포의 세척)의 종래-허용된 실시와 상반되며, 세포 내부의 타이로신 키나제 억제제 (예를 들면, Gleevec®, Tasigna®, Sprycel®, 등)와 같은 항암 약물의 실질적인 희석 없이 발견된 세포부터의 세포 분해물을 제공한다.
CD45 Dynabead 를 이용한 혈액 1 ml 로부터 K562 세포 회수
1. 완충액 1을 제조
1.1 PBS 500ml에 BSA 500mg 첨가
1.2 0.5M EDTA 2ml 첨가
2. 혈액 제조 및 K562 세포로 스파이크
2.1 공여자로부터 백혈구 1Oml 수득
2.2 완충액 1과 혈액의 1:1: 희석
2.3 자동 CellCounter를 사용하여 K562 세포의 세포수 계산
2.4 각 농도를 위해 각각 5e6, le6, 0.1e6, 및 0 K562 세포를 1ml의 희석된 혈액에 첨가
3. DynaBead 세척 (Invitrogen Cat. No. 111.53D)
3.1 100 ㎕의 비드를 1.5ml 에펜돌프 튜브 내의 모든 le7 세포에 전달
3.2 완충액 1 1ml를 첨가하여 온화하게 혼합
3.3 상기 튜브를 1분 동안 자석 위에 올려둠
3.4 상층액 제거
3.5 상기 튜브를 자석으로부터 제거하고 전달된 비드의 출발 부피와 동일한 양의 완충액 1에 재부유
4. 세포 단리
4.1 100 ㎕의 세척 비드를 각각의 K562 스파이크된 혈액 샘플에 첨가
4.2 20분, 2시간 또는 1시간 동안 냉방 (또는 실온)에서 회전기 상에 샘플을 인큐베이트
4.3 상기 샘플을 자석 위에 놓고 상층액 제거
5. 세포 분해물 제조
5.2 500 ㎕의 용해 완충액을 le6 K562 세포와 결합된 비드에 첨가
5.3 100 ㎕의 용해 완충액을 0.1e6 K562 세포와 결합된 비드에 첨가
5.4 20' 동안 아이스에서 볼텍스하고 위치시킴; 단속적으로 볼텍싱함
5.5 4도에서 최대 스피드로 15' 동안 원심분리
5.6 상기 상층액을 에펜돌프 튜브로 전달, 예를 들면, 본 명세서에 기술된 근접-매개 면역검정법을 수행하는 것에 의해 마이크로어레이를 가동
CD45 및/또는 CD 15 Dynabead 를 이용하여 환자 혈액 샘플로부터 CML 세포 단리
1. 완충액 1 준비
1.1 PBS 500ml에 BSA 500mg 첨가
1.2 0.5M EDTA 2ml를 첨가
2. 환자 혈액 준비
2.1 항응고제로서 EDTA (또는 헤파린)을 사용하여 환자로부터 백혈구 2-3ml를 수득
2.2 프로테아제 억제제를 첨가 또는 미첨가
3. DynaBead 세척 (Invitrogen Cat. No. 1 11.53D)
3.1 100 ㎕ (200 ㎕, 300 ㎕) 비드를 1.5ml 에펜돌프 튜브 내의 모든 혈액 샘플 1ml에 전달
3.2 완충액 1 1ml첨가 및 온화하게 혼합
3.3 상기 튜브를 1분 동안 자석 위에 둠
3.4 상층액 제거
3.5 상기 튜브를 자석으로부터 제거 및 전달된 비드의 출발 부피와 같은 100 ㎕의 완충액 1에 재부유
4. 세포 단리
4.1 1.5ml의 에펜돌프 튜브 내의 혈액 샘플 1 ml에 세척 비드 100 ㎕ 첨가
4.2 20분, 2시간, 또는 1시간 동안 냉방 (또는 실온)에서 회전기상에 샘플을 인큐베이트
4.3 샘플을 자석 위에 둠 및 상층액 제거
5. 세포 분해물 제조
5.1 용해 완충액 100 ㎕을 세포와 결합된 비드에 첨가
5.2 20' 동안 아이스 상에서 볼텍스하고 위치시킴; 단속적으로 볼텍스
5.3 4도에서 최대 속도고 15' 동안 원심분리
5.4 상기 상층액을 에펜돌프 튜브에 전달, 예를 들면, 본 명세서에 기술된 근접-매개 면역검정법을 수행하는 것에 의해 마이크로어레이 가동
도 24는 인산화된 BCR-ABL가 항-CD45 자석 비드를 이용하여 혈액으로부터 단리된 K562 세포로부터 제조된 세포 분해물에서 검출되어 측정될 수 있음을 나타낸다. 특히, 융합 단백질의 Abl 부분 내의 인산-타이로신 잔기에 결합하는, 4G10 항체 (Millipore)가 인산화된 BCR-ABL 수준을 검출하는데 사용되었다. 인산화된 BCR-ABL의 존재 및/또는 수준을 검출하고 측정하기 위하여, 유사한 검정법이 항-CD45 및/또는 항-CD15 자석 비드를 사용하여 환자 샘플의 혈액으로부터 단리된 백혈구 세포 (예를 들면, 만성 골수 백혈병 (CML) 세포)로부터 제조된 세포 분해물 상에서 수행될 수 있다.
실시예 10. 환자 샘플 내의 전체 종양원성 융합 단백질 뿐만 아니라 전체 천연 전장 단백질 수준의 검출
본 실시예는 종양원성 융합 단백질 내에서 발견된 염기서열 또는 도메인을 함유하는 하나 또는 2개의 천연 전장 단백질과 조합된 종양원성 융합 단백질의 전체 양 및/또는 활성화 상태의 연속 검출을 위한 방법을 입증한다. 특정 구현예에서, 본 방법은 혈액 또는 골수 흡인물 샘플과 같은 생물학적 샘플 내의 모든 전체 BCR-ABL 수준 뿐만 아니라 전체 천연 전장 BCR 및/또는 ABL 수준의 검출 및/또는 측정을 가능하게 한다.
특정 구현에에서, 천연 단백질 수준 (예를 들면, 전장 BCR 및/또는 ABL 수준)은 단일 패드 상의 멀티플렉스 방법으로 종양원성 융합 단백질 수준 예를 들면, BCR-ABL 수준)과 함께 측정된다. 이러한 구현예에서, 천연 전장 단백질은 이러한 분자의 수준이 동일한 패드 상에서 측정될 수 있도록 종양원성 융합 단백질과 함께 유리하게 단리될 수 있다.
도 25는 천연 전장 BCR의 C-말단 (C-말단 도메인이 BCR-ABL 내에 존재하지 않음)에 직접 결합된 항체가 BCR-ABL의 N-말단 영역에 결합된 항체와 동일한 패드 내의 동일한 슬라이드 상에 스폿될 때, 전체 BCR-ABL 수준은 변경되지 않음을 입증한다. 도 26은 천연 BCR의 C-말단에 결합된 항체가 동일한 패드 내의 동일한 슬라이드 상에 스폿될 때 N-말단-특이적 BCR 항체로 검출된 유리 천연 BCR 신호가 감소됨을 입증한다.
특정 구현에에서, 본 실시예에 기술된 방법은 전체 BCR-ABL 수준 뿐만 아니라 전체 천연 전장 BCR 또는 ABL 수준을 측정하고 및/또는 검출하기 위해 사용될 수 있고, 그리고 천연 전장 BCR 또는 ABL 수준에 대한 BCR-ABL 수준의 비율을 예를 들면, 주요 분자 반응, 완전한 분자 반응, 완전한 세포유전학적 반응, 및 그것의 조합과 같은 반응 지시자의 보다 정확한 측정을 제공하기 위하여 계산된다. 아른 예에서, 본 실시예에 기술된 방법은 치료요법에 대한 함수로서 (예를 들면, 타이로신 키나제 억제제 치료요법) 천연 전장 BCR 또는 ABL (예를 들면, 천연 전장 BCR 또는 ABL 수준에 대한 전체 BCR-ABL 수준의 비유을 계산하는 것에 의해)와 같은 대조군에 대한 BCR-ABL의 발현에서의 변화를 관찰하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물 및 특허 출원은 각각의 개별적 간행물 또는 특허 출원이 참조로서 포함되는 것으로 특별하고 개별적으로 지정된 것과 같이 참조로서 본원에 포함된다. 상술된 발명은 명료한 이해를 위해 예시 및 예를 들어서 다소 상세하기 기재되었으나, 첨부된 청구의 범위의 사상 또는 범위로부터 벗어남이 없이 발명에 대해 특정 변경 및 변형이 이루어질 수 있음이 본 발명의 교시내용에 비추어 당업자에게 용이하게 명백할 것이다.

Claims (100)

  1. 종양원성 융합 단백질의 수준 또는 활성화 상태를 측정하기 위한 방법으로, 상기 방법은:
    (a) 세포 추출액을 세포 추출액 내에 존재하는 제1 전장 단백질을 제1 전장 단백질과 제1 결합 모이어티를 포함하는 복합체로 전환하기에 적합한 조건 하에 제1 전장 단백질의 제1 도메인에 특이적인 제1 결합 모이어티와 접촉시키는 단계, 여기서 상기 제1 전장 단백질의 제1 도메인은 제2의, 다른 전장 단백질의 제1 도메인에 융합된 제1 전장 단백질의 제2의, 다른 도메인을 포함하는 대응되는 종양원성 융합 단백질이 부재하고;
    (b) 세포 추출액으로부터 단계 (a)의 복합체를 제거함으로써 제1 전장 단백질이 없는 세포 추출액을 형성하는 단계;
    (c) 단계 (b)로부터의 세포 추출액을 세포 추출액 내에 존재하는 종양원성 융합 단백질을 종양원성 융합 단백질과 제2 결합 모이어티를 포함하는 복합체로 전환하기에 적합한 조건 하에 제1 전장 단백질의 제2의, 다른 도메인에 특이적인 제2 결합 모이어티와 접촉시키는 단계; 및
    (d) 단계 (c)로부터의 복합체의 수준 또는 활성화 상태를 측정함으로써, 종양원성 융합 단백질의 수준 또는 활성화 상태를 판단하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 여기서 상기 세포 추출액은 샘플로부터 단리된 세포의 추출액을 포함하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 여기서 상기 샘플은 전혈, 혈청, 혈장, 소변, 담(sputum), 기관지 세척액(bronchial lavage fluid), 눈물, 유두 흡인물, 림프, 타액, 미세침 흡인물 (fine needle aspirate, FNA), 및 그것의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 여기서 상기 샘플은 암을 갖는 환자로부터 수득되는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 여기서 상기 암은 암 세포 내의 염색체 전좌(translocation)로 인한 종양원성 융합 단백질의 형성에 의해 야기되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 여기서 상기 암은 악성혈액 종양, 골육종, 연조직 육종인 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 여기서 상기 악성혈액 종양은 백혈병 또는 림프종인 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 여기서 상기 백혈병은 만성 골수 백혈병(chronic myelogenous leukemia, CML)인 것인 방법.
  9. 제2항에 있어서, 여기서 상기 단리된 세포는 순환 종양 세포, 백혈구, 및 그것의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  10. 제2항에 있어서, 여기서 상기 단리된 세포는 성장 인자에 의해 인 비트로(in vitro)에서 자극되는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 여기서 상기 단리된 세포는 성장 인자 자극 이전에 항암 약물로 인큐베이션되는 것인 방법.
  12. 제10항에 있어서, 여기서 상기 단리된 세포는 성장 인자 자극 이후에 용해됨으로써 세포 추출액을 생성하는 것인 방법.
  13. 제2항에 있어서, 여기서 상기 단리된 세포는 용해 이전에 세척됨이 없이 세포 추출액을 생성하는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 종양원성 융합 단백질은 BCR-ABL, DEK-CAN, E2A-PBX1, RARα-PML, IREL-URG, CBFβ-MYH11, AML1-MTG8, EWS-FLI, LYT-10-Cα1, HRX-ENL, HRX-AF4, NPM-ALK, IGH-MYC, RUNXl-ETO, TEL-TRKC, TEL-AMLl, MLL-AF4, TCR-RBTN2, COL1A1-PDGF, E2A-HLF, PAX3-FKHR, ETV6-NTRK3, RET-PTC, TMRSS-ERG, TPR-MET, 및 그것의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 종양원성 융합 단백질은 BCR-ABL인 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 여기서 상기 제1 전장 단백질은 BCR인 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 여기서 상기 제1 전장 단백질의 제1 도메인은 BCR의 카르복실-말단 영역(BCR-C)을 포함하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 여기서 상기 제1 전장 단백질의 제2의, 다른 도메인은 BCR의 아미노-말단 영역(BCR-N)을 포함하는 것인 방법.
  19. 제15항에 있어서, 여기서 상기 제2의, 다른 전장 단백질은 ABL인 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 여기서 상기 제2의, 다른 전장 단백질의 제1 도메인은 ABL의 카르복실-말단 영역(ABL-C)을 포함하는 것인 방법.
  21. 제15항에 있어서, 여기서 상기 제1 전장 단백질은 ABL인 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 여기서 상기 제2의, 다른 전장 단백질은 BCR인 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 활성화 상태는 인산화 상태, 유비퀴틴화 상태, 복합체화 상태, 및 그것의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 종양원성 융합 단백질은 BCR-ABL이고, 상기 활성화 상태는 인산화 상태인 것인 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 일 또는 그 이상의 신호전달 분자의 수준 또는 활성화 상태를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 여기서 상기 일 또는 그 이상의 신호 전달 분자는 BCR-ABL 기질인 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 여기서 상기 BCR-ABL 기질은 CRKL, JAK2, STAT5, VAV, BAP-1, 및 그것의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 제1 결합 모이어티는 제1 항체를 포함하는 것인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 여기서 상기 제1 항체는 고체 지지체에 부착되는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 여기서 상기 고체 지지체는 유리, 플라스틱, 칩, 핀, 필터, 비드, 종이, 막, 섬유 다발, 및 그것의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 제2 결합 모이어티는 제2 항체를 포함하는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 여기서 상기 제2 항체는 고체 지지체에 부착되는 것엔, 방법.
  33. 제32항에 있어서, 여기서 상기 고체 지지체는 유리, 플라스틱, 칩, 핀, 필터, 비드, 종이, 막, 섬유 다발, 및 그것의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  34. 제32항에 있어서, 여기서 상기 제2 항체는 어드레스가능한(addressable) 어레이 내의 고체 지지체상에 고정되는 것인 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 단계 (c) 및 (d)는 효소-결합 면역학적 검정법((ELISA), 유세포 검정법, 또는 태그-분류 검정법을 포함하는 것인 방법.
  36. 제35항에 있어서, 여기서 상기 ELISA는 샌드위치 ELISA를 포함하는 것인 방법.
  37. 제35항에 있어서, 여기서 상기 유세포 검정법은 형광-활성 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting, FACS) 검정법을 포함하는 것인 방법.
  38. 제35항에 있어서, 여기서 상기 태그-분류 검정법은 Luminex® 검정법을 포함하는 것인 방법.
  39. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 단계 (c) 및 (d)는 근접 이중 검출 검정법을 포함하는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 단계 (c)는:
    (c') 단계 (b)로부터의 세포 추출액을 세포 추출액 내에 존재하는 종양원성 융합 단백질을 종양원성 융합 단백질과 제2의, 제3의, 및 제4의 결합 모이어티를 포함하는 복합체로 전환하기에 적합한 조건 하에 제3의 결합 모이어티 및 제4의 결합 모이어티와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하고,
    여기서 상기 제3의 결합 모이어티는 촉진 모이어티로 표지되고, 하기의; (i) 제2의, 다른 전장 단백질의 제1 도메인; (ii) 제1의 전장 단백질의 제2의, 다른 도메인; 또는 (iii) 제1 전장 단백질의 제2의, 다른 도메인과 제2의, 다른 전장 단백질의 제1 도메인 사이의 융합 부위 중 하나에 특이적이고,
    여기서, 제4의 결합 모이어티는 신호 증폭쌍의 제1의 일원으로 표지되고 제2의, 다른 전장 단백질의 제1 도메인에 특이적이고, 그리고
    여기서 촉진 모이어티는 신호 증폭쌍의 제1 일원에 채널링하고 상기에 반응하는 산화제를 발생시키고;
    상기 단계 (d)는:
    (d') 단계 (c')로부터의 복합체를 신호 증폭쌍의 제2의 일원과 인큐베이션함으로써, 증폭된 신호를 발생시키는 단계; 및
    (d") 신호 증폭 쌍의 제1 및 제2의 일원으로부터 발생된 증폭된 신호를 검출하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 여기서 상기 단계 (b)로부터의 세포 추출액은 제2의 결합 모이어티의 연속된 희석물과 접촉됨으로써 종양원성 융합 단백질과 제2의 결합 모이어티를 포함하는 다수의 복합체를 형성하는 것인 방법.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 여기서 상기 제3의 및 제4의 결합 모이어티는 각각 제3의 및 제4의 항체를 포함하는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 여기서 상기 제3의 및 제4의 항체는 둘다 활성화 상태-비의존성 항체인 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 여기서 상기 신호 증폭쌍의 제1 및 제2의 일원으로부터 발생된 증폭된 신호는 종양원성 융합 단백질의 전체 양과 상관관계에 있는 것인 방법.
  45. 제42항에 있어서, 여기서 상기 제3의 항체는 활성화 상태-비의존성 항체이고 상기 제4의 항체는 활성화 상태-의존성 항체인 것인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 여기서 상기 신호 증폭쌍의 제1 및 제2의 일원으로부터 발생된 증폭된 신호는 활성화된 종양원성 융합 단백질의 양과 상관관계에 있는 것인 방법.
  47. 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 제3의 결합 모이어티는 촉진 모이어티로 직접 표지되는 것인 방법.
  48. 제40항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 제4의 결합 모이어티는 신호 증폭쌍의 제1의 일원으로 직접 표지되는 것인 방법.
  49. 제40항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 제4의 결합 모이어티는 제2의 검출 항체에 컨뷰게이트된 결합쌍의 제1의 일원과 신호 증폭쌍의 제1의 일원에 컨쥬게이트된 결합쌍의 제2의 일원 사이의 결합을 통해 신호 증폭쌍의 제1의 일원으로 표지되는 것인 방법.
  50. 제49항에 있어서, 여기서 상기 결합쌍의 제1 일원은 비오틴인 것인 방법.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 여기서 상기 결합쌍의 제2의 일원은 스트렙타비딘인 것인 방법.
  52. 제40항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 촉진 모이어티는 글루코스 옥시다제(glucose oxidase)인 것인 방법.
  53. 제52항에 있어서, 여기서 상기 글루코스 옥시다제 및 제3의 결합 모이어티는 술프히드릴-활성화된 덱스트란 분자에 컨쥬게이트되는 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 여기서 상기 술프히드릴-활성화된 덱스트란 분자는 500kDa의 분자량을 갖는 것인 방법.
  55. 제52항에 있어서, 여기서 상기 산화제는 하이드로겐 퍼옥사이드(H202)인 것인 방법.
  56. 제55항에 있어서, 여기서 상기 신호 증폭쌍의 제1 일원은 퍼옥시다제인 것인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 여기서 상기 퍼옥시다제는 호스라디시 퍼옥시다제(HRP)인 것인 방법.
  58. 제56항에 있어서, 여기서 상기 신호 증폭쌍의 제2의 일원은 티라미드 시약인 것인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 여기서 상기 티라미드 시약은 비오틴-티라미드인 것인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 여기서 상기 증폭된 신호는 비오틴-티라미드의 퍼옥사이드 산화에 의해 발생됨으로써 활성화된 티라미드를 생성하는 것인 방법.
  61. 제60항에 있어서, 여기서 상기 활성화된 티라미드는 직접 검출되는 것인 방법.
  62. 제60항에 있어서, 여기서 상기 활성화된 티라미드는 신호-검출 시약의 첨가시 검출되는 것인 방법.
  63. 제62항에 있어서, 여기서 상기 신호-검출 시약은 스트렙타비딘-표지 형광물질인 것인 방법.
  64. 제62항에 있어서, 여기서 상기 신호-검출 시약은 스트렙타비딘-표지 퍼옥시다제 및 발색 시약인 것인 방법.
  65. 제64항에 있어서, 여기서 상기 발색 시약은 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)인 것인 방법.
  66. 제1항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
    (e) 상기 세포 추출액을 세포 추출액 내에 존재하는 제2의, 다른 전장 단백질을 제2의, 다른 전장 단백질과 제5의 결합 모이어티를 포함하는 복합체로 전환하기에 적합한 조건 하에 제2의, 다른 전장 단백질에 특이적인 제5의 결합 모이어티와 접촉시키는 단계, 여기서 상기 제2의, 다른 전장 단백질의 제2의 도메인은 종양원성 융합 단백질이 부재하고; 및
    (f) 세포 추출액으로부터 단계 (e)의 복합체를 제거함으로써 제2의, 다른 전장 단백질이 없는 세포 추출액을 형성하는 단계를 추가로 포함하고, 여기서 단계 (e)는 단계 (a) 이전에, 단계 (a) 동안, 또는 단계 (a) 이후에 수행되는 것인 방법.
  67. 제66항에 있어서, 여기서 상기 제5의 결합 모이어티는 제5의 항체를 포함하는 것인 방법.
  68. 제67항에 있어서, 여기서 상기 제5의 항체는 고체 지지체에 부착되는 것인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 여기서 상기 고체 지지체는 유리, 플라스틱, 칩, 핀, 필터, 비드, 종이, 막, 섬유 다발, 및 그것의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  70. 암을 갖는 피검체에서 치료요법을 최적화하고 그리고/또는 독성을 감소시키고, 그리고 암의 치료를 위한 치료요법 과정을 수여하는 방법으로, 상기 방법은:
    (a) 종양 약물의 투여 이후에 암 세포를 단리시키는 단계;
    (b) 상기 단리된 세포를 용해시킴으로써 세포 추출액을 생성하는 단계;
    (c) 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 세포 추출액 내의 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 수준을 측정하는 단계; 및
    (d) 상기 측정된 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 수준을 치료요법 과정 동안의 이른 시점에 측정된 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 수준과 비교하는 단계; 및
    (e) 단계 (d)로부터의 비교를 비탕으로 피검체에 치료요법의 과정의 후속 용량 또는 피검체에 다른 치료요법 과정을 투여해야 하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  71. 제70항에 있어서, 여기서 상기 종양원성 융합 단백질은 BCR-ABL인 것인 방법.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, 여기서 상기 피검체는 치료요법 과정을 수여받기 이전에 종양원성 융합 단백질을 발현하는 암 세포를 갖는 것으로 측정되는 것인 방법.
  73. 제72항에 있어서, 여기서 상기 피검체는 BCR-ABL에 양성인 것인 방법.
  74. 제70항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 종양원성 융합 단백질의 발현 수준 뿐만 아니라 활성화 수준은 세포 추출액 내에서 측정되는 것인 방법.
  75. 제74항에 있어서, 여기서 상기 단계 (c)는 전체 종양원성 융합 단백질 수준에 대한 활성화된 것의 비율을 계산하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  76. 제75항에 있어서, 여기서 상기 단계 (d)는 계산된 전체 종양원성 융합 단백질에 대한 활성화된 것의 비율을 이른 시점에 피검체에서 계산된 전체 종양원성 융합 단백질 수준에 대한 활성화된 것의 비율과 비교하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  77. 제75항 또는 제76항에 있어서, 여기서 상기 계산된 전체 종양원성 융합 단백질에 대한 활성화된 것의 비율은 항암 약물 치료시 활성화된 종양원성 융합 단백질의 백분율 억제와 상관관계에 있는 것인 방법.
  78. 제75항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 계산된 전체 종양원성 융합 단백질 수준에 대한 활성화된 것의 비율은 조절 단백질의 수준과 상응하는 것인 방법.
  79. 제75항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 계산된 전체 종양원성 융합 단백질 수준에 대한 활성화된 것의 비율은 인산/전체 BCR-ABL 단백질 수준의 비율을 포함하는 것인 방법.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서, 여기서 상기 조절 단백질은 종양원성 융합 단백질 내부에서 발견되는 염기서열 또는 도메인을 함유하는 천연 전장 단백질을 포함하는 것인 방법.
  81. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 조절 단백질은 전장 BCR, 전장 ABL, 및 그것의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  82. 제70항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 종양원성 융합 단백질의 활성화 수준의 약 50% 미만의 억제는 치료요법 과정의 후속 용량을 증가시키거나 다른 치료요법 과정을 투여해야할 필요함을 나타내는 것인 방법.
  83. 제70항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 종양원성 융합 단백질의 활성화 수준의 약 50% 미만의 억제는 치료요법 과정에 대한 피검체의 순응성 결핍, 치료요법 과정과 관련된 부-작용 또는 독성의 존재 가능성, 또는 그것의 조합을 나타내는 것인 방법.
  84. 제70항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 종양원성 융합 단백질의 활성화 수준의 약 80% 초과의 억제는 피검체가 정확한 용량에서 정확한 치료요법 과정을 받고 있음을 나타내는 것인 방법.
  85. 제70항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 암은 만성 골수 백혈병(CML)인 것인 방법.
  86. 제70항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 항암 약물은 모노클로날 항체, 타이로신 키나제 억제제, 화학요법제, 호르몬 치료제, 방사선 치료제, 백신, 및 그것의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  87. 제86항에 있어서, 여기서 상기 타이로신 키나제 억제제는 이마티니브 메실레이트(Gleevec®), 니로티니브(Tasigna®), 다사티니브 (Sprycel®), 보수티니브 (SKI-606), 및 그것의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  88. 제70항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 단계 (c) 내지 단계 (e)은 선택적으로:
    (c') 세포 추출액 내의 종양원성 융합 단백질 및 그것의 경로 내의 일 또는 그 이상의 신호 전달 분자의 발현 및/또는 활성화 수준을 측정하는 단계; 및
    (d') 상기 측정된 종양원성 융합 단밸질 및 신호 전달 분자의 발현 및/또는 활성화 수준을 치료요법 과정 동안 이른 시점에서 측정된 종양원성 융합 단백질 및 신호 전달 분자의 발현 및/또는 활성화 수준과 비교하는 단계; 및
    (e') 단계 (d')로부터의 비교를 바탕으로 피검체에 치료요법 과정의 후속 용량 또는 다른 치료요법 과정을 피검체에 투여해야 하는지 여부를 판단하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  89. 암의 치료에 적합한 항암 약물을 선별하는 방법으로, 상기 방법은:
    (a) 항암 약물의 투여 이후에 또는 항암 약물로 인큐베이션 이전에 암 세포를 단리하는 단계;
    (b) 상기 단리된 세포를 용해함으로써 세포 추출액을 생성하는 단계;
    (c) 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 세포 추출액 내의 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 수준을 측정하는 단계; 및
    (d) 상기 종양원성 융합 단백질의 검출된 발현 및/또는 활성화 수준을 항암 약물의 부재시 발생되는 참조 수준 및/또는 활성화 프로파일과 비교함으로써, 상기 항암 약물이 암의 치료에 적합한지 또는 부적합한지 여부를 결정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  90. 항암 약물로 치료에 대한 암의 반응성을 확인하기 위한 방법으로, 상기 방법은:
    (a) 항암 약물의 투여 이후에 또는 항암 약물로 인큐베이션 이전에 암 세포를 단리하는 단계;
    (b) 상기 단리된 세포를 용해함으로써 세포 추출액을 생성하는 단계;
    (c) 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 세포 추출액 내의 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 수준을 측정하는 단계; 및
    (d) 상기 종양원성 융합 단백질의 검출된 발현 및/또는 활성화 수준을 항암 약물의 부재시 발생되는 참조 수준 및/또는 활성화 프로파일과 비교함으로써, 항암 약물로 치료에 대한 반응성 또는 비-반응성으로 암을 확인하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  91. 암을 갖는 환자의 항암 약물로 치료에 대한 반응을 예측하는 방법으로, 상기 방법은:
    (a) 항암 약물의 투여 이후에 또는 항암 약물로 인큐베이션 이전에 암 세포를 단리하는 단계;
    (b) 단리된 세포를 용해함으로써 세포 추출액을 생성하는 단계;
    (c) 제1항 재지 제69항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 세포 추출액 내의 죵양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 수준을 측정하는 단계;
    (d) 상기 종양원성 융합 단백질의 검출된 발현 및/또는 활성화 수준을 항암 약물의 부재시 발생되는 참조 수준 및/또는 활성화 프로파일과 비교함으로써, 피검체가 항암 약물로 치료에 반응할 가능성을 예측하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  92. 암을 갖는 환자가 항암 약물로 치료에 내성이 있는지 여부를 측정하는 방법으로, 상기 방법은:
    (a) 항암 약물의 투여 이후에 또는 항암 약물로 인큐베이션 이전에 암 세포를 단리하는 단계;
    (b) 상기 단리된 세포를 용해시킴으로써 세포 추출액을 생성하는 단계;
    (c) 제1항 내지 제69항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 세포 추출액 내의 종양원성 융합 단백질의 발현 및/또는 활성화 수준을 측정하는 단계; 및
    (d) 상기 종양원성 융합 단백질의 검출된 발현 및/또는 활성화 수준을 항암 약물의 부재시 또는 이른 시점에 항암 약물의 존재시 발생되는 참조 수준 및/또는 활성화 프로파일과 비교함으로써, 항암 약물로 치료에 내성이 있는지 또는 민감한지 여부를 측정하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  93. 제89항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 암은 만성 골수 백혈병(CML)인 것인 방법.
  94. 제89항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 상기 항암 약물은 모노클로날 항체, 타이로신 키나제 억제제, 화학요법제, 호르몬 치료제, 방사선 치료제, 백신, 및 그것의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  95. 제94항에 있어서, 여기서 상기 모노클로날 항체는 트라스투주맙 (trastuzumab, Herceptin®), 알레투주맙 (alemtuzumab, Campath®), 베바시주맙 (bevacizumab, Avastin®), 세투시맙 (bevacizumab, Erbitux®), 겜투주맙 (gemtuzumab, Mylotarg®), 파니투무맙 (panitumumab, Vectibix™), 리투시맙 (rituximab, Rituxan®), 토시투모맙 (tositumomab, BEXXAR®), 및 그것의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  96. 제94항에 있어서, 여기서 상기 타이로신 키나제 억제제는 이마티니브 메실레이트 (imatinib mesylate, Gleevec®), 니로티니브 (nilotinib, Tasigna®), 다사티니브 (dasatinib, Sprycel®), 보수티니브 (bosutinib, SKI-606), 게피티니브 (gefitinib, Iressa®), 수니티니브 (sunitinib, Sutent®), 어로티니브 (sunitinib, Tarceva®), 라파티니브 (lapatinib, GW-572016; Tykerb®), 카넬티니브 (canertinib, CI 1033), 세막시니브 (semaxinib, SU5416), 바타라니브 (vatalanib, PTK 787/ZK222584), 소파레니브 (sorafenib, BAY 43-9006; Nexavar®), 레프루노마이드 (leflunomide, SU101), 및 반데타니브 (vandetanib, ZACTEVIA™; ZD6474);,및 그것의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  97. 제94항에 있어서, 여기서 상기 타이로신 키나제 억제제는 이마티니브 메실레이트(Gleevec®), 니로티니브(Tasigna®), 다사티니브 (Sprycel®), 보수티니브 (SKI-606), 및 그것의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  98. 제95항에 있어서, 여기서 상기 화학 치료제는 페메트렉세드 (pemetrexed, ALDVITA®), 겜시타빈 (gemcitabine, Gemzar®), 시로리무스 (라파마이신), 라파마이신 유사체, 백금 화합물, 카보플라틴, 시스플라틴, 사트라플라틴, 파크리탁셀(Taxol®), 도세탁셀(Taxotere®), 템시로리무스(CCI-779), 에버로리무스(RAD001), 및 그것의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  99. 제94항에 있어서, 여기서 상기 호르몬 치료제는 아로마타제 억제제, 선택적 에스트로겐 수용체 조절제, 스테로이드, 피나스테리드, 고나도트로핀-방출 호르몬 아고니스트, 그것의 약제학적으로 허용가능한 염, 그것의 입체이성질체, 그것의 유도체, 그것의 유사체, 및 그것의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  100. 제94항에 있어서, 상기 방사선 치료제는 47Sc, 64Cu, 67Cu, 89Sr, 86Y, 87Y, 90Y, 105Rh, 111Ag, 111In, 117 mSn, 149Pm, 153Sm, 166Ho, 177Lu, 186Re, 188Re, 211At, 212Bi, 및 그것의 조합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
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Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120065092A1 (en) * 2010-09-14 2012-03-15 Wai Hobert Fusion analyte cytometric bead assay, and systems and kits for performing the same
SG191230A1 (en) 2010-12-23 2013-07-31 Nestec Sa Drug selection for malignant cancer therapy using antibody-based arrays
EP2676137B1 (en) 2011-02-17 2014-12-31 Nestec S.A. Assays for detecting autoantibodies to anti-tnf drugs
EP2681552A2 (en) 2011-03-02 2014-01-08 Nestec S.A. Prediction of drug sensitivity of lung tumors based on molecular and genetic signatures
CN102676648A (zh) * 2011-03-07 2012-09-19 重庆医科大学附属儿童医院 白血病诊疗的基因芯片
CA2831468A1 (en) 2011-04-04 2012-10-11 Nestec S.A. Methods for predicting and improving the survival of gastric cancer patients
CN103649336A (zh) 2011-05-10 2014-03-19 雀巢产品技术援助有限公司 用于个体化治疗管理的疾病活动性表征方法
CA2833212C (en) * 2011-05-12 2020-06-09 Genentech, Inc. Multiple reaction monitoring lc-ms/ms method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature peptides
US9804160B2 (en) * 2011-09-28 2017-10-31 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Protein-protein interaction as biomarkers
US9335292B2 (en) 2011-10-13 2016-05-10 Auburn University Electrochemical proximity assay
EP2788752B1 (en) 2011-12-05 2018-10-03 Pierian Holdings, Inc. Method of therapy selection for patients with lung cancer
JP6517018B2 (ja) * 2012-02-09 2019-05-22 ヴァー２・ファーマシューティカルズ・アンパルトセルスカブＶＡＲ２ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ ＡｐＳ コンドロイチン硫酸グリカンのターゲティング
DK2831587T3 (en) 2012-03-27 2018-07-23 Ventana Med Syst Inc Signaling conjugates and methods of use
JP2014030572A (ja) * 2012-08-03 2014-02-20 Akira Sakai 抗がん剤投与装置
US9422602B2 (en) 2012-08-15 2016-08-23 Bio-Rad Laboratories, Inc. Methods and compositions for determining nucleic acid degradation
EP3640645A1 (en) 2012-10-05 2020-04-22 Prometheus Biosciences, Inc. Methods for predicting and monitoring mucosal healing
CN103792364B (zh) * 2012-10-31 2016-06-08 张宝弘 用于检测外周血中循环肿瘤细胞ror1蛋白的试剂及其应用
WO2014122582A1 (en) 2013-02-05 2014-08-14 Nestec S.A. Drug selection for non-small cell lung cancer therapy
EP2954328A1 (en) 2013-02-05 2015-12-16 Nestec S.A. Drug selection for colorectal cancer therapy using receptor tyrosine kinase profiling
WO2014122600A1 (en) 2013-02-05 2014-08-14 Nestec S.A. Methods of selecting combination therapy for colorectal cancer patients
CN104007257B (zh) * 2013-02-24 2017-02-08 北京莱尔生物医药科技有限公司 一种检测非体液性稀有有核细胞的方法和试剂盒
WO2014141306A2 (en) * 2013-03-15 2014-09-18 Rajiv Gandhi Centre For Biotechnology Methods and materials for identifying therapeutic response in chronic myeloid leukemia
CA2912989A1 (en) 2013-05-21 2014-11-27 Nestec S.A. Methods for predicting and improving the survival of colorectal cancer patients
WO2015110989A1 (en) 2014-01-23 2015-07-30 Nestec S.A. Biomarker panel for assessment of mucosal healing
GB2524519B (en) * 2014-03-25 2019-11-06 Pelago Bioscience AB Methods for identifying a biomarker indicative of a reduced drug response using a thermal shift assay
JP2017520769A (ja) * 2014-06-30 2017-07-27 ネステク ソシエテ アノニム フローサイトメトリーを使用する協調的酵素増強反応性（ｃｅｅｒ）免疫アッセイ
WO2016063204A1 (en) 2014-10-20 2016-04-28 Nestec S.A. Methods for prediction of anti-tnf alpha drug levels and autoantibody formation
US11149299B2 (en) * 2015-06-25 2021-10-19 Ramesh Vallabhaneni Method and system for multiplex profiling of chromosomes in biological samples using target-specific DNA probes
TWI734775B (zh) * 2016-04-26 2021-08-01 美商美國泰福生技股份有限公司 細胞培養基
CN106645728A (zh) * 2016-11-09 2017-05-10 百奥森（江苏）食品安全科技有限公司 一种食品中氟喹诺酮类药物的检测试剂盒
US10799503B2 (en) 2016-12-01 2020-10-13 Ignyta, Inc. Methods for the treatment of cancer
WO2018165566A1 (en) 2017-03-09 2018-09-13 Auburn University Differential circuit for background correction in electrochemical measurements
KR20180117529A (ko) * 2017-04-19 2018-10-29 주식회사 프로티나 단백질-단백질 상호작용 분석에 의한 약물 반응성 예측 방법
CA3064529C (en) 2017-05-31 2021-12-14 Prometheus Biosciences, Inc. Methods for assessing mucosal healing in crohn's disease patients
WO2019010341A1 (en) 2017-07-07 2019-01-10 Innamed, Inc. APTAMERS FOR MEASURING LIPOPROTEIN RATES
US11560565B2 (en) 2018-06-13 2023-01-24 Auburn University Electrochemical detection nanostructure, systems, and uses thereof
CN109439759A (zh) * 2018-12-18 2019-03-08 武汉迪安医学检验实验室有限公司 一种用于检测CBFβ-MYH11融合基因的试剂盒
WO2020140927A1 (en) * 2019-01-02 2020-07-09 Crownmab Biotech Inc. Cancer treatment using multi-targeted kinase inhibitor in combination of protein kinase biomarkers
WO2023286723A1 (ja) 2021-07-13 2023-01-19 キヤノン株式会社 検体の分析方法および検体分析装置
WO2023058624A1 (ja) * 2021-10-08 2023-04-13 コニカミノルタ株式会社 染色方法、評価方法および標本

Family Cites Families (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4197199A (en) 1977-10-25 1980-04-08 Manor Engineering Company Limited Filter presses
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5532138A (en) 1990-04-26 1996-07-02 Behringwerke Ag Method and kits for determining peroxidatively active catalysts
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
WO1992021032A1 (en) 1991-05-24 1992-11-26 The Regents Of The University Of California Methods for the detection of bcr-abl and abnormal abl proteins in leukemia patients
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
DE69334255D1 (de) 1992-02-06 2009-02-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Marker für Krebs und biosynthetisches Bindeprotein dafür
JP3571337B2 (ja) 1992-02-11 2004-09-29 セル ジェネシス，インコーポレーテッド 遺伝子標的現象による同型遺伝子接合
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
US5332662A (en) 1992-07-31 1994-07-26 Syntex (U.S.A.) Inc. Methods for determining peroxidatively active substances
WO1994004690A1 (en) 1992-08-17 1994-03-03 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
US5618829A (en) 1993-01-28 1997-04-08 Mitsubishi Chemical Corporation Tyrosine kinase inhibitors and benzoylacrylamide derivatives
KR960703622A (ko) 1993-07-15 1996-08-31 수잔 포오덴 단백질 티로신 키나아제 억제제의 프로드러그(prodrugs of protein tyrosine kinase inhibitors)
EP0711341A4 (en) * 1993-07-29 2001-12-19 Cor Therapeutics Inc METHODS OF DETERMINING THE FUNCTION OF A RECEPTOR
ATE177842T1 (de) 1993-09-03 1999-04-15 Behringwerke Ag Fluoreszenz-sauerstoffkanalisation-immunteste
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5804396A (en) 1994-10-12 1998-09-08 Sugen, Inc. Assay for agents active in proliferative disorders
US6107457A (en) 1995-02-16 2000-08-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Bcr-Abl directed compositions and uses for inhibiting Philadelphia chromosome stimulated cell growth
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5639757A (en) 1995-05-23 1997-06-17 Pfizer Inc. 4-aminopyrrolo[2,3-d]pyrimidines as tyrosine kinase inhibitors
DK0892789T4 (da) 1996-04-12 2010-04-06 Warner Lambert Co Irreversible inhibitorer af tyrosin kinaser
US6057098A (en) 1997-04-04 2000-05-02 Biosite Diagnostics, Inc. Polyvalent display libraries
PT983510E (pt) * 1997-05-20 2004-06-30 Univ Erasmus Reconhecimento de produtos geneticos especificos de tumor em cancro
US6686165B2 (en) 1997-05-20 2004-02-03 Erasmus Universiteit Rotterdam Recognition of tumor-specific gene products in cancer
ZA986732B (en) 1997-07-29 1999-02-02 Warner Lambert Co Irreversible inhibitiors of tyrosine kinases
US6100254A (en) 1997-10-10 2000-08-08 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibitors of protein tyrosine kinases
US6897073B2 (en) 1998-07-14 2005-05-24 Zyomyx, Inc. Non-specific binding resistant protein arrays and methods for making the same
US6780582B1 (en) 1998-07-14 2004-08-24 Zyomyx, Inc. Arrays of protein-capture agents and methods of use thereof
US6197599B1 (en) 1998-07-30 2001-03-06 Guorong Chin Method to detect proteins
US6740665B1 (en) 1999-02-10 2004-05-25 Ramachandran Murali Tyrosine kinase inhibitors and methods of using the same
US6245759B1 (en) 1999-03-11 2001-06-12 Merck & Co., Inc. Tyrosine kinase inhibitors
EP1206260A4 (en) 1999-06-30 2002-10-30 Merck & Co Inc SRC-KINASE INHIBITING COMPOUNDS
WO2001000214A1 (en) 1999-06-30 2001-01-04 Merck & Co., Inc. Src kinase inhibitor compounds
ATE253915T1 (de) 1999-06-30 2003-11-15 Merck & Co Inc Src-kinase hemmende verbindungen
US7179638B2 (en) 1999-07-30 2007-02-20 Large Scale Biology Corporation Microarrays and their manufacture by slicing
WO2001017995A1 (en) 1999-09-10 2001-03-15 Merck & Co., Inc. Tyrosine kinase inhibitors
AU778042B2 (en) 1999-10-19 2004-11-11 Merck & Co., Inc. Tyrosine kinase inhibitors
JP3822494B2 (ja) 1999-10-19 2006-09-20 メルク エンド カムパニー インコーポレーテッド チロシンキナーゼ阻害剤
US6794393B1 (en) 1999-10-19 2004-09-21 Merck & Co., Inc. Tyrosine kinase inhibitors
US6313138B1 (en) 2000-02-25 2001-11-06 Merck & Co., Inc. Tyrosine kinase inhibitors
US6420382B2 (en) 2000-02-25 2002-07-16 Merck & Co., Inc. Tyrosine kinase inhibitors
JP2004506201A (ja) 2000-08-03 2004-02-26 マサチューセッツ・インスティチュート・オブ・テクノロジー 機能性生体分子のマイクロアレイおよびその使用
US20020132274A1 (en) * 2001-01-17 2002-09-19 Nevalainen Marja T. Diagnostic and monitorings methods for cancer
US6777239B2 (en) 2001-04-17 2004-08-17 Xenoport, Inc. Epitope-captured antibody display
JP2004535437A (ja) 2001-06-22 2004-11-25 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド チロシンキナーゼ阻害剤
US6958340B2 (en) 2001-08-01 2005-10-25 Merck & Co., Inc. Tyrosine kinase inhibitors
WO2003020276A1 (en) 2001-08-30 2003-03-13 Merck & Co., Inc. Tyrosine kinase inhibitors
US20030190689A1 (en) * 2002-04-05 2003-10-09 Cell Signaling Technology,Inc. Molecular profiling of disease and therapeutic response using phospho-specific antibodies
US20030153013A1 (en) 2002-11-07 2003-08-14 Ruo-Pan Huang Antibody-based protein array system
US7354773B2 (en) * 2003-05-14 2008-04-08 Beckman Coulter, Inc. Method and apparatus for preparing cell samples for intracellular antigen detection using flow cytometry
EP1507147A1 (en) 2003-08-12 2005-02-16 Erasmus University Medical Center Rotterdam Method for detecting low levels of a fusion protein
US20050214301A1 (en) * 2004-03-24 2005-09-29 Cell Signaling Technology, Inc. Antibodies specific for BCR-ABL fusion protein and uses thereof
US20060263837A1 (en) 2004-06-17 2006-11-23 Liu George D Immunoassay system and method for detection of antigens
US7771955B2 (en) 2005-06-09 2010-08-10 University Of Maryland Affinity membrane for capture of a target biomolecule and formation thereof by site-directed immobilization of a capture biomolecule
WO2007061684A1 (en) * 2005-11-18 2007-05-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Quantification of fusion proteins and their activity from chromosomal translocation
EP2064549B1 (en) * 2006-09-21 2012-10-24 Prometheus Laboratories, Inc. Antibody-based arrays for detecting multiple signal transducers in rare circulating cells
BRPI0717416A2 (pt) 2006-09-21 2013-11-12 Prometheus Lab Inc Método para realizar um imunoensaio complexo de alta produtividade, e, arranjo
JP2008261764A (ja) * 2007-04-13 2008-10-30 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd キナーゼ阻害物質の測定方法
AU2008276251B2 (en) 2007-07-13 2014-04-24 Nestec S.A. Drug selection for lung cancer therapy using antibody-based arrays
GB0714573D0 (en) * 2007-07-26 2007-09-05 Imp Innovations Ltd Marker gene
CN101802182A (zh) * 2007-08-21 2010-08-11 诺达利蒂公司 用于诊断、预后和治疗方法的方法
JP5228416B2 (ja) * 2007-09-12 2013-07-03 株式会社リコー 定電流出力制御型スイッチングレギュレータ
NZ600339A (en) * 2008-02-25 2013-12-20 Nestec Sa Drug selection for breast cancer therapy using antibody-based arrays
EP2108956A1 (en) * 2008-04-07 2009-10-14 Erasmus University Medical Center Rotterdam Improved methods and kits for detecting tumor-specific fusion proteins
US8301258B2 (en) 2008-08-14 2012-10-30 The Chinese University Of Hong Kong Methods and devices for preventing ankle sprain injuries

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IL219313A (en) 2017-03-30
US20120277109A1 (en) 2012-11-01
ZA201202957B (en) 2017-01-25
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MX337666B (es) 2016-03-14
DK2491385T3 (en) 2017-08-28
RU2558797C2 (ru) 2015-08-10
NZ599460A (en) 2014-07-25
JP2018119975A (ja) 2018-08-02
MX2012004619A (es) 2012-05-08
RU2012120722A (ru) 2013-11-27

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