DE69822149T2

DE69822149T2 - Erkennung von tmorspezifische genprodukte

Info

Publication number: DE69822149T2
Application number: DE69822149T
Authority: DE
Inventors: Benjamin Paulus BERENDES; Nicole Janine VEENMAN; Cornelia Adriana VAN DENDEREN; Willem Van Ewijk
Original assignee: Erasmus Universiteit Rotterdam
Current assignee: Erasmus Universiteit Rotterdam
Priority date: 1997-05-20
Filing date: 1998-05-20
Publication date: 2005-03-03
Anticipated expiration: 2018-05-21
Also published as: DE69822149D1; CA2290656A1; PT983510E; ES2217558T3; AU7677198A; WO1998053317A1; EP0983510B1; US6610498B1; CA2290656C; EP0983510A1; DK0983510T3; ATE261125T1

Description

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Krebsdiagnostik und die Anwendung von diagnostischen Verfahren in der Pathologie und Hämatologie. Die Erfindung betrifft insbesondere Verfahren, die auf das Vorhandensein von chromosomalen Aberrationen verweisen, wobei tumorspezifische Genprodukte detektiert werden, die ausschließlich von Tumorzellen exprimiert werden, die solche Chromosomen enthalten.
Chromosomale Abnormalitäten oder Aberrationen sind ein wichtiger Grund für genetische Störungen oder Erkrankungen, einschließlich angeborener Störungen und erworbener Erkrankungen, wie beispielsweise Malignome. Maligne Zellen haben ein gemeinsamen klonalen Ursprung, da angenommen wird, dass sie von einer einzelnen, autonom wachsenden Zelle abstammen, die sich wachstumsregulierenden Signalen der Umgebung entzieht.
Der Begriff „Krebs" umfasst eine heterogene Gruppe von Neoplasmen, in der jede Art ihre eigenen Charakteristika im Hinblick auf ihr malignes Potential und ihre Ansprechbarkeit auf eine Therapie aufweist. Gegenwärtig wird die Wirksamkeit einer Krebsbehandlung empirisch bestimmt. Die am besten geeignetste und wirksamste Behandlung wird in Abhängigkeit von der Entwicklungsphase des Krebses, dem Ursprung und der Ausbreitung des Krebses sowie dem physiologischen Zustand des Patienten bestimmt. Gegenwärtig kann eine Auswahl aus chirurgischer Behandlung, Bestrahlungstherapie und Chemotherapie (oder Kombinationen der genannten Therapien) getroffen werden. Es ist jedoch erkannt worden, dass jede Therapie Nebenwirkungen aufweist, die die Vorteile einer Behandlung enorm gefährden. Es versteht sich von selbst, dass die genaue Diagnose der verschiedenen Krebsarten eine herausragende Bedeutung als Hilfestellung bei der Auswahl der wirksamsten Therapie hat.
Die Grundlage für Krebs liegt in chromosomalen Aberrationen wie beispielsweise Translokationen, Inversionen, Insertionen, Deletionen und anderen Mutationen innerhalb oder zwischen Chromosomen. Häufig sind ein Chromosom oder zwei verschiedene Chromosomen bei der Entwicklung von Malignomen beteiligt. Dabei werden Gene oder Fragmente von Genen aus ihrem normalen physiologischen Kontext des nicht-aberranten Chromosoms entfernt und fusionieren mit einem Empfänger-Chromosom oder finden eine Stelle in einem Empfänger-Chromosom (sei es dasselbe oder ein zweites Chromosom), wo sie an nicht verwandte Gene oder Fragmente von Genen (oft Onkogene oder Proto-Onkogene) grenzen, und wobei die neue genetische Kombination die Grundlage für ein Malignom sein kann.
Umlagerungen, wie beispielsweise Translokationen passieren oftmals in einem relativ etablierten Muster, wobei Gene oder Fragmente derselben von nicht-aberranten Chromosomen an einer Bruchstelle (breakpoint) oder an einer Bruchstellen-Cluster-Region (breakpoint cluster region) von entfernt und an einer Fusionsregion in das Rezipienten-Chromosom insertiert werden, wodurch umgelagerte (deletierte, translozierte) oder fusionierte Gene erzeugt werden, die für den speziellen Krebs spezifisch sind. Darüber hinaus können die Umlagerungen oder Translokationen reziprok verlaufen, sodass zwei Chromosomen Teile austauschen, wodurch Zellen mit zwei reziprok umgelagerten Chromosomen entstehen, die beide neue fusionierte Gene enthalten.
Wenn das fusionierte Gen translatiert wird, erzeugt es ein Genprodukt (mRNA), die einzigartig für den Tumor ist. Die chimäre mRNA umfasst Teile oder Fragmente von zwei mRNAs, die den ursprünglich getrennten Genen entsprechen und ursprünglich von diesen transkribiert wurden. Diese tumorspezifische mRNA ist einzigartig durch einen Fusionspunkt charakterisiert, an dem die RNA-Fragmente sich treffen. In einigen Fällen können diese Fusionspunkte mittels Hybridisierungsnukleinsäuresonden detektiert werden. Jedoch wird es angesichts der großen Variation innerhalb der einzelnen Umlagerungen, die bei diesen Translokationen beobachtet werden, und in Abhängigkeit von der Lokalisierung der Bruchstelle innerhalb des nicht-aberranten Gens, wodurch (sogar wenn die Translokationen innerhalb derselben zwei Gene auftreten) verschiedene tumorspezifische Gene erzeugt werden können, als wahrscheinlich angesehen, dass bei jedem einzelnen Fall dieser Krebsarten neue Fusi onspunkte entstehen. Die Detektion von Krebs durch spezifische Detektion des Fusionspunktes des tumorspezifischen Genproduktes (mRNA) ist aus diesem Grund niemals in breiter Form anwendbar gewesen.
Ist das fusionierte Gen in frame fusioniert, so wird die fusionierte mRNA in ein Fusionsprotein translatiert, welches einzigartig für den Tumor ist. Das Protein umfasst Teile von zwei Proteinen, die den ursprünglich getrennten Genen entsprechen und ursprünglich von diesen transkribiert und translatiert wurden. Tumorspezifische Proteine sind in einzigartiger Weise durch einen Fusionspunkt charakterisiert, an dem die zwei Proteine sich treffen. Die Fusionspunkte sind antigenisch exponiert und umfassen einzelne Epitope, die manchmal immunologisch detektiert werden können. Jedoch wird es angesichts der großen Variation innerhalb der einzelnen Umlagerungen, die bei diesen Translokationen beobachtet werden, und in Abhängigkeit von der Lokalisation der Bruchstelle innerhalb des nicht-aberranten Gens, wodurch (sogar wenn die Translokationen in denselben zwei Genen auftreten) verschiedene tumorspezifische Gene erzeugt werden können, als wahrscheinlich angesehen, dass bei jedem einzelnen Fall dieser Krebsarten neue Fusionspunkte entstehen. Die Detektion von Krebs durch spezifische Detektion des Fusionspunkt-Epitops des tumorspezifischen Proteins ist aus diesem Grunde niemals in breiter Form anwendbar gewesen. Die tumorspezifischen Genprodukte (Fusionsprodukte) der fusionierten oder umgelagerten Gene können zu der weiteren Entwicklung des Krebses beitragen.
Ein Bereich, in dem Chromosomen-Aberrationen relativ gut untersucht sind (im Vergleich zu anderen Krebsarten) ist das Gebiet der Leukämie. Im Vergleich zu den meisten malignen Tumoren, unterscheiden sich die der Leukämie hinsichtlich des Differenzierungsgrades der Tumorzellen. Gemäß des klinischen Bildes werden Leukämie-Tumoren in akute und chronische Formen unterteilt, abhängig von der Geschwindigkeit, mit der sie sich entwickeln und mit der sie, sofern unbehandelt, zum Tode führen.
Abhängig von der Abstammung der Zelle, die bei dem leukämischen Prozess involviert ist, werden akute Leukämien als akute lymphoblastische Leukämien (ALL) und akute nicht-lymphoblastische Leukämien (ANLL) klassifiziert, wobei ALL die vorherrschende Form (> 80 %) ist, die in der Kindheit auftritt.
Chronische Leukämien sind Malignome, bei denen die unkontrolliert proliferierenden leukämischen Zellen in der Lage sind, zu reifen. Zwei Subtypen werden unterschieden, chronische lymphozytische Leukämie (CLL) und chronische myeloische Leukämie (CML). Innerhalb dieser vier Gruppen lässt sich eine beachtliche Heterogenität hinsichtlich der Biologie und der Prognose beobachten, die gegenwärtig gemeinsam mit morphologischen Merkmalen berücksichtigt wird. Dieses Vorgehen ist bislang für das Verständnis und die Vorhersage der Prognose eines leukämischen Patienten sowie hinsichtlich einer sinnvollen Therapieplanung von geringem Wert.
Kürzlich konnten molekulargenetische Untersuchungen von leukämischen Patienten jedoch zeigen, dass eine große Vielzahl von chromosomalen Aberrationen innerhalb der verschiedenen Formen der Leukämie gefunden werden kann. Eine Gruppe besteht aus Immunglobulin (IG)-Gen-Umlagerungen oder T-Zellrezeptor (TCR)-Gen-Umlagerungen, die Gen-Umlagerungen von Antigen-Rezeptoren umfassen, die über die normalen physiologischen Prozesse hinausgehen, die für die Erzeugung der Diversität der Antigen-Rezeptormoleküle, die die lymphoide Zellpopulation typisieren, notwendig sind. Es ist eine große Gruppe von typischen IG- und TCR-Umlagerungen bekannt, die mit Leukämie assoziiert ist, wobei bei verschiedenen dieser Umlagerungen tumorspezifische Antigen-Rezeptormoleküle exprimiert werden. Eine weitere Gruppe von Aberrationen umfasst Deletionen eines ganzen Gens oder Teilen eines Gens aus dem Genom. Als Ergebnis der Deletion können Promotorregionen, die normalerweise zu dem nunmehr deletierten Gen gehören, Kontrolle über andere Gene ausüben, was zu einer aberranten Transkription des Gens führt. Ein Beispiel ist die Deletion der kodierenden Region des SIL-Gens in T-Zellen, die zur Transkription des normalerweise nicht exprimierten TAL-1-Gens in T-Zellen und zu einer ektopischen Expression von TAL-1 Fusionsprotein führt. Eine weitere Gruppe umfasst Translokationen von Genfragmenten zwischen Chromosomen, die zu Fusionsgenen führt, die einzigartige Fusionsproteine transkribieren können, die zu der Entwicklung eines Malignoms beitragen. Hinreichend bekannte Beispiele sind die zu BCR-ABL-Fusionsgenen führenden Translokationen, die in 95 % aller Fälle von CML und in 30 % der Fälle ALL bei Erwachsenen gefunden werden, sowie TEL-AML1, dass in 25 – 30 % aller Fälle von ALL im Kindesalter gefunden wird. Es sind jedoch noch weitere Fusionsgene bekannt, wie beispielsweise E2A-PBX1, ETO-AML1 und PML-RAR.
Chromosomen-Aberrationen können durch eine große Anzahl von Verfahren detektiert werden, von denen zahlreiche Verfahren moderne biomolekulare Technologie erfordrlich machen. Traditionelle Verfahren, wie beispielsweise cytogenetische Analysen mittels herkömmlicher Chromosomen-Bandierungs-Verfahren sind (obgleich in hohem Maße präzise) sehr arbeitsintensiv, erfordern Fachpersonal und sind dementsprechend teuer. Automatisierte Karyotypisierung ist für einige diagnostische Anwendungen hilfreich, wie beispielsweise pränatale Diagnostik, ist jedoch bei der Analyse von komplexen Eigenschaften von Malignomen nicht effektiv. Des Weiteren ist es möglich, die gesteigerte Aktivität von Proteinen zu detektieren, beispielsweise die Tyrosin-Kinaseaktivität (vergl. WO 95/31545) in tumorspezifischen Zellen. Die oben beschriebenen Verfahren erfordern frische Zellen, die nicht immer verfügbar sind. Andere, modernere Verfahren verwenden Southern-Blotting oder andere Nukleinsäure-Hybridisierungs- oder Amplifikationsverfahren (wie beispielsweise PCR) zum Detektieren hinreichend etablierter Chromosomenaberrationen, für die geeignete Nukleinsäuresonden oder Primer verfügbar sind. Bei diesen Verfahren können frische oder gefrorene Zellen verwendet werden; in einigen Fällen können sogar ältere Proben, die in geeigneter Weise gelagert wurden (wie beispielsweise nach Formalinfixierung) verwendet werden, solange die Nukleinsäure, die hybridisiert oder amplifiziert werden soll, zugänglich und intakt bleibt. Jedoch lassen sich sogar bei den obigen, modernen Verfahren einige Nachteile feststellen, die eine Verwendung dieser diagnostischen Verfahren bei dem schnellen Screening nach chromosomalen Aberrationen, die mit den besagten Malignomen in Verbindung stehen, behindern. Southern-Blotting dauert 3 – 4 Wochen, und ist somit viel zu langsam, um in die Therapie von Malignomen einzugreifen, und es erlaubt lediglich die Analyse von Nukleinsäuren von 10 – 15 kb pro Sondenanalyse.
Obgleich die PCR im wesentlichen gut für eine schnelle und massive diagnostische Untersuchung oder sogar für ein Screenings geeignet ist, lassen sich lediglich 0,1 – 2 kb einer Nukleinsäure (DNA oder RNA) in einer PCR-Analyse analysieren, was in hohem Maße das schnelle Screening von großen Chromosomenabschnitten und Bruchstellen-Clustern oder Fusionsregionen innerhalb der Chromosomen und ihrer Genprodukte behindert. Ein zusätzlicher Nachteil der PCR ist die ihr innewohnende Empfindlichkeit gegenüber fehlgepaarten Primern. Kleine, normale und physiologische Veränderungen, die immer in der Nukleinsäuresequenz eines zu dem Primer komplementären Genfragments vorhanden sein können, machen es unmöglich, die PCR mit der erwünschten Wirkung durchzuführen und können zu einer falschen Diagnose und zu falsch-negativen Ergebnissen führen. Insbesondere falsch-negative Ergebnisse lassen einen auf einer PCR basierenden, diagnostischen Test (obgleich sehr spezifisch) als nicht sensitiv genug für eine verlässliche Diagnose erscheinen, und es versteht sich von selbst, dass nur eine verlässliche Diagnose von Malignomen zu einem Verständnis der Prognose und der Erstellung einer geeigneten Therapie beitragen können.
Fluoreszente in situ-Hybridisierungsverfahren (FISH) sind nicht in derart starkem Maße von der exakten Paarung von Nukleinsäuresequenzen abhängig, um positive diagnostische Ergebnisse zu erhalten, können jedoch nur bei der Detektion von chromosomaler DNA und nicht für die Detektion der Genprodukte der Chromosomen angewendet werden. Üblicherweise verwendet FISH Sonden-Analysen mit großen, weitestgehend unspezifischen Nukleinsäuresonden, die (oftmals jedoch mit variierender Stringenz) mit Genen oder Genfragmenten hybridisieren, welche in dem umgelagerten Chromosom der malignen Zelle lokalisiert sind. Die Verwendung großer Sonden macht das FISH-Verfahren sehr sensitiv. Die Bindung von Sonden wird durch nachfolgende Detektion der Sonden mit (oftmals multiplen) Fluorochromen mittels mikroskopischer Beobachtung einer Population von Zellen, die von der getesteten Probe erhalten wird, detektiert.
Jedoch haben sogar die gegenwärtig verwendeten FISH-Protokolle ihnen innewohnende Nachteile, die im wesentlichen mit der Auswahl der in den gegenwärtigen FISH-Protokollen verwendeten Nukleinsäuresonden zusammenhängen und oftmals zu falsch-positiven Ergebnissen bei der Diagnose von chromosomalen Umlagerungen führen, was zu diagnostischen Tests führt, die (obgleich sensitiv) nicht sehr spezifisch sind, zumindest nicht spezifisch genug, um Standard-FISH-Verfahren bei der massiven oder schnellen diagnostischen Untersuchung einzusetzen, ganz zu schweigen bei der automatisierten Untersuchung oder des automatisierten Screenings. Ein falsch-positives Ergebnis macht ein umständliches erneutes Testen von Patienten oder sogar von unbedenklichen Personen, die routinemäßig untersucht wurden, erforderlich, und kann diese Personen in hohem Maße beunruhigen.
Die immunologische Detektion von Fusionsproteinen, die aus chromosomalen Aberrationen resultieren, ist (obgleich vielfach versucht) nie erfolgreich durchgeführt worden. Dies wird hauptsächlich dadurch bedingt, dass es schwierig ist, immunologische Reagenzien aufzufinden, die ausschließlich mit tumorspezifischen Proteinen reagieren, im Gegensatz zur immunologischen Detektion von nicht-Fusionsproteinen, die normalerweise ebenfalls vom Körper produziert werden, wenn auch im geringeren Ausmaß (vergl. Beispielsweise Nagasaki et al., J. Imm. Methods 162, 235-245, 1993). Üblicherweise kreuzreagieren solche Antikörper mit normalen zellulären Proteinen. Nur wenn spezifische Fusionspunkte bekannt sind, kann es möglich sein, spezifische immunologische Reagenzien auszuwählen, die ausschließlich mit dem tumorspezifischen Protein durch selektive Bindung an das Epitop des Fusionspunktes reagieren, Die Variation in den Fusionspunkten ist jedoch so stark, dass eine spezifische immunologische Detektion nur in wenigen Fällen gelingt, oftmals nur von Patient zu Patient.
Ferner haben die obigen diagnostischen Tests den großen, ihnen innewohnenden Nachteil, dass sie spezialisierte und gut ausgestattete Laboratorien sowie ausgebildetes und in hohem Maße qualifiziertes Personal erfordern. Ferner werden die obigen Tests nur in Fällen verwendet, in denen der Verdacht auf Malignome besteht, und sind nicht im großen Maßstab für ein Screening von Populationen auf das Risiko des Vorhandenseins von chromosomalen Aberrationen geeignet. Ein Screening im großen Maßstab sowie ein präventives Screening können zu einer frühzeitigen Detektion von Malignomen führen, wodurch der oftmals tödliche Verlauf eines Malignoms in einer frühen Phase seiner Entwicklung unterbrochen werden kann.
Die vorliegende Erfindung stellt nunmehr ein Verfahren bereit, das bei der diagnostischen Untersuchung von biologischen Proben, wie beispielsweise Blutproben, Serumproben, Zellproben, Gewebeproben, Knochenmark, Biopsien, auf Chromosomenaberrationen verwendet werden soll. Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, das bei einer diagnostischen Untersuchung verwendet werden soll, in der sowohl eine hohe Sensitivität als auch eine hohe Spezifität erforderlich ist. Die Erfindung stellt ein Verfahren bereit, das wahlweise in Routinelaboratorien von Personal mit durchschnittlichen Kenntnissen ausgeführt werden kann.
Die vorliegende Erfindung ist durch ein Verfahren zum Detektieren chromosomaler Aberrationen in einer biologischen Probe über die ausschließliche Detektion eines tumorspezifischen Genproduktes charakterisiert, wobei mindestens zwei verschiedene Sonden verwendet werden, die gegen das tumorspezifische Genprodukt gerichtet sind, welches von der chromosomalen Aberration herrührt. Ein überraschender Vorteil der Erfindung besteht darin, dass die Erfindung ein Verfahren zum Detektieren chromosomaler Aberrationen bereitstellt, die mit einer großer Vielzahl von Krebsarten im Zusammenhang steht; beispielsweise stellt die Erfindung ein Verfahren zum Detektieren chromosomaler Aberrationen bereit, die im Zusammenhang mit Leukämie stehen. Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Detektieren tumorspezifischer Genprodukte von zahlreichen Arten chromosomaler Aberrationen bereit; beispielsweise stellt die Erfindung ein Verfahren zum Detektieren von Genprodukten bereit, die fusionierten Genen entsprechen, welche bei chromosomalen Deletionen, Inversionen oder Translokationen gefunden werden. Als ein Beispiel der Erfindung wird ein Verfahren zum Detektieren der „Philadelphia" Chromosomenaberration bereitgestellt, die in Leukämien gefunden wird. Die Erfindung stellt ein Verfahren zum Detektieren tumorspezifischer Genprodukte, wie beispielsweise tumorspezifischer mRNA und tumorspezifischer Proteine bereit. Die erfindungsgemäß verwendeten Sonden werden wahlweise an die Natur des Genproduktes angepasst. Die mRNA-Detektion wird unter Verwendung von mindestens zwei Nukleinsäuresonden durchgeführt, wobei jede mit ganz bestimmten Stellen auf dem Genprodukt reagiert. Die Detektion von tumorspezifischem Protein wird unter Verwendung von mindestens zwei verschiedene Bindungsproteine als Sonden durchgeführt, wobei jede mit ganz bestimmten Stellen auf dem Genprodukt reagiert. Eine große Anzahl von Proteinen ist im Stand der Technik als Bindungsproteine bekannt, wie beispielsweise Rezeptormoleküle, polyklonale oder monoklonale (synthetische) Antikörper, Bindungspeptide oder „Phagen"-Antikörper, die über das Phagen-Display-Verfahren erhalten wurden, usw. Durch die Verwendung von Antikörpern stellt die Erfindung ein Verfahren zum Detektieren chromosomaler Aberrationen auf immunologischem Wege bereit. Als Beispiel der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, in dem das tumorspezifische Genprodukt mittels eines Sepharose-Western-Blotting-Verfahrens detektiert wird. Als ein weiteres Beispiel der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, in dem das tumorspezifische Genprodukt mittels eines Dipstick-Assays detektiert wird. Es werden jedoch erfindungsgemäß auch andere Verfahren bereitgestellt, mittels derer das tu morspezifische Genprodukt durch mindestens zwei verschiedene Sonden detektiert wird. Beispielsweise stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, in dem mRNA, die von einem fusionierten Gen abgeleitet ist, durch mindestens zwei Nukleinsäuresonden detektiert wird, wobei mindestens eine Sonde gegen ein mRNA-Fragment gerichtet ist, welches das 5'-Ende der tumorspezifischen mRNA umfasst, und mindestens eine weitere Sonde gegen ein mRNA-Fragment gerichtet ist, welches das 3'-Ende der tumorspezifischen mRNA umfasst, wobei jedes der Fragmente einer nicht-tumorspezifischen mRNA entspricht. Ferner stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, in dem ein Protein, das von einem fusionierten Gen abgeleitet ist, durch mindestens zwei Bindungsproteine detektiert wird, wobei mindestens ein Bindungsprotein gegen ein Proteinfragment gerichtet ist, welches das aminoterminale Fragment des tumorspezifischen Proteins umfasst, und mindestens ein weiteres Bindungsprotein gegen ein Proteinfragment gerichtet ist, welches das carboxyterminale Fragment des tumorspezifischen Proteins umfasst, wobei jedes der Fragmente einem nicht-tumorspezifischen Protein entspricht. Als Beispiel stellt die Erfindung ein Verfahren zum Detektieren eines tumorspezifischen Genproduktes bereit, in dem das aminoterminale Proteinfragment des Genproduktes jeweils dem ABL- oder BCR-Protein entspricht, wohingegen das carboxyterminale Proteinfragment dem BCR- bzw. ABL-Protein entspricht. In diesem Beispiel werden Sonden verwendet, die ähnliche Antigen-Spezifitäten aufweisen, wie sie bei den Antikörper 7C6, ER-FP1, Yae, 8E9, G98-271.1.3 beobachtet werden; vergl. experimenteller Teil. Die Erfindung stellt ein Verfahren unter Verwendung von Sonden bereit, die mit Reportermolekülen, wie beispielsweise Biotin, Digoxiginin, Enzyme wie beispielsweise Peroxidase, alkalische Phosphatase oder anderen im Stand der Technik bekannten Reportermolekülen markiert oder konjugiert sein können. Die Erfindung stellt ferner ein diagnostisches Kit bereit, das alle Mittel umfasst, wie beispielsweise (markierte) Sonden oder Reagenzien oder Substrate oder Instruktionen, die notwendig sind, um das erfindungsgemäße Verfahren auszuführen. Die erfindungsgemäß bereitgestellten Verfahren oder die diagnostischen Kits werden vorzugsweise verwendet, um chromosomale Aberrationen zu detektieren, die bei bestimmten Arten von Krebs, beispielsweise bei Leukämie gefunden werden, sei es bei der Detektion von (verbleibendem) Krebs im Patienten oder beim Screening nach Krebs in größeren Gesamtpopulationen.
EXPERIMENTELLER TEIL
Der experimentelle Teil beschreibt die Erfindung genauer in Hinblick auf das Gebiet der Leukämie.
Die reziproke Translokation t(9;22)(g34;q11), die bei chronischer myeloischer Leukämie (CML), bei akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL) und akuter myeloischer Leukämie (AML) beobachtet wird, resultiert aus einer Fusion zwischen zwei Genen: BCR und ABL. In Abhängigkeit von der Lokalisierung der Bruchstelle im BCR-Gen werden verschiedene tumorspezifische BCR-ABL-Gene erzeugt. Diese BCR-ABL-Gene werden in tumorspezifische BCR-ABL-mRNA transkribiert bzw. in tumorspezifische BCR-ABL-Proteine translatiert. Daher sind verschiedene diagnostische Ziele verfügbar, wobei jedes die spezifische Diagnose von t(9;22)(g34;q11)-positiven Leukämien erlaubt.
Während die herkömmliche Cytogenetik auf der Detektion einer charakteristischen chromosomalen Aberration beruht (d.h. das Philadelphia-Chromosom: ein Minute-Chromosom 22), werden andere Verfahren verwendet, um das BCR-ABL-Fusionsgen spezifisch zu detektieren (z. B., fluoreszente in situ-Hybridisierung) oder die BCR-ABL-Fusions-mRNA spezifisch zu detektieren (z. B. reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion). Obwohl alle der zuvor erwähnten Verfahren als diagnostische Verfahren hinreichend etabliert sind, kann keines dieser Verfahren problemlos routinemäßig und schnell ausgeführt werden. Besonders bei ALL ist das Vorhandensein des Philadelphia (Ph) Chromosoms bislang mit einer geringen Prognose assoziiert. Um das schlechte Prognoseresultat zu verbessern, erfordern Ph-positive ALLs eine frühzeitige Identifizierung, um intensive Induktionsbehandlungen oder alternative Behandlungsprotokolle zu ermöglichen.
Es wird ein neues diagnostisches Verfahren präsentiert, das auf der ausschließlichen Detektion von tumorspezifischen Fusionsproteinen basiert. Dieses Verfahren wird zur schnellen und einfachen Identifizierung von Krebs (wie beispielsweise Ph-positive Leukämien) bei der ersten Diagnose geschaffen.
Das Ph Chromosom war die erste karyotypische Aberration, von der gezeigt wurde, dass sie im Zusammenhang mit Tumoren steht. Bislang ist das Ph Chromosom so wohl bei Erwachsenen als auch bei Kindern in zahlreichen hematopoetischen Störungen identifiziert worden; z. B. bei chronischer myeloischer Leukämie (CML), akuter lymphoblastischer Leukämie (ALL) und akuter myeloischer Leukämie (AML).
Das Ph Chromosom wird durch reziproke Translokation zwischen den langen Armen der Chromosomen 9 und 22 erzeugt: t(9;22) (g34,q11) und betrifft das ABL-Gen auf Chromosom 9 und das BCR-Gen auf Chromosom 22. Beide Gene werden unterbrochen und umgelagert; dies führt zu einem tumorspezifischen BCR-ABL Fusionsgen auf Chromosom 22q- und einem ABL-BCR Fusionsgen auf Chromosom 9+.
Während es noch immer nur wenige Berichte über das ABL-BCR Fusionsgen gibt, wurden die BCR-ABL-Fusionsgene intensiv während der letzten zwei Jahrzehnte studiert. Abhängig von der chromosomalen Lokalisation der Bruchstelle wurden verschiedene Arten von BCR-ABL-Fusionsgenen identifiziert. Es wurde gezeigt, dass die Bruchstellen in den BCR-Genen innerhalb von zwei Regionen geclustert sind: die „Major-Breakpoint-Cluster"-Region (M-BCR), die 5 Exons umfasst, die als b1 – b5 bezeichnet werden; und eine „minor-Breakpoint-Cluster"-Region (m-BCR), die 5' des M-BCR im BCR-Gen lokalisiert ist. Im Gegensatz dazu sind die Bruchstellen im ABL-Gen über große Entfernungen verteilt und kommen meist am 5'-Ende von Exon a2 vor. Sowohl in Ph+ CML-Patienten als auch in Ph+ ALL-Patienten sind Bruchstellen im M-BCR gleichmäßig verteilt: entweder befinden sie sich zwischen Exon b2 und b3 oder sie befinden sich zwischen Exon b3 und b4. Die Bruchstellen in Ph+ ALL werden hingegen hauptsächlich (ungefähr zu 70 %) innerhalb der m-BCR gefunden, die in einem Intron zwischen Exon e1 und e2 lokalisiert ist.
Da die Bruchstellen über große Entfernungen verteilt sind (insbesondere im ABL-Gen) werden verschiedene Fusionspunkt-Introns innerhalb der BCR-ABL-Gene erzeugt. Obwohl diese Fusionspunkt-Introns im Hinblick auf die Länge und Nukleotidsequenz des Fusionspunkt-Introns des BCR-ABL-Gens zwischen Ph+ Patienten im hohen Maße variable sind, sind die Fusionspunkte der BCR-ABL-Transkripte im hohen Maße konsistent. Daher wird (abhängig von der ursprünglichen BCR-ABL-Gen-Umlagerung) üblicherweise eine einzelne Art von BCR-ABL-mRNA detektiert: diese variiert von einer 7kb-mRNA, die eine e1a2-Verbindung umfasst, bis zu einer 8,5-BCR-ABL-mRNA, die entweder eine b2a2- oder b3a2-Verbindung umfasst. Da der translationale Leserahmen der BCR-ABL-mRNAs beibehalten wird, expremieren Ph+ Leukämie-Zellen einzigartige BCR-ABL-Proteine.
Während Ph Chromosomen fast unausweichlich in Fällen von CML vorhanden sind, werden Ph Chromosomen in Leukämiezellen von Patienten, die an AML oder ALL leiden, weniger häufig detektiert. Immer noch werden 5 % der AML-Fälle, 25 – 30 % der Erwachsenen mit ALL und 3 – 5 % der Kinder mit ALL als Ph+ diagnostiziert. Wie anhand der hohen Rate von Behandlungsfehlschlägen und Mortalität bei Ph+ Leukämien sowohl bei Erwachsenen als auch bei Kindern ersichtlich ist, stellen die Ph Chromosomen signifikante Risikofaktoren dar, die auf Behandlungsfehlschläge verweisen.
Die Bedeutung der Identifizierung von Risikofaktoren, wie beispielsweise des Ph Chromosoms, steht zweifelsfrei fest. Gegenwärtige Behandlungsprotokolle können durch Identifizieren des t(9;22)(g11;q34) zu einem frühen Zeitpunkt der Erkrankung verbessert werden. Gegenwärtig werden Ph+ Leukämien durch eine Reihe von Verfahren identifiziert, die entweder das aberrante Chromosom, das Gen, die mRNA oder das aberrante Protein detektieren. Jedes dieser Verfahren ist durch typische Spezifikationen und Grenzen charakterisiert, die berücksichtigt werden sollten, bevor man versucht, t(9;22)(g34;q11)-positive Leukämien spezifisch zu diagnostizieren. In dieser Untersuchung beschreiben wir ein neues diagnostisches Verfahren: ein Assay, der entwickelt wurde, um relativ schnell und einfach bei der ersten Diagnose zwischen Ph+ Leukämien und Ph- Leukämien unterscheiden zu können. Das zugrundeliegende Prinzip des Assays basiert auf der Detektion von tumorspezifischen Proteinen durch Antikörper, die spezifisch mit Fragmenten reagieren, die den BCR-ABL-Fusionsproteinen und Bruchstücken der ursprünglichen, nicht-fusionierten BCR- und ABL-Proteine entsprechen.
Material und Methoden
Zellproben
Zelllinien: 6 Ph+ Zelllinien wurden verwendet, um sowohl die Spezifität des Sepharose-Western-Blotting-Verfahrens als auch die des BCR-ABL-Dipstick-Assays zu un tersuchen: LAMA-84 und K562, KCL-22 und BV-173 sowie TOM-1 und ALL/MIK. Alle Zelllinien wurden in RPMI-1640 kultiviert, das mit 10 % fetalem Kälberserum supplimentiert war.
Leukämische Zellproben: 2 leukämische gefrierkonservierte periphere Blutproben aus der Diagnose von leukämischen Patienten wurden verwendet, um die Spezifität des BCR-ABL-Dipstick-Assays zu untersuchen. Klinische Daten und Labordaten dieser Patienten wurden zuvor beschrieben: ein Patient litt an einer Ph-negativen CML mit umgelagerten b2a2-BCR-ABL-Genen, während der andere Patient an einer Phpositiven Vorläufer-B-ALL mit umgelagerten e1a2 BCR-ABL-Genen litt.
Antikörper
Alle Antikörper wurden mittels Protein G gereinigt und wie folgt kategoriesiert: catching-Antikörper: monoklonaler Antikörper (moAb) 7C6 (ein großzügiges Geschenk von Dr. S. Dhut), der gegen das b2-Epitop gerichtet ist, welches in b2a2P210^BCR–ABL, b3a2P210^BCR–ABL, P160^BCR und P130^BCR vorhanden ist; moAb ER-FP1, der gegen den e1a2-Fusionspunkt in e1a2P190^BCR–ABL gerichtet ist; und moAb Yae (Santa Cruz Biotechn., Santa Cruz, Kalifornien, USA), der gegen den Aminoterminus von E2A-Proteinen gerichtet ist. Detektions-Antikörper: moAb 8E9 (ein großzügiges Geschenk von Dr. J. Wang), der gegen die SH2-Domäne gerichtet ist, die in e1a2P190^BCR–ABL, b2a2P190^BCR–ABL, b3a2P190^BCR–ABL und P145^ABL gerichtet ist; und moAb G98-271.1.3. (ein großzügiges Geschenk von Dr. G. Bain) der gegen den Carboxyterminus von E2A-Proteinen gerichtet ist. Sowohl moAb 8E9 und moAb G98-271.1.3 wurden biotinyliert.
Sepharose-Western-Blotting-Verfahren
Die Zellen wurden zweimal mit eiskalter phosphatgepufferter Saline (PBS) gewaschen und in eiskaltem Lysepuffer (1 % Triton X–100, 0,05 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA in 10 mM Natriumphosphat, pH 7,0) bei einer Konzentration von 1 × 10⁷ Zellen/ml für 15 Minuten lysiert, wobei der Puffer mit 40
l Phenylmethylsulphonylfluorid (PMSF: 100 mM in 2-Isopropanol) supplementiert war. Nachdem die Lysate in einer Eppendorfzentrifuge zentrifugiert wurden, um das un lösliche Material zu entfernen (5 min., 4°C), wurden die Überstände in gleiche Volumina unterteilt, die 10⁷ Zellen entsprachen.
Das Sepharose-Western-Blotting wurde entweder durch Zusatz von 10
g moAb 7C6 oder 2
moAb ER-FP1 zu dem Überstand der lysierten Zellen durchgeführt. Die Antigen-Antikörper-Reaktion wurde für zwei Stunden auf einer Rotationsvorrichtung bei 4°C durchgeführt. Anschließend wurden 40
l einer 80 %igen (v/v)-Suspension von GammaBind G-Sepharose-Kügelchen (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden) zugesetzt. Nach 30 Minuten wurden die Kügelchen (beads) gesammelt und dreimal in Lysepuffer ohne SDS gewaschen. Die Kügelchen wurden für 5 Minuten in 60
l Probenpuffer (60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10 % Glycerol, 10 mM EDTA, 2 % SDS, 2 % ß-Mercaptoethanol und 0,03 % Bromphenolblau) gekocht. Die Proteinproben wurden einer 6 %igen SDS-PAGE unterworfen und auf Nitrozellulose (0,45
M Porengröße, Schleicher & Schuell, Dassel, Deutschland) unterworfen (Mini Protean, Bio Rad, Richmond, CA, USA).
Die Nitrocellulose-Membranen wurden mit 5%igem fettfreiem Trockenmilchpulver (Protifar, Nutricia, Niederlande) in PBS blockiert, das mit 0,05% Tween-20 (5% MPBS) supplementiert war.
Anschließend wurden die Membranen für 2 Stunden bei Raumtemperatur in Gegenwart von biotinyliertem moAb 8E9 (2μg/ml) in 1 % MPBS inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit PBS, das mit 0,05 % Tween-20 supplementiert war, wurde an Streptavidin (South. Biotech. Ass., Birmingham, AL, USA) konjugierte alkalische Phosphatase zu einer 1:1500-Verdünnung zugesetzt, und der Inkubation wurde erlaubt, für eine weitere Stunde fortzuschreiten. Der Blot wurde zweimal mit PBS gewaschen, das mit 0,05% Tween-20 supplementiert war, und schließlich mit 0,15 M Veronal-Acetatpuffer, pH 9,6, gewaschen. Zur Sichtbarmachung der Antikörper-Antigen-Komplexe benutzten wir (wie zuvor beschrieben) das Substrat der alkalischen Phosphatase Nitroblautetrazolium / 5-Brom-4-Chlorindoxylphosphat (NBT/BCIP; Sigma, St. Louis, MO, USA.).
BCR-ABL-Dipstick-Verfahren
Jeder Catching-Antikörper wurde als einzelner kleiner Punkt auf eine (± 2cm × 0,5 cm) Nitrocellulosestreifen (0,45 μm Porengröße) aufgetragen und an der Luft getrocknet. Jeder Punkt enthielt entweder 2 μg moAb 7C6, 1 μg moAb ER-FP1 oder 1 μg moAb Yae. Anschließend wurden diese Nitrocellulose-Streifen, die „Dipsticks" genannt werden, in PBS gewaschen, das mit 0,05 Tween-20 supplementiert war, und anschließend in 5% MPBS (1 Stunde, RT) blockiert. An diesem Punkt können die Dipsticks an der Luft getrocknet werden und in einem luftdichten Behälter bei 4 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden.
Die Überstände der zellulären Lysate (verarbeitet wie im ersten Absatz des obigen Abschnittes beschrieben), die 10⁷ Zellen entsprachen, wurden zu den Dipsticks gegeben. Der Bildung des Antigen-Antikörper-Komplexes wurde erlaubt über Nacht bei 4 °C auf einer rotierenden Vorrichtung fortzuschreiten. Anschließend wurden die Dipsticks dreimal in PBS gewaschen, das mit 0,05% Tween-20 supplementiert war, und die gebundenen Antigene wurden durch Inkubation des Dipsticks mit einer Mischung aus biotinyliertem moAb 8E9 (2μg/ml) und biotinyliertem moAb G98-271.1.3 (2μg/ml) detektiert, die in 1 % MPBS verdünnt waren. Von diesem Zeitpunkt an wurden die Dipsticks weiter verarbeitet, wie im Abschnitt Material und Methoden für die Sepharose-Western-Blotting-Verfahren beschrieben.
Ergebnisse
Um zu bestimmen, ob die tumorspezifischen BCR-ABL-Fusionsproteine ausschließlich durch immunologische Verfahren erkannt werden können, entwickelten wir ein Sepharose-Western-Blotting-Verfahren. Ein Sepharose-Western-Blotting-Verfahren ist eine Kombination einer Immunpräzipitations-Reaktion mit einem Catching-Antikörper, gefolgt von einem Western-Blotting-Verfahren mit einem Detektionsantikörper.
Als Catching-Antikörper wurden jeweils die MoAbs 7C6 oder ER-FP1, präzipitierende Proteine aus zellulären Lysaten von LAMA-84 und KCL-22 oder TOM-1-Zellen verwendet. Nach dem Immunoblot wurden präzipitierte Proteine durch Verwendung von biotinylierten moAb 8E9 als detektierende Antikörper und an Streptavidin konjugierter alkalischer Phosphatase detektiert. Diese Sepharose-Western-Blotting-Experimente mit 7C6/8E9-Antikörperkombinationen sowie diejenigen, die die Antikörperkombinationen ER-FP1/8E9 verwendeten, erlaubten die ausschließliche Detektion von BCR-ABL-Proteinen. Die ER-FP1-Antikörperkombination detektiert e1a2P190^BCR–ABL-Proteine, die durch die 7C6/8E9-Antikörperkombination nicht erfasst wird. Die Kombination von 7C6/8E9 detektiert spezifisch b2a2P210^BCR–ABL und b3a2P210^BCR–ABL-Proteine, die beide nicht von ER-FP1-Antikörpern erkannt werden.
Es lässt sich feststellen, dass unsere Daten des Sepharose-Western-Blottings verifizieren, dass tumorspezifische BCR-ABL-Fusionsproteine ausschließlich durch geeignete Auswahl und Mischung von Antikörpern identfiziert werden können.
Ausschließliche Erkennung von BCR-ABL-Proteinen in einem Dipstick-Assay
Als nächstes untersuchten wir, ob das Sepharose-Western-Blotting-Verfahren vereinfacht werden kann. Durch Verwendung derselben Gruppe von Antikörpern, die wir bereits in den Sepharose-Western-Blotting-Experimenten verwendet haben, wurde ein altnatives BCR-ABL-Detketionssystem, das als BCR-ABL-Dipstick bezeichnet wird, hinsichtlich seiner Fähigkeit untersucht, BCR-ABL-Proteine ausschließlich zu identifizieren.
Der BCR-ABL-Dipstick wird aus Nitrozellulose-Streifen hergestellt, auf dem drei verschiedene Antikörper immobilisiert sind:

1) moAb 7C6, 2) moAb ER-FP1 und 3) moAb Yae.

Um zu untersuchen, ob der BCR-ABL-Dipstick für die spezifische Identifizierung von BCR-ABL-Proteinen verwendet werden kann, wurden BCR-ABL-Dipsticks entweder mit zellulären Lysaten von: 1) LAMA-84, 2) KCL-22 oder 3) TOM-1-Zellen inkubiert. Fusionsproteine, die durch immobilisierte Antikörper eingefangen worden waren, wurden durch nachfolgende Inkubation mit einer Mischung von biotinyliertem moAb 8E9 (8E9-bio, er erkennt den Carboxyterminus sowohl von ABL- als auch BCR-ABL-Proteinen) und biotinyliertem moAb G98-272.1.3 (er erkennt den Carboxyterminus von E2A-Proteinen) gefolgt von alkalischer Phosphatase, die an Streptavidin konjugiert war, detektiert.
Die Inkubation eines BCR-ABL-Dipsticks entweder mit zellulären Lysaten von LAMA-84 oder zellulären Lysaten von KCL-22 führt bei anschließender Inkubation mit biotinylierten Antikörpern (d.h. 8E9-bio und G98.271.1.3-bio), sowie mit Streptavidin-AP und seinem Substrat zu sichtbaren Punkten, die an dem moAb 7C6-Antikörper-Punkt lokalisiert sind. Bei Inkubation eines BCR-ABL-Dipsticks mit zellulären Lysaten von TOM-1 kommt es bei nachfolgender Inkubation mit den zuvor genannten Molekülen zu einem sichtbaren Punkt, der am ER-FP1 Antikörper-Punkt lokalisiert ist. Unter Berücksichtigung der oben beschriebenen Daten aus dem Sepharose-Western-Blotting stellen diese Punkte gebundene BCR-ABL-Proteine dar.
Zusamenfassend zeigten diese Daten, dass der BCR-ABL-Dipstick-Assay für die ausschließliche Detektion von tumorspezifischen BCR-ABL-Proteine verwendet werden kann.
Der BCR-ABL-Dipstick-Assay detektiert spezifisch BCR-ABL-Proteine in zellulären Lysaten, die aus Zelllinien hergestellt wurden. Als nächstes haben wir untersucht, ob der BCR-ABL-Dipstick-Assay für die spezifische Diagnose von BCR-ABL-positiven Leukämien verwendet werden kann.
Zwei gefrierkonservierte, mittels Ficoll angereicherte Blutproben von Patient A und Patient B, bei denen zuvor BCR-ABL-positive Leukämien diagnostiziert worden waren, wurden lysiert und sowohl durch BCR-ABL-Dipstick-Assay als auch durch Sepharose-Western-Blotting-Verfahren untersucht. Die Blutproben von Patient A und Patient B stellen eine Ph- CML mit kryptisch umgelagerten b3a2BCR-ABL-Genen bzw. eine Ph+ ALL mit umgelagerten e1a2BCR-ABL-Genen dar. Beide Proben wurden bezüglich des Vorhandenseins von BCR-ABL-Fusionsprotein als positiv gewertet.
Diskussion
Das Vorhandensein des Ph Chromosoms in leukämischen Zellen ist mit einer schwachen Prognose assoziiert. Insbesondere bei ALL ist es wichtig zwischen Ph+ Leukämien und Ph- Leukämien zu unterscheiden, da das Vorhandensein des Ph Chromosoms eine große Gruppe von Patienten identifiziert, die einer unsicheren Zukunft entgegensehen.
Dieses schwache therapeutische Ergebnis könnte nunmehr durch frühzeitigen Start einer aggressiveren Induktionstherapie verbessert werden. Daher sind sensitive und verlässliche diagnostische Verfahren, die das Ph Chromosom oder seine Produkte zu einem frühzeitigem Zeitpunkt der Erkrankung identifizieren, bei der ALL-Diagnose extrem wichtig. Gegenwärtig ist die konventionelle cytogenetische Analyse bei der Identifizierung zahlreicher chromosomaler Abnormalitäten bei ALL das Verfahren der Wahl. Die Ergebnisse, die durch die cytogenetische Analyse erhalten werden, sind jedoch nicht immer verlässlich, da die Ergebnisse in hohem Maße von der Anzahl der untersuchten Metaphasen abhängen. Lediglich Institutionen mit spezieller Erfahrung im Bereich der ALL-Cytogenetik erhalten in nahezu jedem Patienten eine erfolgreiche Karyotypisierungsanalyse. Selbst unter diesen Umständen entgehen manche kryptischen BCR-ABL-Umlagerungen der Detektion mittels konventioneller cytogenetischer Analyse.
Im Gegensatz zur konventionellen Cytogenetic sind die Verfahren der fluoreszenten in situ-Hybridisierung nicht auf arbeitsintensive Analysen der Metaphase beschränkt. Duch Anwendung von Sonden, die sich gegen die BCR- und ABL-Gene richten, und von denen jede mit verschiedenen Flurochromen markiert ist, lassen sich Ph+ Interphase-Zellen identifizieren. Wegen der Co-Lokalisierung der zwei Hybridisierungssignale in einem Punkt ist ihre Sensitivität beschränkt, da eine Co-Lokalisierung in Form eines Artefaktes in nicht-malignen, normalen Zellen beobachtet werden könnte.
Die polymerase Kettenreaktion (PCR) ist gegenwärtig die sensitivste Methode zum Detektieren genetischer Abnormalitäten. Tatsächlich detektiert die molekulare Analyse regelmäßig Aberrationen, die auf karyotypischem Wege nicht beobachtet werden können. Da jedoch die Bruchstellen in den der tumorspezifischen Fusionspunkt-Introns über große Entfernungen verstreut sind, ist das Verfahren mittels PCR lediglich nach reverser Transkription von BCR-ABL-Messenger-RNA anwendbar. Obwohl sehr sensitiv, sind strenge Vorschriften erforderlich, um falsch-positive (bedingt durch Kreuzkontamination) und falsch-negative (bedingt durch vorzeitige mRNA-Degradation) Ergebnisse zu vermeiden.
Vorliegend wird die Entwicklung eines neuen, einfachen und schnellen Verfahrens beschrieben, das auf der Detektion von zwei bestimmten antigenischen Stellen auf dem BCR-ABL-Fusionsprotein basiert. Die kombinierte Spezifität von mindestens zwei verschiedenen Antikörpern erlaubt die ausschließliche Detektion von BCR-ABL-Proteinen innerhalb von 24 Stunden.
Unsere Schlussfolgerung hinsichtlich der ausschließlichen immunologischen Detektion von BCR-ABL-Proteinen durch die geeignete Kombination von Antikörpern erwies sich als richtig, da sie zunächst in Sepharose-Western-Blotting-Experimenten getestet wurden. Diese Experimente zeigten, dass b3a2BCR-ABL-Proteine und b2a2BCR-ABL-Proteine spezifisch durch die moAn 7C6/8E9-bio Kombination detektiert werden konnten, wohingegen e1 a2BCR-ABL-Proteine spezifisch durch den moAb ER-FP1/8E9-bio Kombination identifiziert wurden.
Als nächstes untersuchten wir, ob das Sepharose-Western-Blotting-Verfahren vereinfacht werden konnte. Der resultierende BCR-ABL-Dipstick, ein kleiner Nitrozellulosestreifen, auf dem drei verschiedene Antikörper immobilisiert sind, wurde sowohl hinsichtlich der Spezifität als auch der Sensitivität durch Verwendung verschiedener Ph+ Zelllinien untersucht. Die Spezifität wurde duch Analyse der Ph+ Zelllinien bestätigt: Jede exprimierte eine unterschiedliche Art von BCR-ABL-Protein. Die Ergebnisse sind konsistent und wurden bei der Untersuchung anderer Ph+ Zelllinien, wie beispielsweise K562, BV173 und MIK-ALL, ebenfalls beobachtet. Die Ergebnisse zeigen, dass dieser Assay als ein alternatives Screening-Verfahren zum Detektieren von BCR-ABL-positiven Leukämien bei der ersten Diagnose dienen kann. Die Dipstick-Analyse von zwei leukämischen Zellproben mit (zuvor beschriebenen) umgelagerten BCR-ABL-Genen zeigen, dass die anfängliche Diagnose von BCR-ABL-positiven Leukämien in der Tat realisierbar ist. Ferner zeigt sich ihr darüber hinausgehender Wert in Bezug auf die konventionelle Cytogenetik bei der Analyse des Patienten A. Obwohl dieser Patient an einer Ph-negativen CML mit kryptisch umgelagerten BCR-ABL-Genen litt, wurden BCR-ABL-Proteine problemlos durch Verwendung des BCR-ABL-Dipstick-Assays identifiziert.

Claims

Verfahren zum Detektieren chromosomaler Aberrationen in einer biologischen Probe via Detektion eines ausschließlich von Tumorzellen exprimierten, tumorspezifischen Genprodukts, unter Verwendung von mindestens zwei verschiedenen Sonden, die gegen das von der chromosomalen Aberration herrührende Genprodukt gerichtet sind, wobei jede Sonde mit ganz bestimmten Stellen auf dem Genprodukt reagiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die chromosomale Aberration Leukämie verursachen kann.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die chromosomale Aberration eine Translocation ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei aus der Translocation eine Philadelphia Chromosomenaberration resultiert.
Verfahren nach einem der obigen Ansprüche, wobei das tumorspezifische Genprodukt ein Protein ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Protein immunologisch detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das tumorspezifische Protein mittels Sepharose-Western-Blot-Verfahren detektiert wird.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das tumorspezifische Protein mittels Dipstick-Assay detektiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 5–8, wobei das tumorspezifische Protein ein aminoterminales Proteinfragment und ein carboxylterminales Fragment aufweist, von denen jedes einem anderen nicht-tumorspezifischen Protein entspricht.
Verfahren nach Anspruch 9, worin zumindest eine Sonde spezifisch mit dem aminoterminalen Proteinfragment und zumindest eine Sonde spezifisch mit dem carboxyterminalen Proteinfragment reagiert.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das aminoterminale Proteinfragment dem ABL- oder BCR-Protein entspricht, während das carboxyterminale Proteinfragment dem BCR- oder ABL-Protein entspricht.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei zumindest eine Sonde aus der Gruppe von Antikörpern ausgewählt ist, die gegen das in b2a2P210^BCR–ABL, b3a2P210^BCR–ABL, P160^BCR und P130^BCR vorhandene b2-Epitop; die gegen den e1a2-Fusionspunkt in e1 a2P190^BCR–ABL; die gegen den Aminoterminus von E2A-Proteinen; die gegen die in e1 a2P190^BCR–ABL, b2a2P190^BCR–ABL, b3a2P190^BCR–ABL und P145^ABL vorhandene SH2-Domäne; und die gegen den Carboxyterminus der E2A-Proteine gerichtet sind.
Diagnostikkit zur Detektion chromosomaler Aberrationen in einer biologischen Probe via Detektion eines ausschließlich von Tumorzellen exprimierten, tumorspezifischen Genprodukts, welcher mindestens zwei verschiedene Sonden enthält, die gegen das von der chromosomalen Aberration herrührende Genprodukt gerichtet sind, wobei jede Sonde mit ganz bestimmten Stellen auf dem Genprodukt reagiert.
Verwendung einer Methode nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder eines Diagnostikkits nach Anspruch 13, zur Detektion von oder zum Screenen nach Krebs.