CN108148752A - 一种基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法 - Google Patents

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Abstract

一种基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法，所述微流控芯片构成如下：上层为液路控制层，下层为气路控制层，底面为空白玻璃底板。基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法的步骤依次如下：①芯片预处理；②细胞的接种与培养；③药物刺激；④荧光染色。所有液路层入口均由一个气路层的阀单独控制，可同时进行不同种类细胞培养、不同药物刺激以及不同抗体染色。本发明利用微流控芯片中的微流体与微型阀技术实现了在微流控芯片上的药物筛选与荧光染色，为细胞培养、细胞原位荧光染色以及药物筛选研究提供全新的技术平台。本发明操作简便、细胞与试剂用量少、高度集成化、应用范围广泛。

Description

一种基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法
技术领域
本发明涉及微流控技术与细胞生物学的交叉应用技术领域，特别提供了一种基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法。
背景技术
现有技术中，微流控芯片是一种在微小通道中操控微小体积流体流动的系统，其中通道的尺度为几十到几百微米，承载流体的量为10-9～10-18L。微流控芯片的各个操作单元通过微通道网络内流体的流动相互联系。微流体控制是微流控芯片实验室的操作核心，所涉及的进样、混合、反应、分离等过程都是在可控流体的运动中完成的。无论是宏观还是微观流体，阀都是流体控制的核心部件。由于其重要性，微型阀的研制早在微流控芯片诞生之前引起人们的广泛关注。理论上讲，凡是能控制微通道闭合和开启状态的部件均可作为微流控芯片中的微阀使用。一个理想的微阀应该具备以下特征：低泄漏、低功耗、响应速度快、线性操作能力和适应面广。微流体和微型阀构成了一套完整的微流控芯片系统。
微流控分析的核心是利用微流控芯片将样品预处理、生物和化学反应、分离检测等基本操作单元集成在具有微米或纳米微通道网络的芯片上，通过操控流体完成复杂的分析过程，具有样品和试剂消耗量少、分析时间短、高通量、容易实现大规模平行测定等优点。利用微流控分析技术可方便的实现分析系统的小型化、集成化和便携化。目前，该系统被广泛应用在生命科学、疾病诊断与治疗、药物合成与筛选等领域。
细胞水平药物筛选微流控芯片系统旨在通过设计有不同功能的芯片来培养细胞，对细胞施加药物刺激，并配合自动化的检测装置，采集药物与细胞相互作用的信号，收集数据，从而分析药物的作用，进行筛选并得到筛选结果。该系统的优点在于通过对样品全分析过程的微缩化和集成化，实现高灵敏的快速检测，高通量输出以及在线自动化操作等功能，较以往的细胞水平筛选技术表现出极大的优势，非常适合药物成分的筛选。
免疫荧光染色技术是将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质定位的技术，是用于观察细胞内蛋白质分布和定位的普遍方法。免疫荧光染色的传统做法需要消耗大量的试剂，人力和时间，特别是某些珍贵抗体的消耗，限制了传统方法的使用。微流控芯片技术以其大大减少样品消耗，节省人工及时间成本，可在厘米见方的空间上实现自动化、高通量的实验等优势，受到了广泛的关注。
人们迫切希望获得一种技术效果优良的集成化药物筛选与染色微流控芯片的制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种技术效果优良的基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法。以解决以往细胞药物筛选与染色过程中存在的操作步骤繁琐复杂、消耗大量试剂等技术局限。
本发明提供了一种基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法，其特征在于：所述集成化药物筛选与染色微流控芯片由上层、下层、底面三层顺序串联贴合布置组成，其中：上层为液路控制层，下层为气路控制层，底面为空白玻璃底板；
所述液路控制层具体设置有下述结构：
——细胞荧光染色进样口：位于在整个液路控制层的最上游；
——荧光染色进样通道区P1：布置在细胞荧光染色进样口和细胞进样通道区P2之间用于沟通二者；
——细胞进样口：其设置有至少两个，每一个细胞进样口都设置在细胞进样通道区P2中的其中一条通道上，且前述细胞进样通道区P2中的每一条通道都串接着一个细胞培养室；
——细胞进样通道区P2：设置在荧光染色进样通道区P1和细胞培养室之间；
——细胞培养室：至少有二个，布置在细胞进样通道区P2和药物进样通道区P3之间；
——药物进样通道区P3：其为包括覆盖所有细胞培养室和药物进样口之间的通道的区域；
——药物进样口：其数量和细胞培养室相等，各自布置在每一个细胞培养室下游的通道上；
——液体流出通道区P4：其布置在细胞培养室下游通道的下游和整个液路最尾端的出液口13之间；
——出液口13：布置在整个液路控制层所有结构的最下游；
基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法具体要求如下：细胞荧光染色步骤如下：
①从各个药物进样口分别吸出药物溶液，从各个细胞进样口分别加入PBS冲洗2～5次，3～8min/次；
②从各个细胞进样口分别加入0.04g/mL预冷的多聚甲醛固定细胞，PBS冲洗2～5次，3～8min/次；
③从各个药物进样口分别吸去多聚甲醛，从各个细胞进样口分别加入PBS冲洗2～5次，3～8min/次；
④从各个细胞进样口分别加入表面活性剂Triton X-100覆盖细胞10min，增加细胞膜的通透性，磷酸缓冲液PBS冲洗2～5次，3～8min/次；
⑤从各个细胞进样口分别加入用血清封闭细胞15～60min；
⑥在抗体加入之前，打开分别控制各个细胞进样口的气阀F～I和分别控制各个药物进样的气阀K～N；
⑦打开用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，将骨桥蛋白一抗从细胞荧光染色进样口流经荧光染色进样通道P1加入细胞培养室，孵育过夜；关闭用于控制细胞荧光染色进样口的气阀；打开用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，从该气阀对应的细胞荧光染色进样口加入磷酸缓冲液PBS冲洗2～5次，3～8min/次；
⑧次日，关闭控制细胞荧光染色进样口的气阀，打开另一控制细胞荧光染色进样口的气阀，将二抗从另一个细胞荧光染色进样口流经荧光染色进样通道P1加入细胞培养室，避光孵育0.5-3h；关闭前述用于引入二抗的细胞荧光染色进样口；打开用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，从该气阀对应的细胞荧光染色进样口加入磷酸缓冲液PBS冲洗2～5次，3～8min/次；
⑨关闭前述引入磷酸缓冲液PBS冲洗的用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，打开另一控制细胞荧光染色进样口，将能够与DNA强力结合的荧光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚DAPI从对应这一细胞荧光染色进样口入口引入并流经荧光染色进样通道P1加入细胞培养室；之后关闭前述用于控制细胞荧光染色进样口的气阀；打开前述引入磷酸缓冲液PBS冲洗的用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，从对应的用于控制细胞荧光染色进样口加入磷酸缓冲液PBS清洗，通过荧光显微镜直观的观察细胞培养室中细胞经药物刺激后的生长状态以及荧光信号表达；
⑩在⑦～⑨步骤中，当细胞荧光染色进样口进入的液体进入细胞培养室后，打开控制染料排出的阀五E、控制药物排出的阀六J；细胞荧光染色进样口进入的液体流经荧光染色进样通道P1和液体流出通道P4，从出液口13排出。
所述集成化药物筛选与染色微流控芯片满足下述要求之一或其组合：
其一，细胞荧光染色进样口设置有四个，其具体分别为：一抗入口1、二抗入口2、细胞核染料入口3、PBS缓冲液入口4；所述集成化药物筛选与染色微流控芯片中设置有四个以前述四个细胞荧光染色进样口为入口的通道，其相互并联并最终汇成一个共用的通道；最终汇成的共用通道再次一分为四，变成四条各自设置有一个细胞进样口的四条通道，每个细胞进样口还分别依次连接着下游的细胞培养室、药物进样口和再之后的液体流出通道P4；所述四个细胞进样口分别为：细胞进样口一5、细胞进样口二6、细胞进样口三7、细胞进样口四8；与前述四个细胞进样口依次对应处于同一液体通路上的四个细胞培养室分别是：细胞培养室一R1、细胞培养室二R2、细胞培养室三R3、细胞培养室四R4；同样的，对应的四个药物进样口分别依次是：药物进样口一9、药物进样口二10、药物进样口三11、药物进样口四12；
其二，液体流出通道区P4：其是将细胞培养室下游的四条通道合并为最终的共用的一个出液口13的通道合并区域；
其三，所述微流控芯片的下层即气路控制层具体由泵阀控制区组成，每个荧光染色液体入口有单独的泵阀单元控制，以使进样液体互相不影响；气路控制层具体包含有下述结构之一或其组合：依次设置在前述四个细胞进样口即细胞进样口一5、细胞进样口二6、细胞进样口三7、细胞进样口四8上游的控制用的阀：阀七F、阀八G、阀九H、阀十I；依次设置在前述四个药物进样口下游的控制用的阀：阀十一K、阀十二L、阀十三M、阀十四N；依次设置在前述四个细胞荧光染色进样口即一抗入口1、二抗入口2、细胞核染料入口3、PBS缓冲液入口4的下游通道上的控制用的阀：阀一A、阀二B、阀三C、阀四D；所述微芯片的所有控制用的阀均为常闭阀；
其四，细胞培养室设置有四个：细胞培养室一R1、细胞培养室二R2、细胞培养室三R3、细胞培养室四R4，与之对应的在细胞进样通道区P2上游的细胞进样口和下游药物进样通道区P3的药物进样口也都分别对应有四个；每一条通道上从上游开始依次串接布置有1个细胞进样口、1个细胞培养室、1个药物进样口；
其五，每个细胞培养室由单独的细胞培养液、药物刺激、荧光染色液体入口、进样通道组成；
其六，至少两个并联的细胞培养室组成液路层；
其七，所述上层芯片和下层芯片的材料均为聚二甲基硅氧烷聚合物，上层芯片厚1～5mm，下层芯片厚100～500μm；
其八，所述细胞培养室的尺寸为15mm×2mm×100μm的长梭形；
其九，所述芯片的气路和液路通道高度相同，均为80～200μm
其十，所述芯片的气路和液路通道宽度不同，气路通道宽度为100～300μm，液路通道宽200～600μm。
其十一，所述液路层为模块；气路层是在制作成功的气路模板上甩一层高于模板10～50μm的聚二甲基硅氧烷膜，所述液路层的聚二甲基硅氧烷模板有结构一侧封接到气路层聚二甲基硅氧烷膜无结构一侧，气路层聚二甲基硅氧烷膜有阀结构一侧等离子键合到洁净的玻璃片上；
所述集成化药物筛选与染色微流控芯片的制备方法相关步骤依次要求如下：
①从四个并联的药物进样口即药物进样口一9、药物进样口二10、药物进样口三11、药物进样口四12分别吸出药物溶液，从细胞进样口一5、细胞进样口二6、细胞进样口三7、细胞进样口四8分别加入磷酸缓冲液PBS冲洗3次，4～6min/次；
②从细胞进样口一5、细胞进样口二6、细胞进样口三7、细胞进样口四8分别加入0.04g/mL预冷的多聚甲醛固定细胞，磷酸缓冲液PBS冲洗3次，4～6min/次；
③从四个并联的药物进样口即药物进样口一9、药物进样口二10、药物进样口三11、药物进样口四12分别吸去多聚甲醛，从细胞进样口一5、细胞进样口二6、细胞进样口三7、细胞进样口四8分别加入磷酸缓冲液PBS冲洗3次，4～6min/次；
④从细胞进样口一5、细胞进样口二6、细胞进样口三7、细胞进样口四8加入表面活性剂或称界面活性剂Triton X-100覆盖细胞10min，磷酸缓冲液PBS冲洗3次，4～6min/次；
⑤从细胞进样口一5、细胞进样口二6、细胞进样口三7、细胞进样口四8加入用血清封闭细胞30min；
⑥在抗体加入之前，打开阀七F、阀八G、阀九H、阀十I和阀十一K、阀十二L、阀十三M、阀十四N；
⑦打开阀一A，将骨桥蛋白一抗从一抗入口1流经荧光染色进样通道P1加入细胞培养室一R1、细胞培养室二R2、细胞培养室三R3、细胞培养室四R4，孵育过夜；关闭阀一A，打开阀四D，从磷酸缓冲液PBS缓冲液入口4加入磷酸缓冲液PBS冲洗3次，4～6min/次；
⑧次日，关闭阀四D，打开阀二B，将二抗从二抗入口2流经荧光染色进样通道P1加入细胞培养室一R1、细胞培养室二R2、细胞培养室三R3、细胞培养室四R4，避光孵育0.5-3h；关闭阀二B，打开阀四D，从磷酸缓冲液PBS缓冲液入口4加入磷酸缓冲液PBS冲洗3次，4～6min/次；
⑨关闭阀四D，打开阀三C，将能够与DNA强力结合的荧光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚DAPI从细胞核染料入口3流经荧光染色进样通道P1加入细胞培养室一R1、细胞培养室二R2、细胞培养室三R3、细胞培养室四R4，关闭阀三C，打开阀四D，从PBS缓冲液入口4加入磷酸缓冲液PBS清洗，通过荧光显微镜直观的观察细胞培养室中细胞经药物刺激后的生长状态以及荧光信号表达；
所述集成化药物筛选与染色微流控芯片还满足下述要求之一或其组合：⑩在⑦～⑨步骤中，当四个细胞荧光染色进样口即一抗入口1、二抗入口2、细胞核染料入口3、PBS缓冲液入口4液体进入细胞培养室后，打开控制染料排出的阀五E、控制药物排出的阀六J；四个细胞荧光染色进样口即一抗入口1、二抗入口2、细胞核染料入口3、PBS缓冲液入口4液体流经荧光染色进样通道P1和液体流出通道P4，从出液口13排出。
所述基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法中还满足下述要求之一或其组合：
所述芯片可进行不同种类的细胞培养，可进行不同种类或不同浓度的药物刺激，可进行不同种类的抗体染色。
所述芯片为细胞培养、药物筛选和细胞荧光染色提供了便捷的技术平台，灵活可控、集成度高、应用范围广。
所述芯片的细胞培养单元、流体通道、药物进样单元和泵阀控制单元可随意增减，用于培养不同种类细胞、进行多种药物刺激。
所述芯片的荧光染色进样口和荧光染色通道可随意增减，用于进行细胞的多指标荧光染色；
所述微芯片的细胞培养室中接种的细胞为小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1；细胞密度为5×104cells/mL～5×107cells/mL；
所述芯片的细胞培养室中接种细胞，细胞铺满培养区域底面后，在药物进样区加入药物刺激，细胞培养周期结束，固定细胞，荧光染色；
所述微流控芯片细胞培养3～7d，采用多聚甲醛固定，多聚甲醛浓度为0.01～0.08g/mL；
所选用的药物为纳米羟基磷灰石(nHAP)，药物的浓度范围为0～0.1g/mL。
如前所述集成化药物筛选与染色微流控芯片的制备方法，其相关步骤依次要求如下：
①采用光刻和腐蚀方法制备出通道部分凸起的光刻胶SU-8模板；
②用乳酸乙酯对光刻胶SU-8模板进行显影，165℃～180℃坚膜1～3h；
③将芯片下层的光刻胶SU-8模板用硅烷化试剂处理5～10min，使PDMS容易剥离模板底面；
④将聚二甲基硅氧烷PDMS与引发剂以体积比5～20：1混合均匀，分别浇注于芯片上、下层结构光刻胶SU-8模板，80℃烘箱固化20～40min，将聚二甲基硅氧烷PDMS与芯片上层光刻胶SU-8模板剥离，得到带有结构的聚二甲基硅氧烷PDMS芯片；
⑤将芯片上层带有结构的一侧与光刻胶SU-8模板上无结构的芯片下层进行氧等离子体处理1～3min，70～90℃热烘30～60min，进行不可逆封接；
⑥将上述封接好的聚二甲基硅氧烷PDMS芯片与下层结构光刻胶SU-8模板剥离，与干净的空白玻璃片经过氧等离子体处理1～3min，70～90℃热烘30～60min进行不可逆封接，即得到集成化药物筛选与染色微流控芯片。
所述集成化药物筛选与染色微流控芯片的制备方法还满足下述要求：所述微流控芯片的细胞培养室中在接种细胞且细胞铺满培养区域底面后，在药物进样区加入药物刺激；细胞培养周期结束，固定细胞，进行荧光染色。所述集成化药物筛选与染色微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述集成化药物筛选与染色微流控芯片的制备方法还满足下述要求：所述微流控芯片的细胞培养室中在接种细胞且细胞铺满培养区域底面后，在药物进样区加入药物刺激；细胞培养周期结束，固定细胞，进行荧光染色。
本发明利用微流体与微型阀技术，实现了在一块厘米级的微流控芯片上集细胞培养、药物筛选与荧光染色为一体，三种检测指标相继进行。首先在芯片中培养细胞，随后施加药物刺激，最后通过一体化的荧光染色装置，采集药物与细胞相互作用的信号，收集数据。芯片平台集程度高，分析速度快；利用芯片进行细胞培养、药物筛选及后期荧光染色检测方法简单方便，无需大量细胞与试剂消耗。因此，本发明提供了一种基于微流控芯片的集成化细胞培养、药物筛选与染色方法，并期望在细胞学、药物毒理学、分析检测研究等领域得到应用。
本发明制备过程稳定，操作简单，可实现快速、高效、高度集成化的药物筛选与细胞染色。
本发明所述集成化药物筛选与染色微流控芯片的用途说明：该芯片可用于施加不同浓度药物刺激对细胞生物学特性研究，并对该条件下的细胞状态进行荧光染色检测。所述集成化微流控芯片可进行不同种类的细胞培养，可进行不同种类或不同浓度的药物刺激，可进行不同种类的抗体染色。
本发明利用微流体与微型阀技术，制备了一种集细胞培养、药物筛选与荧光染色为一体，三种检测指标相继进行的微流控芯片。整个芯片平台结构简单，操作方便，集成度高，分析速度快，效率高，无需任何复杂和昂贵的设备，无需大量细胞与试剂消耗。综上所述，发明一种方便，快捷，集成度高，应用范围广的集成化药物筛选与染色微流控芯片具有十分重要意义的。
本发明解决了以往细胞药物筛选与染色过程中存在的操作步骤繁琐复杂、消耗大量试剂等技术局限。本发明制备过程稳定，操作简单，集成度高。
本发明的优点在于：1、操作简便、快捷；2、细胞与试剂用量少，实验成本低廉；3、不接触有毒有害试剂，环境友好；4、高度集成化、应用范围广泛。
附图说明
下面结合附图及实施方式对本发明作进一步详细的说明：
图1为集成化药物筛选与染色微流控芯片结构示意简图；
图2为集成化药物筛选与染色微流控芯片上层结构示意图；
图3为集成化药物筛选与染色微流控芯片下层结构示意图；
图4为芯片培养MC3T3-E1细胞三天后的细胞生长状态图；
图5为芯片培养MC3T3-E1细胞三天后的细胞荧光染色图。
具体实施方式
附图标记含义如下：
图1中，附图标记1～4均为细胞荧光染色进样口，其具体分别为：一抗入口1、二抗入口2、细胞核染料入口3、PBS缓冲液入口4；荧光染色进样通道P1；5～8分别为细胞进样口一5、细胞进样口二6、细胞进样口三7、细胞进样口四8；细胞进样通道P1；R1～R4分别为：细胞培养室一R1、细胞培养室二R2、细胞培养室三R3、细胞培养室四R4，可同时培养4种不同种类细胞；9～12分别为：药物进样口一9、药物进样口二10、药物进样口三11、药物进样口四12；药物进样通道P3，可同时加入不同种类药物或同种不同浓度药物；液体流出通道P4，出液口13；A～D为分别控制附图标记为1～4的四个细胞荧光染色进样口的阀，四者分别为：阀一A、阀二B、阀三C、阀四D；另有：控制染料排出的阀五E、控制药物排出的阀六J；附图标记F～I是分别控制附图标记为5～8的各个细胞进样口的阀，分别具体是：阀七F、阀八G、阀九H、阀十I；附图标记K～N为分别控制附图标记9～12这四个药物进样口的阀，其具体是：阀十一K、阀十二L、阀十三M、阀十四N；
图1、图2中，基体材料的边界线省略未画出，图3中基体材料的边界线即外部的矩形框仅为示意；特此说明。
实施例1
一种基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法，所述集成化药物筛选与染色微流控芯片由上层、下层、底面三层顺序串联贴合布置组成，其中：上层为液路控制层，下层为气路控制层，底面为空白玻璃底板；
所述液路控制层具体设置有下述结构：
——细胞荧光染色进样口：位于在整个液路控制层的最上游；
——荧光染色进样通道区P1：布置在细胞荧光染色进样口和细胞进样通道区P2之间用于沟通二者；
——细胞进样口：其设置有至少两个，每一个细胞进样口都设置在细胞进样通道区P2中的其中一条通道上，且前述细胞进样通道区P2中的每一条通道都串接着一个细胞培养室；
——细胞进样通道区P2：设置在荧光染色进样通道区P1和细胞培养室之间；
——细胞培养室：至少有二个，布置在细胞进样通道区P2和药物进样通道区P3之间；
——药物进样通道区P3：其为包括覆盖所有细胞培养室和药物进样口之间的通道的区域；
——药物进样口：其数量和细胞培养室相等，各自布置在每一个细胞培养室下游的通道上；
——液体流出通道区P4：其布置在细胞培养室下游通道的下游和整个液路最尾端的出液口13之间；
——出液口13：布置在整个液路控制层所有结构的最下游；
所述集成化药物筛选与染色微流控芯片还满足下述要求之一或其组合：
其一，细胞荧光染色进样口设置有四个，其具体分别为：一抗入口1、二抗入口2、细胞核染料入口3、PBS缓冲液入口4；所述集成化药物筛选与染色微流控芯片中设置有四个以前述四个细胞荧光染色进样口为入口的通道，其相互并联并最终汇成一个共用的通道；最终汇成的共用通道再次一分为四，变成四条各自设置有一个细胞进样口的四条通道，每个细胞进样口还分别依次连接着下游的细胞培养室、药物进样口和再之后的液体流出通道P4；所述四个细胞进样口分别为：细胞进样口一5、细胞进样口二6、细胞进样口三7、细胞进样口四8；与前述四个细胞进样口依次对应处于同一液体通路上的四个细胞培养室分别是：细胞培养室一R1、细胞培养室二R2、细胞培养室三R3、细胞培养室四R4；同样的，对应的四个药物进样口分别依次是：药物进样口一9、药物进样口二10、药物进样口三11、药物进样口四12；
其二，液体流出通道区P4：其是将细胞培养室下游的四条通道合并为最终的共用的一个出液口13的通道合并区域；
其三，所述微流控芯片的下层即气路控制层具体由泵阀控制区组成，每个荧光染色液体入口有单独的泵阀单元控制，以使进样液体互相不影响；气路控制层具体包含有下述结构之一或其组合：依次设置在前述四个细胞进样口即细胞进样口一5、细胞进样口二6、细胞进样口三7、细胞进样口四8上游的控制用的阀：阀七F、阀八G、阀九H、阀十I；依次设置在前述四个药物进样口下游的控制用的阀：阀十一K、阀十二L、阀十三M、阀十四N；依次设置在前述四个细胞荧光染色进样口即一抗入口1、二抗入口2、细胞核染料入口3、PBS缓冲液入口4的下游通道上的控制用的阀：阀一A、阀二B、阀三C、阀四D；所述微芯片的所有控制用的阀均为常闭阀；
其四，细胞培养室设置有四个：细胞培养室一R1、细胞培养室二R2、细胞培养室三R3、细胞培养室四R4，与之对应的在细胞进样通道区P2上游的细胞进样口和下游药物进样通道区P3的药物进样口也都分别对应有四个；每一条通道上从上游开始依次串接布置有1个细胞进样口、1个细胞培养室、1个药物进样口；
其五，每个细胞培养室由单独的细胞培养液入口、药物入口、荧光染色液入口、进样通道组成；
其六，至少两个并联的细胞培养室组成液路层；
其七，所述上层芯片和下层芯片的材料均为聚二甲基硅氧烷聚合物，上层芯片厚1～5mm，下层芯片厚100～500μm；
其八，所述细胞培养室的尺寸为15mm×2mm×100μm的长梭形；
其九，所述芯片的气路和液路通道高度相同，均为80～200μm
其十，所述芯片的气路和液路通道宽度不同，气路通道宽度为100～300μm，液路通道宽200～600μm。
其十一，所述液路层为模块；气路层是在制作成功的气路模板上甩一层高于模板10～50μm的聚二甲基硅氧烷膜，所述液路层的聚二甲基硅氧烷模板有结构一侧封接到气路层聚二甲基硅氧烷膜无结构一侧，气路层聚二甲基硅氧烷膜有阀结构一侧等离子键合到洁净的玻璃片上；
所述集成化药物筛选与染色微流控芯片的制备方法相关步骤依次要求如下：
①从四个并联的药物进样口即药物进样口一9、药物进样口二10、药物进样口三11、药物进样口四12分别吸出药物溶液，从细胞进样口一5、细胞进样口二6、细胞进样口三7、细胞进样口四8分别加入磷酸缓冲液PBS冲洗3次，4～6min/次；
②从细胞进样口一5、细胞进样口二6、细胞进样口三7、细胞进样口四8分别加入0.04g/mL预冷的多聚甲醛固定细胞，磷酸缓冲液PBS冲洗3次，4～6min/次；
③从四个并联的药物进样口即药物进样口一9、药物进样口二10、药物进样口三11、药物进样口四12分别吸去多聚甲醛，从细胞进样口一5、细胞进样口二6、细胞进样口三7、细胞进样口四8分别加入磷酸缓冲液PBS冲洗3次，4～6min/次；
④从细胞进样口一5、细胞进样口二6、细胞进样口三7、细胞进样口四8加入表面活性剂或称界面活性剂Triton X-100覆盖细胞10min，磷酸缓冲液PBS冲洗3次，4～6min/次；
⑤从细胞进样口一5、细胞进样口二6、细胞进样口三7、细胞进样口四8加入用血清封闭细胞30min；
⑥在抗体加入之前，打开阀七F、阀八G、阀九H、阀十I和阀十一K、阀十二L、阀十三M、阀十四N；
⑦打开阀一A，将骨桥蛋白一抗从一抗入口1流经荧光染色进样通道P1加入细胞培养室一R1、细胞培养室二R2、细胞培养室三R3、细胞培养室四R4，孵育过夜；关闭阀一A，打开阀四D，从磷酸缓冲液PBS缓冲液入口4加入磷酸缓冲液PBS冲洗3次，4～6min/次；
⑧次日，关闭阀四D，打开阀二B，将二抗从二抗入口2流经荧光染色进样通道P1加入细胞培养室一R1、细胞培养室二R2、细胞培养室三R3、细胞培养室四R4，避光孵育0.5-3h；关闭阀二B，打开阀四D，从磷酸缓冲液PBS缓冲液入口4加入磷酸缓冲液PBS冲洗3次，4～6min/次；
⑨关闭阀四D，打开阀三C，将能够与DNA强力结合的荧光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚DAPI从细胞核染料入口3流经荧光染色进样通道P1加入细胞培养室一R1、细胞培养室二R2、细胞培养室三R3、细胞培养室四R4，关闭阀三C，打开阀四D，从PBS缓冲液入口4加入磷酸缓冲液PBS清洗，通过荧光显微镜直观的观察细胞培养室中细胞经药物刺激后的生长状态以及荧光信号表达；
⑩在⑦～⑨步骤中，当细胞荧光染色进样口进入的液体进入细胞培养室后，打开控制染料排出的阀五E、控制药物排出的阀六J；细胞荧光染色进样口进入的液体流经荧光染色进样通道P1和液体流出通道P4，从出液口13排出。
所述集成化药物筛选与染色微流控芯片还满足下述要求之一或其组合：⑩在⑦～⑨步骤中，当四个细胞荧光染色进样口即一抗入口1、二抗入口2、细胞核染料入口3、PBS缓冲液入口4液体进入细胞培养室后，打开控制染料排出的阀五E、控制药物排出的阀六J；四个细胞荧光染色进样口即一抗入口1、二抗入口2、细胞核染料入口3、PBS缓冲液入口4液体流经荧光染色进样通道P1和液体流出通道P4，从出液口13排出。
所述基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法中还满足下述要求之一或其组合：
所述芯片可进行不同种类的细胞培养，可进行不同种类或不同浓度的药物刺激，可进行不同种类的抗体染色。
所述芯片为细胞培养、药物筛选和细胞荧光染色提供了便捷的技术平台，灵活可控、集成度高、应用范围广。
所述芯片的细胞培养单元、流体通道、药物进样单元和泵阀控制单元可随意增减，用于培养不同种类细胞、进行多种药物刺激。
所述芯片的荧光染色进样口和荧光染色通道可随意增减，用于进行细胞的多指标荧光染色；
所述微芯片的细胞培养室中接种的细胞为小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1；细胞密度为5×104cells/mL～5×107cells/mL；
所述芯片的细胞培养室中接种细胞，细胞铺满培养区域底面后，在药物进样区加入药物刺激，细胞培养周期结束，固定细胞，荧光染色；
所述微流控芯片细胞培养3～7d，采用多聚甲醛固定，多聚甲醛浓度为0.01～0.08g/mL；
所选用的药物为纳米羟基磷灰石(nHAP)，药物的浓度范围为0～0.1g/mL。
如前所述集成化药物筛选与染色微流控芯片的制备方法，其相关步骤依次要求如下：
①采用光刻和腐蚀方法制备出通道部分凸起的光刻胶SU-8模板；
②用乳酸乙酯对光刻胶SU-8模板进行显影，165℃～180℃坚膜1～3h；
③将芯片下层的光刻胶SU-8模板用硅烷化试剂处理5～10min，使PDMS容易剥离模板底面；
④将聚二甲基硅氧烷PDMS与引发剂以体积比5～20：1混合均匀，分别浇注于芯片上、下层结构光刻胶SU-8模板，80℃烘箱固化20～40min，将聚二甲基硅氧烷PDMS与芯片上层光刻胶SU-8模板剥离，得到带有结构的聚二甲基硅氧烷PDMS芯片；
⑤将芯片上层带有结构的一侧与光刻胶SU-8模板上无结构的芯片下层进行氧等离子体处理1～3min，70～90℃热烘30～60min，进行不可逆封接；
⑥将上述封接好的聚二甲基硅氧烷PDMS芯片与下层结构光刻胶SU-8模板剥离，与干净的空白玻璃片经过氧等离子体处理1～3min，70～90℃热烘30～60min进行不可逆封接，即得到集成化药物筛选与染色微流控芯片。
所述集成化药物筛选与染色微流控芯片的制备方法还满足下述要求：所述微流控芯片的细胞培养室中在接种细胞且细胞铺满培养区域底面后，在药物进样区加入药物刺激；细胞培养周期结束，固定细胞，进行荧光染色。所述集成化药物筛选与染色微流控芯片的制备方法，其特征在于：所述集成化药物筛选与染色微流控芯片的制备方法还满足下述要求：所述微流控芯片的细胞培养室中在接种细胞且细胞铺满培养区域底面后，在药物进样区加入药物刺激；细胞培养周期结束，固定细胞，进行荧光染色。
本实施例利用微流体与微型阀技术，实现了在一块厘米级的微流控芯片上集细胞培养、药物筛选与荧光染色为一体，三种检测指标相继进行。首先在芯片中培养细胞，随后施加药物刺激，最后通过一体化的荧光染色装置，采集药物与细胞相互作用的信号，收集数据。芯片平台集程度高，分析速度快；利用芯片进行细胞培养、药物筛选及后期荧光染色检测方法简单方便，无需大量细胞与试剂消耗。因此，本实施例提供了一种基于微流控芯片的集成化细胞培养、药物筛选与染色方法，并期望在细胞学、药物毒理学、分析检测研究等领域得到应用。
本实施例制备过程稳定，操作简单，可实现快速、高效、高度集成化的药物筛选与细胞染色。
本实施例利用微流体与微型阀技术，制备了一种集细胞培养、药物筛选与荧光染色为一体，三种检测指标相继进行的微流控芯片。整个芯片平台结构简单，操作方便，集成度高，分析速度快，效率高，无需任何复杂和昂贵的设备，无需大量细胞与试剂消耗。综上所述，发明一种方便，快捷，集成度高，应用范围广的集成化药物筛选与染色微流控芯片具有十分重要意义的。
本实施例解决了以往细胞药物筛选与染色过程中存在的操作步骤繁琐复杂、消耗大量试剂等技术局限。本实施例制备过程稳定，操作简单，集成度高。
本实施例所述集成化药物筛选与染色微流控芯片的用途说明：该芯片可用于施加不同浓度药物刺激对细胞生物学特性研究，并对该条件下的细胞状态进行荧光染色检测。所述集成化微流控芯片可进行不同种类的细胞培养，可进行不同种类或不同浓度的药物刺激，可进行不同种类的抗体染色。
本实施例的优点在于：1、操作简便、快捷；2、细胞与试剂用量少，实验成本低廉；3、不接触有毒有害试剂，环境友好；4、高度集成化、应用范围广泛。
实施例2
一种基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法，所述集成化药物筛选与染色微流控芯片由上层、下层、底面三层顺序串联贴合布置组成，其中：上层为液路控制层，下层为气路控制层，底面为空白玻璃底板；
所述液路控制层具体设置有下述结构：
——细胞荧光染色进样口：位于在整个液路控制层的最上游；
——荧光染色进样通道区P1：布置在细胞荧光染色进样口和细胞进样通道区P2之间用于沟通二者；
——细胞进样口：其设置有至少两个，每一个细胞进样口都设置在细胞进样通道区P2中的其中一条通道上，且前述细胞进样通道区P2中的每一条通道都串接着一个细胞培养室；
——细胞进样通道区P2：设置在荧光染色进样通道区P1和细胞培养室之间；
——细胞培养室：至少有二个，布置在细胞进样通道区P2和药物进样通道区P3之间；
——药物进样通道区P3：其为包括覆盖所有细胞培养室和药物进样口之间的通道的区域；
——药物进样口：其数量和细胞培养室相等，各自布置在每一个细胞培养室下游的通道上；
——液体流出通道区P4：其布置在细胞培养室下游通道的下游和整个液路最尾端的出液口13之间；
——出液口13：布置在整个液路控制层所有结构的最下游；
基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法具体要求如下：细胞荧光染色步骤如下：
①从各个药物进样口分别吸出药物溶液，从各个细胞进样口分别加入PBS冲洗2～5次，3～8min/次；
②从各个细胞进样口分别加入0.04g/mL预冷的多聚甲醛固定细胞，PBS冲洗2～5次，3～8min/次；
③从各个药物进样口分别吸去多聚甲醛，从各个细胞进样口分别加入PBS冲洗2～5次，3～8min/次；
④从各个细胞进样口分别加入表面活性剂Triton X-100覆盖细胞10min，增加了细胞的通透性，磷酸缓冲液PBS冲洗2～5次，3～8min/次；
⑤从各个细胞进样口分别加入用血清封闭细胞15～60min；
⑥在抗体加入之前，打开分别控制各个细胞进样口的气阀F～I和分别控制各个药物进样的气阀K～N；
⑦打开用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，将骨桥蛋白一抗从细胞荧光染色进样口流经荧光染色进样通道P1加入细胞培养室，孵育过夜；关闭用于控制细胞荧光染色进样口的气阀；打开用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，从该气阀对应的细胞荧光染色进样口加入磷酸缓冲液PBS冲洗2～5次，3～8min/次；
⑧次日，关闭控制细胞荧光染色进样口的气阀，打开另一控制细胞荧光染色进样口的气阀，将二抗从另一个细胞荧光染色进样口流经荧光染色进样通道P1加入细胞培养室，避光孵育0.5-3h；关闭前述用于引入二抗的细胞荧光染色进样口；打开用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，从该气阀对应的细胞荧光染色进样口加入磷酸缓冲液PBS冲洗2～5次，3～8min/次；
⑨关闭前述引入磷酸缓冲液PBS冲洗的用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，打开另一控制细胞荧光染色进样口，将能够与DNA强力结合的荧光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚DAPI从对应这一细胞荧光染色进样口入口引入并流经荧光染色进样通道P1加入细胞培养室；之后关闭前述用于控制细胞荧光染色进样口的气阀；打开前述引入磷酸缓冲液PBS冲洗的用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，从对应的用于控制细胞荧光染色进样口加入磷酸缓冲液PBS清洗，通过荧光显微镜直观的观察细胞培养室中细胞经药物刺激后的生长状态以及荧光信号表达；
⑩在⑦～⑨步骤中，当细胞荧光染色进样口进入的液体进入细胞培养室后，打开控制染料排出的阀五E、控制药物排出的阀六J；细胞荧光染色进样口进入的液体流经荧光染色进样通道P1和液体流出通道P4，从出液口13排出。
所述集成化药物筛选与染色微流控芯片满足下述要求之一或其组合：
其一，细胞荧光染色进样口设置有四个，其具体分别为：一抗入口1、二抗入口2、细胞核染料入口3、PBS缓冲液入口4；所述集成化药物筛选与染色微流控芯片中设置有四个以前述四个细胞荧光染色进样口为入口的通道，其相互并联并最终汇成一个共用的通道；最终汇成的共用通道再次一分为四，变成四条各自设置有一个细胞进样口的四条通道，每个细胞进样口还分别依次连接着下游的细胞培养室、药物进样口和再之后的液体流出通道P4；所述四个细胞进样口分别为：细胞进样口一5、细胞进样口二6、细胞进样口三7、细胞进样口四8；与前述四个细胞进样口依次对应处于同一液体通路上的四个细胞培养室分别是：细胞培养室一R1、细胞培养室二R2、细胞培养室三R3、细胞培养室四R4；同样的，对应的四个药物进样口分别依次是：药物进样口一9、药物进样口二10、药物进样口三11、药物进样口四12；
其二，液体流出通道区P4：其是将细胞培养室下游的四条通道合并为最终的共用的一个出液口13的通道合并区域；
其三，所述微流控芯片的下层即气路控制层具体由泵阀控制区组成，每个荧光染色液体入口有单独的泵阀单元控制，以使进样液体互相不影响；气路控制层具体包含有下述结构之一或其组合：依次设置在前述四个细胞进样口即细胞进样口一5、细胞进样口二6、细胞进样口三7、细胞进样口四8上游的控制用的阀：阀七F、阀八G、阀九H、阀十I；依次设置在前述四个药物进样口下游的控制用的阀：阀十一K、阀十二L、阀十三M、阀十四N；依次设置在前述四个细胞荧光染色进样口即一抗入口1、二抗入口2、细胞核染料入口3、PBS缓冲液入口4的下游通道上的控制用的阀：阀一A、阀二B、阀三C、阀四D；所述微芯片的所有控制用的阀均为常闭阀；
其四，细胞培养室设置有四个：细胞培养室一R1、细胞培养室二R2、细胞培养室三R3、细胞培养室四R4，与之对应的在细胞进样通道区P2上游的细胞进样口和下游药物进样通道区P3的药物进样口也都分别对应有四个；每一条通道上从上游开始依次串接布置有1个细胞进样口、1个细胞培养室、1个药物进样口；
其五，每个细胞培养室由单独的细胞培养液入口、药物入口、荧光染色液入口、进样通道组成；
其六，至少两个并联的细胞培养室组成液路层；
其七，所述上层芯片和下层芯片的材料均为聚二甲基硅氧烷聚合物，上层芯片厚1～5mm，下层芯片厚100～500μm；
其八，所述细胞培养室的尺寸为15mm×2mm×100μm的长梭形；
其九，所述芯片的气路和液路通道高度相同，均为80～200μm
其十，所述芯片的气路和液路通道宽度不同，气路通道宽度为100～300μm，液路通道宽200～600μm。
其十一，所述液路层为模块；气路层是在制作成功的气路模板上甩一层高于模板10～50μm的聚二甲基硅氧烷膜，所述液路层的聚二甲基硅氧烷模板有结构一侧封接到气路层聚二甲基硅氧烷膜无结构一侧，气路层聚二甲基硅氧烷膜有阀结构一侧等离子键合到洁净的玻璃片上；
所述集成化药物筛选与染色微流控芯片还满足下述要求之一或其组合：⑩在⑦～⑨步骤中，当四个细胞荧光染色进样口即一抗入口1、二抗入口2、细胞核染料入口3、PBS缓冲液入口4液体进入细胞培养室后，打开控制染料排出的阀五E、控制药物排出的阀六J；四个细胞荧光染色进样口即一抗入口1、二抗入口2、细胞核染料入口3、PBS缓冲液入口4液体流经荧光染色进样通道P1和液体流出通道P4，从出液口13排出。
所述基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法中还满足下述要求之一或其组合：
所述芯片可进行不同种类的细胞培养，可进行不同种类或不同浓度的药物刺激，可进行不同种类的抗体染色。
所述芯片为细胞培养、药物筛选和细胞荧光染色提供了便捷的技术平台，灵活可控、集成度高、应用范围广。
所述芯片的细胞培养单元、流体通道、药物进样单元和泵阀控制单元可随意增减，用于培养不同种类细胞、进行多种药物刺激。
所述芯片的荧光染色进样口和荧光染色通道可随意增减，用于进行细胞的多指标荧光染色；
所述微芯片的细胞培养室中接种的细胞为小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1；细胞密度为5×104cells/mL～5×107cells/mL；
所述芯片的细胞培养室中接种细胞，细胞铺满培养区域底面后，在药物进样区加入药物刺激，细胞培养周期结束，固定细胞，荧光染色；
所述微流控芯片细胞培养3～7d，采用多聚甲醛固定，多聚甲醛浓度为0.01～0.08g/mL；
所选用的药物为纳米羟基磷灰石(nHAP)，药物的浓度范围为0～0.1g/mL。
实施例3
采用光刻和腐蚀方法制备出通道部分突起的SU-8模板，芯片上下层结构分别由两个SU-8模板反模PDMS组成；将芯片下层结构的SU-8模板用硅烷化试剂处理10min，使PDMS容易剥离模板底面；PDMS与引发剂以体积比10：1混合均匀，分别浇注于芯片上、下层结构SU-8模板，80℃烘箱固化40min，将PDMS与芯片上层SU-8模板剥离，得到带有结构的PDMS芯片；将芯片上层带有结构的一侧与SU-8模板上无结构的芯片下层进行氧等离子体处理2min，80℃热烘1h，不可逆封接；将上述封接好的PDMS芯片与下层结构SU-8模板剥离，与干净的空白玻璃片经过氧等离子体处理2min，80℃热烘1h进行不可逆封接，即得到集成化药物筛选与染色微流控芯片。
实施例4
将前述实施例3所述芯片经75％乙醇浸泡，紫外照射过夜灭菌处理后，用DMEM培养基浸润通道,芯片所有气阀处于关闭状态；从入口5～8接种MC3T3-E1细胞单细胞悬浮液，接种密度为5×105cells/mL，细胞经细胞进样通道P1进入细胞培养室R1～R4；培养3天，待细胞铺满芯片底面，将不同浓度的nHAP从入口9～12流经药物进样通道P3分别加入细胞培养室R1～R4，药物浓度分别为对照组、0.01g/mL、0.02g/mL、0.04g/mL；药物作用结束，进行OPN抗体荧光染色。荧光染色步骤如下：
①从入口9～12分别吸出药物溶液，从入口5～8加入PBS冲洗3次，5min/次；
②从入口5～8加入0.04g/mL预冷的多聚甲醛固定细胞，PBS冲洗3次，5min/次；
③从入口9～12分别吸去多聚甲醛，从入口5～8加入PBS冲洗3次，5min/次；
④从入口5～8加入Triton X-100覆盖细胞10min，PBS冲洗3次，5min/次；
⑤从入口5～8加入用血清封闭细胞30min；
⑥在抗体加入之前，打开气阀F～I和K～N；
⑦打开气阀A，将骨桥蛋白一抗从入口1流经荧光染色进样通道P1加入细胞培养室R1～R4，孵育过夜；关闭气阀A，打开气阀D，从入口4加入PBS冲洗3次，5min/次；
⑧次日，关闭气阀D，打开气阀B，将二抗从入口2流经荧光染色进样通道P1加入细胞培养室R1～R4，避光孵育1h；关闭气阀B，打开气阀D，从入口4加入PBS冲洗3次，5min/次；
⑨关闭气阀D，打开气阀C，将DAPI从入口3流经荧光染色进样通道P1加入细胞培养室R1～R4，关闭气阀C，打开气阀D，从入口4加入PBS清洗后观察。
⑩在⑦～⑨步骤中，当入口1～4液体进入细胞培养室后，打开气阀E、J，入口1～4液体流经荧光染色进样通道P1和液体流出通道P4，从出液口13排出。
图1和图2为芯片结构示意图，图3为芯片培养MC3T3-E1细胞三天后的细胞生长状态图，细胞接种6h即可黏附，培养3d后，细胞能达到底面的80％-90％，并且长势良好。图4为芯片培养MC3T3-E1细胞三天后的荧光染色图。当不加nHAP时，MC3T3-E1细胞不表达骨桥蛋白，证明其没有向成骨分化；当加入nHAP时，MC3T3-E1细胞表达骨桥蛋白，证明已向成骨分化；随着nHAP含量的增加，骨桥蛋白的表达量增加，当nHAP浓度为0.04g/mL时，骨桥蛋白表达量最高。本实施例所述的微流控芯片可集细胞培养、药物筛选与荧光染色为一体，因此，本实施例提供了全新的技术平台，具有十分重要意义的。
图1中，附图标记1～4均为细胞荧光染色进样口，其具体分别为：一抗入口1、二抗入口2、细胞核染料入口3、PBS缓冲液入口4；荧光染色进样通道P1；5～8分别为细胞进样口一5、细胞进样口二6、细胞进样口三7、细胞进样口四8；细胞进样通道P1；R1～R4分别为：细胞培养室一R1、细胞培养室二R2、细胞培养室三R3、细胞培养室四R4，可同时培养4种不同种类细胞；9～12分别为：药物进样口一9、药物进样口二10、药物进样口三11、药物进样口四12；药物进样通道P3，可同时加入不同种类药物或同种不同浓度药物；液体流出通道P4，出液口13；细胞荧光染色进样通道将细胞荧光染色进样口和细胞进样口连接，细胞进样通道将细胞进样口和细胞培养室连接，药物进样通道将药物进样口和细胞培养室连接，液体流出通道将药物进样口和出液口连接；A～D为分别控制附图标记为1～4的四个细胞荧光染色进样口的阀，四者分别为：阀一A、阀二B、阀三C、阀四D；另有：控制染料排出的阀五E、控制药物排出的阀六J；附图标记F～I是分别控制附图标记为5～8的各个细胞进样口的阀，分别具体是：阀七F、阀八G、阀九H、阀十I；附图标记K～N为分别控制附图标记9～12这四个药物进样口的阀，其具体是：阀十一K、阀十二L、阀十三M、阀十四N。
所有进样口由单独的阀控制，不同种类的细胞通过附图标记分别为5～8的结构分别进入附图标记分别为R1～R4的四个单独的细胞培养室，待细胞生长稳定，从附图标记分别为9～12的结构处加入不同药物刺激细胞，分别将细胞固定液、细胞封闭液从附图标记分别为5～8的结构处加入，随后通过附图标记分别为1～4的结构处分别加入一抗、二抗、细胞核染料和PBS冲洗后，进行荧光显微镜观察。
图1、图2和图3为芯片结构示意图，图4为芯片培养MC3T3-E1细胞三天后的细胞生长状态图，细胞接种6h即可黏附，培养3d后，细胞能达到底面的80％-90％，并且长势良好。图5为芯片培养MC3T3-E1细胞三天后的荧光染色图。当不加nHAP时，MC3T3-E1细胞不表达骨桥蛋白，证明其没有向成骨分化；当加入nHAP时，MC3T3-E1细胞表达骨桥蛋白，证明已向成骨分化；随着nHAP含量的增加，骨桥蛋白的表达量增加，当nHAP浓度为0.04g/mL时，骨桥蛋白表达量最高。本实施例所述的微流控芯片可集细胞培养、药物筛选与荧光染色为一体，因此，本实施例提供了全新的技术平台，具有十分重要意义的。

Claims (5)

1.一种基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法，其特征在于：所述集成化药物筛选与染色微流控芯片由上层、下层、底面三层顺序串联贴合布置组成，其中：上层为液路控制层，下层为气路控制层，底面为空白玻璃底板，；
所述液路控制层具体设置有下述结构：
——细胞荧光染色进样口：位于在整个液路控制层的最上游；
——荧光染色进样通道区(P1)：布置在细胞荧光染色进样口和细胞进样通道区(P2)之间用于沟通二者；
——细胞进样口：其设置有至少两个，每一个细胞进样口都设置在细胞进样通道区(P2)中的其中一条通道上，且前述细胞进样通道区(P2)中的每一条通道都串接着一个细胞培养室；
——细胞进样通道区(P2)：设置在荧光染色进样通道区(P1)和细胞培养室之间；
——细胞培养室：至少有二个，布置在细胞进样通道区(P2)和药物进样通道区(P3)之间；
——药物进样通道区(P3)：其为包括覆盖所有细胞培养室和药物进样口之间的通道的区域；
——药物进样口：其数量和细胞培养室相等，各自布置在每一个细胞培养室下游的通道上；
——液体流出通道区(P4)：其布置在细胞培养室下游通道的下游和整个液路最尾端的出液口(13)之间；
——出液口(13)：布置在整个液路控制层所有结构的最下游；
基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法具体要求如下：细胞荧光染色步骤如下：
①从各个药物进样口分别吸出药物溶液，从各个细胞进样口分别加入PBS冲洗2～5次，3～8min/次；
②从各个细胞进样口分别加入0.04g/mL预冷的多聚甲醛固定细胞，PBS冲洗2～5次，3～8min/次；
③从各个药物进样口分别吸去多聚甲醛，从各个细胞进样口分别加入PBS冲洗2～5次，3～8min/次；
④从各个细胞进样口分别加入表面活性剂Triton X-100覆盖细胞10min，增加细胞膜的通透性，磷酸缓冲液冲洗2～5次，3～8min/次；
⑤从各个细胞进样口分别加入血清封闭细胞15～60min；
⑥在抗体加入之前，打开分别控制各个细胞进样口的气阀和分别控制各个药物进样的气阀；
⑦打开用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，将骨桥蛋白一抗从细胞荧光染色进样口流经荧光染色进样通道(P1)加入细胞培养室，孵育过夜；关闭用于控制细胞荧光染色进样口的气阀；打开用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，从该气阀对应的细胞荧光染色进样口加入磷酸缓冲液冲洗2～5次，3～8min/次；
⑧次日，关闭控制细胞荧光染色进样口的气阀，打开另一控制细胞荧光染色进样口的气阀，将二抗从另一个细胞荧光染色进样口流经荧光染色进样通道(P1)加入细胞培养室，避光孵育0.5-3h；关闭前述用于引入二抗的细胞荧光染色进样口；打开用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，从该气阀对应的细胞荧光染色进样口加入磷酸缓冲液冲洗2～5次，3～8min/次；
⑨关闭前述引入磷酸缓冲液冲洗的用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，打开另一控制细胞荧光染色进样口，将能够与DNA强力结合的荧光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚从对应这一细胞荧光染色进样口入口引入并流经荧光染色进样通道(P1)加入细胞培养室；之后关闭前述用于控制细胞荧光染色进样口的气阀；打开前述引入磷酸缓冲液冲洗的用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，从对应的用于控制细胞荧光染色进样口加入磷酸缓冲液清洗，通过荧光显微镜直观的观察细胞培养室中细胞经药物刺激后的生长状态以及荧光信号表达。
2.按照权利要求1所述基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法，其特征在于：所述基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法还有步骤⑩：在⑦～⑨步骤中，当细胞荧光染色进样口进入的液体进入细胞培养室后，打开控制染料排出的阀五(E)、控制药物排出的阀六(J)；细胞荧光染色进样口进入的液体流经荧光染色进样通道(P1)和液体流出通道(P4)，从出液口(13)排出。
3.按照权利要求1所述基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法，其特征在于：所述集成化药物筛选与染色微流控芯片还满足下述要求之一或其组合：
其一，细胞荧光染色进样口设置有四个，其具体分别为：一抗入口(1)、二抗入口(2)、细胞核染料入口(3)、PBS缓冲液入口(4)；所述集成化药物筛选与染色微流控芯片中设置有四个以前述四个细胞荧光染色进样口为入口的通道，其相互并联并最终汇成一个共用的通道；最终汇成的共用通道再次一分为四，变成四条各自设置有一个细胞进样口的四条通道，每个细胞进样口还分别依次连接着下游的细胞培养室、药物进样口和再之后的液体流出通道(P4)；所述四个细胞进样口分别为：细胞进样口一(5)、细胞进样口二(6)、细胞进样口三(7)、细胞进样口四(8)；与前述四个细胞进样口依次对应处于同一液体通路上的四个细胞培养室分别是：细胞培养室一(R1)、细胞培养室二(R2)、细胞培养室三(R3)、细胞培养室四(R4)；同样的，对应的四个药物进样口分别依次是：药物进样口一(9)、药物进样口二(10)、药物进样口三(11)、药物进样口四(12)；
其二，液体流出通道区(P4)：其是将细胞培养室下游的四条通道合并为最终的共用的一个出液口(13)的通道合并区域；
其三，所述微流控芯片的下层即气路控制层具体由泵阀控制区组成，每个荧光染色液体入口有单独的泵阀单元控制，以使进样液体互相不影响；气路控制层具体包含有下述结构之一或其组合：依次设置在前述四个细胞进样口即细胞进样口一(5)、细胞进样口二(6)、细胞进样口三(7)、细胞进样口四(8)上游的控制用的阀：阀七(F)、阀八(G)、阀九(H)、阀十(I)；依次设置在前述四个药物进样口下游的控制用的阀：阀十一(K)、阀十二(L)、阀十三(M)、阀十四(N)；依次设置在前述四个细胞荧光染色进样口即一抗入口(1)、二抗入口(2)、细胞核染料入口(3)、PBS缓冲液入口(4)的下游通道上的控制用的阀：阀一(A)、阀二(B)、阀三(C)、阀四(D)；所述微芯片的所有控制用的阀均为常闭阀；
其四，细胞培养室设置有四个：细胞培养室一(R1)、细胞培养室二(R2)、细胞培养室三(R3)、细胞培养室四(R4)，与之对应的在细胞进样通道区(P2)上游的细胞进样口和下游药物进样通道区(P3)的药物进样口也都分别对应有四个；每一条通道上从上游开始依次串接布置有1个细胞进样口、1个细胞培养室、1个药物进样口；
其五，每个细胞培养室由单独的细胞培养液入口、药物入口、荧光染色液入口、进样通道组成；
其六，至少两个并联的细胞培养室组成液路层；
其七，所述上层芯片和下层芯片的材料均为聚二甲基硅氧烷聚合物，上层芯片厚1～5mm，下层芯片厚100～500μm；
其八，所述细胞培养室的尺寸为15mm×2mm×100μm的长梭形；
其九，所述芯片的气路和液路通道高度相同，均为80～200μm
其十，所述芯片的气路和液路通道宽度不同，气路通道宽度为100～300μm，液路通道宽200～600μm。
其十一，所述液路层为模块；气路层是在制作成功的气路模板上甩一层高于模板10～50μm的聚二甲基硅氧烷膜，所述液路层的聚二甲基硅氧烷模板有结构一侧封接到气路层聚二甲基硅氧烷膜无结构一侧，气路层聚二甲基硅氧烷膜有阀结构一侧等离子键合到洁净的玻璃片上；
所述集成化药物筛选与染色微流控芯片的制备方法相关步骤依次要求如下：
①从四个并联的药物进样口即药物进样口一(9)、药物进样口二(10)、药物进样口三(11)、药物进样口四(12)分别吸出药物溶液，从细胞进样口一(5)、细胞进样口二(6)、细胞进样口三(7)、细胞进样口四(8)分别加入磷酸缓冲液PBS冲洗3次，4～6min/次；
②从细胞进样口一(5)、细胞进样口二(6)、细胞进样口三(7)、细胞进样口四(8)分别加入0.04g/mL预冷的多聚甲醛固定细胞，磷酸缓冲液冲洗3次，4～6min/次；
③从四个并联的药物进样口即药物进样口一(9)、药物进样口二(10)、药物进样口三(11)、药物进样口四(12)分别吸去多聚甲醛，从细胞进样口一(5)、细胞进样口二(6)、细胞进样口三(7)、细胞进样口四(8)分别加入磷酸缓冲液冲洗3次，4～6min/次；
④从细胞进样口一(5)、细胞进样口二(6)、细胞进样口三(7)、细胞进样口四(8)加入表面活性剂Triton X-100覆盖细胞10min，磷酸缓冲液冲洗3次，4～6min/次；
⑤从细胞进样口一(5)、细胞进样口二(6)、细胞进样口三(7)、细胞进样口四(8)加入用血清封闭细胞30min；
⑥在抗体加入之前，打开阀七(F)、阀八(G)、阀九(H)、阀十(I)和阀十一(K)、阀十二(L)、阀十三(M)、阀十四(N)；
⑦打开阀一A，将骨桥蛋白一抗从一抗入口(1)流经荧光染色进样通道(P1)加入细胞培养室一(R1)、细胞培养室二(R2)、细胞培养室三(R3)、细胞培养室四(R4)，孵育过夜；关闭阀一(A)，打开阀四(D)，从磷酸缓冲液缓冲液入口(4)加入磷酸缓冲液冲洗3次，4～6min/次；
⑧次日，关闭阀四(D)，打开阀二(B)，将二抗从二抗入口(2)流经荧光染色进样通道(P1)加入细胞培养室一(R1)、细胞培养室二(R2)、细胞培养室三(R3)、细胞培养室四(R4)，避光孵育0.5-3h；关闭阀二(B)，打开阀四(D)，从磷酸缓冲液缓冲液入口(4)加入磷酸缓冲液冲洗3次，4～6min/次；
⑨关闭阀四(D)，打开阀三(C)，将能够与DNA强力结合的荧光染料4',6-二脒基-2-苯基吲哚从细胞核染料入口(3)流经荧光染色进样通道(P1)加入细胞培养室一(R1)、细胞培养室二(R2)、细胞培养室三(R3)、细胞培养室四(R4)，关闭阀三(C)，打开阀四(D)，从缓冲液入口(4)加入磷酸缓冲液清洗，通过荧光显微镜直观的观察细胞培养室中细胞经药物刺激后的生长状态以及荧光信号表达。
4.按照权利要求3所述基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法，其特征在于：所述集成化药物筛选与染色微流控芯片还满足下述要求之一或其组合：步骤⑩：在⑦～⑨步骤中，当四个细胞荧光染色进样口即一抗入口(1)、二抗入口(2)、细胞核染料入口(3)、PBS缓冲液入口(4)液体进入细胞培养室后，打开控制染料排出的阀五(E)、控制药物排出的阀六(J)；四个细胞荧光染色进样口即一抗入口(1)、二抗入口(2)、细胞核染料入口(3)、PBS缓冲液入口(4)液体流经荧光染色进样通道(P1)和液体流出通道(P4)，从出液口(13)排出。
5.按照权利要求3所述基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法，其特征在于：所述基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法中还满足下述要求之一或其组合：
所述微芯片的细胞培养室中接种的细胞为小鼠胚胎成骨细胞前体细胞MC3T3-E1；细胞密度为5×104cells/mL～5×107cells/mL；
所述芯片的细胞培养室中接种细胞，细胞铺满培养区域底面后，在药物进样区加入药物刺激，细胞培养周期结束，固定细胞，荧光染色；
所述微流控芯片细胞培养3～7d，采用多聚甲醛固定，多聚甲醛浓度为0.01～0.08g/mL；
所选用的药物为纳米羟基磷灰石，药物的浓度范围为0～0.1g/mL。
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