CN102517207B - 基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片装置及加工工艺 - Google Patents

Abstract

一种基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片装置，由细胞电融合芯片和流路控制层组成。细胞电融合芯片具有硅基底层，在硅基底层上有二氧化硅绝缘层，在二氧化硅绝缘层上有顶层低阻硅层，在顶层低阻硅层中有微通道，微通道以二氧化硅绝缘层为底，微通道的两侧相对为齿状侧壁微电极，在相邻的齿状侧壁微电极之间采用绝缘隔离结构隔离低阻硅与齿状侧壁微电极，被隔离的低阻硅的端面与齿状侧壁微电极的端面齐平，使微通道为光滑的通道。本芯片既保证了齿状微电极阵列在微通道内部形成非均匀电场，又形成光滑的直线型微通道侧壁，可避免传统的齿状微电极结构带来的细胞堵塞问题。

Description

基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片装置及加工工艺

技术领域

本发明涉及一种基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片装置及其加工工艺，其主要使用范围为动物、植物、微生物细胞的融合细胞制备，同时也可应用于电穿孔、电转染等研究中，可广泛应用于遗传学、动植物远缘杂交育种、发育生物学、药物筛选、单克隆抗体制备、哺乳动物克隆等领域。

背景技术

细胞电融合技术自上世纪80年代起，因为其效率较高、操作简便、对细胞无毒害，便于观察，适于仪器应用和规范操作等优点，得到了快速发展和广泛应用（参见4326934, April 27, 1982, Pohl; 441972, April 10, 1982, Pohl; 4578168, March 25, 1986, Hofman; 4695547, Sep 22, 1987, Hillard; 4699881, Oct 13, 1987, Matschke, et al.;）。

细胞电融合可以分为两个主要阶段：细胞排队和细胞融合。

细胞排队的原理在于：生物细胞处于非均匀电场中时，被电场极化形成偶极子，该偶极子在非均匀电场作用中会受到特定的力而发生运动，即介电电泳（dielectrophoresis）。利用介电电泳可以控制细胞的运动，在细胞电融合过程中，利用介电电泳现象使细胞排列成串，压紧相互接触的细胞，完成细胞电融合过程所需的排队和融合后压紧。

细胞融合的原理在于：强电场作用会导致细胞膜穿孔，这种效应称为细胞膜电致穿孔效应（electroporation）。在细胞电融合过程中利用电致穿孔效应，使两接触的细胞膜穿孔，从而使细胞间进行膜内物质交换，使细胞质、膜融合，在一定强度的电场作用下的电穿孔是一种可逆穿孔，细胞膜会在减小或撤销电场强度时回复原状，产生细胞电融合过程的膜融合。

传统的细胞电融合系统通常都采用大型融合槽，其优点在于：（1）操作较为简便，采用大型融合槽降低了包括样品进样与出样等步骤的难度；（2）加工简便，大型融合槽的尺寸一般都在厘米量级，利用传统的机械加工手段可以较为方便地加工出所需要的融合槽结构；（3）融合量大，传统的融合槽可以容纳数毫升样品，一次实验即可获得足够的细胞进行后期筛选、培养等工作。

但传统的细胞电融合设备也存在一些缺点：（1）由于融合槽中的电极间距较大，要达到够强度的细胞排队、融合及压紧信号，需要很高的外界驱动电压，往往高达几百上千伏，对系统的电气安全性要求高，系统的成本也因此大为提高；（2）电极间的较大间距不利于对细胞的精确控制等。

为解决这一问题，研究者将细胞电融合技术与MEMS加工技术相结合。MEMS技术的加工范围通常在1 ~ 50μm，这与细胞的直径范围相当，所产生的微结构能有效控制细胞。有多家研究机构开始研究利用微流控芯片技术或者微电极阵列技术构建生物芯片来实现细胞电融合操作。

例如，美国MIT的研究人员提出了利用微流控芯片技术实现对细胞的精确控制，达到高效的细胞配对和融合（参见J. Voldman, A.M. Skelley, O. Kirak, H. Suh, R. Jaenisch, Microfluidic control of cell pairing and fusion, Nat Methods, 2009）；国内赵志强等研究人员也提出了利用MEMS技术构建微电极阵列（参见中国专利200610054121.x），通过构建微米量级间距的微电极阵列，实现在低电压条件下的细胞电融合。日本研究者提出的利用一对微电极，通过流路控制细胞的流动，使细胞运动到微电极对位置区域后，利用电场作用使两个细胞形成配对，再借助于电脉冲实现电融合（参见Daniel T Chiu，A microfluidics platform for cell fusion，Current Opinion In Biotechnology，2001）。

但上述芯片仍然存在一定的问题，如梁伟等人提出的金属丝微电极阵列，其间距依然较大，电压要求依然较高，同时，金属丝的直径较大不利于形成微电场细胞细胞配对与融合控制（参见CN86210174，辽宁肿瘤研究所，梁伟）；如美国MIT所研究的微流控芯片虽然较好的解决了细胞配对的问题，但该芯片两电极间的间距较大，仍然需要较高的外界电压才能够实现电融合。而赵志强提出的芯片所集成的微电极数量较少，不能实现高通量融合；微电极所产生的电场强度和电场梯度也比较弱，难以实现细胞的精确控制；所选择的加工材料的抗腐蚀、抗氧化能力也较差；同时，由于未集成进出样装置，操作也较为不便（参见中国专利200610054121.x）。日本研究者提出利用微孔的方式实现两个通道的分隔，进而实现不同细胞的独立进样完成细胞配对，但该方法对微孔的定位要求很高，无法进行大规模应用，同时，该方法依然采用距离较大的平板电极实现电融合，工作电压高（M. Gel, Y. Kimura, O. Kurosawa, H. Oana, H. Kotera, M. Washizu, Dielectrophoretic cell trapping and parallel one-to-one fusion based on field constriction created by a micro-orifice array, Biomicrofluidics, 2010）。

重庆大学胡宁等研究人员在上述芯片的基础上也提出了包括三维微电极阵列（参见中国专利200710092892.2），解决了一些问题，但仍存在进一步改进之处。该课题组提出的基于微小室阵列结构的细胞电融合芯片装置的细胞配对是基于一个随机原理进行的细胞配对与融合，虽然能够达到两个细胞配对的目地，但仍然无法精确实现AB细胞的配对与融合（参见中国专利200910191052.0）。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提出基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片装置及其加工工艺，芯片通过在顶层低阻硅层上通过刻蚀硅、氧化形成二氧化硅和填充多晶硅形成绝缘隔离结构，通过干法刻蚀形成离散式侧壁微电极阵列，离散式侧壁微电极阵列和绝缘隔离结构共同形成微通道的侧壁，这样既保证了齿状微电极阵列在微通道内部形成非均匀电场，又形成了光滑的直线型微通道侧壁，避免了传统的齿状微电极结构带来的细胞堵塞问题

本发明的技术方案如下：

一种基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片装置，它由基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片和流路控制层组成。

所述基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片具有硅基底层，在硅基底层上有二氧化硅绝缘层，在二氧化硅绝缘层上有顶层低阻硅层，在顶层低阻硅层中形成有微通道，微通道以二氧化硅绝缘层为底，微通道的两侧相对形成有齿状的侧壁微电极，在相邻的侧壁微电极之间采用绝缘隔离结构隔离低阻硅与侧壁微电极，被隔离的低阻硅的端面与齿状侧壁微电极的端面齐平，使微通道为光滑的通道；所述顶层低阻硅层上有铝引线层，与侧壁微电极接通，在整个顶层低阻硅层上覆盖有二氧化硅钝化层，并留出部分铝引线层作为与外界电信号电气连接的键合区。

所述绝缘隔离结构是在低阻硅与侧壁微电极之间刻蚀深至二氧化硅绝缘层的U型深槽，并在深槽的侧壁上形成一层二氧化硅绝缘层，并用多晶硅填充深槽的其余部分。

所述流路控制层由PDMS盖片和导管组成， PDMS盖片盖在细胞电融合芯片上，PDMS盖片上有出样口和进样口，对应于细胞电融合芯片的微通道的两端，连通微通道，导管装于出样口和进样口上。

所述硅基底层的厚度为300~450 μm，二氧化硅绝缘层的厚度为0.5~2 μm，顶层硅层的厚度在40~50 μm，所述铝引线层为0.5~2μm厚的金属铝，二氧化硅钝化层厚度为1~2 μm厚。

所述顶层硅层的电导率为7~9Ω/cm。

所述PDMS盖片的厚度在0.5~2mm，出样口和进样口的直径为0.3~0.5mm。 

以上基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片装置的加工工艺包括以下步骤：

（1）细胞电融合芯片的加工：

A.      选取SOI晶圆；

B.       清洗；

C.       对顶层低阻硅层进行离子注入，使其电导率降到7-9Ω/m的水平；

D.      干法刻蚀顶层低阻硅层，形成绝缘隔离结构所需的深槽；

E.       在深槽的侧壁上高温氧化形成二氧化硅绝缘层；

F.        将多晶硅填充于深槽中，在微电极与低阻硅之间形成绝缘隔离结构；

G.      对顶层平整化去除多余的多晶硅，并形成平整的上表面；

H.      在上表面上溅射铝；

I.         光刻形成铝引线层；

J.         等离子气象沉积PECVD在铝引线层表面形成二氧化硅钝化层；

K.      干法刻蚀二氧化硅去除微通道及键合区表面的二氧化硅钝化层；

L.         干法刻蚀顶层低阻硅层形成微通道及离散式侧壁微电极阵列；

（2）流路控制盖片的加工通过倒模工艺实现，材料选用PDMS：

完成上述加工后，将细胞电融合芯片和顶层流路控制层通过键合实现密闭，形成一密闭腔体，仅通过进样口和出样口进行细胞悬浮液的进出样。

本发明提出的基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片装置，通过在SOI结构的顶层低阻硅层通过干法刻蚀形成隔离槽，结合氧化生成SiO₂绝缘层，再通过多晶硅填槽，进而形成各个隔离区，各个隔离区和最终刻蚀形成的微通道共同形成了离散式侧壁微电极阵列。这样既保证了微电极阵列依然为齿状突出结构，进而可在微通道内部形成非均匀的电场，实现细胞高效排队控制和高效融合；还能保证微通道为一连续光滑的面，进而保证芯片具有良好的流动特性，进行实现了细胞在微通道内部的自由流动。

本发明具有如下优点：

本装置保留了原有的齿状微电极阵列电极间距小，可在低电压条件下形成高强度电场进而实现电融合的效果；同时，齿状离散式侧壁微电极阵列结构可在微通道内部形成非均匀电场，其独特的电场分布可实现高效细胞排队和细胞融合；同时通过将离散式侧壁微电极之间的凹槽用多晶硅填充并隔离，形成光滑的流路通道，有利于细胞在微通道内部的流动，降低传统的齿状微电极阵列结构易使细胞堵塞的可能；同时，铝引线层保证了芯片具有良好的电气导通性能；二氧化硅钝化层和芯片材料保证了芯片具有良好的生物相容性及抗腐蚀性能，这即保证了芯片的可靠性，也提高了细胞融合的安全性。同时，芯片内部集成了大量的离散式侧壁微电极阵列，可实现大量细胞的同时融合，融合效率高；自动进样和自动出样减小对融合后细胞的物理损伤，提高其存活能力。

附图说明

图1  基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片装置总体示意图；

图2  基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片装置两主要功能模块示意图；

图3  基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片组装示意图；

图4  基于离散式侧壁微电极结构示意图。

具体实施方式

参见图1至图4，基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片装置由基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片1和流路控制层2组成。

基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片1自下而上依次有硅基底层4、二氧化硅绝缘层5、顶层低阻硅层6（包括离散式侧壁微电极阵列、绝缘隔离结构和微通道）、铝引线层9、二氧化硅钝化层10。

硅基底层4选用直径为3~4                                               

的SOI晶圆，硅基底层的功能在于提供机械支撑层，厚度为300~450μm。

二氧化硅绝缘层5的厚度为0.5~2 μm，其功能在于提供良好的电气绝缘性能。

顶层低阻硅层6的厚度应在40~50 μm，以保证各类细胞均能在微通道内部有足够的空间流动，顶层低阻硅层同时还兼具微电极基体的作用，因此需要进行离子注入处理以提高其电导率，其电导率最小应降至7~9Ω/cm的水平。

通过使用干法刻蚀工艺在顶层低阻硅层6刻蚀形成深至SiO₂绝缘层5的宽度为2~3μm深槽，再结合氧化工艺在深槽表面形成一层厚度为0.2~1μm的SiO₂绝缘层16、19，由于这个绝缘层的厚度不足以把这个深槽填满，所以需要使用多晶硅填充深槽的其余部分，这样能够为深槽提供良好的机械支撑，深槽也不会因为中间有一些空隙进而在使用过程中塌陷。因此，随后再使用多晶硅17、20填充SiO₂绝缘层16、19，再借助表面平整化工艺去除多余的多晶硅17、20，进而形成所需要的绝缘隔离结构，绝缘隔离结构与微通道之间的低阻硅18因被二氧化硅、多晶硅与离散式侧壁微电极阵列隔离，因此在通电工作时无电压，不会在此区域形成梯度电场。绝缘隔离结构的主要功能在于在两个相邻的齿状离散式侧壁微电极15之间形成隔离，并填充两个齿状离散式侧壁微电极15之间的凹陷区，进而在保证传统的单纯齿状微电极阵列形成非均匀电场的情况下，获得一个光滑的微通道8。

实际上在加工时，是先刻蚀形成一个深槽，然后再进行氧化，在深槽侧壁上形成一层二氧化硅氧化层，但是二氧化硅氧化层的厚度不够，于是还需要用多晶硅进行回填，回填后形成的仅仅是绝缘隔离结构，而两个电极之间凹陷区本身就有硅存在，只是被绝缘隔离结构包着（水平方向上），在最后刻蚀微通道的时候，电极、绝缘隔离结构、低阻硅区域不刻蚀，仅仅刻蚀微通道位置的硅，这样，电极、缘隔离结构、低阻硅区域的硅就得到了保留，就形成了上述的电极、隔离硅结构和低阻硅结构 。需要注意的是：两个电极之间的低阻硅本身就存在，只是用最后一步刻蚀，用绝缘槽、微通道将其与微电极之间彻底绝缘隔离而已。

离散式侧壁微电极阵列的形状依然采用两相对的梳状结构，其基体材料为低阻硅，厚度为40~50μm；同一离散式侧壁微电极阵列上两相邻微电极15间的间距为60 μm，离散式侧壁微电极15的长度、宽度均为20 μm；离散式侧壁微电极阵列的宽度和长度可随芯片集成微电极15的数目进行调整；SiO₂绝缘层16、19的宽度为2~3 μm，SiO₂绝缘层的厚度为0.2~1 μm，SiO₂绝缘层16、19的深度与低阻硅层6相同，为40~50μm，填充的多晶硅17、20深度为低阻硅层6厚度减去SiO₂绝缘层的厚度；多余的多晶硅17、20通过平整化工艺去除；随后在低阻硅层6表面溅射一层厚度为0.5~2μm厚的金属铝，并通过光刻形成铝引线层9。但是由于铝是活性金属，实验中加载缓冲液，在通电的情况下会发生电化学反应，故需要在铝引线层上做一层钝化层保护铝引线，因此进一步在铝引线层9的表面通过PECVD工艺形成了一层厚度为2~3μm的二氧化硅钝化层10，以保护铝引线层9在通电工作条件下不被腐蚀。二氧化硅钝化层10和铝引线层9之间形成的窗为外围信号的键合/连接区3，可采用键合工艺或者直接选用夹具连接，进而形成外围电信号和芯片的电气连接，进而引入电信号；最后通过干法刻蚀工艺在低阻硅层6上刻蚀形成微通道8和储样池7。

流路控制层2由PDMS盖片11和导管14组成，PDMS盖片11上集成了进样口12和出样口13，进样口和出样口的直径为0.3~0.5mm，导管14的外径与进样口/出样口一致。

基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片装置由基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片1和顶层流路控制层2通过键合实现密闭，形成一密闭腔体，仅通过进样口12和出样口13进行细胞悬浮液的进出样。

在实验中，可使用微量泵将细胞悬浮液从进样口12注入芯片内部，但细胞悬浮液流经微通道8时，经键合/连接区3加载正弦波电刺激信号，相对的离散式侧壁微电极15间将形成一非均匀梯度电场，离散式侧壁微电极15间的两个细胞将在介电电泳力作用下进行细胞排队；完成排队后，施加方波脉冲序列信号，完成排队的细胞对将在离散式侧壁微电极15间高强度的脉冲电场作用下完成细胞电穿孔-细胞电融合等过程。完成细胞电融合过程后，再结合流路控制层2，利用微量泵注入细胞培养液，将微通道内的细胞经微通道8，储样孔7、出样口13及导管14流出，获得细胞缓冲液可利用培养皿进行收集，进行后期的培养。随后，再次使用微量泵注入细胞悬浮液，再次进行上述的电融合过程。

基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片，其加工工艺流程为：

细胞电融合芯片的加工：

1、选取SOI晶圆；

2、清洗；

3、顶层硅经离子注入后，电导率降到7-9Ω/m的水平；

4、干法刻蚀顶层低阻硅形成深槽；

5、高温氧化形成二氧化硅绝缘层；

6、多晶硅填充深槽形成隔离槽；

7、顶层平整化去除多余的多晶硅，并形成平整的表面；

8、溅射铝；

9、光刻形成铝引线层；

10、PECVD在铝引线层表面形成二氧化硅钝化层；

11、干法刻蚀二氧化硅去除微通道及键合区表面的二氧化硅钝化层；

12、干法刻蚀低阻硅层形成微通道及离散式侧壁微电极阵列， 

PDMS盖片的加工步骤如下：

A.    利用印刷电路板制作工艺，模具结构为细胞悬浮液进样口和出样口；

B.     将模具固定于一培养皿上；

C.     倒入混合好的PDMS混合胶，静止后抽真空；

D.    置于加热台上75℃固化；

E.     揭下固化后PDMS，根据底层结构形状剪裁，并去除进样口、出样口的胶即可。

完成上述加工后，基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片装置由基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片和顶层流路控制层通过键合实现密闭，形成一密闭腔体，仅通过进样口和出样口进行细胞悬浮液的进出样。

Claims (5)

1.一种基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片装置，其特征在于：它由基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片和流路控制层组成；

所述基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片具有硅基底层，在硅基底层上有二氧化硅绝缘层，在二氧化硅绝缘层上有顶层低阻硅层，在顶层低阻硅层中有微通道，微通道以二氧化硅绝缘层为底，微通道的两侧相对为齿状侧壁微电极，在相邻的齿状侧壁微电极之间采用绝缘隔离结构隔离低阻硅与齿状侧壁微电极，被隔离的低阻硅的端面与齿状侧壁微电极的端面齐平，使微通道为光滑的通道；所述顶层低阻硅层上有铝引线层，与侧壁微电极接通，在整个顶层低阻硅层上覆盖有二氧化硅钝化层，并留出部分铝引线层作为与外界电信号电气连接的键合区；

所述绝缘隔离结构是在低阻硅与侧壁微电极之间刻蚀深至二氧化硅绝缘层的U型深槽，并在深槽的侧壁上形成一层二氧化硅绝缘层，并用多晶硅填充深槽的其余部分；

所述流路控制层由PDMS盖片和导管组成， PDMS盖片盖在细胞电融合芯片上，PDMS盖片上有出样口和进样口，对应于细胞电融合芯片的微通道的两端，连通微通道，导管装于出样口和进样口上。

2.根据权利要求1所述的基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片装置，其特征在于：所述硅基底层的厚度为300~450μm，二氧化硅绝缘层的厚度为0.5~2 μm，顶层低阻硅层的厚度在40~50 μm，所述铝引线层为0.5~2μm厚的金属铝，二氧化硅钝化层厚度为1~2μm厚。

3.根据权利要求1或2所述的基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片装置，其特征在于：所述顶层低阻硅层的电导率为7~9Ω/cm。

4.根据权利要求1或2所述的基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片装置，其特征在于：所述PDMS盖片的厚度在0.5~2mm，出样口和进样口的直径为0.3~0.5mm。

5. 权利要求1所述的基于离散式侧壁微电极阵列的细胞电融合芯片装置的加工工艺，其特征在于包括以下步骤：

（1）细胞电融合芯片的加工：

选取SOI晶圆；

清洗；

对顶层低阻硅层进行离子注入，使其电导率降到7-9Ω/cm的水平；

干法刻蚀顶层低阻硅层，形成U型深槽；

在深槽的侧壁上高温氧化形成二氧化硅绝缘层；

将多晶硅填充于深槽中，在微电极与低阻硅之间形成绝缘隔离结构；

对顶层平整化去除多余的多晶硅，并形成平整的上表面；

在上表面溅射铝；

光刻形成铝引线层；

用等离子气相沉积在铝引线层表面形成二氧化硅钝化层；

干法刻蚀二氧化硅去除微通道及键合区表面的二氧化硅钝化层；

干法刻蚀顶层低阻硅层形成微通道及离散式侧壁微电极阵列；

（2）流路控制盖片的加工通过倒模工艺实现，材料选用PDMS：

完成上述加工后，将细胞电融合芯片和顶层流路控制层通过键合实现密闭，形成一密闭腔体，仅通过进样口和出样口进行细胞悬浮液的进出样。

 

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