CN103084230B - 一种集成软弹性细胞电化学传感器的微流控芯片及其制法和在细胞动态分析中的应用 - Google Patents
一种集成软弹性细胞电化学传感器的微流控芯片及其制法和在细胞动态分析中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103084230B CN103084230B CN201310060501.4A CN201310060501A CN103084230B CN 103084230 B CN103084230 B CN 103084230B CN 201310060501 A CN201310060501 A CN 201310060501A CN 103084230 B CN103084230 B CN 103084230B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- pdms
- liquid
- microcavity
- groove
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title description 9
- 239000004205 dimethyl polysiloxane Substances 0.000 claims abstract description 91
- 229920000435 poly(dimethylsiloxane) Polymers 0.000 claims abstract description 91
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims abstract description 42
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims abstract description 42
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 31
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 7
- 235000013870 dimethyl polysiloxane Nutrition 0.000 claims description 82
- CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N octamethyltrisiloxane Chemical compound C[Si](C)(C)O[Si](C)(C)O[Si](C)(C)C CXQXSVUQTKDNFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 82
- 238000004987 plasma desorption mass spectroscopy Methods 0.000 claims description 82
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 65
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 24
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 17
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 claims description 16
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 13
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims description 13
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 12
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 claims description 12
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 9
- 238000000840 electrochemical analysis Methods 0.000 claims description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 238000009795 derivation Methods 0.000 claims description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 5
- 238000009413 insulation Methods 0.000 claims description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000005234 chemical deposition Methods 0.000 claims description 4
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 claims description 3
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 claims description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims description 3
- 238000006392 deoxygenation reaction Methods 0.000 claims description 3
- 230000005484 gravity Effects 0.000 claims description 3
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 claims description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229920000260 silastic Polymers 0.000 claims description 3
- 230000003068 static effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 claims description 2
- -1 Polydimethylsiloxane Polymers 0.000 abstract description 3
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 abstract description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 abstract description 2
- 238000007599 discharging Methods 0.000 abstract 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000004832 voltammetry Methods 0.000 description 5
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 230000005518 electrochemistry Effects 0.000 description 3
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 3
- FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N benzyl N-[2-hydroxy-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]carbamate Chemical compound OC1=C(NC(=O)OCC2=CC=CC=C2)C=CC(=C1)N1CCOCC1=O FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 2
- 230000029052 metamorphosis Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002484 cyclic voltammetry Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000001903 differential pulse voltammetry Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000005183 dynamical system Methods 0.000 description 1
- 239000007772 electrode material Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- YAGKRVSRTSUGEY-UHFFFAOYSA-N ferricyanide Chemical compound [Fe+3].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] YAGKRVSRTSUGEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000010408 sweeping Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
一种集成软弹性细胞电化学传感器的微流控芯片，它由三层PDMS薄片组成：具有集成有微流管道和细胞培养微腔的PDMS中间层；具有金膜工作电极的PDMS底层和具有金膜辅助电极和银参比电极的PDMS上层，PDMS中间层上有液体引入流路凹槽1，在液体引入流路凹槽1的末端连接一个圆形细胞培养微腔凹槽3，微腔凹槽3的下游有液体导出流路凹槽4，在导出流路凹槽4的上游端靠近微腔凹槽3边缘有圆形通孔5，圆形通孔用于芯片内流体与上层的辅助电极和参比电极接触，PDMS中间层与PDMS底层镀有金膜7的一面封合，如此构成液体引入流路、细胞培养微腔和液体导出流路，三层PDMS封合构成集成软弹性细胞电化学传感器的微流控芯片。本发明公开了其制法。
Description
技术领域
本发明涉及集成软弹性细胞电化学传感器的微流控芯片及其制法和在细胞动态分析中的应用。
背景技术
发展原位、快速的分析新方法一直是分析化学界的重大挑战。尤其在细胞生物学领域，随着分析样品的复杂性、多样性，对这些分析方法提出了更高的要求。细胞作为生命活动的基本单位，其行为的发展变化对疾病的发生、发展都具有重要意义。一个活细胞可以被描述为一个在细胞界面上电子生成和迁移的电化学动态系统。近年来，一系列用于细胞传感的电化学方法发展起来（参见：(a) Zhang, J. J.; Zheng, T. T.; Cheng, F. F.; Zhang, J. R.; Zhu, J. J. Anal.
Chem. 2011, 83, 7902. (b) Min, K.; Jo, H.; Song, K.; Cho, M.; Chun, Y. S.; Jon,
S.; Kim, W. J.; Ban, C. Biomaterials 2011, 32, 2124. (c) Takahashi, Y.;
Miyamoto, T.; Shiku, H.; Asano, R.; Yasukawa, T.; Kumagai, I.; Matsue, T. Anal. Chem. 2009, 81, 2785. (d)
Chang, B.-Y.; Park, S.-M. Annu. Rev. Anal. Chem.
2010, 3, 207. (e) Wang, W.; Foley, K.; Shan, X.; Wang, S.; Eaton, S.; Nagaraj, V. J.; Wiktor, P.;
Patel, U.; Tao, N. Nature Chem. 2011, 3, 249.）。在诸多分析方法中，基于细胞芯片的电化学方法以其简单、快速且具有高灵敏性和无损性而发展迅速（参见：(f) Wang, L.; Yin, H.;
Xing, W.; Yu, Z.; Guo, M.; Cheng, J. Biosens. Bioelectron. 2010, 25,
990. (g) Lee, J. H.; Oh, B. K.; Choi, B.; Jeong, S.; Choi, J. W. Biochip J.
2010, 4, 1. (h) El-Said, W. A.; Yea, C. H.; Kim, H.; Oh, B. K.; Choi, J.-W. Biosens. Bioelectron. 2009, 24, 1259. (i)
El-Said, W. A.; Kim, T.-H.; Kim, H.; Choi, J.-W. Biosens. Bioelectron. 2010, 26,
1486. (j) Kafi, M. A.; Kim, T. H.; An, J. H.; Choi, J. W. Anal. Chem. 2011, 83, 2104.）。但培养腔室内试剂的不充分移除对准确分析造成了一定的困难，且基于硅基底的金电极的加工过程需要昂贵的仪器设备从而限制了该装置在普通实验室的使用。微流控芯片以其操作便捷、试剂耗样量少、便于各功能单元的集成等诸多优点而受到人们的广泛青睐(参见：(k) Cao, J. T.; Hao, X. Y.; Zhu, Y. D.; Sun, K.; Zhu, J. J. Anal. Chem.
2012, 84, 6775. (l) Li, L.-M.; Wang, W.; Zhang, S.-H.; Chen, S.-J.; Guo, S.-S.; Français, O.; Cheng,
J.-K.; Huang, W.-H. Anal. Chem. 2011, 83, 9524.)。虽然目前已有将软弹性电极材料集成于微流控芯片平台上的研究（参见：Sameenoi, Y.; Mensack,
M. M.; Boonsong, K.; Ewing, R.; Dungchai,
W.; Chailapakul, O.; Cropek,
D. M.; Henry, C. S. Analyst 2011, 136, 3177-3184.），但至今尚未有基于PDMS-金/银软弹性细胞电化学传感器集成在微流控芯片平台上并进行细胞动态行为分析的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种集成软弹性细胞电化学传感器的微流控芯片及其制法和在细胞动态分析中的应用
具体而言，本发明以PDMS为芯片材料和软弹性电化学传感器基底材料，提供了一种集成软弹性细胞电化学传感器的微流控芯片及其在细胞动态分析中的应用。
本发明的技术方案如下：
一种集成软弹性细胞电化学传感器的微流控芯片，如图1所示，它由三层PDMS薄片组成：具有集成有微流管道和细胞培养微腔的PDMS中间层；具有金膜工作电极的PDMS底层和具有金膜辅助电极和银参比电极的PDMS上层，集成有微流管道和细胞培养微腔的PDMS中间层有如下结构：它是一片厚1±0.1mm的PDMS薄片，PDMS薄片上有一条液体引入流路凹槽1，在液体引入流路凹槽的上游端有一个穿透PDMS薄片的、由硅橡胶材料制作的、与液体引入流路凹槽连通的圆形小管2，圆形小管用于试剂或细胞的输入，在液体引入流路凹槽1的下游末端连接一个圆形细胞培养微腔凹槽3，细胞培养微腔凹槽3的下游连接一条液体导出流路凹槽4，在液体导出流路凹槽4的上游端距细胞培养微腔凹槽3边缘1±0.5mm处有一个圆形通孔5，圆形通孔用于芯片内流体与上层的辅助电极和参比电极接触，液体导出流路凹槽4的下游端连接圆形通孔液体出口6；具有金膜工作电极的PDMS底层是一片镀有一条金膜7的PDMS薄片，金膜7的宽度应大于圆形细胞培养微腔凹槽3的直径，金膜的长度方向垂直于液体引入流路凹槽1的长度方向，PDMS中间层的集成有微流管道和细胞培养微腔的一面向下，与PDMS底层镀有金膜7的一面封合，如此构成液体引入流路、细胞培养微腔和液体导出流路；具有金膜辅助电极和银参比电极的PDMS上层是一片镀有金膜辅助电极8和银参比电极9的PDMS薄片，金膜辅助电极8与银参比电极9平行且相距0.5±0.03mm，以保证两者之间电绝缘又能同时与圆形通孔5下的芯片内流体接触，金膜辅助电极8与银参比电极9的长度方向垂直于液体引入流路凹槽1的长度方向，三层PDMS薄片封合构成集成软弹性细胞电化学传感器的微流控芯片。
上述的微流控芯片，所述的液体引入流路凹槽1优选的是长15±0.2mm、宽0.3±0.05mm和深60±5μm的凹槽。
上述的微流控芯片，所述的圆形细胞培养微腔凹槽3优选的是直径为3±0.5mm和深60±5μm的凹槽。
上述的微流控芯片，所述的液体导出流路凹槽4优选的是长10±0.2mm，宽0.15±0.05mm和深60±5μm的凹槽。
上述的微流控芯片，所述的圆形通孔5优选的是直径为3±0.5mm的圆形小孔。
上述的微流控芯片，所述的金膜工作电极7优选的是长20±2mm、宽4±0.5mm的金膜；金膜辅助电极8优选的是长20±2mm、宽2±0.2mm的金膜；银膜参比电极9优选的是长20±2mm、宽2±0.2mm的银膜。
一种制备上述的集成软弹性细胞电化学传感器的微流控芯片的方法，它包括下列步骤：
步骤1. 如图1a所示，在一片厚1±0.1mm的PDMS薄片上制作一条液体引入流路凹槽1、圆形细胞培养微腔凹槽3、液体导出流路凹槽4和液体出口，在液体导出流路凹槽4的上游端距细胞培养微腔凹槽3边缘1±0.5mm处开一个圆形通孔5，在液体导出流路凹槽4上游顶端插入连接一圆形小管2，圆形小管2与液体导出流路凹槽4连通，制得集成有微流管道和细胞培养微腔的PDMS中间层，备用；
步骤2. 如图1b所示，在一片PDMS薄片上通过化学沉积方法制作一条金膜条带为金膜工作电极7，金膜的宽度不小于圆形细胞培养微腔凹槽3的直径，金膜工作电极7的长度方向垂直于PDMS薄片的长度方向，制得具有金膜工作电极的PDMS底层，备用；
步骤3. 如图1c所示，在一片PDMS薄片上通过化学沉积方法制作一条金膜条带为金膜辅助电极8和用银胶制作一条银膜条带为银膜参比电极9，金膜辅助电极8和银膜参比电极9互相平行，相距0.5±0.03mm，以保证两者之间电绝缘又能同时两电极部分被圆形通孔5覆盖，制得具有金膜辅助电极和银参比电极的PDMS上层，备用；
步骤4. 首先将步骤2制得的具有金膜工作电极的PDMS底层和步骤1制得的具有集成有微流管道和细胞培养微腔的PDMS中间层通过氧等离子体清洗器处理1 min后将两芯片不可逆封合，封合时将细胞培养微腔凹槽3处于金膜工作电极7的正上方，并形成液体引入流路、细胞培养微腔和液体导出流路，然后通过超薄防水双面胶将步骤3制得的具有金膜辅助电极和银参比电极的PDMS上层与集成有微流管道和细胞培养微腔的PDMS中间层封合，PDMS上层的金膜辅助电极8和银膜参比电极9与PDMS中间层的圆形通孔5对正，使圆形通孔5部分覆盖金膜辅助电极8和银膜参比电极9，即制得所述的集成软弹性细胞电化学传感器的微流控芯片。
本发明的PDMS-金膜工作电极通过扫描电化学显微镜表征，表明PDMS-金膜表面由金颗粒致密地排布而成，均匀的膜表面为的电化学分析提供了良好的电极表面环境（见图2A）。
本发明的微流控芯片通过在0.5 M H2SO4溶液中的循环伏安行为表征，表明该PDMS-金膜电极具有与传统金电极一致的电化学行为特征（见图2B）。
本发明的微流控芯片通过在铁氰化钾混合溶液中不同扫速下的循环伏安行为表征，表明该体系当中电子传递是一个受扩散控制的过程，与传统三电极体系一致（见图2C和D）。
本发明的微流控芯片对受测试的细胞行为可以通过电化学的示差脉冲伏安法进行检测。
本发明的微流控芯片可以对受测细胞通过电化学信号和光学观察对细胞增殖和凋亡过程进行监测。
本发明的微流控芯片对受测细胞通过电化学信号和光学观察对细胞增殖和凋亡过程进行监测的步骤如下：
步骤1. 将1 × 105 ~1 × 106 cells mL-1细胞悬液通过集成软弹性细胞电化学传感器的输入试剂或细胞的圆形小管2利用重力作用引入到细胞培养微腔内；
步骤2. 通过平衡出入口液面高度使液流保持静止6 h，让细胞贴壁生长；
步骤3. 将0.01 M， pH 7.4 的PBS（用氮气除氧30min）引入培养微腔对细胞进行冲洗后，在形同PBS溶液中进行细胞增殖电化学测试，并通过光学显微镜对细胞形态进行观察并用CCD拍摄；
步骤4. 电化学测试完成后，将培养基引入细胞培养微腔，在不同细胞培养时间点（6 - 48 h）按步骤3对细胞增殖行为过程进行电化学监测和光学拍摄；
步骤5. 在步骤4完成细胞增殖检测后，将含有50~150 µΜ 抗肿瘤药物依托泊苷的培养基引入细胞培养微腔，在不同细胞培养时间点（4 ~ 48 h）按步骤3对细胞凋亡行为过程进行电化学监测和光学拍摄。
采用本发明的微流控芯片对受测细胞通过电化学信号和光学观察对细胞增殖和凋亡过程进行监测的结果表明本发明的微流控芯片可以灵敏监测细胞增殖和凋亡过程。
附图说明
图1为本发明的微流控芯片结构示意图，图1a为集成有微流管道和细胞培养微腔的PDMS中间层；图1b为具有金膜工作电极的PDMS下层；图1c为具有金膜辅助电极和银参比电极的PDMS上层，其中：1为液体引入流路凹槽；2为圆形小管；3为细胞培养微腔凹槽；4为液体导出流路凹槽；5为圆形通孔；6为液体出口；7为金膜工作电极；8为金膜辅助电极；9为银膜参比电极。
图2 为本发明微流控芯片的表征图。PDMS-金膜的SEM图（图A）；PDMS-金膜在0.5 M H2SO4
溶液中的循环伏安行为（图B）；微流控芯片电化学传感器在铁氰化钾混合溶液中不同扫速下的循环伏安行为（图C）；扫速与氧化还原峰电流的相互关系（图D），其中a, b分别为阳极峰电流和阴极峰电流变化与扫速的关系。
图3 为本发明对细胞增殖过程中细胞行为电化学和光学监测。图3A-C 分别为PDMS-金膜电极表面细胞在培养6，12，24小时过程中的形态， 图3D为在细胞增殖各时间点细胞的电化学响应。
图4为本发明对细胞凋亡过程中细胞行为电化学和光学监测。细胞在凋亡过程中的电化学信号变化（图4A和B），细胞在凋亡过程中的形态变化（图4C-F）。
具体实施方式
下面结合附图所示实施例进一步说明本发明的具体内容：
实施例1. 微流控芯片制备
本微流控芯片平台由三层PDMS组成，包括集成有微流管道和细胞培养微腔的PDMS中间层，具有金膜工作电极的PDMS底层和具有金膜辅助电极和银参比电极的PDMS上层。集成有微流管道和细胞培养微腔的PDMS中间层是一片厚1±0.1mm的PDMS薄片，其上有一条长15±0.2mm，宽0.3±0.05mm的液体引入流路凹槽1，在液体引入流路凹槽1的上游端有一个穿透PDMS薄片的、由硅橡胶材料制作的、与液体引入流路凹槽连通的内径为2±0.1mm的圆形小管2，圆形小管用于试剂或细胞的输入，在液体引入流路凹槽1的下游末端连接一个直径为3±0.5mm的圆形细胞培养微腔凹槽3，细胞培养微腔凹槽3的下游连接一条液体导出流路凹槽4，在液体导出流路凹槽4的上游端距细胞培养微腔凹槽3边缘1±0.5mm处有一个直径为3±0.5mm的圆形通孔5，圆形通孔用于芯片内流体与上层的辅助电极和参比电极接触，液体导出流路凹槽4的下游端连接圆形通孔液体出口6；具有金膜工作电极的PDMS底层是一片镀有一条长20±2mm，宽4±0.5 mm金膜7的PDMS薄片，金膜的长度方向垂直于液体引入流路凹槽1的长度方向，PDMS中间层的集成有微流管道和细胞培养微腔的一面向下，与PDMS底层镀有金膜7的一面封合，如此构成液体引入流路、细胞培养微腔和液体导出流路；具有金膜辅助电极和银参比电极的PDMS上层是一片镀有长20±2mm、宽2±0.2mm金膜辅助电极8和长20±2mm、宽2±0.2mm银参比电极9的PDMS薄片，金膜辅助电极8与银参比电极9平行且相距0.5±0.03mm，以保证两者之间电绝缘又能同时与圆形通孔5下的芯片内流体接触，金膜辅助电极8与银参比电极9的长度方向垂直于液体引入流路凹槽1的长度方向，三层PDMS薄片封合构成集成软弹性细胞电化学传感器的微流控芯片。
上述的PDMS-金膜的制备方法如下：将PDMS单体与固化剂以1 : 0.1的比列混合在90℃条件下固化20分钟即可得基片与盖片。化学镀金溶液：0.01 g mL-1
HAuCl4, 200 g L-1 KHCO3, and 2% (w/v) 葡萄糖 (v/v, 2:1:1)。 另外准备两块PDMS作为框架，其中一块其上有4±0.5 * 20±2 mm2 的面积为空洞， 另一块其上有2 ±2* 20±2 mm2 的面积为空洞，这两块框架被两片相同的PDMS膜夹心在中间，其内充满镀金溶液。将该三明治结构放入37℃的恒温箱中3小时使金被充分还原。所有制得的PDMS-金膜条带分别用于制备金膜工作电极和金膜辅助电极，金膜厚度300±20 nm。在距该金膜辅助电极边界0.5±0.03mm处，均匀涂一层宽2±0.2mm，长20±2mm银胶作为参比电极。
微流控芯片的封合：
首先将具有金膜工作电极的PDMS底层和集成有微流管道和细胞培养微腔的PDMS中间层通过氧等离子体清洗器处理1 min后将两芯片不可逆封合，细胞培养微腔处于金膜工作电极正上方。然后通过超薄防水双面胶将具有金膜辅助电极和银参比电极的PDMS上层与集成有微流管道和细胞培养微腔的PDMS中间层封合，上层PDMS芯片上的金膜和银工作电极与中间层小孔正对。
实施例3. 集成软弹性电化学细胞传感器的微流控芯片的表征
对所形成的PDMS-金膜进行扫描电化学显微镜表征，表明PDMS-金膜表面由金颗粒致密地排布而成，均匀的膜表面为的电化学分析提供了良好的电极表面环境（见图 2 A）。将0.5 M H2SO4
引入微流控芯片中，进行循环伏安扫描，结果表明该电化学传感器件具有和传统金电极体系一致的电化学行为特征（见图 2B）。将铁氰化钾混合溶液引入芯片体系，在不同扫速下记录该体系循环伏安行为（见图 2C）并通过图2C得到扫速与氧化还原峰电流的相互关系（见图 2D）。结果表明，在该体系内的电子传递过程是受扩散控制的过程，与传统三电极体系一致。
实施例4. 细胞增殖过程动态监测表征
将1 × 105 ~1 × 106 cells mL-1细胞悬液通过重力作用引入细胞培养腔，通过平衡出入口液面高度，使液流静止，将芯片放入37 ℃，5 % CO2孵育箱中，使细胞在金膜表明贴壁生长。在电化学监测时，将0.01 M， pH 7.4 的PBS（用氮气除氧30 min）引入培养微腔对细胞进行冲洗后，在该PBS溶液中进行细胞增殖电化学测试，并通过光学显微镜对细胞形态进行观察并用CCD拍摄。在不同细胞培养时间点（6~24 h），对细胞增殖行为过程进行电化学监测和光学拍摄。细胞在芯片上孵育6，12， 24 h时的电化学行为和形态变化表征结果见图3。
实施例5. 细胞凋亡过程动态监测表征
在对细胞增殖过程进行监测后，将含有50~150 µΜ 抗肿瘤药物依托泊苷的培养基引入细胞培养微腔诱导细胞凋亡。在诱导不同细胞培养时间点（4~36 h）对细胞凋亡行为过程进行电化学监测和光学拍摄，测定条件同实施例4. 表征结果见图4。
Claims (9)
1.一种集成软弹性细胞电化学传感器的微流控芯片，其特征是：它由三层PDMS薄片组成：具有集成有微流管道和细胞培养微腔的PDMS中间层；具有金膜工作电极的PDMS底层和具有金膜辅助电极和银参比电极的PDMS上层，集成有微流管道和细胞培养微腔的PDMS中间层有如下结构：它是一片厚1±0.1mm的PDMS薄片，PDMS薄片上有一条液体引入流路凹槽(1)，在液体引入流路凹槽的上游端有一个穿透PDMS薄片的、由硅橡胶材料制作的、与液体引入流路凹槽连通的圆形小管(2)，在液体引入流路凹槽(1)的下游末端连接一个圆形细胞培养微腔凹槽(3)，细胞培养微腔凹槽(3)的下游连接一条液体导出流路凹槽(4)，在液体导出流路凹槽(4)的上游端距细胞培养微腔凹槽(3)边缘1±0.5mm处有一个圆形通孔(5)，圆形通孔(5)用于芯片内流体与上层的辅助电极和参比电极接触，液体导出流路凹槽(4)的下游端连接圆形通孔液体出口(6)；具有金膜工作电极的PDMS底层是一片镀有一条金膜的PDMS薄片，金膜的宽度大于圆形细胞培养微腔凹槽(3)的直径，金膜的长度方向垂直于液体引入流路凹槽(1)的长度方向，PDMS中间层的集成有微流管道和细胞培养微腔的一面向下，与PDMS底层镀有金膜的一面封合，如此构成液体引入流路、细胞培养微腔和液体导出流路；具有金膜辅助电极和银参比电极的PDMS上层是一片镀有金膜辅助电极(8)和银膜参比电极(9)的PDMS薄片，金膜辅助电极(8)与银参比电极(9)平行且相距0.5±0.03mm，以保证两者之间电绝缘又能同时与圆形通孔(5)下的芯片内流体接触，金膜辅助电极(8)与银参比电极(9)的长度方向垂直于液体引入流路凹槽(1)的长度方向，三层PDMS薄片封合构成集成软弹性细胞电化学传感器的微流控芯片。
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征是：所述的液体引入流路凹槽(1)是长15±0.2mm、宽0.3±0.05mm和深60±5μm的凹槽。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征是：所述的圆形细胞培养微腔凹槽(3)是直径为3±0.5mm和深60±5μm的凹槽。
4.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征是：所述的液体导出流路凹槽(4)是长10±0.2mm，宽0.15±0.05mm和深60±5μm的凹槽。
5.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征是：所述的圆形通孔(5)是直径为3±0.5mm的圆形小孔。
6.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征是：所述的金膜工作电极(7)是长20±2mm、宽4±0.5mm的金膜；金膜辅助电极(8)是长20±2mm、宽2±0.2mm的金膜；银膜参比电极(9)是长20±2mm、宽2±0.2mm的银膜。
7.一种制备权利要求1所述的集成软弹性细胞电化学传感器的微流控芯片的方法，其特征是包括下列步骤：
步骤1.在一片厚1±0.1mm的PDMS薄片上制作一条液体引入流路凹槽(1)、圆形细胞培养微腔凹槽(3)、液体导出流路凹槽(4)和圆形通孔液体出口(6)，在液体导出流路凹槽(4)的上游端距细胞培养微腔凹槽(3)边缘1±0.5mm处开一个圆形通孔(5)，在液体导出流路凹槽(4)上游顶端插入连接一圆形小管(2)，圆形小管(2)与液体导出流路凹槽(4)连通，制得集成有微流管道和细胞培养微腔的PDMS中间层，备用；
步骤2.在一片PDMS薄片上通过化学沉积方法制作一条金膜条带为金膜工作电极(7)，金膜的宽度不小于圆形细胞培养微腔凹槽(3)的直径，金膜工作电极(7)的长度方向垂直于PDMS薄片的长度方向，制得具有金膜工作电极的PDMS底层，备用；步骤3.在一片PDMS薄片上通过化学沉积方法制作一条金膜条带为金膜辅助电极(8)和用银胶制作一条银膜条带为银膜参比电极(9)，金膜辅助电极(8)和银膜参比电极(9)互相平行，相距0.5±0.03mm，以保证两者之间电绝缘又能同时两电极部分被圆形通孔(5)覆盖，制得具有金膜辅助电极和银参比电极的PDMS上层，备用；
步骤4.首先将步骤2制得的具有金膜工作电极的PDMS底层和步骤1制得的具有集成有微流管道和细胞培养微腔的PDMS中间层通过氧等离子体清洗器处理1min后将两芯片不可逆封合，封合时将细胞培养微腔凹槽(3)处于金膜工作电极(7)的正上方，并形成液体引入流路、细胞培养微腔和液体导出流路，然后通过超薄防水双面胶将步骤3制得的具有金膜辅助电极和银参比电极的PDMS上层与集成有微流管道和细胞培养微腔的PDMS中间层封合，PDMS上层的金膜辅助电极(8)和银膜参比电极(9)与PDMS中间层的圆形通孔(5)对正，使圆形通孔(5)部分覆盖金膜辅助电极(8)和银膜参比电极(9)，即制得所述的集成软弹性细胞电化学传感器的微流控芯片。
8.权利要求1所述的微流控芯片在对受测细胞通过电化学信号和光学观察，监测其增殖和凋亡过程中的应用。
9.权利要求1所述的微流控芯片对受测细胞通过电化学信号和光学观察对细胞增殖和凋亡过程进行监测的的方法，其特征是包括如下步骤：
步骤1.将1×105～1×106cells mL-1细胞悬液通过集成软弹性细胞电化学传感器的输入试剂或细胞的圆形小管(2)利用重力作用引入到细胞培养微腔内；
步骤2.通过平衡出入口液面高度使液流保持静止6h，让细胞贴壁生长；
步骤3.将用氮气除氧30min后的0.01M，pH 7.4的PBS引入培养微腔对细胞进行冲洗后，在形同PBS溶液中进行细胞增殖电化学测试，并通过光学显微镜对细胞形态进行观察并用CCD拍摄；
步骤4.电化学测试完成后，将培养基引入细胞培养微腔，在6～48h内的不同细胞培养时间点按步骤3对细胞增殖行为过程进行电化学监测和光学拍摄；
步骤5.在步骤4完成细胞增殖检测后，将含有50～150μΜ抗肿瘤药物依托泊苷的培养基引入细胞培养微腔，在4～48h内的不同细胞培养时间点按步骤3对细胞凋亡行为过程进行电化学监测和光学拍摄。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310060501.4A CN103084230B (zh) | 2013-02-26 | 2013-02-26 | 一种集成软弹性细胞电化学传感器的微流控芯片及其制法和在细胞动态分析中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310060501.4A CN103084230B (zh) | 2013-02-26 | 2013-02-26 | 一种集成软弹性细胞电化学传感器的微流控芯片及其制法和在细胞动态分析中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103084230A CN103084230A (zh) | 2013-05-08 |
| CN103084230B true CN103084230B (zh) | 2015-01-07 |
Family
ID=48197656
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310060501.4A Expired - Fee Related CN103084230B (zh) | 2013-02-26 | 2013-02-26 | 一种集成软弹性细胞电化学传感器的微流控芯片及其制法和在细胞动态分析中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103084230B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108802148B (zh) * | 2018-07-21 | 2020-07-03 | 福建医科大学 | 一种基于纳米金修饰丝网印刷电极在线监测细胞内多巴胺的微流控纸芯片 |
| CN112473757B (zh) * | 2020-11-19 | 2021-12-17 | 江南大学 | 一种用于食品安全快速检测的微流控芯片检测系统 |
| CN113074860A (zh) * | 2021-03-17 | 2021-07-06 | 重庆大学 | 用于血管芯片的微型压力传感装置 |
| CN113652355B (zh) * | 2021-07-26 | 2024-06-18 | 法国介观生物技术有限公司 | 用于电阻抗监测的微流控装置及检测细胞电阻抗的方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI296608B (en) * | 2006-04-14 | 2008-05-11 | Ind Tech Res Inst | Microscale heating module |
| CN102580794B (zh) * | 2011-01-13 | 2014-03-19 | 博奥生物有限公司 | 可定位细胞及生物体的微流控芯片及其应用 |
| CN102174388B (zh) * | 2011-01-25 | 2012-12-05 | 重庆大学 | 基于表面电极技术的高通量细胞电融合芯片装置 |
| CN102644049A (zh) * | 2012-04-26 | 2012-08-22 | 北京工业大学 | 一种基于TiO2纳米薄膜浸润性的微流体驱动方法 |
-
2013
- 2013-02-26 CN CN201310060501.4A patent/CN103084230B/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103084230A (zh) | 2013-05-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wu et al. | Fabrication of miniature Clark oxygen sensor integrated with microstructure | |
| Luo et al. | A low temperature co-fired ceramic based microfluidic Clark-type oxygen sensor for real-time oxygen sensing | |
| CN105758917B (zh) | 一种Nafion/辣根过氧化物酶/四氧化三钴‑石墨烯/离子液体碳糊电极的制备及催化应用 | |
| CN106198659B (zh) | 一种在微流控孔道中沉积纳米金的方法 | |
| Zuaznabar-Gardona et al. | A wide-range solid state potentiometric pH sensor based on poly-dopamine coated carbon nano-onion electrodes | |
| Ding et al. | Trends in cell-based electrochemical biosensors | |
| CN103084230B (zh) | 一种集成软弹性细胞电化学传感器的微流控芯片及其制法和在细胞动态分析中的应用 | |
| Mross et al. | Integrated multi-sensor system for parallel in-situ monitoring of cell nutrients, metabolites, cell density and pH in biotechnological processes | |
| KR20170016282A (ko) | 폴리센싱 생체 전자공학적 시험판 | |
| WO2009157739A3 (ko) | 전도성 그라핀을 이용한 바이오센서 및 그 제조방법 | |
| CN106525943A (zh) | 一种表面蛋白压印自供能生物燃料电池传感器的构建方法及其应用 | |
| CN108414599A (zh) | 铜纳米颗粒无酶电化学葡萄糖传感器的制备方法 | |
| Dixon et al. | The control and measurement of ‘CO2’during fermentations | |
| CN103743801A (zh) | 基于液滴微流控的铂黑修饰电极生物传感器的制备方法及其应用 | |
| Chou et al. | Integrating a plastic glucose biosensor based on arrayed screen-printed electrodes utilizing magnetic beads with a microfluidic device | |
| CN101109749B (zh) | 一种多功能免疫芯片及其制法和在免疫检测中的应用 | |
| Abe et al. | Electrochemical imaging for single-cell analysis of cell adhesion using a collagen-coated large-scale integration (LSI)-based amperometric device | |
| Gardner et al. | Development of a microelectrode array sensing platform for combination electrochemical and spectrochemical aqueous ion testing | |
| Moya et al. | Miniaturized multiparametric flexible platform for the simultaneous monitoring of ionic: Application in real urine | |
| CN101430303B (zh) | 一种单层功能膜脲酶生物传感器芯片及制备方法 | |
| CN114518395A (zh) | 一种基于吸附态洛伊希瓦氏菌pv-4实现微生物电化学传感器即时检测的方法 | |
| CN109975376B (zh) | 一种高柔韧全固态硫离子选择性电极及其制备方法 | |
| Luo et al. | Light addressable potentiometric sensors for biochemical imaging on microscale: A review on optimization of imaging speed and spatial resolution | |
| Wang et al. | An all-solid-state potentiometric microsensor for real-time monitoring of the calcification process by Bacillus subtilis biofilms | |
| TW201209411A (en) | Enzyme electrode and method for producing the same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150107 Termination date: 20160226 |