CN105758917B - 一种Nafion/辣根过氧化物酶/四氧化三钴‑石墨烯/离子液体碳糊电极的制备及催化应用 - Google Patents

一种Nafion/辣根过氧化物酶/四氧化三钴‑石墨烯/离子液体碳糊电极的制备及催化应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种生物传感器,具体是一种Nafion/辣根过氧化物酶/四氧化三钴‑石墨烯/离子液体碳糊电极(Nafion/HRP/Co3O4‑GR/CILE)的制备方法及催化应用,属于电化学分析检测技术领域。本发明公布了Nafion/HRP/Co3O4‑GR/CILE的制备方法,以离子液体碳糊电极为基底电极,利用Co3O4‑GR纳米复合材料特有的大表面积和生物相容性好的优点,将HRP吸附在材料表面,进一步用Nifion膜固定制得Nafion/HRP/Co3O4‑GR/CILE。所述修饰电极中的HRP保持其天然结构和其生物活性。研究了该修饰电极的电化学性能,表明所述的修饰电极对三氯乙酸(TCA)具有良好的电化学催化能力,能有效检测TCA,检测限为0.33 mmol/L。本发明不涉及环境污染,所述修饰电极具有良好的稳定性、重现性和灵敏度,且制备工艺简单,成本价格低,易于操作,具有广泛的社会效益。

Description

一种Naf i on/辣根过氧化物酶/四氧化三钴-石墨烯/离子液体 碳糊电极的制备及催化应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种生物传感器,具体是一种Nafion/辣根过氧化物酶/四氧化三钴-石墨烯/离子液体碳糊电极(Naf ion/HRP/Co3〇4-GR/CILE)的制备方法及催化应用;属于电化 学分析检测技术领域。
背景技术
[0002] 辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)是一种含亚铁血红素的蛋白质, 其比活性高,稳定,分子量小,纯酶容易制备,是研究最为广泛的分析用酶之一。基于氧化还 原酶的直接电子转移电化学生物传感器由于优良的选择性、灵敏度和方便性引起了极大关 注,并在制药监控、临床诊断和食品分析等领域得到广泛应用。
[0003] 酶生物传感器的构建需要解决两个关键问题,一是如何在电极表面上实现酶的固 定且不变性;二是如何加速酶蛋白与电极之间的电子转移。由于大多数酶的氧化还原中心 深深埋在它们内部的三维矩阵结构中,直接电化学通常很难实现。解决方案的两个关键问 题是修饰材料的选择和电化学生物传感器的设计。许多具有大表面积和良好的生物相容性 的纳米材料如金属纳米粒子,金属硫化物,金属氧化物和碳材料等已被用于固定生物酶。
[0004] 碳糊电极是通过将导电石墨粉与憎水性粘合剂混制成糊状物,填充于电极管中而 制成的一类碳电极,具有制备简单、价格便宜、选择性好、灵敏度高、电位适用范围宽及表面 易于更新等优点。
[0005] 室温离子液体是指在室温及邻近温度下完全由阴阳离子组成的液体物质,具有电 化学窗口宽、导电率高、热稳定性和化学稳定性好等优点。作为绿色溶剂可以部分或全部替 代憎水性粘合剂,离子液体与石墨粉混合制备离子液体修饰碳糊电极,不仅可以增强碳糊 电极的稳定性,还可以提高电极的导电性,能明显改善碳糊电极的性能。
[0006] 石墨烯(GR)是单层石墨紧密排列所形成的蜂窝状二维空间材料,具有比表面积 大、机械强度高、热导性高、导电性好等独特的性质,石墨烯优越的特性使得其成为电化学 分析中优良的电极修饰材料,石墨烯及其复合材料逐渐被应用到制备电化学传感器之中。
[0007] 四氧化三钴-石墨稀复合材料中四氧化三钴(C〇3〇4)纳米颗粒以石墨稀为载体,两 者的复合使之产生协同作用,既发挥出纳米氧化物的生物相容性又具有石墨烯的高导电 性。复合材料中的C03O4纳米颗粒的尺寸在50〜100 nm。
[0008] 本发明首先制备了 1-己基吡啶六氟磷酸盐(HPPF6)修饰的碳糊电极(CILE),进而 采用分层涂布法用Naf ion将Co3O4-GR纳米复合材料和HRP分层固定在CILE表面,制得了HRP 修饰的电极(Naf ion/HRP/Co3〇4_GR/CILE),并采用电化学方法和光谱方法对该修饰电极分 别进行了电化学和光谱表征,求解了相关的电化学参数,该修饰电极可成功应用于三氯乙 酸(TCA)的含量检测。
发明内容
[0009] 本发明涉及一种Naf ion/辣根过氧化物酶/四氧化三钴-石墨稀/离子液体碳糊电 极(Naf ion/HRP/Co3〇4_GR/CILE)的制备方法及催化应用。
[00Ί0] —种Naf ion/辣根过氧化物酶/四氧化三钴-石墨稀/离子液体碳糊电极的制备方 法,其特征在于以下的过程和步骤:
[0011] I) 1-己基吡啶六氟磷酸盐(HPPF6)修饰碳糊电极(CILE)的制备:以石墨粉、离子 液体质量比为2:1混合,具体称量1.6 g石墨粉和0.8 g离子液体(HPPF6)放入研钵中研磨均 匀,将研磨好的混合物填入玻璃管中,内插铜丝作为导线,将玻璃管中的固体混合物压实即 得CILE,使用前将电极表面打磨成镜面;
[0012] 2) Nafion/HRP/Co3〇4-GR/CILE的制备:分别配制 15 mg/mL HRP与0.5 mg/mL C〇3〇4-GR的溶液,取6 yL 0.5 mg/mL C〇3〇4-GR的溶液滴涂在CILE表面,自然晾干后在电极 表面滴涂6 yL 15 mg/mL HRP,自然晾干后在电极表面滴涂8yL 0.5 % Nafion成膜固定 HRP,即得修饰电极Naf i on/HRP/Co3〇4-GR/C ILE;
[0013] 3) —种Nafion/HRP/Co3〇4_GR/CILE修饰电极的应用,其用途是:此修饰电极可作 为电化学传感器直接用于三氯乙酸(TCA)浓度的电化学检测;使用方法如下:电化学工作站 为电化学实验仪器,采用Nafion/HRP/C〇3〇4-GR/CILE修饰电极为工作电极,饱和甘汞电极 (SCE)为参比电极,铂丝(Pt)电极为辅助电极的三电极系统;电化学测定时,将三电极系统 置于经30分钟氮气除氧的0.1 mol/L pH 3.0磷酸盐缓冲溶液(PBS)中;在电化学循环伏安 扫描窗口范围为+0.2 V〜-0.8 V(vs. SCE),扫描速度为100 mV/s的条件下,分别研究TCA在 Naf ion/HRP/C〇3〇4-GR/CILE修饰电极上的电化学行为。实验结果表明该修饰电极对TCA具有 较强的电催化作用,还原峰电流和TCA的浓度在1.0〜52.0 mmo 1/L范围内呈良好的线性关 系,检测限为0.33 mmol/L(3〇)。
[00M]本发明的有益效果是:本发明提出了一种基于Co3O4-GR纳米复合材料的修饰电极 Nafion/HRP/C〇3〇4-GR/CILE。所述修饰电极兼具离子液体修饰电极制备简单,选择性好,电 位窗口宽,表面易于更新,使用方便,导电性能良好等优点,以及Co3O4-GR纳米复合材料特有 的比表面积大,导电性优良,生物相容性好等优点。实验结果表明Nafion/HRP/C〇3〇4-GR/ CILE修饰电极可用于TCA的直接电化学测定,且具有催化活性高,稳定性好,灵敏度高线性 范围宽等优点。
附图说明
[0015]图1为复合材料C〇3〇4_GR的扫描电子显微镜图。
[0016] 图2为HRP (a)和HRP-C〇3〇4-GR混合液在pH3.0的PBS缓冲溶液的紫外-可见吸收光谱 图。
[0017] 图3A,3B分别为HRP和HRP/C〇3〇4-GR膜的红外光谱图。
[0018] 图 4 为不同修饰电极(a)CILE,(b)Nafion/CILE,(c)Nafion/Co3〇4-GR/CILE,(d) Nafion/HRP/CILE,(e)Nafion/HRP/Co3〇4-GR/CILE分别在pH 3.0的 PBS中的循环伏安曲线; 扫速为100 mV/s。
[0019] 图5为不同扫速下Nafion/HRP/Co3〇4_GR/CILE的循环伏安图(曲线a到k分别为50, 100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000 mV/s)。
[0020]图6为修饰电极在不同浓度三氯乙酸存在下的循环伏安曲线图(a到m分别为0.0, 1·0,3·0,6·0,10·0,15·0,22·0,24·0,29·0,33·0,38·0,45·0,55·0 mmol/L);插图为催化还 原峰电流与三氯乙酸浓度之间的关系曲线。
具体实施方式
[0021] 以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述,但并不因此而 限制本发明的保护范围,现将具体实施例叙述于后。
[0022] 以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
[0023] 实施例1
[0024] 1-己基吡啶六氟磷酸盐(HPPF6)修饰碳糊电极的制备:称量1.6 g石墨粉和0.8 g 离子液体(HPPF6)放入研钵中充分研磨均匀,把研磨好的混合物填入内径为4 mm玻璃电极 管中,内插铜丝作为导线,将玻璃电极管中的固体混合物压实即可得到离子液体修饰的碳 糊电极(CILE),使用前将电极表面打磨成镜面。
[0025] 实施例2
[0026] Nafion/HRP/Co3〇4-GR/CILE的制备:分别配制 15 mg/mL HRP与0.5 mg/mL Co3O4-GR的溶液,取0.5 mg/mL C〇3〇4-GR的溶液6 yL滴涂在电极表面,自然晾干后在电极表面涂6 yL 15 mg/mL的HRP溶液,自然晾干后在电极表面涂8 yL 0.5 % Nafion成膜固定HRP,即得 修饰电极 Naf i on/HRP/Co3〇4-GR/C ILE。
[0027] 实施例3
[0028] 图2是HRP和HRP/C〇304-GR复合材料中的HRP在pH3.0的I3BS缓冲溶液中的紫外吸收 光谱曲线,所用实验仪器为TU-1901双光束紫外可见分光光度计。HRP分子在I3BS中的Soret 吸收带位于403.0 nm处(曲线a),HRP与C〇3〇4-GR混合溶液在TU-1901双光束紫外可见分光光 度计中的Soret吸收带也在相同的位置(曲线b),表明HRP分子在HRP/C〇3〇4-GR复合材料中保 持了其原本的结构,没有发生变性。
[0029] 实施例4
[0030] 图3是HRP和HRP/C〇3〇4-GR复合材料中的HRP的傅立叶变换红外光谱图,实验所用仪 器为赛默飞世尔科技公司的Nicolet 6700型傅立叶变换红外光谱仪。HRP自身的吸收带酰 胺I和酰胺Π分别位于1651 Cnf1和1543 cnf1 (图3A),而在HRP/C〇3〇4-GR复合材料内HRP的 酰胺I和酰胺Π的红外吸收带分别位于1649 Cnf1和1536 Cnf1 (图3B),两者的吸收带位置 几乎相同,可以认为Co3O4-GR复合膜中的HRP基本保持了其二级结构的固有特征。
[0031] 实施例5
[0032] 如图4所示,Nafion/HRP/Co3〇4-GR/CILE在pH 3.0的I3BS中的循环伏安图,在基底 电极CILE (曲线a),Naf ion/CILE (曲线b)和Naf ion/Co3〇4_GR/CILE (曲线c)上没有出现氧化 还原特征峰,表明电极表面不存在电活性物质。在Nafion/HRP/CILE (曲线d)上出现一对明 显的非对称氧化还原峰,说明HRP和CILE之间存在电子传输。而在Nafion/HRP/Co3〇4_GR/ CILE (曲线e)上出现一对良好且准可逆的氧化还原峰出现,氧化还原峰电位分别是Epa=-0 · 114V和Epc=-O · 173V,峰电位差(△ Ep)为59 mV,式电位Etr=-O · 144V (vs · SCE),氧化还原峰 电流之比接近于1,表现出蛋白质内血红素辅基Fe (III)/Fe (II)氧化还原电对的特征电化 学行为。
[0033] 实施例6
[0034] 如图5所示,在50〜1000 mV/s扫速范围内研究Nafion/HRP/Co3〇4-GR/CILE的电极 反应过程。结果表明氧化还原峰电流和扫速的一次方成正比,线性回归方程为IpcOiA) = 71 · 51v (V/s) +6 · 81 (n=10,r=0 · 997)和Ipa (μΑ) =-85 · 81v (V/s) -1 · 80 (n=10,r=0 · 999),表明电 极反应是典型的表面控制薄层电化学行为。根据公式Q=nAFr,Γ为电活性物质的表面浓度 (m〇l/cm2),n为电活性物质发生电极反应时的电子转移数,F为法拉第常数,A为有效面积 (cm2),求得Γ值为
Figure CN105758917BD00061
,固定在电极表面的HRP的总量为
Figure CN105758917BD00062
cm2,求得在电极表面参与电化学反应的HRP占电极表面HRP总量的4.17%七与11^之间的线 性回归方程为Epc (V) =-0 · 01491nv (V/s) -0 · 2309 (n=10,r=0 · 997)和Epa (V) =0 · 01331nv (V/ s) -0.1250 (n=10,r=0.998)。根据Laviron理论可求得电子转移数n为1.02,电子传递系数 α为0.47,反应的速率常数1值为
Figure CN105758917BD00063
,结果表明C〇3〇4-GR复合膜的存在可以为HRP提供 一个合适的微环境,加快速电子转移速率。
[0035] 实施例7
[0036] 以CHI 660D型电化学工作站为电化学实验仪器,以Nafion/HRP/Co3〇4_GR/CILE为 工作电极,饱和甘汞电极(SCE)为参比电极,铂丝(Pt)电极为辅助电极,组成三电极系统;将 三电极系统置于含有一定量TCA的pH 3.0的I3BS中,经30分钟氮气除氧后进行电化学检测, 考察该修饰电极对TCA的电催化还原作用,结果如图6所示。在-0.290 V左右出现一个新的 还原峰,随着TCA加入量的增加,还原峰电流明显增大,氧化峰逐渐消失,这是典型的TCA还 原过程。还原峰电流和TCA的浓度在1.0〜53.0 mmol/L的范围内呈良好的线性关系,线性回 归方程为Ip (μΑ) =1.86C (mmol/L) +16.70 (η=17,γ =0.998),检测限为0.33 mmol/L,表明修 饰电极对TCA表现出良好的电催化活性。
[0037] 实施例8
[0038] 采用标准加入法研究所述修饰电极Naf ion/HRP/Co3〇4_GR/CILE检测实验室自来水 水样中TCA的含量,结果如表1,表明水样中无残留的TCA,测定的回收率在95.00 %〜99.64 % 范围内。此实验结果表明修饰电极对TCA具有良好的检测性能。
[0039] 表1实验室水样中TCA的检测结果(n=3)。
[0040]
Figure CN105758917BD00064
[0041] 实施例9
[0042] 研究了修饰电极Nafion/HRP/Co3〇4_GR/CILE的稳定性,将修饰电极置于pH 3.0的 PBS中的循环伏安曲线,连续扫描50圈,结果峰电流依然能保持初始峰电流的98.2 %,持续 扫描200圈后,峰电流与原来相比降低了8.7 %,结果说明Nafion/HRP/Co3〇4_GR/CILE在I3BS 中的稳定性较好。修饰电极在4 °C冰箱中存放两周之后的峰电流能保持原来的96.1 %;存 放30天后,峰电流仍可保持原来的91.5 %,表明HRP在电极表面上的电活性能够维持较长时 间。

Claims (3)

1. 一种Naf ion/辣根过氧化物酶/四氧化三钴-石墨稀/离子液体碳糊电极的制备方法, 其特征在于包括以下步骤: 1) 1-己基吡啶六氟磷酸盐HPPF6修饰碳糊电极CILE的制备:称量1.6g石墨粉和0. Sg离子 液体HPPF6放入研钵中研磨均匀,将研磨好的混合物填入玻璃管中,内插铜丝作为导线,将 玻璃管中的固体混合物压实即得CILE,使用前将电极表面打磨成镜面; 2) Naf ion/辣根过氧化物酶/四氧化三钴-石墨稀/离子液体碳糊电极的制备:分别配制 15mg/mL HRP与0.5mg/mL Co3O4-GR的溶液,取6yL 0.5mg/mL Co3O4-GR的溶液滴涂在CILE表 面,自然晾干后在电极表面滴涂6yL 15mg/mL HRP,自然晾干后在电极表面滴涂8yL 0.5% Naf ion成膜固定HRP,即得Naf ion/辣根过氧化物酶/四氧化三钴-石墨稀/离子液体碳糊电 极。
2. 根据权利要求1所述制备方法制备的Naf ion/辣根过氧化物酶/四氧化三钴-石墨烯/ 离子液体碳糊电极的应用,其特征在于以Naf ion/辣根过氧化物酶/四氧化三钴-石墨稀/离 子液体碳糊电极作为电化学传感器,直接用于三氯乙酸浓度的电化学检测。
3. 根据权利要求2所述的应用,主要包括以下步骤: 1) 以CHI 660D型电化学工作站为电化学实验仪器,分别以Nafion/辣根过氧化物酶/四 氧化三钴-石墨烯/离子液体碳糊电极为工作电极,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为 辅助电极,组成三电极系统; 2) 将三电极系统置于经30分钟氮气除氧的O.lmol/L pH 3.0磷酸盐缓冲溶液中; 3) 设置电化学循环伏安扫描窗口范围为+0.2V〜-0.8V,扫描速度为100mV/S,研究三氯 乙酸在Naf ion/辣根过氧化物酶/四氧化三钴-石墨稀/离子液体碳糊电极上的电化学行为; 4) 还原峰电流和三氯乙酸的浓度在1.0〜52. OmmoI/L范围内呈良好的线性关系,检测 限为 〇. 33mmol/L; 5) 采用标准加入法用于水样中三氯乙酸的检测。
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Deiminiat et al. Development of a new electrochemical imprinted sensor based on poly-pyrrole, sol–gel and multiwall carbon nanotubes for determination of tramadol
Niu et al. A novel electrochemical sensor of bisphenol A based on stacked graphene nanofibers/gold nanoparticles composite modified glassy carbon electrode
Wang et al. Electrochemical nonenzymatic sensor based on CoO decorated reduced graphene oxide for the simultaneous determination of carbofuran and carbaryl in fruits and vegetables
Song et al. Multiwall carbon nanotubes-poly (diallyldimethylammonium chloride)-graphene hybrid composite film for simultaneous determination of catechol and hydroquinone
Sadeghi et al. A novel biosensor based on ZnO nanoparticle/1, 3-dipropylimidazolium bromide ionic liquid-modified carbon paste electrode for square-wave voltammetric determination of epinephrine
Lin et al. Glassy carbon electrodes modified with gold nanoparticles for the simultaneous determination of three food antioxidants
Yue et al. A novel nitrite biosensor based on single-layer graphene nanoplatelet–protein composite film
Zhu et al. Simultaneous determination of Cd (II) and Pb (II) using square wave anodic stripping voltammetry at a gold nanoparticle-graphene-cysteine composite modified bismuth film electrode
Huang et al. Electrochemical determination of nitrite and iodate by use of gold nanoparticles/poly (3-methylthiophene) composites coated glassy carbon electrode
Karimi-Maleh et al. A voltammetric biosensor based on ionic liquid/NiO nanoparticle modified carbon paste electrode for the determination of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH)
Rinaldi et al. Impedimetric non-enzymatic glucose sensor based on nickel hydroxide thin film onto gold electrode
Demetriades et al. A study of pencil-lead bismuth-film electrodes for the determination of trace metals by anodic stripping voltammetry
Shahrokhian et al. Application of thionine-nafion supported on multi-walled carbon nanotube for preparation of a modified electrode in simultaneous voltammetric detection of dopamine and ascorbic acid
Guo et al. Gold nanoparticle/carbon nanotube hybrids as an enhanced material for sensitive amperometric determination of tryptophan
Yin et al. Electrochemical oxidation behavior of guanine and adenine on graphene–Nafion composite film modified glassy carbon electrode and the simultaneous determination
Cui et al. A novel hydrogen peroxide sensor based on Ag nanoparticles electrodeposited on DNA-networks modified glassy carbon electrode
Tang et al. A label-free electrochemical immunoassay for carcinoembryonic antigen (CEA) based on gold nanoparticles (AuNPs) and nonconductive polymer film
Peng et al. A novel electrochemical sensor of tryptophan based on silver nanoparticles/metal–organic framework composite modified glassy carbon electrode
Liu et al. A novel sensor based on electrodeposited Au–Pt bimetallic nano-clusters decorated on graphene oxide (GO)–electrochemically reduced GO for sensitive detection of dopamine and uric acid
Jeyapragasam et al. Electrochemical biosensing of carbofuran based on acetylcholinesterase immobilized onto iron oxide–chitosan nanocomposite
Ruan et al. Electrochemical myoglobin biosensor based on graphene–ionic liquid–chitosan bionanocomposites: Direct electrochemistry and electrocatalysis
Feng et al. Simultaneous determination of hydroquinone and catechol using covalent layer-by-layer self-assembly of carboxylated-MWNTs
Zhao et al. Study on the electrochemical behavior of dopamine with poly (sulfosalicylic acid) modified glassy carbon electrode

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