CN106047706B - 一种基于单细胞捕获实现细胞定位培养芯片及其使用及制备方法 - Google Patents

一种基于单细胞捕获实现细胞定位培养芯片及其使用及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于微细加工技术实现的单细胞捕获并定位培养芯片及其使用和制备方法，属于生物微机电系统(Bio‑MEMS)领域。该芯片由细胞定位培养层与玻片层组成，所述的细胞定位培养结构层包含有进样口1、出样口8、以及两者之间的若干细胞定位培养单元。使用时先从进样口1加入细胞悬液，细胞随流体进入阵列中的捕获区域3；再从出样口7加入不含细胞的培养液，被捕获的细胞受流体推力，沿通道进入细胞培养区域5，待细胞在培养结构中贴壁培养。本发明解决了细胞捕捉所需要的小空间以及细胞培养铺展所需要的大空间之间的矛盾，在一个芯片上集成了细胞捕获区域与细胞培养区域，既可以精准的捕获细胞得到较高的单细胞率，又可以给单个细胞提供足够的铺展空间使其贴壁生长。

Description

一种基于单细胞捕获实现细胞定位培养芯片及其使用及制备 方法
所属领域
本发明涉及一种基于微细加工技术实现的单细胞捕获并定位培养芯片及其使用和制备方法，属于生物微机电系统(Bio-MEMS)领域。
背景技术
单细胞定位培养芯片作为贴壁依赖型细胞研究及行为控制的实验性工具，使人们能够更加清晰地认识到细胞群中每个细胞的本质区别、了解细胞间的相互作用力及信号传导、分析单个细胞如何相互作用形成组织和器官，进而从单细胞层面理解各种生命现象。因此在细胞生物学、药物检测，生物传感器以及疾病诊断等等领域具有广阔的应用前景。传统的用微细加工技术实现细胞定位培养有两种方案，一种是通过对培养基底表面进行修饰，形成细胞贴附生长的指定的区域，使细胞选择性地贴附生长形成细胞图型；另一种方法是通过可移除的物理阻隔层将细胞限制在特定的区域生长。通过进行表面化学修饰的细胞培养芯片稳定性不足，实验结果的可重复性不足。Ching-Hui Lin等人(C.Lin,Y.Hsiao,H.Chang,C.Yeh,C.He,E.M.Salm,C.Chen,I.Chiu and C.Hsu,Lab Chip,2015,DOI:10.1039/C5LC00541H.)借助微流控技术，设计了两片PDMS芯片，其中一片是较小的孔阵列用于细胞捕获，另一层是较大的孔阵列，用于细胞培养。这种实现细胞捕获的方法能够实现单细胞的捕获，并能提供细胞生长所需的铺展空间。然而它是由两片PDMS构成，大孔阵列与小孔阵列的对准与键合具有一定的难度。因此本发明旨在解决这一问题。
发明内容
本发明的目的是：为了解决现有的单细胞捕获和培养芯片对准和键合困难的问题，本发明提供了一种基于单细胞捕获的一体式细胞定位培养芯片。
本发明的技术方案是：一种基于单细胞捕获实现细胞定位培养芯片由细胞定位培养层与玻片层组成，该细胞定位培养层可由任何适合培养生物细胞的生物相容材料制成；所述的细胞定位培养结构层包含有进样口1、出样口8、以及两者之间的若干细胞定位培养单元；所述细胞定位培养单元由捕获区域3与培养区域4组成；所述捕获区域3是由结构外壁7内侧构成的U形腔体以及拦截微柱6组成，细胞捕获结构开口由两结构外壁7构成，其宽度尺寸d1：d0<d1<2d0，其中d0为待培养细胞的直径；所述拦截微柱6与左右侧壁的距离小于d0且拦截微柱宽d2：d0/2<d2<d1；其中拦截入口为两结构外壁7捕获区域3构成的结构，反向入口为两结构外壁7在培养区域构成的与拦截入口相对的结构，其中任一个培养单元的拦截入口应当与细胞通道5、另外一个培养单元的反向入口有对齐关系；培养区域3是由结构外壁内侧形成的腔体，该腔体边长d3：30μm<d3<200μm；相邻的两个结构外壁7外侧构成细胞通道 5；流体反向入口宽为d1；所述细胞定位培养单元宽度为D；d3+20μm<D<d3+40μm；阵列横向间距为w1：D+d1<w1<D+2d1；整列纵向间距为w2：2d1+d3<w2<2d1+d3+100；
更优方案:根据实验结果提出优化方案：1.结构外壁轮廓设计为带倾角或圆角的结构更加符合仿真结果，有利于液体流动。2.加厚结构外壁壁厚有利于牢固的键合。3.设计为两个进样口1以及两个出样口8有利于芯片内部稳态。
所述基于单细胞捕获的一体式细胞定位芯片的使用方法包括以下步骤：
步骤一：从进样口1加入细胞悬液，则细胞被捕获区域3拦截。
步骤二：从进样口1加入培养液或缓冲液，将未被捕获的细胞冲走。
步骤三：从出样口8反向加入培养液或缓冲液，将被捕获的细胞冲到细胞培养区域4，待细胞在培养结构中贴壁培养。
本发明还公开了细胞定位培养层材料为聚合物的所述基于单细胞捕获的一体式细胞定位培养芯片的制备方法，采用MEMS技术和复制模塑技术完成完成，具体包括如下步骤：
步骤一：准备聚合物材料；
步骤二：将聚合物浇注在硅模板上，并静置；
所述硅模板包括如下子步骤：
子步骤一：涂光刻胶，进行曝光，显影，将刻蚀结构从掩膜板转移到光刻胶上；
子步骤二：对有光刻胶结构的硅片进行ICP刻蚀；
子步骤三：丙酮去除光刻胶。
步骤三：将聚合物从硅模板剥下，得到所述具有单细胞捕获及培养结构的聚合物基片；
步骤四：将聚合物基片与载玻片进行键合，形成微通道；
步骤五：在通道出入口的位置上外接流体管道，完成芯片制备。
本发明的有益效果是：发明提出了一种基于单细胞捕获实现细胞定位培养芯片及其使用和制备方法。该芯片解决了细胞捕捉所需要的小空间以及细胞培养铺展所需要的大空间之间的矛盾，在一个芯片上集成了细胞捕获区域与细胞培养区域，既可以精准的捕获细胞得到较高的单细胞率，又可以给单个细胞提供足够的铺展空间使其贴壁生长。其次，相较于传统的双层芯片，本发明解决了键合对准的问题，制备工艺简单，使用步骤简化。
附图说明
图1为本发明提出的基于单细胞捕获的一体式细胞定位培养芯片效果图
图2为本发明提出的基于单细胞捕获的一体式细胞定位培养芯片的阵列结构设计图
图3为本发明的基于单细胞捕获的一体式细胞定位培养芯片的硅模板加工工艺路线
图4为本发明提出的基于单细胞捕获的一体式细胞定位培养芯片的制作工艺路线
图中：1.进样口，2.细胞，3.捕获区域，4.培养区域，5.细胞通道，6拦截微柱，7.结构外壁，8.出样口
具体实施方式
实施例1：
本实施例中的芯片用于培养成纤维细胞L929来进行细胞定位培养研究。L929在悬浮液中平均直径d0为10μm。
参阅图1～图3。本实施例中将基于单细胞捕获的一体式细胞定位培养芯片用于单个L929细胞培养。其中，基于单细胞捕获的一体式细胞定位培养芯片的结构尺寸如下：细胞捕获区域3的尺寸捕捉入口d1＝15μm；拦截微柱宽度d2＝5μm；培养区域边长d3＝50μm；D＝70μm；相邻两个结构阵列横向间距w1＝90μm；相邻两个结构阵列纵向间距w2＝100μm；w3＝15μm；刻蚀深度h＝15μm。
本实施例中基于单细胞捕获的一体式细胞定位培养芯片，采用MEMS技术和复制模塑技术完成，具体包括如下步骤：
步骤一：按质量为10:1混合PDMS预聚体和交联剂，并充分搅拌均匀后，放入真空干燥箱中脱气30分钟，直至混合过程中产生的气泡完全排除；
步骤二：将PDMS浇注在硅模板上，并静置；
所述硅模板包括如下子步骤：
子步骤一：制作掩模版；
子步骤二：光刻；
子步骤三：电感耦合等离子体反应刻蚀，刻蚀深度为15μm；
子步骤四：丙酮去除光刻胶；
子步骤五：钝化1min。
步骤三：将浇注PDMS后的硅模板置于真空干燥箱中，使PDMS发生交联反应而固化，固化参数为：固化温度80℃，固化时间1h；将冷却后的PDMS轻轻剥下，就得到了所述基于单细胞捕获的一体式细胞定位培养芯片的基片；切片并打孔；
步骤四：用电晕放电仪将PDMS基片与载玻片表面改性处理30s后，进行键合；
步骤五：将毛细管接入芯片出入口即可得到所需基于单细胞捕获的一体式细胞定位培养芯片。
实施例2：
本实施例中的芯片用于培养人乳腺上皮细胞HMEC来单细胞捕获及定位培养研究。HMEC在悬浮状态平均直径d0＝10μm。
参阅图1～图3。本实施例中将基于单细胞捕获的一体式细胞定位培养芯片用于单个 HMEC细胞培养。其中，基于单细胞捕获的一体式细胞定位培养芯片的结构尺寸如下：细胞捕获区域3的尺寸拦截入口d1＝15μm；拦截微柱d2＝5μm；培养区域内反向入口d3＝60μm；培养单元整体尺寸D＝80μm；相邻两个结构阵列横向间距w1＝100μm；相邻两个结构阵列纵向间距w2＝110μm；w3＝15μm；刻蚀深度h＝15μm。
本实施例中基于单细胞捕获的一体式细胞定位培养芯片，采用MEMS技术和复制模塑技术完成，具体包括如下步骤：
步骤一：按质量为10:1混合PDMS预聚体和交联剂，并充分搅拌均匀后，放入真空干燥箱中脱气30分钟，直至混合过程中产生的气泡完全排除；
步骤二：将PDMS浇注在硅模板上，并静置；
所述硅模板包括如下子步骤：
子步骤一：制作掩模版；
子步骤二：光刻；
子步骤三：电感耦合等离子体反应刻蚀，刻蚀深度为15μm；
子步骤四：丙酮去除光刻胶；
子步骤五：钝化1min。
步骤三：将浇注PDMS后的硅模板置于真空干燥箱中，使PDMS发生交联反应而固化，固化参数为：固化温度80℃，固化时间1h；将冷却后的PDMS轻轻剥下，得到所述基于单细胞捕获的一体式细胞定位培养芯片的基片；切片并打孔；
步骤四：用电晕放电仪将PDMS基片与载玻片表面处理30s后，进行键合；
步骤五：将毛细管接入芯片出入口即可得到所需基于单细胞捕获的一体式细胞定位培养芯片。

Claims (5)

1.一种基于单细胞捕获实现细胞定位培养芯片，其特征在于，由细胞定位培养层与玻片层组成，所述细胞定位培养层由生物相容材料制成；所述的细胞定位培养层包含有进样口(1)、出样口(8)、以及两者之间的若干细胞定位培养单元；所述细胞定位培养单元由捕获区域(3)与培养区域(4)组成；所述捕获区域(3)是由结构外壁(7)内侧构成的U形腔体以及拦截微柱(6)组成，细胞捕获结构开口由两结构外壁(7)构成，其宽度尺寸d1：d0<d1<2d0，其中d0为待培养细胞的直径；所述拦截微柱(6)与左右侧壁的距离小于d0且拦截微柱宽d2：d0/2<d2<d1；其中拦截入口为两结构外壁(7)捕获区域(3)构成的结构，反向入口为两结构外壁(7)在培养区域构成的与拦截入口相对的结构，其中任一个培养单元的拦截入口应当与细胞通道(5)、另外一个培养单元的反向入口有对齐关系；培养区域(3)是由结构外壁内侧形成的腔体，该腔体边长d3：30μm<d3<200μm；相邻的两个结构外壁(7)外侧构成细胞通道(5)；流体反向入口宽为d1；所述细胞定位培养单元宽度为D；d3+20μm<D<d3+40μm；阵列横向间距为w1：D+d1<w1<D+2d1；整列纵向间距为w2：2d1+d3<w2<2d1+d3+100μm。
2.一种如权利要求1所述的基于单细胞捕获实现细胞定位培养芯片，其特征在于，所述结构外壁(7)为带倾角或圆角的结构。
3.一种如权利要求1所述的基于单细胞捕获实现细胞定位培养芯片，其特征在于，所述结构外壁(7)壁厚加厚。
4.一种如权利要求1所述的基于单细胞捕获实现细胞定位培养芯片，其特征在于，所述进样口(1)及出样口(8)均为两个。
5.如权利要求1～4之一的基于单细胞捕获实现细胞定位培养芯片的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：从进样口(1)加入细胞悬液，则细胞被捕获区域(3)拦截；
步骤二：从进样口(1)加入培养液或缓冲液，将未被捕获的细胞冲走；
步骤三：从出样口(8)反向加入培养液或缓冲液，将被捕获的细胞冲到细胞培养区域(4)，待细胞在培养结构中贴壁培养。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108570416B (zh) * 2018-04-08 2021-08-10 西北工业大学 功能分离的单细胞级直接共培养芯片及其使用及制备方法
CN117264765A (zh) * 2019-05-31 2023-12-22 西安医学院 细胞捕获与肿瘤球培养的阵列化芯片及其制备和操作方法
CN110272811B (zh) * 2019-07-05 2022-06-21 大连海事大学 一种基于双柱捕获的单细胞表面部分区域磁化装置及方法
CN110272823B (zh) * 2019-07-05 2022-06-24 大连海事大学 一种基于微通道阵列的多细胞表面部分区域磁化装置及方法
CN113278523A (zh) * 2021-05-08 2021-08-20 上海碧博生物医药科技有限公司 具有细胞定位功能的细胞培养板及其制备方法和细胞定位的方法
CN114073996B (zh) * 2021-11-24 2023-04-14 中山大学 一种嵌套式微井阵列芯片及其制备方法
CN115895876B (zh) * 2022-11-30 2024-04-02 重庆大学 一种基于双侧流场配对结构阵列的细胞电融合芯片装置及制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101717718A (zh) * 2009-12-03 2010-06-02 西北工业大学 一种用于细胞分选的微网筛结构及其使用方法
CN102212458A (zh) * 2011-03-31 2011-10-12 西北工业大学 基于可变间距微柱阵列的细胞分选结构及其制作方法
CN103865752A (zh) * 2014-03-07 2014-06-18 复旦大学附属中山医院 循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片及其制造和使用
CN104513787A (zh) * 2015-01-07 2015-04-15 东北大学 用于单细胞捕获、培养和给药的集成微流控芯片及系统

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103620016B (zh) * 2011-04-13 2016-08-17 深圳华大基因科技有限公司 微流控装置及其用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101717718A (zh) * 2009-12-03 2010-06-02 西北工业大学 一种用于细胞分选的微网筛结构及其使用方法
CN102212458A (zh) * 2011-03-31 2011-10-12 西北工业大学 基于可变间距微柱阵列的细胞分选结构及其制作方法
CN103865752A (zh) * 2014-03-07 2014-06-18 复旦大学附属中山医院 循环肿瘤细胞捕获和分类磁性微流控芯片及其制造和使用
CN104513787A (zh) * 2015-01-07 2015-04-15 东北大学 用于单细胞捕获、培养和给药的集成微流控芯片及系统

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
《A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture》;Ching-Hui Lin等;《Lab on a chip》;20150721;第15卷(第14期);第2928-2938页 *

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