CN101597568B

CN101597568B - 一种集成微流控芯片及其用于活细胞控制与分析的应用

Info

Publication number: CN101597568B
Application number: CN2009100231645A
Authority: CN
Inventors: 王进义; 刘文明; 李立; 宋鹏; 任丽; 王雪琴; 任莉莉; 王旭明
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2009-07-02
Filing date: 2009-07-02
Publication date: 2012-07-25
Anticipated expiration: 2029-07-02
Also published as: CN101597568A

Abstract

本发明公开了一种适用于不同种类细胞定位、培养和相互作用的集成微流控芯片，由流动层、控制层和覆盖层(自上而下)三层组成。其中，流动层主要由一个微米级管道网络和四个圆形腔组成，通过细管道将相邻的腔体两两连接，该层总共有十个进出样口。控制层由数个单管道末端封闭的微阀开关组成，可以分别对流动层不同管道位置的样品输入和输出进行时间和空间的控制。本发明的集成微流控芯片具有制备材料优质、制备方法重复性强、应用范围广的优点。可开展对多种类细胞的定位共培养及相互作用研究。

Description

一种集成微流控芯片及其用于活细胞控制与分析的应用

技术领域

本发明涉及一种微流控芯片，尤其是一种集成微流控芯片，应用该集成微流控芯片能够进行时间与空间控制不同种类细胞的定位培养及相互作用研究。

背景技术

微流控芯片技术是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、反应、分离和检测等基本操作单元集成到一块几平方厘米或更小的芯片上，由微通道网络运输流体贯穿于整个系统以控制生物或化学反应过程，并对其反应产物进行分析的一种技术。微流控芯片的最大优势在于微小尺寸下各种功能单元技术的灵活组合和规模集成，其结果是实现最大限度的自动化、高通量和低消耗。与此同时，微流控芯片的上述特征使得芯片实验室(Lab-on-a-Chip)概念向基于微流控芯片平台的基因诊断、病毒检测及细胞分析研究的渗透成为可能。这种从传统的中心实验室向芯片实验室的模式转变将为许多研究工作带来革命性进步，一些原本无法实现的工作诸如复杂生物学实验、微观生命科学研究、野外考察、疾病现场检测等将藉助于芯片实验室得以完成。

由于在高通量、微型化、集成化、自动化和便携化等方面的巨大发展潜力，近十几年来，微流控芯片技术受到了国内外生物化学、分析化学、分子毒理学、环境医学和预防医学等领域的高度重视，也成为21世纪最为重要的前沿技术之一。目前，基于微流控芯片技术的基因分析、蛋白质(酶)分析、核酸分析、免疫分析等方面的应用，已取得很大的进展。此外，基于微流控芯片技术的单细胞研究也正在有条不紊地进行。国外已初步实现了微米级管道或腔内的多种类型活细胞培养【R.Gomez-Sjoberg，A.A.Leyrat，D.M.Pirone，et al.，Anal.Chem.2007，79(22)：8557-8563.】及其实时分析；同时产生了一批以基于活细胞的药物筛选与分析系统、细胞传感器等为代表分析设备【P.J.Lee，P.J.Hung，V.M.Rao，et al.，Biotechnol.Bioeng.2006，94(1)：5-14.】，其简单、快捷、高通量和高敏感性优势，在很大程度上促进了生命科学研究进展，同时也进一步加速了该技术的多元化、市场化，从而服务于社会。

然而，微流控芯片技术在细胞生物学领域的应用仍处于发展阶段，尤其涉及到细胞精确控制与定位以及细胞-细胞相互作用方面。针对细胞的控制与定位，现多采用表面化学修饰法来实现细胞的黏附与脱离【E.E.Hui，S.N.Bhatia，PNAS 2007，104(14)：5722-5726.】，且这种方法具有不可逆性和非重复性。关于细胞相互作用的微流控芯片，目前也仅实现了简单的平行单管道水平【A.P.Wong，R.Perez-Castillejos，L.J.Christopher，et al.，Biomaterials 2008，29(12)：1853-1861.】。因此，建立一种多功能集成的微流控芯片分析系统与平台，实施细胞的精确控制与定位，开展细胞相互作用研究，不仅有利于研究工作的简单、高效、快速的展开，同时也有利于加快所获得技术成果的市场化应用。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种集成微流控芯片以及该集成微流控芯片应用于各种生理和病理情况下的多种细胞相互作用研究。本发明的一种集成微流控芯片能够实现多种细胞的精确定位、共培养，开展时间与空间控制的单细胞水平的生命科学研究。同时，该芯片的应用改变了以往惯用的两种类型细胞相互作用研究模式，拓宽了细胞相互作用研究的范围，发挥了其研究系统全面性的特点。

为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：

一种集成微流控芯片，其特征在于，该集成微流控芯片自上而下设有流动层、控制层和覆盖层，其中，流动层主要由一个微米级管道网络和四个圆形细胞培养腔组成，流动层周边设有八个进样口和两个出样口，中间设有四个圆形细胞培养腔，圆形细胞培养腔之间通过细管道相连；控制层设有二十八个进气口，进气口上分别连接单个管道末端封闭的微阀开关；覆盖层则是对控制层的管道进行封装。

上述集成微流控芯片的制备方法，其特征在于，采用软光刻技术，首先将流动层和控制层的设计结构制成光掩膜；然后进行光刻胶涂膜、紫外曝光、显影，制备芯片模子；最后将聚二甲基硅氧烷(PDMS)或其它已知的弹性高分子材料覆盖于芯片模子表面，烘烤固化，显微镜下将流动层和控制层校对粘合，再将控制层与覆盖层粘合封装，制成集成微流控芯片。

本发明具有如下优点：

1、本发明的集成微流控芯片选用聚二甲基硅氧烷(PDMS)或其它已知的弹性高分子材料，相对于以往芯片材料(如硅、玻璃和石英等)而言，具有更好的生物兼容性、电绝缘隔离性、热隔离性等性能，且具有优异的透光性。以上优点便于开展活细胞为基础的相关研究。

2、本发明的集成微流控芯片的控制层微阀开关结构，可以在特定时间对流动层特定区域进行流体的进样和出样，以及时间和空间控制各种不同类型细胞在各自培养区的定位以及共培养。

3、本发明的集成微流控芯片具有两两连接相邻微型细胞培养区的微米级管道设计。相邻细胞培养区的连通，便于研究不同培养区的同型和异型细胞相互作用。

4、本发明的集成微流控芯片可开展两种以上不同类型细胞的相互作用研究，突破了以往的两种细胞相互作用研究模式，有利于探索生理或病理情况下各种生物体和组织器官内不同种类细胞的协作与拮抗。

附图说明

图1是集成微流控芯片的流动层和控制层平面结构示意图，其中标号分别表示：1、2为流动层管道进样口，3、4为流动层管道出样口，5、6、7和8为控制层微阀开关的进气口，9、10、11和12为微型细胞培养区，13为相邻培养区的连接管道，14为控制层的微阀开关。

图2是微阀开关关闭状态的微流控芯片截面图，其中标号分别表示：21为流动层单个管道，22为关闭状态的控制层微阀开关，23为控制层微阀开关的进气管道，24为控制层微阀开关的进气口。

图3是流动层管道半关闭状态的微流控芯片截面图，其中标号分别表示：31为半开启状态的微阀开关，32为低气压气体进入微阀开关管道。

图4是流动层管道完全关闭状态的微流控芯片截面图，其中标号分别表示：41为完全开启状态的微阀开关，42为较高气压气体进入微阀开关管道。

图5是集成微流控芯片内定位接种第一种细胞的示意图，其中51为关闭状态的微阀开关，52为完全开启状态的微阀开关，53为第一种细胞。

图6是集成微流控芯片内定位接种第一种细胞后清洗的示意图，其中61为清洗液进入路线。

图7是集成微流控芯片内定位接种第二种细胞的示意图，其中71为第二种细胞。

图8是集成微流控芯片内定位接种第二种细胞后清洗的示意图，其中81为清洗液进入路线。

以下结合附图和发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明。

具体实施方式

实施例1：

如图1所示，本实施例制备的集成微流控芯片，由流动层、控制层和覆盖层(自上而下)三层组成。其中，流动层周边设有八个进样口(如图标号1、2处，每处4个)以及两个出样口(如图标号3、4处)，中间设有四个圆形细胞培养腔(如图标号9、10、11、12)，通过细管道13将相邻的腔体两两连接以进行细胞相互作用研究。

控制层设有共二十八个进气口(如图标号5、6、7、8处，每处7个)，分别连接单个管道末端封闭的微阀开关。

微流控芯片的制作(以PDMS微流控芯片的制作为例)：

1、采用软光刻技术制备芯片模子，首先将流动层和控制层的设计结构制成光掩膜；然后进行光刻胶(SU-8)涂膜、使用曝光机进行紫外曝光，随后用显影剂进行显影，从而制备出芯片模子，其中流动层模子的厚度为40μm；控制层模子的厚度为25μm。

2、微流控芯片的制备：将聚二甲基硅氧烷(PDMS)预聚物分别覆盖于流动层和控制层模子表面，其中流动层所用PDMS预聚物(合成橡胶∶交联剂，比例为5∶1)，控制层所用PDMS预聚物(合成橡胶∶交联剂，比例为20∶1)，分别烘烤固化，然后将流动层和控制层在显微镜下校对粘合。将该双层以控制层表面粘合于涂有均匀PDMS预聚物(合成橡胶∶交联剂，比例为5∶1)的覆盖层的玻片上封装。最后放入烘箱内烘烤，加速层层粘合，从而制备出PDMS集成微流控芯片。

实施例2：

控制层进气口上的微阀开关对流动层管道的控制如图2所示，进气口24未进气时，微阀开关管道23内处于大气压状态，微阀开关22则处于关闭状态，此时流动层管道21畅通，管道内样品可任意出入；当较低压强(20psi)气体32进入微阀开关管道时(图3所示)，微阀开关31膨胀而呈现凸起，使流动层管道处于半关闭状态；进一步，如图4所示，当较高压强(40psi)气体42进入微阀开关管道时，微阀开关41与流动层管道完全紧贴，封闭了流动层管道，从而达到控制流动层管道内样品出入的目的。

实施例3：

本实施例以微流控芯片内进行肝癌细胞和成纤维细胞定位培养为例。

1、首先将制备的实施例1中的微流控芯片进行高压灭菌，然后对流动层管道和腔体进行清洗(采用微量注射泵进样，清洗液选用0.01M的PBS，pH＝7.4，流速25μL/min，时间15min)，再对流动层管道和腔体的表面进行包被修饰(包被修饰物选用多聚-L-赖氨酸，100μg/mL，37℃，2h)，再清洗(同样采用微量注射泵进样，清洗液选用0.01M的PBS，pH＝7.4，流速25μL/min，时间15min)，无菌气体吹干，待用。

2、制备肝癌细胞和成纤维细胞悬液，本实施例中选用肝癌细胞系细胞(HepG2细胞)和成纤维细胞系细胞(NIH 3T3细胞)，通过常规体外细胞培养，进行细胞数目的扩增。临用时将细胞分别消化，离心，重悬，细胞密度调整为10⁶个细胞/mL。

3、细胞进样，首先对肝癌细胞进行进样(如图5所示)，将肝癌细胞培养区和细胞进样路线的微阀开关关闭，其它细胞培养区和管道的微阀开关开启，形成单一通路，配合微量注射泵，将肝癌细胞接种于特定的培养区内；开启肝癌细胞培养区微阀开关(如图6所示)，使肝癌细胞定位于该区域，然后对进样路线中的周边管道进行清洗(DMEM细胞培养液)，以便于进行下一种细胞的进样，防止不同种类细胞的交叉污染。静置20min，促进细胞贴壁。第二步，成纤维细胞进样(如图7所示)，将成纤维细胞培养区和细胞进样路线的微阀开关关闭，其它细胞培养区和相关管道的微阀开关开启，配合微量注射泵，将成纤维细胞接种于特定的培养区内；开启成纤维细胞培养区微阀开关(如图8所示)，关闭该培养区，然后对进样路线中的周边管道进行清洗，并静置10min。

4、芯片内细胞的培养，参照生物体体内状态，尽量保障相对静态的细胞生长环境，采用隔时微量进样方式，配合微量注射泵进样功能，对芯片内细胞进行营养的供给(细胞培养液)，每2小时进样一次，每次1min，进样速率为5μL/min，此时4个细胞培养区的微阀开关均为关闭状态。细胞生长和细胞行为则通过倒置显微镜进行定时观察、记录。

Claims

1.一种集成微流控芯片，其特征在于，该集成微流控芯片的材料为聚二甲基硅氧烷，用于对两种以上不同种类的细胞在集成微流控芯片的不同区域进行定位接种和共培养以及开展多种细胞的相互作用研究，其结构由自上而下的流动层、控制层和覆盖层组成，其中，流动层由一个微米级管道网络和四个圆形细胞培养腔组成，流动层周边设有八个进样口和两个出样口，中间设有四个圆形细胞培养腔，圆形细胞培养腔之间通过细管道将相邻的培养腔两两相连；控制层设有二十八个进气口，进气口上分别连接单个管道末端封闭的微阀开关，覆盖层则是对控制层的管道进行封装；

所述的控制层进气口上的微阀开关，分别用于对流动层不同管道位置的样品输入和输出进行时间和空间的控制：

当进气口未进气时，微阀开关管道内处于大气压状态，则微阀开关处于关闭状态，此时流动层管道畅通，管道内样品可任意出入；

当较低压强的气体进入微阀开关管道时，微阀开关膨胀而呈现凸起，使流动层管道处于半关闭状态；

当较高压强的气体进入微阀开关管道时，微阀开关与流动层管道完全紧贴，封闭流动层管道。

2.权利要求1所述的集成微流控芯片的制备方法，其特征在于：该方法首先将流动层和控制层的设计结构制成光掩膜；然后进行光刻胶涂膜、紫外曝光、显影，制备芯片模子；将聚二甲基硅氧烷覆盖于流动层和控制层模子表面，分别烘烤固化，然后将流动层和控制层在显微镜下校对粘合，制成集成微流控芯片。