CN101007999B - 可透见的三维空间细胞培养系统及其在组织细胞和新生器官培养中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种三维细胞培养系统，它包括：容器，在容器内含有细胞培养基及三维细胞培养单元，所述三维细胞培养单元含有可植入细胞并利于细胞黏附和长期生长、分化、成熟的空腔。所述三维空间培养单元是可透见的，可动态观察细胞的黏附、扩伸、移行、增生、分化、成熟、衰老、死亡及发展形成组织或器官。本发明的系统可用于长期培养细胞和生产大量细胞作为组织工程的种子细胞，还可在短期内形成再生组织和微器官以供移植治疗。此外，本发明系统为肿瘤的体外研究提供了独特的环境，可帮助肿瘤诊断，观察肿瘤浸润和转移，筛选抗肿瘤药物。亦用于离体培养各种细胞，以及用于研究细胞内在的基因程序改变和细胞外环境变化对细胞的影响等。

Description

可透见的三维空间细胞培养系统及其在组织细胞和新生器官培养中的应用

技术领域

本发明属于细胞生物学和组织工程领域，具体涉及一种三维空间细胞培养系统及其在组织细胞和新生器官培养中的应用。 

背景技术

组织细胞培养是研究正常、病变和恶性细胞的一个重要方法。利用组织和细胞培养技术可在体外的特定条件下观察、设定或改变不同类型的细胞的激活、增生、分化、移行、成熟、衰老、脱落乃至细胞死亡的整个过程和其调控机制。在过去的50多年中组织细胞培养对基础医学科学研究的发展和临床治疗的改进起了重要的推动作用。 

临床所见到的多种疾病或外伤均可引起细胞的变性坏死或损伤，进而导致组织器官的功能受损或丧失。这是人类疾病和死亡的主要原因。同时也是目前人类对许多疾病，由其是对一些严重危害人类健康和生命的常见病和多发病缺乏有效治疗方法的根本性原因。例如临床所用的各种治疗方法对糖尿病，慢性肝炎，肝硬化，多种中枢神经系统病变，如巴金森氏病，老年痴呆症，中风和脊髓受伤，以及各种癌症仅能取得对症治疗，缓解症状的效果。因为这些治疗方法通常并不能取代变性坏死的细胞，也不能恢复组织器官的正常结构和其功能。所以难以达到从根本上治愈这些疾病的目的。而组织细胞培养技术本身也生产大量的各种不同类型的细胞，这些组织细胞可作为细胞治疗的来源，用以治疗许多传统性药物治疗所不能治愈的急性和慢性疾病，包括多种退行性和变性性疾病。这些细胞可直接用于细胞移植，或种植在生物可降解材料上再回植入机体，以达到用来取代变性坏死的组织细胞，修复组织器官的结构和恢复其正常的功能。 

传统的组织细胞培养方法是在平面，也就是二维空间状态下培养细胞，这是一种简便易行的方法，便于观察所要研究的被培养的细胞，并可获得一定程度的细胞的增生。但细胞在这种状态下生长很容易发生拥挤现象，导致细胞之间的接触抑制、同时暴露于培养液的细胞表面积减少，细胞黏附面积有限。由于缺乏细胞和细胞之间，以及细胞和细胞基质的交互作用这一体内的细胞和组 织生长所特有的必要的条件，细胞的增生受到一定的限制，细胞的功能低下，不能达到类似于活体状态下的组织构架的形成和细胞功能的充分表达。 

尽管人们作了一些改进，例如将细胞培养在与基底膜成分有关的自然物质上，比如让细胞生长在胶原和其它细胞基质上，但仍不能获得细胞的长期生长和终末期分化，以及细胞功能的充分表达。因此二维空间的单层细胞培养并不能产生三维的组织和器官，而只是细胞的伸展，细胞常常变为欠分化的细胞并缺乏正常细胞所应有的功能。 

三维组织细胞的培养是将细胞培养在事先准备好的三维细胞培养材料或支架上，或是生物可降解的三维空间结构中，然后再进行培养。三维空间的结构和环境可为细胞黏附提供更大的表面积，可以减少或者避免单层二维空间培养时的细胞接触抑制。同时三维空间为细胞的生长提供了类似于体内的生长环境，充分保障了细胞之间和细胞与细胞外基质之间的交互作用，有利于细胞的移行和运动，维持了分化细胞的表型。总之，组织细胞培养的三维空间结构和环境促进了细胞的黏附和增生，形态上的成熟，以及细胞功能的完善。 

目前所采用的各种不同三维空间的培养系统虽然比二维空间培养方法有了明显的改善，但仍有一些不足之处。以胶原为支架的技术有一大限制，即由于位于支架深部的细胞缺乏营养，细胞倾向于生长在胶原支架的表面。如以matrigel作为细胞外基质时，所培养的细胞与这一基质分离时要用酶来降解或溶解胶，这可造成细胞损伤。有些基质缺乏良好的生物相容性，有可能导致细胞毒性，或致畸或致瘤作用。有些基质的生物降解性较差，不利于细胞种植治疗和组织移植或植入。另外，大多支架材料不具有可透见性，难以对所培养的组织细胞直接进行随时和动态观察，尤其是在不破坏“标本”的条件下。此外，目前所采用的三维空间培养系统尚未能获得所培养的细胞能够维持长久细胞增殖。现有方法所产生的细胞数量尚不足，组织的大小或厚薄不够，缺乏应有的强度，尚不能成熟分化生长成类似于正常体内组织和器官所特有的形态。 

因此，迫切需要建立一个较为完善的三维组织细胞空间培养系统，所述系统应有利于细胞的增生和成熟，并且有利于对细胞的观察以及有利于将细胞从培养系统中分离。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种理想的三维细胞培养系统，所述三维细胞培养系统可为细胞提供一个近似于体内生长的三维空间。 

本发明的目的还在于提供所述三维细胞培养系统的各种用途。 

在本发明的第一方面，提供一种三维细胞培养装置，所述系统包括： 

(a)容器，在容器内装有液态细胞培养基；以及 

(b)位于所述液态细胞培养基中的三维细胞培养单元，其中所述的三维细胞培养单元内包括用于培养的空腔以及界定所述空腔的空腔壁，所述的空腔壁含有有利于细胞黏附和长期生长的生物可降解的材料，并且所述的空腔壁可透过以下物质：营养成分、细胞代谢产物。 

在另一优选例中，营养成分包括但不限于：氧气、蛋白质、糖、脂肪、维生素、激素。 

在另一优选例中，代谢产物包括但不限于：二氧化碳、细胞代谢产物。 

在另一优选例中，所述的空腔壁含有80-100wt％的生物可降解材料。 

在本发明的一个优选例中，所述的空腔的横截面积为0.1-100mm²，长度为1-1000mm，所述空腔壁的厚度为0.1-10mm。 

在另一优选例中，所述的空腔壁的厚度为0.1-6mm；更优选的，所述的空腔壁的厚度为0.1-2mm。 

在本发明的一个优选例中，所述的空腔壁可透过液态细胞培养基。 

在另一优选例中，所述的空腔壁基本上没有肉眼可见的孔(如直径大于2mm孔)。 

在另一优选例中，所述的生物可降解的材料为在较高温度下(如50-100℃)熔解，常温下(如25-37℃)凝固的材料；或在低温下(如4℃)呈液态，常温下(如25-37℃)凝固的材料。 

在本发明的一个优选例中，所述的生物可降解的材料是生物可降解物质形成的凝胶，其中所述的生物可降解物质选自：琼脂、琼脂糖、水凝胶、胶原，Matrigel、或其组合。 

在另一优选例中，所述的生物可降解的材料是可透见的，透明或半透明的生物可降解材料。 

在另一优选例中，所述的生物可降解的材料中，生物可降解物质的浓度为0.1-10g/100ml生物可降解材料(即0.1-10％)。 

较佳地，所述的生物可降解的物质可用50-99.99％以下物质溶解：水、生理盐水、PBS缓冲液、或含有细胞外基质，生长因子，激素，维生素的细胞培养液。更优选的，所述的生物可降解的材料中含有80-99.5％的以下物质：水、生理盐水、PBS缓冲液、或含有细胞外基质，生长因子，激素，维生素的细胞培养液。 

在另一优选例中，所述的生物可降解的物质的溶剂包括但不限于：水、生理盐水、PBS缓冲液、或细胞培养液。 

在另一优选例中，所述的生物可降解的物质的浓度为0.1-5g/100ml生物可降 解材料(0.1％-5％)；更优选的，所述的生物可降解的物质的浓度为0.5g/100ml-2g/100ml(0.5％-2％)。 

在另一优选例中，所述的生物可降解的物质为琼脂或琼脂糖，浓度为0.1-10g/100ml生物可降解材料(0.1-10％)；更优选的，所述的琼脂或琼脂糖的浓度为0.1-5g/100ml生物可降解材料(0.1％-5％)。在本发明的一个优选实施例中，采用了琼脂作为生物可降解的物质，其浓度为1g/100ml生物可降解材料(1％，生物可降解物质用PBS缓冲液作为溶剂)。 

在本发明的一个优选例中，所述的空腔为长条形，并且其界面形状选自：长方形、正方形、圆形、椭圆形、卵形、五角形、六角形、或螺旋形； 

或者所述的空腔的形状对应于器官的形状。 

一些优选的空腔为长方体(即内腔横截面是方型或长方形，或近似于方型或长方形)、正方体(即内腔横截面是方型或长方形，或近似于方型或长方形)、圆柱体(即内腔横截面是圆形或椭圆形，或近似于圆形或椭圆形)。 

在另一优选例中，所述的空腔的横截面积为0.2-60mm²，长度为3-600mm；更优选的，所述的空腔的横截面积为0.5-30mm²，长度为5-300mm。 

在另一优选例中，所述的空腔为一种长方体形状(横截面为长方形或近似于长方形)，空腔为长方体形状的培养单元适合于需要较大的表面黏附面积的细胞生长，如适合于形成条索状组织的细胞的培养。 

在另一优选例中，所述的空腔为一种圆柱体形状(横截面为圆形或近似于圆形)，空腔为圆柱体形的培养单元适合于需要生长、发展为微器官或实体器官的细胞的培养。 

在另一优选例中，所述的空腔为哺乳动物组织或器官的形状。 

在另一优选例中，所述的空腔两端是封闭的；或者，可选择的，所述的空腔两端是敞开的。 

在本发明的一个优选例中，所述的三维细胞培养单元中含有1-100个空腔。 

在另一优选例中，所述的三维细胞培养单元中含有2-50个所述空腔；更优选的，所述的三维细胞培养单元中含有2-10个所述空腔。 

在本发明的一个优选例中，所述的内层空腔壁的生物可降解的材料中还可添加细胞外基质、或营养成分。 

在另一优选例中，所述的细胞外基质可促进细胞黏附。 

在另一优选例中，所述的营养成分包括但不限于：细胞生长、分化、或增殖所必须或优选的培养基、蛋白质、脂肪、糖、维生素、细胞外基质、激素、生长因子、药理活性因子和/或微量元素等。 

在本发明的第二方面，提供一种培养细胞的方法，包括以下步骤： 

(1)提供一三维细胞培养单元，所述的三维细胞培养单元内包括用于培养的空腔以及界定所述空腔代谢产物的空腔壁，所述的空腔壁含有生物可降解的材料，并且所述的空腔壁可透过以下物质：营养成分、代谢产物。 

(2)将细胞引入到三维细胞培养单元的空腔中； 

(3)将(2)中带有细胞的三维细胞培养单元置于含有液态细胞培养基的容器中，并在适合生长的条件下培养细胞。 

在另一优选例中，营养成分包括但不限于：氧气、蛋白质、糖、脂肪、维生素、激素。 

在另一优选例中，代谢产物包括但不限于：二氧化碳、细胞代谢产物。 

在另一优选例中，所述的细胞可以是任何细胞，包括但不限于：真核细胞、原核细胞、动物细胞、植物细胞、或单细胞微生物，哺乳动物组织或器官细胞、肿瘤细胞、干细胞、各种主要组织细胞、各种实体肿瘤细胞。 

在另一优选例中，所述的哺乳动物组织或器官细胞包括但不限于：神经细胞、肌肉细胞、胰岛细胞、肝脏细胞、肠细胞、肾细胞、脑细胞、心细胞、肌肉细胞、骨细胞、肝细胞、胃细胞、皮肤细胞、泌尿生殖系统细胞、神经系统细胞、免疫系统细胞、脾细胞、骨髓细胞、淋巴结细胞。 

在另一优选例中，所述的肿瘤细胞为各种良性或恶性肿瘤细胞，如各种肝癌细胞、乳腺癌细胞、胃癌细胞、前列腺癌、肺癌细胞、脑肿瘤细胞、卵巢癌细胞、骨肿瘤细胞、结肠癌细胞、甲状腺肿瘤细胞、纵隔肿瘤细胞、小肠肿瘤细胞、肾肿瘤细胞、肾上腺肿瘤细胞、膀胱肿瘤细胞、睾丸肿瘤细胞、恶性淋巴瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、神经系统肿瘤细胞。 

在本发明的第三方面，提供所述的三维细胞培养装置的用途，用于离体培养细胞。 

所述的细胞可以是任何细胞，包括但不限于：真核细胞、原核细胞、动物细胞、植物细胞、或单细胞微生物，哺乳动物组织或器官细胞、肿瘤细胞、干细胞、各种主要组织细胞、各种实体肿瘤细胞。 

在另一优选例中，所述的哺乳动物组织或器官细胞包括但不限于：神经细胞、肌肉细胞、胰岛细胞、肝脏细胞、肠细胞、肾细胞、脑细胞、心细胞、肌肉细胞、骨细胞、肝细胞、胃细胞、皮肤细胞、泌尿生殖系统细胞、神经系统细胞、免疫系统细胞、脾细胞、骨髓细胞、淋巴结细胞。 

在另一优选例中，所述的肿瘤细胞为各种良性或恶性肿瘤细胞，如各种肝癌细胞、乳腺癌细胞、胃癌细胞、前列腺癌、肺癌细胞、脑肿瘤细胞、卵巢癌细胞、骨肿瘤细胞、结肠癌细胞、甲状腺肿瘤细胞、纵隔肿瘤细胞、小肠肿瘤细胞、肾肿瘤细胞、肾上腺肿瘤细胞、膀胱肿瘤细胞、睾丸肿瘤细胞、恶性淋巴瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、神经系统肿瘤细胞。

在另一优选例中，所述的三维细胞培养装置用于观察各种细胞的生长、增殖、分化、成熟、运动、或迁移。 

在另一优选例中，一个本发明的三维细胞培养装置中可培养至少一种细胞。 

在另一优选例中，一个本发明的三维细胞培养装置中培养两种或两种以上的细胞。 

在本发明的一个优选例中，所述的三维细胞培养装置可用于制备哺乳动物的组织或器官。 

在另一优选例中，所述的三维细胞培养装置用于制备各种哺乳动物的再生组织和微型器官。 

在另一优选例中，所述的三维细胞培养装置用于观察一种类型的细胞中各个体之间的相互影响，或用于观察两种或两种以上的细胞之间的相互影响。 

在另一优选例中，所述的三维细胞培养装置用于进行种子细胞的培养。 

在另一优选例中，所述的三维细胞培养装置用于培养肿瘤细胞，观察肿瘤细胞的生长、增殖、分化、运动、浸润、转移。 

在另一优选例中，所述的三维细胞培养装置用于体外研究各种细胞在不同生理状态和病理情况时的反应和变化。 

在另一优选例中，所述的三维细胞培养装置用于培养基因工程重组细胞，如含有外源基因的大肠杆菌细胞，含有外源基因的CHO细胞等。 

在另一优选例中，所述的三维细胞培养装置用于肿瘤高转移细胞株和干细胞的分离鉴定。 

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。 

附图说明

图1是本发明的一种三维细胞培养单元的预制模具的示意图(模具两端的盖套忽略)。其中，图1A为本发明的三维细胞培养单元的模具的正视示意图，图1B为本发明的三维细胞培养单元的模具的侧视示意图。在一种方形外套中预置三根方形条索，在所述装置的外套中可注入生物可降解的材料，待所述生物可降解的材料凝固后取出条索即可形成供种植细胞的管道。图中所示1为外套；2为条索。 

图2A和图2B本发明的三维细胞培养单元的模具的立体示意图，其中，图2A为从正面看的立体图，图2B为从上侧看的立体图。图中所示1为外套；2 为条索。 

图3显示了细胞种植入本发明的方形和圆形的三维空间细胞培养单元的比较。图3A是细胞种植入空腔横截面为方形的细胞培养单元的结果，图3B是细胞种植入空腔横截面为圆形的细胞培养单元的结果。 

图4所示肝癌细胞株SMMC7721在在一般的二维培养系统和本发明的三维培养系统中生长的比较和观察。其中图4A为在传统二维培养系统中肿瘤细胞SMMC7721的培养生长情况；图4B、图4C和图4D分别是在本发明的培养系统中肿瘤细胞SMMC7721的培养生长情况。 

图5所示胰岛β细胞瘤细胞MIN6在一般的二维培养系统和本发明的三维培养系统中生长的比较和观察。其中图5A为在传统二维培养系统中肿瘤细胞MIN6的培养生长情况；图5B、图5C和图5D分别是在本发明的培养系统中肿瘤细胞MIN6的培养生长情况。 

图6是一种肝细胞株ATCC CRL 2254在一般的二维培养系统和本发明的三维培养系统中生长的比较。其中图6A为肝细胞ATCC CRL 2254在二维环境中培养生长的照片；图6B、图6C、图6D分别是肝细胞株ATCC CRL 2254在本发明的三维培养系统中的培养生长情况。 

图7是一种胰岛素瘤(insolinoma)细胞株ATCC CRL 11506在一般的二维培养系统和本发明的三维培养系统中生长的比较。其中，图7A为胰岛素瘤(insolinoma)细胞株ATCC CRL 11506在二维培养系统中的培养生长情况；图7B、图7C、图7D分别为胰岛素瘤(insolinoma)细胞株ATCC CRL 11506在本发明的三维培养系统中的培养生长情况。 

图8是正常人骨骼肌肌细胞在一般的二维培养系统和本发明的三维培养系统中生长的比较。其中，图8A为肌细胞在二维培养系统中的培养生长状况；图8B、图8C、图8D为肌细胞在本发明的三维培养系统中培养生长状况。 

图9显示了代表神经细胞的雪旺氏细胞(来源于小鼠的坐骨神经)在一般二维培养系统和本发明的三维培养系统中的比较。其中，图9A为雪旺氏细胞在二维培养系统中生长的照片；图9B、图9C、图9D为雪旺氏细胞在本发明的三维培养系统中生长的照片。 

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，发现一种三维细胞培养系统可为细胞提供一个近似于体内生长的三维空间的理想环境，将各种细胞在所述的三维细胞培养系统中培养，可使细胞更好地生长、分化、成熟，并且有利于一些细胞形成具有与体内组织器官类似的组织结构。基于此完成了本发明。 

三维细胞培养装置(系统) 

如本发明所用，“三维空间细胞培养系统”，“三维细胞培养系统”，“三维空间培养系统”，“三维空间细胞培养装置”、“三维细胞培养装置”，“三维空间培养装置”可互换使用，都是指用于细胞培养的、可为细胞提供近似于体内生长环境的三维细胞培养系统。 

在本发明中，所述三维细胞培养系统包括： 

(a)容器，在容器内装有液态细胞培养基；以及 

(b)位于所述液态细胞培养基中的三维细胞培养单元，其中所述的三维细胞培养单元内包括用于培养的空腔以及界定所述空腔的空腔壁，所述的空腔壁含有生物可降解的材料，并且所述的空腔壁可透过以下物质：营养成分如氧气、蛋白质、糖、脂肪、维生素、激素等，以及二氧化碳等代谢产物。 

三维细胞培养单元 

本发明提供了一种三维细胞培养单元，所述的三维细胞培养单元由生物可降解的材料制成，其中含有至少一个空腔(也可称为管腔、内腔、或管道)。细胞可在所述的空腔中生长。 

在本发明的一个优选方式中，所述的三维细胞培养单元为一种可透见的三维细胞培养单元，所述的三维细胞培养单元由生物可降解的透明材料制成。 

本发明的三维细胞培养单元可由多种生物可降解的材料(优选的，所述材料为透明或半透明的材料)制成。所述生物可降解的材料是一种在一定的温度下可形成流体状、而在另一种温度下又可凝固成固体凝胶状的材料，比如可以是琼脂、琼脂糖、水凝胶、胶原，Matrigel等或其组合。 

在本发明中，所述的生物可降解的材料是生物可降解物质形成的凝胶，其中所述的生物可降解物质选自：琼脂、琼脂糖、水凝胶、胶原，Matrigel、或其组合。所述生物可降解的材料可预先制备成液体状，注入到预先设计的预制模具中，待其凝固后，形成所需的内在和外在形状。应理解，任何传统用于二维细胞培养系统(如细胞培养平板)培养、且可形成一定的固态形状的生物可降解材料(如可凝固成固态的细胞培养基)都可用于本发明制成三维细胞培养单元。 

在配制所述生物可降解材料时，所述的生物可降解的物质的溶剂包括但不限于：水、生理盐水、PBS缓冲液、或细胞培养液。所述的细胞培养液可以是一种适合于所需培养的细胞生长、分化、迁移等的液体培养基。 

在本发明中，所述的生物可降解的物质的浓度为0.1-10g/100ml生物可降解材料(即0.1-10％)；在另一优选方式中，所述的生物可降解的物质的浓度为 0.1-5g/100ml生物可降解材料(0.1％-5％)；更优选的，所述的生物可降解的物质的浓度为0.5-2g/100ml生物可降解材料(0.5％-2％)。 

在另一优选方式中，所述的物可降解的物质为琼脂或琼脂糖，浓度为0.1-10g/100ml生物可降解材料(0.1-10％)；更优选的，所述的琼脂或琼脂糖的浓度为0.1-5g/100ml生物可降解材料(0.1％-5％)。在本发明的一个优选实施例中，采用了琼脂作为生物可降解的物质，其浓度为1g/100ml生物可降解材料(1％，用PBS缓冲液作为溶剂)。 

较佳地，所述的生物可降解的材料可用50-99.99％以下物质溶解：水、生理盐水、PBS缓冲液、或含有细胞外基质，生长因子，激素，维生素的细胞培养液。更优选的，所述的生物可降解的材料中含有80-99.5％的以下物质：水、生理盐水、PBS缓冲液、或含有细胞外基质，生长因子，激素，维生素的细胞培养液。 

根据细胞培养的需要，所述三维细胞培养单元可以是多种多样的形状。比如长方体、正方体、圆筒形等；优选的，本发明的三维细胞培养单元是一种长方体或正方体或是一种与哺乳动物组织或器官形状相似的结构。所述三维细胞培养单元的形状和大小可根据细胞培养的具体需要而定。 

根据细胞培养的需要，所述三维细胞培养单元内的空腔可以是多种多样的形状。比如长方体(即内腔横截面是方型或长方形的，或近似于方型或长方形)、正方体(即内腔横截面是方型或长方形的，或近似于方型或长方形(如三角形、梯形))、圆筒形(内腔横截面是圆形或椭圆形的，或近似于圆形或椭圆形(如六边形))等；优选的，本发明的三维细胞培养单元内的空腔是一种长方体或正方体或是一种与哺乳动物组织或器官形状相似的结构，更优选的，本发明的三维细胞培养单元内的空腔是长方体结构或是与哺乳动物组织或器官形状相似的结构。并且，所述的空腔两端是封闭的或是敞开的。在一种特别优选的方式中，当所述的三维细胞培养单元内的空腔是一种方形结构时，圆形的细胞位于方型的空腔中，可为细胞的黏附提供较大的表面积。因此，相对于圆形而言，方型的空腔更有利于条索形组织的生长和形成。 

所述空腔的形状和大小可根据细胞培养的具体需要而定，优选的，所述的空腔的横截面积为0.1-100mm²，长度为1-1000mm。比如其可以为一种长方体形状，长度可以为1-1000mm，更优选的为2-600mm，最优选的为5-300mm；宽度可以为0.1-10mm，更优选的为0.2-5mm，最优选的为0.2-2mm；高度可以为0.1-10mm，更优选的为0.2-5mm，最优选的为0.2-2mm。比如，在本发明的一个实施例中，三维细胞培养单元中的空腔为一种长方体形状，其尺寸为：长度为100mm，宽度为6.5mm，高度为3mm，壁厚度为0.5mm。 

所述的三维细胞培养单元内的空腔的数量根据细胞培养的具体需要而 定，比如可以为1-100个，更优选的为2-50个，最优选的为2-10个。 

另外，根据培养细胞的要求不同，本发明的三维细胞培养单元或其中的空腔还可制备成模仿哺乳动物体各种组织或器官(比如条索状组织如神经和肌肉，或是实体器官如肝脏和胰腺等)的形状，以便于细胞按照所需的要求进行生长和/或分化。 

在本发明的生物可降解材料中可添加一种或多种有利于细胞黏附的细胞外基质，或细胞培养所必须的营养成分、生长因子、激素和/或微量元素，根据不同的细胞，所需要的成分也是不同的。比如，对于肝细胞，可添加肝细胞生长因子，应理解，各种细胞在进行培养时所需要的不同成分是本领域技术人员所已知的。 

三维细胞培养单元的制作 

本发明的三维细胞培养单元可以通过手工制作、机器压制、模具塑形等各种方式来进行制作。在本发明的一个优选例中，采用模具塑形的方式进行制作，使用一种外套管，其中放置至少一根细条索，将生物可降解的材料熔解后灌注于其中，待其凝固后去除外套管和细条索，即制成本发明的三维细胞培养单元。 

本发明的三维细胞培养单元的外套管可以根据需要制成不同的形状，比如长方体、正方体、圆筒形、哺乳动物体各种组织或器官形状等；在本发明的一个优选例中，所述形状为长方型。所述外套管的材料可以是任何可塑形的、有一定牢固性、不易变形且不易降解的材料，比如可为金属，玻璃、陶瓷或塑料等。 

外套管的形状和大小可根据细胞培养的具体需要而定，比如其可以为一种长方体形状，长度可以为1mm-1200mm，更优选的为2mm-300mm，最优选的为5-80mm；宽度可以为1mm-700mm，更优选的为2mm-300mm，最优选的为2-50mm；高度可以为0.5-600mm，更优选的为1mm-200mm，最优选的为1-30mm。比如，在本发明的一个实施例中，采用一种长方体外套管，其尺寸为：长度为100mm，宽度为6.5mm，高度为3mm，壁厚度为0.5mm。 

在外套内可预先置放至少一根细条索，在注入细胞培养材料且凝固后，抽出细条索，留出的管腔内用于培养细胞。所述的细条索可以是与外套管相对应的各种形状，比如长方体、正方体、圆柱形等。所述的细条索可以是由任何有一定牢固性且不易变形和降解的材料制成，比如可以是金属、玻璃或塑料等。根据所需要的空腔的大小来设计细条索的大小。 

所述细条索在外套内的数量根据细胞培养的具体需要而定，比如可以为 1-100根，更优选的为2-50根，最优选的为2-10根。比如，在本发明的一个实施例中，采用一种方型金属丝，其长度为200mm，宽度和高度各为0.9mm。 

并且，外套管的两端可以由与外套管以及细条索相匹配的盖套密封。根据外套管和细条索设计的不同，所述盖套的形状和大小也是不同的。 

具体的代表性的三维细胞培养单元的模具如图1所示。 

细胞培养 

利用本发明的三维空间培养系统进行细胞培养的特点是细胞可以在三维空间中长期生长、增生、分化、成熟，而区别于传统的二维培养。 

位于三维细胞培养单元中细胞的三维空间生长是通过如下方式实现的：通过三维细胞培养单元为细胞的生长提供近似于体内生长的空间和结构，同时也可提供利于细胞黏附和生长的细胞外基质和生长因子，此外，还可用两种或多种细胞的共同培养，促进细胞和细胞基质以及细胞和细胞之间的交互作用。前述一种或多种方式的结合为细胞提供了理想的生长环境。 

本发明的三维细胞培养系统可用于培养任何种类的细胞，可在制作所述三维细胞培养单元时先将细胞生长、增生、分化、迁移所需的营养成分添加到所述三维细胞培养单元中，再在其中引入细胞，直接进行细胞培养；或者可选择地，可在三维细胞培养单元中将细胞和细胞外基质和生长因子共同引入；或者可选择地，可在三维细胞培养单元中先引入细胞，再将带有细胞的三维细胞培养单元浸入到含有细胞培养所需营养成分的培养基中。所述的培养基一般是一种液体培养基。 

在本发明的一个优选方式中，在采用本发明的细胞培养系统培养细胞之前，将细胞按照通常的方法培养至细胞长满到80％-90％时消化，消化后的细胞用毛细管作用引入三维细胞培养单元的内在管腔。根据不同的应用，细胞也可以和各种细胞外基质，比如各种类型的胶原混合，一起引入管腔，或用其他常用的方法注入管腔。 

在注入细胞后，将内腔中含有细胞的三维细胞培养单元放入所需的培养液中，放于所需的常规的二氧化碳培养箱中培养。也可放入生物反应器中培养。 

组织器官的形成和发育 

组织器官的形成本身就是一个复杂的三维过程，本发明所提供的三维空间培养系统为组织的形成提供了一个良好的空间，并引导其结构的发育形成。在本发明的三维空间培养系统中细胞可长期生长，增生，保持细胞的特有功能，更为重要的是，细胞培养在这一系统中生长，分化，成熟形成相应的再生组织 和新生的微型器官，具有多种多样的特性。 

在器官移植中，目前对于提供发育完整的来自机体本身的自然机体的器官，尚无法做到离体培养和维持其正常生理功能。本发明的三维空间培养系统提供了一个近似于所述条件的环境，即把相应的细胞以三维的形式细胞培养在本发明的三维空间培养系统中，使其生长，分化，成熟形成相应的再生组织和新生的微型器官。然后再移植入所需要的部位，利用机体本身的生物学特性来生长。 

从细胞到成熟的器官还有大量的工作并需要一定的时间，本发明的三维空间培养系统有利于实现从细胞替代治疗到组织替代治疗乃至器官替代治疗的突破。这对于基础科学的研究和临床医学的应用均有重大的意义。 

从三维细胞培养单元中获取培养物 

由于在本发明的三维细胞培养系统中，三维细胞培养单元的制备采用了生物可降解的材料，因此所述材料不仅有利于在三维细胞培养单元的空腔壁内外进行物质交换，而且还有利于获取细胞或由细胞发展而成的微器官或组织。 

本领域技术人员应理解，可采用多种化学和物理的方法从所述的三维细胞培养单元中获取细胞。 

比如，可通过切割工具，将所述的三维细胞培养单元的空腔壁切开，从而获取所述的培养物。 

并且，也可以采用生物化学降解的方法来获取所述的培养物，比如，可以用胶原酶消化胶原来获取所述的培养物。 

细胞生长、运动的动态观察 

在本发明的一种优选方式中，本发明的三维空间培养单元是可透见的，在细胞培养实验中可随时动态观察所述三维空间培养单元中培养的细胞乃至所发展形成的组织和器官的整个过程。不仅可研究细胞的黏附，扩伸，移行，增生，分化，成熟，衰老，以至死亡的过程。而且可在体外进一步了解组织和器官的发展和形成过程，为从组织和器官这一高级的层次研究提供了理想的工具和条件。可以在不破坏“标本”的条件下，对所培养的组织细胞直接进行随时的动态观察。 

细胞间相互影响的观察 

根据各种不同的需要和具体的实验条件，两种或两种以上的细胞可在本发明的培养系统中共同或分别培养，籍以观察细胞与细胞之间，或细胞与细胞外 基质之间的交互作用和影响，如细胞间的分化诱导，激活，接触性和非接触性诱导，分化抑制和细胞外物质的介导作用，如近距离介导的细胞外基质和黏附分子，和远距离介导的激素，细胞因子。还可以从细胞水平和分子水平来观察细胞之间的交互影响，例如不同细胞所分泌的激素，生长因子，受体，免疫球蛋白，细胞因子等的交互影响，并可研究激素的旁分泌，自分泌，细胞因子，神经肽，神经递质等共同组成的复杂的细胞间信号分子系统。多种细胞的复合培养技术还可改善细胞的存活和完善其功能。 

种子细胞的培养 

种子细胞一直是组织工程研究的核心问题之一，理想的种子细胞应是容易获取，易于体外培养增殖，长期传代并保持其生物学特征，组织修复能力强，携带患者自体全部基因组型的抗原性小的细胞，目前所用的自体细胞来源有限，易老化，有创伤性修复等特点，已成为组织工程发展的瓶颈。 

本发明的三维空间培养系统可用来培养细胞生长和生产大量细胞。一些从培养基质上脱落的细胞常常在悬浮状态下不能生长，短期内很快变性死亡。而在本发明的三维空间培养系统中，所述细胞可长期生长，增生，产生大量的细胞，所述细胞在三维空间这一类似于体内的生长环境中生长，保持其特有的功能和特性，因此不仅可产生大量可供进一步研究或应用的细胞，满足体内移植所需的细胞的数量，同时也可获得大量的细胞活性产物。 

形成再生组织和微型器官 

细胞在本发明的三维系统中聚集，组合，可在短期内形成再生组织和微型器官。所形成的细胞，组织和器官不但可以在不损伤标本的状态下随时观察和动态追踪，而且可在对细胞组织器官无任何化学伤害的条件下收获产品供移植或植入治疗。另外所培养的组织和器官很容易与所用三维空间的细胞支架分离，临床应用不用担心生物材料的组织相容性和生物降解性。本发明的系统培养所获得的小器官不仅可用于移植治疗，还可在移植后观察整体的组织和器官对移植物的系统支持。 

组织工程学是综合应用工程学和生命科学的基本原理，基本理论，基本技术和基本方法。其方法是在体外预先构建一个有生物活性的种植体，然后植入体内，修复组织缺损，替代组织和器官的一部分或全部功能。或作为体外装置，暂时替代器官部分功能，达到提高生存，生活质量，延长生命活动的目的。 

本发明的三维系统所采用的材料很容易塑形为类似于体内自然形成的组织和器官的各种构型，包括条索状组织如神经和肌肉，或是实体器官如肝脏和 胰腺等。辅之以允许细胞培养营养物质自由进入，代谢产物的自由排出，可为组织工程提供各种可选择的细胞移植，组织移植和器官移植。 

尽管现有的新型的生物材料已被用来生长类似于肝脏的组织，但在动物实验中仅可恢复单一的肝脏化学功能，并不能体现整个器官的肝脏功能。移植有结构，有功能的器官，即把合适的细胞以三维空间生长的形式植入所需要的部位，利用机体本身的生物特性来生长，将有利于改善临床疗效。 

生理状态和病理情况的体外研究 

由于本发明的系统所培养的细胞可长期生长并保持细胞特有的功能使其可作为体外研究细胞在不同生理状态和病理情况的模型。并且，其也可作为代谢的转换系统和待试器官来筛选细胞毒性物质，各种药物和生理活性分子，致畸或致瘤物质，生长调节因子。 

创造单纯的组织器官环境也可供研究组织器官所特有的功能。这在药物研究中具有广泛的用途。如研究药物代谢的改变，例如细胞色素的P-450的活性。 

本发明的系统具有能在各种可以任意调控的环境条件下观察细胞和组织，乃至新生器官的形态学。可用于观察激素，生长因子，营养物质，代谢产物和药理活性因子对其生长的影响，如可用于在细胞水平对药物的药理药效，毒理等进行研究和用于观察内在基因程序的调控。 

基因工程领域的研究 

目前常用的基因治疗技术虽然能通过把正常编码序列导入突变细胞，从而使突变的功能得到纠正，但导入基因的整合的表达难以精确控制，特别是使基因植入后对其他细胞产生的效应尚无法预知。 

本发明的系统有利于细胞的长期培养。产生的细胞可用于基因工程研究来表达基因产物，长期表达外源性基因，引入基因治疗或基因产物用于基因治疗，达到控制和治疗疾病的目的。也可导入外源性基因，把在特定发育阶段中起决定作用的基因导入细胞的基因组中，使其准确地分化为某一特定类型的细胞。或可改变细胞基因的表达，用于移植和回植，减少排异，改善移植治疗，作为辅助或根治措施。 

本发明的三维培养系统的用途还包括研究各种基因在不同时限和空间环境的关闭和开启，以及各种转录因子的表达上调或下降。作为治疗性基因的载体细胞，对损伤或病变部位施行基因治疗，移植后达到准确定位，高效表达。克服基因改变的细胞在体外不易稳定地被传染和增殖传代，以及在细胞更新中可能丢失治疗基因的问题。 

本发明的三维培养系统还可用于研究免疫系统的组织、细胞之间的交互影响，了解细胞如何参与免疫防御，免疫自稳和免疫监视，以执行识别自身和非己抗原物质。 

肝脏细胞的培养 

肝脏是人体的重要器官，人体的肝脏至少含有6种以上不同的细胞，它们可有规律地形成显微镜下可观察到的小叶结构。各种不同的细胞有其不同的功能，而且一种细胞的功能常依赖于它和其他细胞之间的交互影响。肝脏具有许多代谢和储存功能，如调节和合成蛋白质，凝血因子，脂蛋白等，并参与内源性和外源性化学物质的解毒和纯化。 

肝炎，肝硬化和肝癌等肝脏疾病是临床上的常见病。如何有效地治疗肝炎，肝硬化和肝癌等肝脏疾病一直是临床上的难题，目前有希望的治疗方法有原位肝移植，生物人工肝等，但这些方法都面临着肝源或肝细胞短缺的问题。为了形成可供移植用的器官，研究者必须更好地了解如何在近似于体内的环境下培养肝细胞，并提供其发挥它们的正常的生理功能的环境。 

人的肝脏细胞培养有相当的困难，因为这些细胞有分化的类型，所以限制了细胞的增殖的能力，此外，通常的细胞培养技术并不能使分化的细胞长期保留其功能。另外，在活体内研究肝脏的某一特有的功能是比较困难的，因为这些生理功能常常受到其他脏器的影响，例如肾脏，肠道和肺脏等。 

目前已有一些生物可降解材料被用于生长类似于肝脏的组织，但所获得的新生组织在动物实验中仅可恢复单一的肝脏的化学功能，或在不同程度上延长了肝细胞的功能，尚未能获得重复作为整个器官的肝脏的功能。 

在本发明的三维空间培养系统中肝细胞可长期生长，增生，保持细胞的特有功能，更为重要的是，细胞培养在这一系统中生长，分化，成熟形成新生的微型器官。这对研究肝细胞生长和功能，对研究肝脏的DNA的合成，激素的转录，翻译过程，代谢调节，胆汁的形成，分泌过程，肝细胞的代谢作用，包括致癌和致畸都是理想的工具。同时可用于基因治疗代谢性疾病，以及替代在肝病或肝细胞损伤中所损失的肝细胞，进而恢复其组织结构和正常功能，同时由于新生的微型器官具有包膜和分支管结构，可植入体内以供移植治疗。 

胰岛细胞的培养 

因胰岛素分泌缺乏而导致的糖尿病是危害人类健康的常见病。据统计世界上大约有150,000,000名患者。到目前为止对糖尿病的病因治疗尚无有效的方法。 

糖尿病的基本病理生理为绝对或相对胰岛素分泌不足，病理检查显示胰岛数量、大小和β细胞减少。在胰岛素依赖型糖尿病患者中，进行性的自身免疫反应不断摧毁正常的胰岛β细胞，导致机体胰岛β细胞减少，不能合成，储存和释放足够的胰岛素。胰岛素分泌缺乏的糖尿病患者对体内的葡萄糖水平不能进行正常的代谢和调节，引起体内葡萄糖增多和脂肪、蛋白质、电解质等代谢紊乱，进而导致一系列并发症。严重时发生糖尿病性昏迷而威胁生命. 

胰岛β细胞属于高度分化的细胞，其再生能力有限。因此，由于体内胰岛β细胞减少而导致的胰岛素依赖型糖尿病患者通常需要终身每天接受胰岛素治疗。近十多年来，人们对胰岛移植进行了广泛的研究，希望通过胰岛移植的方法为糖尿病患者提供更理想的治疗。但由于目前很难得到相当大量的胰岛β细胞，胰岛移植治疗方法的临床应用受到了很大的限制。 

本发明的三维空间培养系统可用来培养生产大量细胞。在所述的三维空间培养系统中细胞可长期生长，增生，产生大量的细胞，这不仅可产生大量可供进一步研究或应用的细胞，满足体内移植所需的细胞的数量。 

由于全胰腺移植所面临的许多问题，移植胰腺胰岛代表了糖尿病病人内分泌功能的最有希望的途径。胰腺细胞的体外扩增并使其成为真正的成熟的胰岛β细胞不仅是重要的生物学研究的工具，而且是重要的用于治疗的组织来源。本发明的三维空间培养系统所扩增的大量胰岛细胞可植入血管部位如大网膜和肠系膜以期改善临床疗效。 

神经和肌肉细胞的培养 

临床医学和基础医学都很重视神经修复的问题，中枢神经和周围神经的损害和病变常导致感觉和/或运动功能的部分或全部丧失。尽管过去的30年来人类对神经损伤再生，生长的生物学机制有了较为深入的了解，衍生了各种不同的治疗方法，但是很少能够获得功能性的恢复。与其他部位的组织损伤不同，神经损伤通常伴有随之而来的功能性的障碍，通常表现为感觉异常和/或功能障碍。 

目前对周围神经损伤的治疗方法，为取自体神经作为移植物，这需要获取和牺牲一段正常的神经，同时还有许多不利之处，如：供应部位的功能损失，手术伴随的危险性，供应部位形成神经瘤，可供选择的部位很有限，手术获取时损伤神经。 

神经再生的两个重要因素是轴突的生长的速度和质量，以及再生轴突的生长方向和特性，此外雪旺氏细胞在支持神经生长中起到几方面的关键性的作用，雪旺氏细胞可合成许多营养因子来支持神经的生存和和为轴突提供轴突生 长的引导方向。 

一些研究者在一定程度上成功地应用了其他可供选择的方法来解决神经损伤修复的问题，包括生物的和合成的神经定向支架，不幸的是，这些方法尚未在临床上证实其有效性。 

可生物降解的纤维也被用来引导轴突生长，由于绝大多数聚合物是不透明的，因此在移植前或移植治疗后均不能很直接观察细胞的生长情况，况且，所观察到的神经再生和功能恢复的效果也是有限的。 

近来所用的支架技术是基于用神经细胞或组织，以及细胞外基质加上生物可降解材料来提供一个包容性的细胞支架来促进轴突生长跨越病变部位，这一生物可降解材料的引导加上雪旺氏细胞，可用来移植入周围神经或背髓横贯型损伤，以促进中枢神经系统受损伤的轴突的再生和修复。但其制造过程相当复杂，费时过长。要用对细胞有毒的试剂。以及引入细胞多，需要特殊设备，且耗时数小时。同时所用材料为不可透见，不利于随时动态观察和随访细胞的生长情况。 

因此需要一个改进的神经支架，具有以下的特点：1.物理上包容性引导结构(多通道)；2.有利的化学物质(细胞外基质)；3.有活性的细胞成分(雪旺氏细胞)。来促进细胞的黏附和延伸，以帮助周围和中枢神经再生。 

本发明系统为细胞生长提供了一个支架，细胞可在支架中生长，由于支架是透明的，细胞在其内的生长和形态学可被直接观察，由于支架的主体是由多个管道构成，本支架可用于生长细胞供组织工程的应用，如肌肉，血管，神经的延伸或再生。 

本发明的系统可提供雪旺氏细胞的黏附，在数小时之内就延伸和形成条索状的具有细胞活性的结构，由于准备这一系统的整个步骤简单，可在短时间内完成，使其可促进神经的早期再生，以利神经的再生和功能的恢复。在管道内的黏附性细胞外基质可支持雪旺氏细胞的生长，雪旺氏细胞的生长对轴突的初生，伸展，分支，和长期生存和分化起到重要的支持作用，本系统所能早期形成的雪旺氏细胞支架可用于周围神经损伤，背髓损伤，和中枢神经系统损害。 

在神经损伤后尽快地提供雪旺氏细胞支架，使之在本发明的三维培养系统的管道中生长。本发明的三维培养系统不仅可作为物理性的支架以促进移植物和宿主组织的整合，而且可促进受损的轴突的再生和/或可缩短通常伴随与神经损伤的早期的神经再生过程，以达到加速神经再生，增加可修复神经的缺损区域，缩短神经和靶组织连接时间，于是改进功能的恢复。 

肿瘤的研究 

肿瘤的浸润和转移是恶性肿瘤的生物学特征之一，是肿瘤细胞粘连、酶降解、移动、基质内增殖等一系列过程的表现，是肿瘤细胞和细胞外基质在宿主多种因素调节下相互作用的结果。临床肿瘤转移的发生率相当高，有人统计60％以上的恶性肿瘤患者于初次诊断时已发现有转移。肿瘤侵袭和转移是肿瘤发生和演进过程中最危险阶段。据统计肿瘤患者约有80％以上死于侵袭和转移。因此肿瘤转移是一个十分令人关注的临床治疗的难题。 

从肿瘤侵袭到转移是一个复杂的肿瘤发病学问题。一般认为肿瘤浸润的机理与多种因素有关，包括肿瘤细胞本身的生物学特性、周围间质的作用以及局部免疫等。癌细胞侵袭和转移是多阶段、多步骤、多因素、多基因等综合作用和发展过程。其涉及的面很广，包括正常细胞经致癌因素启动，促癌因子作用，生长失去控制、恶性变、侵袭到转移；转移灶形成后又可再侵袭和再转移直至宿主死亡。有关肿瘤的侵袭、浸润和转移已有许多研究，但迄今尚未完全了解和解决这一问题。 

肿瘤转移包含脱离、转运和生长3个主要环节，然而这是一个复杂的过程，其步骤至少有：在各种条件具备的情况下，肿瘤细胞的移动和阿米巴运动有助于其本身突破基底膜，进入周围组织间隙。肿瘤细胞脱离原发瘤群体后，粘连侵袭基底膜并在周围间质中浸润生长；肿瘤细胞进入间质以后，需要依靠间质中给予的信息、营养和其他支持，同时也不断向间质分泌排放各种代谢物质，构成肿瘤细胞和周围间质的密切的关系，使肿瘤继续增生发展。肿瘤细胞侵入周围间质后，一般都在基质中压力最小处增殖生长，即所谓“直接播散”或“直接蔓延”形成很不规则的肿块。浸润的肿瘤细胞可进而侵袭邻近的淋巴管和血管。经过一个阶段以后，肿瘤可能形成新的包膜或假包膜，也可能肿瘤细胞进而侵袭局部淋巴管或小血管，并与局部毛细血管或毛细淋巴管内皮细胞密切接触并穿透其管壁，在血管、淋巴管内继续存活并被转运；同时启动血小板聚集，形成小瘤栓.到达靶组织的肿瘤细胞与血管或淋巴管内皮细胞和基底膜粘连，穿透毛细血管或毛细淋巴管壁，向周围间质浸润，在基质中不断增生，形成新的继发瘤。肿瘤还可或落入或突入腔道(如浆膜腔)，通过浆膜或粘膜下间隙在浆膜或粘膜面生长形成肿瘤转移。 

恶性瘤细胞能在继发部位存活和生长，依赖于瘤细胞的特性和宿主体内多种因素的作用。这些特性和因素为转移形成提供合适的基质和细胞存活、增长的环境。自癌细胞从瘤母体脱离到转移灶形成要经过各种细胞与细胞及细胞与基质相互作用、逃逸机体免疫机制、适应新的环境等复杂过程和机制，方能形成转移。因而最终仅有少数具有高转移能力的瘤细胞形成转移灶。 

在肿瘤实体内存在异质性已被证实。动物实验证明在肿瘤细胞群体中有高 转移性潜能的细胞亚系的存在。从转移的肿瘤细胞中可筛选出转移性潜能高低不同的细胞，这种转移潜能高低不同的细胞可能遗传密码、细胞表面结构、抗原特性、代谢特性、受体种类和分布、侵袭力、与血管内皮细胞等的粘连力、产生局部血凝因子或肿瘤血管形成因子的能力，以及对免疫反应的应答力等都不相同，以致侵袭、浸润和转移的能力也不同。这些变化也可称为相关的生物学特性，或称为与侵袭和转移相关的特性。目前研究最多的是瘤细胞的粘附性、运动性和降解酶分泌等。 

以往在人体上很难观察到浸润和转移的全过程。动物的自发性肿瘤在短期内出现转移的也不多。因此在研究肿瘤浸润和转移的发生机理时，常需用复制动物模型的方法来进行。在复制动物转移模型时，往往需要反复多次静脉注入万余个瘤细胞后才能成功。而且由于测定血循环中瘤细胞数量的技术较复杂，灵敏的测定方法尚有待建立，形态学鉴定瘤细胞的方法很不可靠。 

本发明的三维空间培养系统可在体外系统研究肿瘤细胞的原位运动和异位运动，肿瘤细胞的分离与细胞接触抑制的丧失，间质对肿瘤浸润的作用以及肿瘤细胞产物及其他有关成分的作用。将有助于弄清肿瘤细胞特异的运动性，粘附性、侵袭、转移和器官来源的可溶性因子的调节作用的分子机制。在癌症治疗方面可通过抑制特异的细胞粘附作用来阻断转移形成，或可用干扰器官来源的刺激因子作用或用抑制这些因子的方法达到治疗转移的目的。 

本发明的三维空间培养系统还可用于分离鉴定在肿瘤细胞群体中的高转移性细胞亚系，筛选出转移性潜能高低不同的细胞。并对这些细胞与侵袭和转移相关的生物学特性如遗传密码、细胞表面结构、受体种类和分布、抗原特性、代谢特性、侵袭力、与血管内皮细胞等的粘连力、产生局部血凝因子或肿瘤血管形成因子的能力，以及对免疫反应的应答力等进行研究。 

本发明的三维空间细胞培养系统还可用于肿瘤干细胞的分离鉴定。实体肿瘤异质性的另一方面是只有少数细胞在培养中或体内呈“克隆优势”生长现象。这些肿瘤细胞可能是肿瘤干细胞。由于绝大多数具有克隆的起源的肿瘤产生肿瘤的癌细胞一定会产生具有不同基因表型的细胞，包括只具有有限再生能力或无再生能力的肿瘤细胞，或是具有无限增生能力的癌细胞，这提示产生肿瘤病的癌细胞经历的生长过程是和正常干细胞自我增生和分化的过程是相似的。如果实体肿瘤的生长是由癌干细胞驱使的，那麽将对癌症的治疗带来深远的影响。目前所有的基因表型癌细胞都被当作他们有无限的增生能力，而且可以转移。然而多年以来，人们已发现在远离原发肿瘤的部位可检测到癌细胞，但从不表现转移性病变。可能的原因之一是绝大多数的癌细胞缺乏形成新的肿瘤的能力，只是少量的癌干细胞才有能力导致转移，因此治疗的根本目的应为发现和杀死这些肿瘤干细胞，本发明的三维空间培养系统可在体外观查肿瘤细胞的″克隆优势″生长现象和继发性肿瘤的形成。这将有助于肿瘤干细胞的分离和鉴定，针对肿瘤干细胞的治疗药物和方法将会取得更持久的疗效，甚至达到治愈转移性肿瘤的效果。

尽管人类对于恶性肿瘤进行了大量的研究，但对于其病因进展以及对治疗的反应和规律了解甚少。本发明的培养系统的特点之一是肝癌细胞在本发明的三维培养系统中生长大约48-72小时后形成大小不等的肿瘤。其后瘤组织细胞向外界环境伸出细胞伪足突起，还可观察到细胞运动和/或脱落至肿瘤周围。在大约一周的时间内，肿瘤细胞大量增生，形成多发性肿瘤，包括继发性肿瘤。这种类似于体内环境的肿瘤细胞生长，增生和发展过程可用于体外实体肿瘤模型的研究(具体见后续的实施例)。 

体外三维肿瘤模型对肿瘤生物学的研究提供了非常宝贵的作用，与单层细胞相比，三维肿瘤模型的组织结构更现实地体现了肿瘤的结构支架的细胞分化功能。因此可用于研究肿瘤的病因学。肿瘤的形成和发展，侵犯，转移，血管形成，组织构建，和肿瘤干细胞学的研究，肿瘤基因的表达，允许对放疗，化疗，或免疫治疗的敏感性的研究，并允许治疗个体化的研究。这一模型为肿瘤的生物学研究提供了一个独特的体外环境，可帮助肿瘤诊断，观察肿瘤浸润和转移以及判断预后。 

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。 

应理解，在实施例或实验材料和方法中所显示的成分用量、反应条件等数字或是本申请说明书内容所使用的数字均为大约数值。因此，除非文中特别注明，本说明书的上述数字参数均为近似值，其可根据欲求得的本发明结果而加以变化。并且，这些参数并非用来限定与本发明申请专利范围均等的原理，而是应用正常操作技术下所得到的较佳数据。 

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。 

实施例1可透见的三维细胞培养单元的结构 

在本实施例中，选择琼脂作为可透见的三维细胞培养单元的制作材料。 

可透见的三维细胞培养单元的制作模具如图1和图2所示，首先设计一个长方体的金属外套，在外套内放置3根方型金属丝。 

本实施例中，将长方型的外套尺寸设计为：长度为10mm，宽度为6.5mm，高度为3mm，壁厚度为0.5mm。 

所述的方型金属丝长度为20mm，宽度和高度各为0.9mm。 

外套管的两端由可移动的与外套管相匹配的盖套密封。 

将1％的琼脂溶解于pH7.4的PBS溶液中，消毒溶解后注入的外套内。注入琼脂的外套管在室温下放置15分钟后，琼脂凝聚成胶状，再从凝固的琼脂中取出金属丝，形成多个预制的内在管腔。 

所用的细胞按照通常的方法培养至细胞长满到80％-90％时消化，消化后的细胞用毛细管作用引入三维细胞培养单元的内在管腔中。根据不同的应用，细胞也可以和其他种类的细胞或各种细胞外基质混合，一起引入管腔或用其他常用的方法注入管腔。 

最后将内腔中含有细胞的琼脂凝胶制成的三维细胞培养单元放入所需的培养液中，放于所需的常规的二氧化碳培养箱中培养。也可放入生物反应器中培养。 

实施例2细胞种植入本发明的不同的三维空间细胞培养单元的比较 

在本实施例中，利用实施例1中所描述的方法制备的横截面圆形且内腔横截面也为圆形的三维细胞培养单元。横截面圆形的模具的外套尺寸为外径约6mm，内径约5mm，壁厚约0.5-1mm，长度为200mm，所述圆形金属丝的直径为0.2mm，长度为300mm。所述模具中可放置5-8根金属丝，在模具中加入琼脂凝胶，制备出内腔横截面为圆形的三维细胞培养单元。 

细胞种植入如上制备的横截面为方形和圆形的三维细胞培养单元的结果如图3所示。从图3中可见，内腔为方形的三维细胞培养单元(图3A，10×)比内腔为圆形的三维细胞培养单元(图3B，10×)为种植的细胞提供了更大的表面黏附面积。 

实施例3肝癌细胞株SMMC 7721的培养 

在本实施例中，利用实施例2的方法所制备的横截面圆形的三维细胞培养单元所培养的肝癌细胞株SMMC 7721。所用细胞培养液为RPMI 1640(Sigma R6504)1000ml，100倍青霉素+链霉素(GIBCO 15140-122)10ml，胎牛血清100ml。培养条件为5％二氧化碳，温度37℃。 

并且，本发明人还在一般的二维培养系统(普通细胞培养皿)中，在同样的培养基、培养温度等条件下培养肝癌细胞株SMMC 7721作为对照。 

肝癌细胞株SMMC 7721在二维和本发明的培养系统中的生长的情况如图4所示，其中图4A(10X)为在传统二维培养系统中肝癌细胞株SMMC 7721的培养生长情况，可观察到肝癌细胞株SSMC 7721在二维空间中呈平面生长状态，不能形成任何肿瘤。 

图4B(10X)是在本发明的培养系统中肝癌细胞株SMMC 7721的培养生长情况，大约到48-72小时后可观察到肝癌细胞株SMMC 7721在三维空间中生长，形成大小不等的肿瘤。 

其后瘤组织细胞向外界环境伸出细胞伪足突起，还可观察到肿瘤细胞运动和/或脱落至肿瘤周围(图4C 20X)。 

在大约一周的时间内，肿瘤细胞大量增生，形成多发性肿瘤，包括继发性肿瘤(图4D 20X)。 

综合图4中各图。肝癌细胞株SMMC 7721在二维空间中培养呈平面生长状态，不能形成任何肿瘤。而在本发明的培养系统中肝癌细胞株培养大约到48-72小时后即可观察到肝癌细胞株在三维空间中生长，形成大小不等的肿瘤。其后瘤组织细胞向外界环境伸出细胞伪足突起，运动和/或脱落至肿瘤周围。在大约一周的时间内，肿瘤细胞大量增生，形成多发性肿瘤，包括继发性肿瘤。 

实施例4胰岛β细胞瘤细胞MIN6的培养 

在本实施例中，利用实施例2的方法所制备的横截面圆形的三维细胞培养单元培养胰岛β细胞瘤细胞MIN6。所用细胞培养液为DMEM(GIBCO12800-017)1000ml，100倍青霉素+链霉素(GIBCO 15140-122)10ml，胎牛血清150ml。培养条件为5％二氧化碳，温度37℃。 

并且，本发明人还在一般的二维培养系统(普通细胞培养皿)中，在同样的培养基、培养温度等条件下培养胰岛β细胞瘤细胞MIN6作为对照。 

胰岛β细胞瘤细胞MIN6在二维和本发明的培养系统中的生长的情况如图5所示，其中图5A(10X)为在传统二维培养系统中肿瘤细胞MIN6的培养生长情况，可观察到MIN6细胞在二维空间中生长，部分细胞成团簇状生长(肿瘤)。 

图5B(20X)是在本发明的培养系统中肿瘤细胞MIN6的培养生长情况，可观察到MIN6细胞株在三维空间中生长，肿瘤体积明显增大，脱落细胞呈现出原位运动，瘤组织外层的瘤细胞向周围环境伸出细胞突起，如丝状伪足和叶状伪足等。图5C(20X)可观察到继发性肿瘤从原发性肿瘤发展形成，并向管壁侵袭。图5D(20X)可观察到继发性肿瘤从原发性肿瘤上脱离，向远处转移。 

综合图5中各图，胰岛β细胞瘤细胞MIN6在二维系统中生长时，尽管可获得一定程度的细胞的增生，但细胞的增生受到一定的限制。而当胰岛β细胞 瘤细胞MIN6在本发明的三维系统中生长时，肿瘤体积明显增大，部分细胞呈现出原位运动，向周围环境伸出细胞突起，如丝状伪足和叶状伪足等。还可观察到继发性肿瘤从原发性肿瘤发展形成，并向管壁侵袭，以及继发性肿瘤从原发性肿瘤上脱离，向远处转移。 

实施例5肝细胞株ATCC CRL 2254的培养 

在本实施例中，利用实施例2的原理所制备的横截面圆形的三维空间细胞培养单元培养肝细胞株ATCC CRL 2254。所用细胞培养液为DMEM/F12(GIBCO12400-016)1000ml，100倍青霉素+链霉素(GIBCO 15140-122)10ml，100倍ITS(Sigma I 1884)10ml，地塞米松(Sigma D 8893)1ml，胎牛血清100ml。培养条件为5％二氧化碳，温度37℃。 

并且，本发明人还在一般的二维培养系统(普通细胞培养皿)中，在同样的培养基、培养温度等条件下培养肝细胞株ATCC CRL 2254作为对照。 

肝细胞株ATCC CRL 2254在二维和三维培养系统中的生长情况见图6。其中图6A(20X)为肝细胞ATCC CRL 2254在二维环境中培养生长的照片，可观察到肝细胞株ATCC CRL 2254的生长呈平面状态，细胞之间易于发生接触抑制，细胞的生长减慢以至停顿。 

图6B(10X)为肝细胞ATCC CRL 2254在本发明的三维培养系统中培养生长的照片，可观察到在三维生长环境下，肝细胞ATCC CRL 2254聚集生长，在大约12小时即可形成类似于肝脏外形的微型肝脏器官。图6C(20X)可观察到微型肝脏器官周围的肝细胞向外伸展生长。图6D(10X)可观察到伸展生长的肝脏细胞形成清晰可见的管道状结构，并可见包膜的形成。 

因此可见，肝细胞株ATCC CRL 2254在二维培养系统中培养时，只能获得有限的细胞增殖，无法生长和分化而形成微型器官；但是，肝细胞株ATCC CRL2254在本发明的三维培养系统中生长时，在大约12小时即可形成类似于肝脏外形的微型肝脏器官。其后细胞进一步分化成熟，形成了有包膜和管道状结构的的类似于肝脏的微型肝脏器官。 

实施例6胰岛素瘤(insolinoma)细胞株ATCC CRL 11506的培养 

在本实施例中，利用实施例2的方法所制备的横截面圆形的三维空间细胞培养单元培养胰岛素瘤(insolinoma)细胞株ATCC CRL 11506。所用细胞培养液为DMEM(GIBCO 12800-017)1000ml，100倍青霉素+链霉素(GIBCO15140-122)10ml，胎牛血清100ml。培养条件为5％二氧化碳，温度37℃。 

并且，本发明人还在一般的二维培养系统(普通细胞培养皿)中，在同样的 培养基、培养温度等条件下培养胰岛素瘤(insolinoma)细胞株ATCC CRL 11506作为对照。 

胰岛素瘤(insolinoma)细胞株ATCC CRL 11506在二维和三维培养系统中的生长情况见图7。其中，图7A(10X)为胰岛素瘤(insolinoma)细胞株ATCC CRL 11506在二维培养系统中的培养生长情况，可观察到胰岛素瘤(insolinoma)细胞株ATCC CRL 11506在二维环境中生长，细胞呈岛状生长，部分细胞形成肿瘤，脱落的细胞不能继续生长，最终死亡。 

图7B(20X)为胰岛素瘤(insolinoma)细胞株ATCC CRL 11506在本发明的三维培养系统中的培养生长情况，可观察到胰岛素瘤(insolinoma)细胞株ATCC CRL 11506在三维环境中生长，体积明显增大。 

图7C(10X)和图7D(10X)可观察到胰岛素瘤(insolinoma)细胞株ATCCCRL 11506在三维空间中长期大量增殖生长，以至长满整个管腔，最终突出管腔外。整个培养过程可达3个月或更久。 

实施例7肌肉细胞的培养 

在本实施例中，利用实施例1和2的方法所制备的三维空间细胞培养单元(空腔横截面为方型或圆形)培养来源于正常人骨骼肌活检的肌细胞(采用常规的方法，将肌肉组织切成小碎片，通过外植法(explant)进行培养，并分离得到肌细胞)，所用细胞培养液为DMEM(GIBCO 12800-017)1000ml，100倍青霉素+链霉素(GIBCO 15140-122)10ml，马血清2％，胰岛素10μg/ml，地塞米松0.39μg/ml。培养条件为5％二氧化碳，温度37℃。 

并且，本发明人还在一般的二维培养系统(普通细胞培养皿)中，在同样的培养基、培养温度等条件下培养肌肉细胞作为对照。 

图8A(20X)为肌细胞在二维培养时的生长状况。可观察到在二维培养中，部份肌细胞融合。 

图8B(细胞培养单元的空腔横截面圆形，10X)、图8C(细胞培养单元的空腔横截面圆形，10X)、图8D(细胞培养单元的空腔横截面方型，20X)为肌细胞在本发明的三维培养系统中培养生长状况，图8B可观察到在三维培养系统中，肌细胞可生长形成条索状的组织。 

图8C和图8D可观察到在三维培养系统中培养所形成的明显延长和增宽的肌肉组织。 

实施例8雪旺氏细胞的培养 

在本实施例中，利用实施例1和2的方法所制备的三维空间细胞培养单元 (空腔横截面为方型或圆形)培养来源于小鼠坐骨神经组织的雪旺氏细胞(采用常规的方法，将小鼠坐骨神经组织切成小碎片，通过外植法(explant)进行培养，并分离得到雪旺氏细胞)，所用细胞培养液为CDM培养液+10％胎牛血清，培养条件为5％二氧化碳，温度37℃。 

并且，本发明人还在一般的二维培养系统(普通细胞培养皿)中，在同样的培养基、培养温度等条件下培养雪旺氏细胞作为对照。 

代表神经细胞的雪旺氏细胞在二维和三维培养系统的生长情况见图9。其中，图9A(10X)为雪旺氏细胞在二维培养系统中生长的照片，可观察到细胞成平面状态生长分布，无法形成条索状组织。 

图9B(细胞培养单元的空腔横截面圆形，10X)、图9C(细胞培养单元的空腔横截面圆形，20X)、图9D(细胞培养单元的空腔横截面方形，20X)为雪旺氏细胞在本发明的三维培养系统中生长的照片。从图9B和图9C观察到，在三维管道的环境中，雪旺氏细胞可在数小时内形成条索状组织。 

从图9D观察到，本发明优选的方形管道中，雪旺氏在细胞的粘附表面积明显增加，更有利于神经细胞生长，细胞条索的宽度显著增宽。 

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 

Claims (8)

1.一种三维细胞培养装置，其特征在于，所述系统包括：

(a)容器，在容器内装有液态细胞培养基；以及

(b)位于所述液态细胞培养基中的三维细胞培养单元，其中所述的三维细胞培养单元内包括用于培养的空腔以及界定所述空腔的空腔壁，所述的空腔壁含有细胞可黏附和生长的生物可降解的材料，并且所述的空腔壁可透过以下物质：营养成分、细胞代谢产物；

所述的生物可降解的材料是生物可降解物质形成的凝胶，其中所述的生物可降解物质选自：琼脂、琼脂糖或其组合；且所述的生物可降解的材料是可透见的；

所述空腔壁的厚度为0.1-10mm；

所述的生物可降解的材料中，生物可降解物质的浓度为0.1-10g/100ml。

2.如权利要求1所述三维细胞培养装置，其特征在于，所述的空腔的横截面积为0.1-100mm²，长度为1-1000mm。

3.如权利要求1所述三维细胞培养装置，其特征在于，所述的空腔壁含有80-100wt％的生物可降解材料。

4.如权利要求1所述三维细胞培养装置，其特征在于，所述的空腔为长条形，并且其截面形状选自：长方形、正方形、圆形、椭圆形、卵形、五角形、六角形、或螺旋形；

或者所述的空腔的形状对应于器官的形状。

5.如权利要求1所述的三维细胞培养装置，其特征在于，所述的三维细胞培养单元中含有1-100个空腔。

6.如权利要求1所述的三维细胞培养装置，其特征在于，所述的空腔壁的生物可降解的材料中还添加细胞外基质、或营养成分。

7.一种培养细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提供一个或多个三维细胞培养单元，所述的三维细胞培养单元内包括用于培养的空腔以及界定所述空腔的空腔壁，所述的空腔壁含有生物可降解的材料，并且所述的空腔壁可透过以下物质：营养成分、代谢产物；

所述的生物可降解的材料是生物可降解物质形成的凝胶，其中所述的生物可降解物质选自：琼脂、琼脂糖或其组合；且所述的生物可降解的材料是可透见的；

(2)将一种或多种细胞引入到三维细胞培养单元的空腔中；

(3)将(2)中带有细胞的三维细胞培养单元置于含有液态细胞培养基的容器中，并在适合生长的条件下培养细胞；

所述空腔壁的厚度为0.1-10mm；

所述的生物可降解的材料中，生物可降解物质的浓度为0.1-10g/100ml。

8.权利要求1所述的三维细胞培养装置的用途，其特征在于，用于离体培养细胞；或

用于动态观察细胞的黏附、扩伸、移行、增生、分化、成熟、衰老、死亡；或

用于制备哺乳动物的组织、或器官。

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