JPH0271750A - フィブリン―コラーゲン組織相当物、その製造方法及び使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、（１）収縮物質で収縮さけた水和コラーゲン
格子（ｈｙｄｒａｔｅｄ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　１ａｔｔ
ｉｃｅ）と（ｉｉ）フィブリンとからなる組織相当物（
ｔｉＳｓｕｅｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）並びにこのような
組織相当物の製法及び使用法に関する。本発明はまた、
組織相当物のｎ傷を修復する方法に６係る。

組織相当物を形成するために繊［細胞又は血小板のよう
な収縮物質で収縮させた水和コラーゲン格子から製造し
た組織相当物は、米国特許用４４８５０９６・４４８５
０９７・４５３９７１６・４５４Ｇ　５００４、６０４
．３４６号明ｉｌｌ書及び１９８７年３月３１日出願し
た係属中の米国特許出願用３２，８４８号に開示されて
Ｊ３す、これらは全て参考として本明細書に含むものと
する（以下、全て［−従来の特許」と記す）。これらの
Ｉｆ’ｌ織相当物には、上皮組織、結合組織、軟骨、骨
、血液、臓器、腺及び血管の相当物が含まれるがこれら
に限定されるものではない。組織相当物は生細胞と細胞
外のマトリックス分子、主としてコラーゲンからなり、
適宜、正常な組織に典型的には見られない成分を有して
いてもよい。

このような組織相当物は、研究開発、組織及び臓器の移
植並びに検査での使用を含め広範な用途を有している。

前記の組織相当物は長期間生存しえ、産生された単位が
実質的に均一であることを確保しながら人聞に製造する
ことができる細胞で形成される。

このような組織相当物中の細胞の構造的配置、生合成吊
及び透過性（ｐｅｒｌｌｅａｂｉ　ｌ　１ｔｙ）は正常
組繊細胞のものと類似している。これらの組織相当物は
人間のものである必要はなく、所望のどんな＃Ｊ物のも
のであってよいことを理解すべきである。

ヒトの皮膚組織相当物は、十分分化しているヒトの正常
な上皮細胞を増殖させて、現在の所通常の培養法では得
られていない正常な皮膚角質層と完全な基底膜を生成す
ることができる。このような皮膚相当物は動物実験での
永久的皮膚移植では非常に多く使用されてきており、米
国では最近１床試験が行われている。このような皮膚組
織相当物は形態学上正常であり、遺伝学的マーキングが
示１ように移植後も構成細胞は生存し、そのＲ能も示さ
れている。例えば、５ｃｉｅｎｃｅ　　２１１＋１０５
２〜１０５４　（１９８１）　；　Ｊ、Ｉｎｖｅｓｔ、
Ｄｅｒｍａｔｏｌ、　８１：２Ｓ　〜１０Ｓ（１９８３
）参照。

ｉｎ　　ＶｉｔｒＯで製造した皮膚組織相当物は天然の
皮膚と非常に類似しており、十分な構造を有する基底膜
により真皮層と結合しているよく分化した基底細胞を有
する多層の表皮からなる。真皮層は表皮繊維芽Ｉ８胞が
分布しているコラーゲンマトリックスからなる。三次元
的なコラーゲンマトリッウス中のＩ胞は、多くの点で、
ｉｎ　　ｖｉｖｏで優勢なものと同様な分化状態を達成
している。例えば、内在するｍＨ芽細胞は合成的に活性
であり、１ｎｖｉｔｒｏでマＩ・リックスのコラーゲン
と多くの他の分子種の両省を増加させ、ｉｎ　　ｖｉｖ
ｏの細胞に典型的な透過性を示す。例えば、Ｃ０ＩＩａ
Ｏｅｎ　Ｒｅ１．ＲｅＳ。

４：　３５１〜３６４　（１９８４）参照。ヒト及びラ
ットのｔ＆雑芽細胞の組織相当物格子収縮能に対するス
テロイドの作用が評価されている。Ｊ、　Ｉｎｖｅｓｔ
、Ｄｅｒｎ＋ａｔｏｌ。

８２：３４１〜３４４　　（１９８４）　参照。乾ｔｘ
ｔのａ究ノタメに、皮膚組織相当物モデルを使用して、
乾１！ｆｌａｔ胞及び正常細胞を有する組織が作成され
ている（Ｓｃｉｅｎｃｅ　、　２３０：　６６９〜６７
２．１９８５）。最近、表皮クラチン細胞に色素を与え
るメラニンｉｌｌ胞を含有させることにより、皮膚組織
相当物を着色できること、及び紫外線照射によって、ｉ
ｎ　ｖｉｔｒｏでこの過程の速度が上昇することが示さ
れている（ムＩｎｖｅｓｔ、Ｄｅｒｍａｔｏ１．８？：
　　６４２〜６４７　１９８６）。

ヒト血管組織相当物は、典型的には細胞外マトリックス
分子及び培養した血管細胞から構築された多層の管であ
る。例えば、５ｃｉｅｎｃｅ　、　２３１：　３９７〜
４００．１９８６　：米国特許用４．５３９．７１６号
及び第４．４５６，５００号明細書参照。それらは構造
と機能がヒトの血管に類似している。血管Ｉｌ織織物物
は；ｎｖ　ｉ　ｔ　ｒｏで基底膜を産生する一層の内皮
細胞で裏打ちされていてもよい。内皮細胞及び基底膜は
共にこのような血管組織相当物の内膜を構成している。

中間層はコラーゲン格子中の平滑筋Ｉ胞からなり、この
ような血管組織相当物の中膜を構成する。平滑筋細胞は
マトリックスにコラーゲン、エラスチン及び他の分子を
提供する。いくつかの実７ＩＩ！ｉ態様では、特別な用
途用にヒアルロン酸のような他の細胞外マトリックス成
分を適宜添加する。血管組織相当物の外層はコラーゲン
格子内の外股繊維芽細胞から作られ、血管組織相当物の
外膜を構成する。支持部材、例えば合成メツシュを、血
管組織相当物の、典型的には中膜と外股との間の壁に適
宜含ませて血管組織相当物を強化することもできる。ａ
ｂｌＬＩＩＩｌｉｎａ１表面に隣接したプラスチックの
スリーブのような取りはずしのて°きる保護不透過膜を
適宜布していてもよい。

このような血管組織相当物内の層は天然の血管でリー型
的に見られるものと逆の順序であってよいことが理解さ
れるべきである。例えば、正常な血管の内膜を構成して
いる内皮細胞と基底膜が管状の血管組織相当物の外側に
なるようにすることができる。このような血管組織相当
物の中層は平滑筋細胞及びコラーゲン格子からなり、血
管組織相当物の中膜を構成する。このような逆の順序に
なっている血管組織相当物の内層はコラーゲン格子内の
外膜繊維芽１［Ｐから作製したものであり、正常な血管
では外股を構成することになる層を形成している。

適切なソースから培養した細胞を使用づることにより種
々の型の血管用の血管組織相当物を製造することができ
る。例えば、動脈の血管組織相当物は動脈の対応する層
から培養した細胞を更に含んでおり、毛細血管の血管組
織相当物は外股ｌｌ維芽細胞の代りに周皮細胞および毛
細管の内皮細胞を更に含んでおり、そして静脈の血管組
織相当物は静脈から培養した細胞を更に含んでおり、動
脈の血管組織相当物より薄い外股を使用して作製する。

特定の疾患を研究するためには、特定の疾患の患者から
の培養細胞を血管組織相当物に取り込ませる。

組織相当物は所望のどんな形にも成形できる。

皮＃？［ｌ織物当物は一般に平坦なシートとして成形し
、血管相当物は一般に中空管又は網目状の中空管として
製造する。しかし、組織相当物の天然の形状又は配置を
変えることが望ましいこともある。

例えば、皮膚組織相当物をシートではなく円筒状に成形
することもでき、血管組織相当物の層を上記のように天
然の血管の順序とは逆にすることができる。

前述の組織相当物の使用において、用途によっては、コ
ラーゲン格子自体を、そして組織相当物が層からなると
きには層目体の結合を強化することが望ましいことが発
見された。広範囲の縫合及び切開のように、組織相当物
のかなりの機械的操作を含む用途では、コラーゲン格子
を強化することが特に望ましい。例えば、血管組織相当
物は多層のコラーゲン格子からなるものであるが、圧力
、切開又は縫合のような機械的ストレス下でこれらの層
が薄層に剥離する場合があることが発見されている。更
に、血管組織相当物は、ある用途では人工血管として使
用される場所で切ったり縫ったりされるので、（受容菌
の血管からクランプを除去した直後）直ちに血管内圧力
に耐えなければならず、また血管組織相当物は、例えば
生きている皮膚の相当物が有しているようなｉｎ　ｖｉ
ｖｏで強化される機会は有していないのである。

従って、ある種の用途では、このような組織相当物の強
化法が望まれる。

発明の概要 本発明は、（１）収縮物質で収縮させた水和コラーゲン
格子及び（１１）フィブリンからなる組織相当物並びに
このような組織相当物の製法を開示している。本発明は
、組織相当物の損傷を修復する方法も１ｍ示している。

本発明の組織相当物は、強度がより強いこと、そし−〇
多層の組織相当物の場合には強度と層間の接着の両方が
より強いという点で、従来の特許に開示されているもの
より右利である。

コラーゲン格子の形成中又は形成侵のいずれかにフィブ
リンをコラーゲン格子に取り込ませるか又は添加するこ
とができる。本発明のある実施態様では、形成中の層も
しくは形成した層内又はその両者にフィブリンを取り込
まＵることができる。

更に、多層の」ラーゲン又はノイブリンーコラーゲンの
Ｉｌ織織物物の多層間の接着は、接着すべき１つ以上の
層の表面にフィブリノーゲン及びトロンビンを適用する
ことにより改善できる。

本発明の組織相当物のフィブリン及びコラーゲンの′ａ
度はそれぞれ約３〜約３０１９　／　ｃｄであるが、フ
ィブリンが約１５〜約２５■／ｄ及びコラーゲンが約１
０〜約１５ａｙ／ｃＪの濃度であるのがより好ましい。

コラーゲン又はフィブリン−コラーゲン組織相当物の表
面にフィブリノーゲン及びトロンビンを適用する実施態
様では、フィブリン濃度は、典型的にはフィブリノーゲ
ン及びトロンビンを適用した表面又は表面付近で最も高
い値となる勾配を示すであろう。

本発明に使用する好ましい収縮物質には繊維芽細胞、平
滑筋細胞、横紋筋細胞、心筋細胞及び血小板がある。

本発明の組織相当物は、その強度及び安定性を更に増す
ために、フィブリンとコラーゲンを架橋結合させうる物
質、例えば第１因子を更に含んでいてもよい。その他の
任意の添加剤としては、フィブリン−コラーゲン格子を
分解から守る薬剤、例えばプロテアーゼ阻害剤がある。

本発明のフィブリン−コラーゲン組織相当物は、表皮ケ
ラヂン細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）もしくは他の
上皮ｖＡｌｆ１又は他の組織ｍ胞のような生細胞及び脱
塩した骨粉グリコツアミノグリカン、例えばヒアルロン
酸、他の結合組織蛋白質例えばフィブロネクチン又はエ
ラスチン及び他の因子、例えば成長因子又はＪｉｌｔ！
管形成因子のような他の添加物質を含有していてもよい
。

本発明方法は、（１）フィブリン−コラーゲン組織相当
物の製法、（ｉｉ）多層のコラーゲン又はフィブリン−
コラーゲン組織相当物の層間の接着の改善法、及び（ｉ
ｉｉ）組織相当物の損傷、例えば裂け目の修復法を含ん
でいる。

フィブリン−コラーゲン組織相当物を形成する本発明の
１つの方法は、 （ａ）ゲル混合物中にコラーゲン、フィブリノーゲン、
フィブリノーゲンからフィブリンを形成させる物質及び
収縮物質が分散しているゲルを形成する条件下で、」ラ
ーゲン、フィブリノーゲン、フィブリノーゲンからフィ
ブリンを形成させる物質及び少なくとも１種の収縮物質
からなる混合物を形成し、そして （ｂ）ステップ（ａ）で製造したゲルを、ゲルが収縮し
てｆｆｉ織相真相当物成される条件下に維持づることか
らなる。

このような混合物中のコラーゲン及びフィブリノーゲン
濃度はそれぞれ約０．３〜約３．０　Ｒｇ／ｄである。

より好ましくは、コラーゲンは約１、θ〜１．５１１９
／ａｄ！、フィブリノーゲンは約１．５〜約２．５ＩＩ
ｇ／Ｉｄ１そしてトロンビンが約０．１〜約１０ψ位（
ｕｎｉｔ）／ｍの濃度である。

フィブリンーフラーゲン組織相当物を製造する本発明の
もう１つの方法は、 （ａ）コラーゲン及び収縮剤が分散しているゲルを形成
する条件下で、コラーゲンと少なくとも１種の収縮剤か
らなる混合物を形成し、 （ｂ）ステップ（ａ）で得たゲルを、ゲルが収縮して組
織相当物が形成される条件下に維持し、そして（Ｃ）ス
テップ（ｂ）の組織相当物の少なくとも１つの表面に、
フィブリノーゲンとフィブリノーゲンからフィブリンを
形成させる物質とを適用することからなる。

フィブリノーゲンからフィブリンを形成させる物質はト
ロンビンからなるのが好ましい。ステップ（Ｃ）では、
フィブリノーゲンとトロンビンを溶液として適用すると
好適である。このような実施態様では、フィブリノーゲ
ン溶液は典型的には約５ｑ／Ｉ１１〜約２５４／ｄ、そ
してトロンビン溶液は約２５〜約５００単位／ｄの濃度
である。組織相当物の表面にフィブリノーゲン及びトロ
ンビンを適用する方法は、多層のコラーゲン又はフィブ
リン−コラーゲン組織相当物の層間の接着を強化するた
めにも使用できる。

本発明は少なくとも２層を有する組織相当物の製法も提
供する。この方法は、 （ａ）ゲル内にコラーゲン、収縮物質、フィブリノーゲ
ン及びフィブリノーゲンからフィブリンを形成させる物
質が分散しているゲルを形成する条件下で、コラーゲン
、少なくとも１梗の収縮物質、フィブリノーゲン及びフ
ィブリノーゲンからフィブリンを形成させる物質とから
なる混合物を形成し、ゲルが収縮して第一の組織相当物
が形成され得る条件下にゲルを維持し、 （ｂ）第一の組織相当物に、フィブリノーゲンとフィブ
リノーゲンからフィブリンを形成させる物質とからなる
混合物を適用し、 （Ｃ）上記ステップ（ａ）に従って製造した第二の組織
相当物を第一の組織相当物と接触させ、そして（ｄ）組
織相当物の層が更に所望の場合には、ステップ（ｂ）及
び（Ｃ）を繰り返す ことからなる。

本発明は、収縮物質で収縮させた水和コラーゲン又は（
ｉ）収縮物質で収縮させた水和１ラーゲン及び（ｉｉＪ
フィブリンからなる組織相当物の損傷の修復、例えば裂
け目を接合する方法も提供する。

この方法は、 （ａ）組織相当物の損傷部分に、フィリノーゲンとフィ
ブリノーゲンからフィブリンを形成させる物質とからな
る混合物を適用し、そして （ｂ）ステップ（ａ）の組織相当物を、フィブリンが形
成されうる条件下に維持することからなる。

１１些１亙鬼λｊ 組織相当物を形成するために収縮物質で収縮させた水和
コラーゲン格子から製造した組織相当物は従来の特許に
開示されている。予期されていなかったが、このような
組織相当物のコラーゲン格子内にフィブリンを取り込ま
せることにより改善された特性を有する組織相当物が製
造されることを発見した。従って、本発明の組織相当物
は製法及び使用法は従来の特許に開示されているものと
同様であるが、更にフィブリンを含有しており、強度が
より強く、そして多層の組織相当物の場合には層間の接
着性がより強い組織相当物を提供１゛る。

本発明の組織相当物は、水和コラーゲン格子の形成中及
び／又は俊に更にフィブリンを取り込ませるか又は添加
すること以外は従来の特許に記載されているように製造
する。、 本発明の組織相当物の製造に使用する材料はコラーゲン
；フィブリノーゲン；フィリノーゲンがらフィブリンを
形成させる物質、例えばトロンビン；フィブリノーゲン
とコラーゲンを架橋結合させる物質、例えば第■囚子：
１種以上の収縮物質；生細胞；栄養培地；及び添加物質
を含んでいてよい。

本発明の組織相当物の形成中にフィブリンを取り込ませ
る好適な方法は、ｐｌ＋約３〜約４、好ましくは約３．
５のコラーゲンの酸性溶液と、フィブリノーゲンとトロ
ンビンの溶液と、ｍ１！芽細胞を含有する栄養培地とを
迅速に混合し、所望であれば得られた溶液のｐＨを約６
．６〜約７．８に調整し、得られた溶液（「成形用混合
物」）を適切な型または成形デバイスに移し、好ましく
は約り５℃〜約４０℃でインキュベーＩ・することを含
んでいる。成形用混合物の成分を合せると同時にｐＨを
調整すると最も好都合である。しかし、成形用混合物を
適切に硬化させるための型に移すのが最後になるように
する限り、これらのステップを任意゛所望の順序で行う
ことができる。溶液を加温し、ｐＨを挙げる結果、成形
用混合物からコラーゲン原繊維が沈澱し、トロンビンの
触媒作用によりフィブリノーゲンがフィブリンを形成し
、カルシウムイオンの存在下でフィブリンが凝固し、そ
してフィブリンの凝固物とコラーゲンのゲルが絡み合っ
て、フィブリンを含み収縮物質で収縮させられた水和コ
ラーゲン格子を形成する。

成形用混合物中に適切な濃度のフィブリノーゲン及びコ
ラーゲンを使用すると、得られるフィブリン−コラーゲ
ン格子はフィブリンのかたまり又はコラーゲンのみから
製造した格子よりも強く丈夫である。成形用混合物中の
コラーゲン及びフィブリノーゲンｍ度はコラーゲン約０
．３〜約３．０　ｍｇ／−及びフィブリノーゲン約０．
３〜約３．０η／−であるのが望ましい。］ララーンが
約１．０〜約１．５■／！ｄ１フイブリノーゲンが約１
．５〜約２．５ＩＩｇ／ａｉ！のｍｒｘであると特に好
ましい。

本発明のフィブリン−コラーゲン組織相当物中のコラー
ゲンとフィブリンの最終濃度は成形用混合物中のちのよ
り約１０倍高い。本発明の組織相当物中のフィブリン及
びコラーゲンはそれぞれ約３〜約３０■／　ｃｄの濃度
である。より好ましくは、フイブリンが約１５〜約２５
Ｎ／ｃｔｉ、コラーゲンが約１０〜約１！Ｍ＋９／々の
濃度である。

フィブリン−コラーゲン格子を収縮さ才るためには、コ
ラーゲン格子を収縮させるために従来の特許に記載され
ているものより高い密度の収縮物質がしばしば必要とな
る。例えば、５００．０００細胞／Ｉｌｌで懸濁した繊
維芽細胞を使って作製したコラーゲン格子は、１．８＃
ｌＦ／−のフィブリノーゲン及び２，０００，０００細
胞／ｄの繊維芽細胞を使って作製したフィブリン−コラ
ーゲン格子と同じ割合で収縮した（第１図）。

コラーゲン格子とフィブリン格子を一緒に成形して本発
明のフィブリン−コラーゲン組織相当物を製造するのが
通常好ましいが、コラーゲン格子の表面にフィブリノー
ゲン及びトロンビンを適用することにより、格子形成後
にフィブリンをコラーゲン格子に取り込ませることもで
きる。本発明の１つの実ＩＭ態様では、従来の特許に記
載されているように組織相当物を形成し、次いでフィブ
リノーゲン溶液を適用してコラーゲン格子内に拡散させ
、フィブリノーゲンがコラーゲン格子内に拡散した後、
適宜第１因子を含有するトロンビン溶液を格子に適用す
る。上記のようにフィブリノーゲンとトロンビンを順次
適用するのが最も好都合であるが、必ずしもそうしなけ
ればならないわけではない。形成したコラーゲン又はフ
ィブリンコラーゲン格子の表面にフィブリノーゲン及び
トロンビンを適用する場合、フィブリノーゲンとトロン
ビンの好ましい濃度はそれぞれ約１０〜約ｓｏｑ／ｄ及
び約１０〜約５００単位／ｄ！である。

フィブリノーゲンからフィブリンを形成させ、成形用混
合物の他の成分と相溶性のものであればどのような物質
も本発明の実施に使用しうる。現在の所、当業界でトロ
ンビンのみがこのような物質として知られている。トロ
ンビンの存在下でフィブリノーゲンからからフィブリン
を形成するためにはカルシウムイオンが必要であり、こ
れは栄養培地中に供給すると便利である。しかしながら
、所望に応じて、別の方法でカルシウムイオンを成形用
混合物に供給覆ることもできる。成形用混合物中のトロ
ンビンの好適濃度は、約０．１〜約１０．０単位／ｄで
ある。形成した」ラーゲン又はフィブリン−コラーゲン
格子の表面にトロンビンを適用するときには約２５単位
／ｍｅの濃いトロンビン溶液を使用するのが好ましい。

本発明の組織相当物の強度及び安定性は、所望であれば
、フィブリンと二」ラーゲンを架橋結合させうる第■因
子（フィブリン安定化因子）のような物質を用いること
によりさらに強化することができる。第■囚子は所望の
程度の架橋結合が得られるＥｌ例えば０．１〜約５単位
／ｄ使用する。フィブリンとコラーゲンを架橋結合させ
うるか又はフィブリン−コラーゲン格子を化学的に安定
化しつる他の物質も使用できる。場合によっては、フィ
ブリン−コラーゲン格子が蛋白質分解による分解を受け
にくくするために、本発明の組織相当物に１種以上のプ
ロテアーゼ阻害剤を加えることが望ましい。

コラーゲン格子を連続的な層に成形して多層の組織相当
物を形成することができる。米国特許箱４．５３９，７
１６号及び第４．５４６．５００号明細占参照。上記の
ようにコラーゲン格子中にフィブリンを取り込ませるこ
とにより、このような組織相当物の層の接着が改善され
ることが発見された。更に、多層の組織相当物を形成づ
るために接合させる形成されたコラーゲン又はフィブリ
ン−コラーゲン格子の層の一方又は両方の表面にフィブ
リノーゲン及びトロンビンを適用することにより、多層
のコラーゲン又はフィブリン−コラーゲン組織相当物実
施例　１ の層間の接着を改善することができる。

本発明の組織相当物は血清を含まない培地及び血清を含
有する培地の両方で製造できる。血清を含まない培地中
で１Ｊ造すると、より経済的であり、また血漿中に通常
存在する同定されていない因子の存在が除去されるので
、工程のコントロールがより良好なものとなる。

次の実施例を参考に本発明を更に説明するが、実施例は
全く純粋に例示のためのものであり、本発明の範囲を限
定するために使用することを意図するものではない。

次の実施例に使用する材料は実施例中に示した入手源か
ら得たもの又は示した出版物に従って調製したものであ
る。

フィブリノーゲンを使用した組織相当物の成形物の製造 フィブリノーゲン（Ｍｉｌｅｓ　１ａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ）を１．１６倍に濃縮し／、：　Ｈｃｃｏｙ　’　
Ｓ　５Ａ培養培地に溶解し、１０．３．１．０，３及び
０．１１１１ｑ／威の名目濃度とした。画線培地２．３
ｄ、ウシ胎児血清（Ｆ［ｌＳ）　０．４５戒、０、ＩＮ
　Ｎａ０ｌｌ　Ｏ，２５７！、０．１％酢酸中３ｍｇ／
ｄで溶解したラットの尾の艇のコラーゲン１．５−１及
び１０％ＦＢＳとトロンビン（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｌｌ
ｌｉＣａ１社）５中位を補ったＨｃＣｏｙ’ｓ　５Ａに
懸濁した繊維芽細胞０．５〆を一緒に混合することによ
りフィブリン−コラーゲン格子を製造した。繊維芽細胞
は５００．０００細胞／Ｉｄ又は２，０００，０００細
胞／ｄの密度で使用した。

フィブリノーゲンを添加していない培地を使用し、上記
と同様に対照の格子を’ＩＪＮした。

得られた混合物を個々の６０Ｍのプラスチックのベトリ
皿に注ぎ入れ、３７℃で、湿気のある５％ＣＯ２−９５
％空気雰囲気化でインキュベートした。

翌日以降、フィブリン−コラーゲン格子の直径を測定し
、その結果を第１図に示した。フィブリノーゲン濃度が
上昇するにつれ、格子の収縮にはより多くの細胞を必要
とした。２つの最高濃度のフィブリノーゲンを使用して
製造した格子は、コラーゲンのみ又は主としてコラーゲ
ンが細胞外マトリックス成分である格子よりもより不透
明であり、ゼラチン様感触がより少なかった。使用した
フィブリノーゲン調製物の６０％が凝固しうる蛋白質で
あり、その約２７３が溶液に移行するだけなので、成形
用混合物中の実際のフィブリノーゲン濃度はそれぞれ約
１．８．０．６．０．２．０．０６及び０．０２１１１
ｇ／ｄであった。

フィブリノーゲン及びフィブリンにｒ！Ａ′ｒｊる以外
の試薬と手順についての一般的な記載は従来の特許にも
記載されている。

実施例　２ 艮１ フィブリノーゲン又はトロンビンは全く使用せずに実施
例１と同様にして２種のコラーゲン格子を製造し、数日
間収縮させた。血清を含まない培地で数回すすぎ、血清
を除去し、次に過剰の培地を吸引した。フィブリノーゲ
ンの濃い水溶液（２５ｊ１９／ｍｌ）の滴を各格子表面
上に置き、格子内に拡散さＶた。トロンビン（５０００
／　ｄ　）及びフィブリン安定化因子（第Ｘｌａ囚子、
１０ｔｌ／ｓｅ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の滴を１つの
格子に置き、次に第二の格子を第一の格子上に置いて約
１分間緩和な圧力下に維持した。血清を含む培地を加え
て格子を覆った。１時間後に、各格子をビンセットでは
さんだが、引離すごとは出来なかった。結合が十分強か
ったので、離れる前に格子自体が裂けた。同様に処理し
たが、フィブリノーゲンを添加しなかった対照の格子は
別々に浮遊していた。このように、成形し収縮させた後
に格子に加えたフィブリノーゲンは格子を接着させるた
めに使用できる。またこの方法は、組織相当物の端を接
着させたり、組織相当物の裂け目又は切れ目を修復する
のに使用される。

彫物の製造 ６＃Ｉｍの心棒を有するヘパリンを加えた２５順のシリ
ンダー内で、名目濃度０．５．５又は１１１Ｉｇ／−の
フィブリノーゲンを含む１，７６倍のＨＣＣＯＶ’８５
Ａ培地１３．８ｍｇ、ラットの尾の−のコラーゲン（０
，１％酢酸中３．３■／ａｄ）　　９．Ｏｄ、　ＦＢ８
２．７ｍ　（少なくともＩ　Ｕ／−のトロンビンに等し
い凝固剤活性を選択）、０．ＩＮ　Ｎａ０ｔｌ　１．５
ｍ及び１０％ＦＢＳを補ったＨＣＣＯｖ’３５Ａ培地中
の平滑筋の懸濁液３．０−から血管組織相当物を成形し
た。平滑筋細胞はｓｏｏ、　ｏｏ。

細胞／ｄ又は２．　Ｇｏｏ、　Ｇｏｏ細胞／Ｉｄの密度
で使用した。心棒の周りに平滑筋層を収縮させた後、Ｄ
ａｃｒｏｎ”メツシュを第一の層上にそっと置き、平滑
筋ではなく外膜の繊維芽細胞を使ってその周りに第二層
を成形した。第二層成形の２遍間後に、心棒から血管組
織相当物を取りはずし、５ｃｉｅｎｃｅ２３１：　３９
７〜４００　（１９８６）に記載されているように破裂
強度を測定した。

従来の特許に従って、フィブリノーゲンを使用せずに製
造した血管組織相当物の破裂強度は１００〜１２０　ｍ
１ｌｏであった。破裂強度テストの間に、内層（平滑筋
）と外層（外膜繊維芽細胞）とが分離した。

濃縮培地中の名目濃度５．５Ｍｌ／ｄのフィブリノーゲ
ン（成形用混合物中の実濃度は約１η／ｍｅ）を使って
製造した血管組織相当物の破裂強度は１３５〜１５０　
ｔｔｍ　ＩＩ　ｇであった。血管組織相当物を手術用の
はさみで切開すると、層はビンセットで引張って容易に
離れ、分離することができた。

濃縮培地中の名目濁度１１Ｒｇ／−のフィブリノーゲン
（最終的な成形用混合物巾約２．ＯｗＩ／ｄ）を使って
製造した血管組織相当物の破裂強度は１６５〜１８０ａ
ｗＨｇであった。これ等は圧力テストの間に層に剥離せ
ず、また横に切っても斜めに切っても剥離しなかった。

切断した片は層分離することなく縫合するとができた。

このテストには６−０ポリプロピレン縫合糸（Ｄａｖｉ
ｓ　＆　Ｇｅｃｋ）と先細の針を使用した。

このように、フィブリン−コラーゲン格子を使用して製
造した血管組織相当物の層は、従来の特許に従ってコラ
ーゲン格子で製造した血管組織相当物より破裂強度が強
いばかりでなく、慣用の外科手法による扱いを非常に容
易にするものである。

６１１１１の心棒を持つヘパリンを添加したガラスのシ
リンダー（直径２５ａｍ）中で血管組織相当物を成形し
た。５ｃｍの長さの血管組織相当物を作るために、２０
ｄの最終的な成形用量を使用した。

（名目上）　１０．２■／ｍ１の濃度で牛のフィブリノ
ーゲン（旧ｌｅｓ　ＬａｂＯｒａｔＯｒｉＯ３）をグル
コース濃度の高い１゜７倍濃縮のＯＭＥＮ：　）（ａｍ
’ｓ　Ｆ１２培地（ＨＡＢｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）に溶
解した。これに、グルタミン（ＨＡ　Ｂ１０ｐｒＯｄｕ
ＣｔＳ）　、ゲンタマイシン（ＨＡＢｉ。

ｐｒｏｄｕｃｔｓ）　、重炭酸ナトリウム及び１１％（
容量）の０．０５Ｎ水酸化ナトリウムを補った。成形容
部の５１％に十分な畿を製造した。

０．０５％酢酸に３ｆＲ’ｊ、７ｍｌ溶解した（豚皮か
らの）１型コラーゲンにこの混合物を加えた。コラーゲ
ン溶液の容量は最終容ト１の３０％であった。

１倍のＤＨＥＨ：　）（ａｍ’ｓ　Ｆ１２中Ｃ１，５〜
２．０細Ｉｎ／蔵で懸濁させた平滑筋細胞を最終容量の
１０％まで加えた。

インシュリン、トランスフェリン、ヒレン、トリョード
チロニン、ステ［］イド類、エタノールアミン及び０−
ホスホリルエタノールアミン、１〜ロンビン、並びに表
皮成長因子を含有する増殖補充物質（５ｃｏｔｔ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ及びＳｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａ
１社）を最終審Ｍの９％の容り号加えた。

この混合物を鋳型に注ぎ入れ、５％ＣＯ２雰囲気下３７
℃でインキュベートした。

１週間侵にメツシュを置いた。

平滑筋細胞ではなく外膜ｙ４維芽細脂を使用すること以
外は上記と同様にして第２層を適用した。

更に１′ｊ５間後に、心棒からはずし、中１ｔｉＪ層と
外股層の間の接着を立証するために手術用のはざみで切
った。コラーゲン格子で作った対照の血管組織相当物の
中膜屑と外膜層は、フィブリン−コラーゲン格子で作っ
た血管組織相当物よりも切断の際に分離しやすい傾向に
あった。このように、フィブリン−コラーゲン格子は血
清を含まない培地中で製造でき、やはりコラーゲンのみ
で製造したものより改善された接着性及び操作特性を提
供する。

本明細書中の実施例及び実施態様は単に説明の目的のみ
のものであり、それ等に基いて当業名に示唆されるであ
ろう種々の改変及び変更は本出願及び承認された特許請
求の範囲の趣旨及び範囲に包含されるものであると理解
されな番プればならない。

【図面の簡単な説明】

第１図は種々のフィブリノーゲン及び繊維芽細ｐａｗを
有するフィブリン−コラーゲン格子の収縮を示すデータ
をプロットしたグラフである。 −３′！

Claims (46)

【特許請求の範囲】
1. （１）（ｉ）収縮物質で収縮させた水和コラーゲン格子
   と （ｉｉ）フィブリンとからなる組織相当物。
2. （２）フィブリンとコラーゲンが架橋結合している請求
   項１の組織相当物。
3. （３）コラーゲン及びフィブリンがそれぞれ約３〜３０
   ｍｇ／ｃｍ＾３の濃度である請求項１の組織相当物。
4. （４）コラーゲンが約１０〜約１５ｍｇ／ｃｍ＾３の濃
   度であり、フィブリンが約１５〜約２５ｍｇ／ｃｍ＾３
   の濃度である請求項１の組織相当物。
5. （５）収縮物質が水和コラーゲン格子を収縮させうる細
   胞型からなる請求項１の組織相当物。
6. （６）収縮物質が繊維芽細胞、平滑筋細胞、横紋筋細胞
   、心筋細胞又は血小板からなる請求項１の組織相当物。
7. （７）格子が更に表皮ケラチン細胞又は脱塩した骨粉を
   含む請求項１の組織相当物。
8. （８）組織相当物が皮膚、骨、血管、臓器又は腺の組織
   相当物である請求項１の組織相当物。
9. （９）更に少なくとも１種のプロテアーゼ阻害剤を含む
   請求項１の組織相当物。
10. （１０）１つ以上の層が（ｉ）収縮物質で収縮させた水
    和コラーゲン格子と（ｉｉ）フィブリンとからなる、少
    なくとも２層を有する組織相当物。
11. （１１）（ａ）コラーゲン、フィブリノーゲン、フィブ
    リノーゲンからフィブリンを形成させる物質及び収縮物
    質がゲル混合物中に分散しているゲルを形成する条件下
    で、コラーゲン、フィブリノーゲン、フィブノーゲンか
    らフィブリンを形成させる物質及び少なくとも１種の収
    縮物質からなる混合物を形成し、そして （ｂ）ゲルが収縮して組織相当物が形成され得る条件下
    に、ステップ（ａ）で製造したゲルを維持することから
    なる組織相当物の製造方法。
12. （１２）フィブリノーゲンからフィブリンを形成させる
    物質がトロンビンからなる請求項１１の方法。
13. （１３）混合物が、フィブリンとコラーゲンを架橋結合
    させる物質を含むか又は該物質に曝されている請求項１
    １の方法。
14. （１４）架橋結合剤が第ＸIII因子である請求項１３の
    方法。
15. （１５）組織相当物中又は組織相当物上に生細胞を加え
    ることを更に含む請求項１１の方法。
16. （１６）コラーゲン及びフィブリノーゲンがそれぞれ約
    ０．３〜約３．０ｍｇ／ｍｌの濃度である請求項１１の
    方法。
17. （１７）コラーゲンが約１．０・〜約１．５ｍｇ／ｍｌ
    、フィブリノーゲンが約１．５〜約２．５ｍｇ／ｍｌの
    濃度である請求項１１の方法。
18. （１８）請求項１１の方法により形成した組織相当物。
19. （１９）コラーゲン及びフィブリンのそれぞれが約３〜
    約３０ｍｇ／ｃｍ＾３の濃度である請求項１８の組織相
    当物。
20. （２０）コラーゲンが約１０〜約１５ｍｇ／ｃｍ＾３、
    フィブリンが約１５〜約２５ｍｇ／ｃｍ＾３の濃度であ
    る請求項１８の組織相当物。
21. （２１）（ａ）コラーゲンと収縮物質とがその中に分散
    しているゲルを形成する条件下で、コラーゲンと少なく
    とも１種の収縮物質からなる混合物を形成し、 （ｂ）ステップ（ａ）で得たゲルを、ゲルが収縮して組
    織相当物が形成され得る条件に維持し、そして（ｃ）フ
    ィブリノーゲンからフィブリンを形成させる物質とフィ
    ブリノーゲンとをステップ（ｂ）の組織相当物の少なく
    とも１つの表面に適用することからなる組織相当物の製
    造方法。
22. （２２）フィブリノーゲンからフィブリンを形成させる
    物質がトロンビンからなる請求項２１の方法。
23. （２３）混合物が、フィブリンとコラーゲンを架橋結合
    させる物質を更に含むか又は前記物質に曝されている請
    求項２１の方法。
24. （２４）架橋結合物質が第ＸIII因子からなる請求項２
    ３の方法。
25. （２５）組織相当物中又は組織相当物上に生細胞を加え
    ることを更に含む請求項２１の方法。
26. （２６）コラーゲン及びフィブリノーゲンがそれぞれ約
    ０．３〜約３．０ｍｇ／ｍｌの濃度である請求項２１の
    方法。
27. （２７）コラーゲンが約１．０〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、
    フィブリノーゲンが約１．５〜約２．５ｍｇ／ｍｌの濃
    度である請求項２１の方法。
28. （２８）請求項２１の方法に従って形成した組織相当物
    。
29. （２９）コラーゲン及びフィブリンがそれぞれ約３．０
    〜約３０．０ｍｇ／ｃｍ＾３の濃度である請求項２８の
    組織相当物。
30. （３０）コラーゲンが約１０．０〜約１５．０ｍｇ／ｃ
    ｍ＾３、フィブリンが約１５．０〜約２５．０ｍｇ／ｃ
    ｍ＾３の濃度である請求項２８の組織相当物。
31. （３１）（ａ）ゲル内にコラーゲンと収縮物質が分散し
    ているゲルを形成する条件下で、コラーゲンと少なくと
    も１種の収縮物質からなる混合物を形成し、ゲルが収縮
    して第一の組織相当物が形成され得る条件下にゲルを維
    持し、 （ｂ）第一の組織相当物にフィブリノーゲンとトロンビ
    ンとからなる混合物を適用し、そして （ｃ）上記ステップ（ａ）に従つて製造した第二の組織
    相当物と第一の組織相当物とを接触させ、（ｄ）組織相
    当物の層が更に所望のときにはステップ（ｂ）及び（ｃ
    ）を繰り返す ことからなる少なくとも２つの層を有する組織相当物の
    製造方法。
32. （３２）ステップ（ａ）、ステップ（ｃ）又はステップ
    （ａ）及びステップ（ｃ）の混合物が更にフィブリノー
    ゲン及びトロンビンを含んでいる請求項３１の方法。
33. （３３）ステップ（ｃ）の組織相当物の表面にフィブリ
    ノーゲンとトロンビンとからなる混合物を適用する請求
    項３１の方法。
34. （３４）（ａ）ゲル内にコラーゲン、収縮物質、フィブ
    リノーゲン及びフィブリノーゲンからフィブリンを形成
    させる物質が分散しているゲルを形成する条件下で、コ
    ラーゲン、少なくとも１種の収縮物質、フィブリノーゲ
    ン及びフィブリノーゲンからフィブリンを形成させる物
    質とからなる混合物を形成し、ゲルが収縮して第一の組
    織相当物が形成されうる条件下にゲルを維持し、 （ｂ）第一の組織相当物に、フィブリノーゲンからフィ
    ブリンを形成させる物質とフィブリノーゲンとからなる
    混合物を適用し、そして （ｃ）上記ステップ（ａ）に従つて製造した第二の組織
    相当物と第一の組織相当物とを接触させ、そして （ｄ）組織相当物の層が更に所望であれば、ステップ（
    ｂ）及び（ｃ）を繰り返す ことからなる少なくとも２層を有する組織相当物の製造
    方法。
35. （３５）（ａ）コラーゲンの酸性溶液を形成し、（ｂ）
    フィブリノーゲン、フィブリノーゲンからフィブリンを
    形成させる物質、少なくとも１種の収縮物質及び栄養培
    地をコラーゲンの酸性溶液と合せ、 （Ｃ）コラーゲンをゲルとし、フィブリノーゲン、フィ
    ブリノーゲンからフィブリンを形成させる物質及び収縮
    物質を含有する水和コラーゲン格子を形成させるのに十
    分なレベルにコラーゲン溶液のｐＨ及び温度を上昇させ
    、そして （ｄ）前記物質がフィブリノーゲンを開裂させてフィブ
    リンを形成させ、収縮物質がコラーゲン格子を収縮させ
    るに十分な条件下に、格子、フィブリノーゲン、フィブ
    リノーゲンから、フィブリンを形成させる物質及び収縮
    物質を維持して組織相当物を形成する ことからなる組織相当物の製造方法。
36. （３６）ステップ（ｂ）と（ｃ）を同時に実施する請求
    項３５の方法。
37. （３７）混合物が更に、フィブリノーゲンとコラーゲン
    を架橋結合させる物質を含んでいる請求項３５の方法。
38. （３８）前記物質が第ＸIII因子である請求項３６の方
    法。
39. （３９）組織相当物中又は組織相当物上に生細胞を加え
    ることをさらに含む請求項３５の方法。
40. （４０）コラーゲン及びフィブリノーゲンがそれぞれ約
    ０．３〜約３．０ｍｇ／ｍｌの濃度である請求項３５の
    方法。
41. （４１）コラーゲンが約１．０〜約１．５ｍｇ／ｍｌ、
    フィブリノーゲンが約１．５〜約２．５ｍｇ／ｍｌの濃
    度である請求項３５の方法。
42. （４２）請求項３５の方法で形成された組織相当物。
43. （４３）コラーゲン及びフィブリンがそれぞれ約３〜約
    ３０ｍｇ／ｃｍ＾３の濃度である請求項４２の組織相当
    物。
44. （４４）コラーゲンが約１０〜約１５ｍｇ／ｃｍ＾３、
    フィブリンが約１５〜約２５ｍｇ／ｃｍ＾３の濃度であ
    る請求項４２の組織相当物。
45. （４５）請求項１の組織相当物中の裂け目を結合する方
    法であつて、 （ａ）フィブリノーゲンとフィブリノーゲンからフィブ
    リンを形成させる物質とからなる混合物を裂け目に適用
    し、そして （ｂ）ステップ（ａ）の組織相当物を、フィブリンが形
    成されうる条件下に維持する ことからなる前記方法。
46. （４６）（ａ）フィブリノーゲンとフィブリノーゲンか
    らフィブリンを形成させる物質とからなる混合物を組織
    相当物の損傷部分に適用し、そして （ｂ）ステップ（ａ）の組織相当物を、フィブリンが形
    成されうる条件下に維持する ことからなる、収縮物質で収縮させた水和コラーゲン格
    子、又は（ｉ）収縮物質で収縮させた水和コラーゲン格
    子と（ｉｉ）フィブリンとからなる組織相当物の損傷を
    修復する方法。