CS277106B6 - Biological carrier of cellular cultures, its application for the preparation of human keratocytes and process for preparing said human keratocytes on said carrier - Google Patents
Biological carrier of cellular cultures, its application for the preparation of human keratocytes and process for preparing said human keratocytes on said carrier Download PDFInfo
- Publication number
- CS277106B6 CS277106B6 CS902858A CS285890A CS277106B6 CS 277106 B6 CS277106 B6 CS 277106B6 CS 902858 A CS902858 A CS 902858A CS 285890 A CS285890 A CS 285890A CS 277106 B6 CS277106 B6 CS 277106B6
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- biological carrier
- carrier according
- carrier
- biological
- keratocytes
- Prior art date
Links
Abstract
Description
Vynález se týká biologického nosiče buněčných kultur, který je tvořen koagulovanou směsí koncentrátu plasmatických bílkovin a trombinu, jeho použití při přípravě kultur keratocytů, při jejich přenosu v podobě rekonstituované epidermis a při jejich léčebném uplatnění.BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention relates to a biological carrier of cell cultures comprising a coagulated mixture of plasma protein concentrate and thrombin, its use in the preparation of keratocyte cultures, their transfer in the form of reconstituted epidermis and their therapeutic application.
V současnosti jsou široce zkoumány možnosti, jak v laboratorních podmínkách rekonstituovat z několika buněk získaných při biopsii žijící, třeba zjednodušenou, kůži, která by dokázala vykonávat fysiologické funkce normální kůže a mohla tak nahradit kůži postiženou závažným onemocněním (např. genetickým) nebo zničenou rozsáhlými popáleninami.At present, possibilities are being explored to reconstitute living, possibly simplified, skin in a laboratory environment from several biopsy cells capable of performing the physiological functions of normal skin and thus replacing skin affected by a serious disease (eg genetic) or destroyed by severe burns .
Kůže je komplexní orgán, který sestává za tří na sebe nesedajících tkání: z pokožky neboli epidermis, přitom 85% epidermis tvoří keratocyty představující nepropustnou rohovou vrstvu isolují tělo od okolního prostředí; ze škáry neboli dermis, která obsahuje buňky, m.j. fibrocyty, uložené v pojivové tkáni sestávající především z kolagenu; dermis pak leží na podkožní tkáni obsahující především tukové buňky. Umělá rekonstituce takto komplexního orgánu proto předpokládá vyřešení četných problémů.The skin is a complex organ that consists of three non-adjacent tissues: the skin or epidermis, while 85% of the epidermis are keratocytes representing the impermeable corner layer isolating the body from the environment; from the dermis or dermis that contains the cells, i. fibrocytes embedded in connective tissue consisting primarily of collagen; The dermis then lies on the subcutaneous tissue containing mainly fat cells. Therefore, artificial reconstitution of such a complex organ presupposes solving numerous problems.
První tkání, kterou se podařilo in vitro úspěšně částečně rekonstituovat, byla dermis, dosáhl toho Bellův tým (Bell et al., Proč. Nati. Acad. Sci, 76-1979-1274).The first tissue to be partially reconstituted in vitro was the dermis, achieved by the Bell team (Bell et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 76-1979-1274).
Nejprve se zdařilo kultivovat fibroblasty z kožní biopsie, zpočátku v jedné vrstvě - jako monolayer, později, po určitém pasážování, mohly být tyto buňky rozptýleny v kultivačním médiu obsahujícím kolagen (extrahovaný ze šlach krysích ocásků). Kolagen přispěl k formování kultivačního média v podobě gelu, což umožnilo trojrozměrný růst buněk. Bylo pozorováno, že fibroblasty v těchto kulturách interagují s kolagenní matrix, organisují ji a kontrahují podobně jako v normální dermis. Tato tkáň, rekonstituovaná in vitro, je známa jako ekvivalent dermis. Po několika týdnech růstu dovolují mechanické vlastnosti ekvivalentu dermis jeho přenos na pacienta nebo raněného, přitom nejsou pozorovány známky rejekce transplantátu hostitelem. Tento evivalent dermis však může sloužit pouze jako dočasné krytí, neboť nedokáže nahradit funkci kůže jako bariéry proti zevnímu prostředí.At first it was possible to cultivate fibroblasts from a skin biopsy, initially in one layer - as a monolayer, and later, after some passage, these cells could be dispersed in culture medium containing collagen (extracted from rat tail tendons). Collagen contributed to the formation of the culture medium in the form of a gel, which allowed for three-dimensional cell growth. Fibroblasts in these cultures have been observed to interact with, organize and contract the collagen matrix similarly to the normal dermis. This tissue, reconstituted in vitro, is known as the dermis equivalent. After several weeks of growth, the mechanical properties of the dermis equivalent allow its transfer to the patient or wounded, with no evidence of transplant rejection by the host. However, this equivalent dermis can only serve as a temporary dressing because it cannot replace the function of the skin as a barrier to the external environment.
Později vyvinul Greenův tým (H. Green et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 76-1979-5665) metodu a kultivační médium umožňující dlouhodobý růst keratocytů. Při této metodě jsou keratocyty nejprve dispergovány pomocí trypsinu a poté inokulovány na předem připravený monolayer fibroblastů, konkrétně 3T3 buněk, letálně ozářený a složitý jako podložní a výživná vrstva. Epidermální vrstva se rychle vyvine ve tkáň o tloušťce 3 až 5 buněk, která může být transplantována pacientovi a pokračuje v diferenciaci in sítu. Bylo již prokázáno, že lze pomocí této metody zachránit těžce popálené (G. Gallico et al., New England J. Med., 311-1984-448).Later, Green's team (H. Green et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 76-1979-5665) developed a method and culture medium allowing long-term keratocyte growth. In this method, keratocytes are first dispersed with trypsin and then inoculated onto preformed monolayer fibroblasts, specifically 3T3 cells, lethal irradiated and complex as a backing and nutrient layer. The epidermal layer rapidly develops into tissue with a thickness of 3-5 cells, which can be transplanted to a patient and continues to differentiate in situ. It has already been shown that severe burns can be saved by this method (G. Gallico et al., New England J. Med., 311-1984-448).
Greenovou technikou lze získat z biopsie o ploše dvou čtverečních centimetrů během tří týdnů epidermis rozsahu jednoho čtverečního metru.The Green technique can be obtained from a biopsy with an area of two square centimeters within three weeks of the epidermis of one square meter.
Velkým problémem je stále isolace rekonstituované tkáně tak, aby vytvářela vhodný štěp schopný transplantace. Nejprve je třeba enzymaticky oddělit buňky od kultivační misky, aniž by však došlo k porušení celistvosti tkáně, při této operaci byla vždy pozorována určitá retrakce buněčné vrstvy a tedy ztráta j isté části povrchu transplantátu. Po oddělení rekonstituované tkáně je třeba připevnit ji k nosiči, který umožňuje její přenášení a transplantaci pacientovi, jako nosič je obvykle užívána obvazová gáza napuštěná vazelínou. Všechny uvedené postupy jsou jemné a náročné na čas.A major problem is still the isolation of the reconstituted tissue to produce a suitable graft capable of transplantation. First, it is necessary to enzymatically separate the cells from the culture dish without disrupting the integrity of the tissue, in which a certain cell layer retraction and thus a loss of a certain part of the graft surface has always been observed. After detaching the reconstituted tissue, it should be attached to a carrier which allows it to be transported and transplanted to the patient, typically a vaseline impregnated dressing gauze is used as the carrier. All these procedures are gentle and time consuming.
Významným přínosem by mohl být proto nový, biologický nosič, který by byl resorbovatelný v organismu pacienta, jemuž byl štěp transplantován, a který by zároveň zjednodušil zacházení s pěstovanými buňkami. Navíc by bylo v zájmu dobré dostupnosti vhodné, kdyby tento nosič nebo jeho součásti mohly být připravovány a baleny v průmyslovém procesu.An important benefit could therefore be a new, biological carrier that is resorbable in the body of the transplanted patient and at the same time simplifies the treatment of the cultured cells. Moreover, in the interest of good accessibility, it would be desirable if the carrier or its components could be prepared and packaged in an industrial process.
Podařilo se vyvinout biologický nosič buněčných kultur, který je tvořen směsí koncentrátu plasmatických bílkovin, jež mohou být koagulovány trombinem, a určitého množství trombinu s přidáním vápníku, trombin je zde nezbytný jako aktivátor koagulace.We have succeeded in developing a biological carrier of cell cultures consisting of a mixture of plasma protein concentrate which can be coagulated by thrombin and a certain amount of thrombin with the addition of calcium, thrombin being necessary here as an activator of coagulation.
Předmětem vynálezu je biologický nosič buněčných kultur charakterisovaný tím, že je tvořen směsí koncentrátu bílkovin koagulovatelných trombinem, získaných po zpracování krevní plasmy etanolem a obsahujících vyvážená množství funkčního fibrinogenu, Faktoru XIII a plasmatického fibronektinu, a určitého množství trombinu obohaceného kalciem, nezbytného jako aktivátoru koagulace.The present invention provides a biological cell culture carrier characterized in that it comprises a mixture of thrombin-coagulable protein concentrate obtained after treatment of blood plasma with ethanol and containing balanced amounts of functional fibrinogen, Factor XIII and plasma fibronectin, and some calcium-enriched thrombin necessary as a coagulation activator.
Biologický nosič podle vynálezu je výhodně charakterisován tím, že koncentrát koagulovatelných plasmatických bílkovin obsahuje přes 90 % fibrinogenu a že v 1 gramu bílkovin obsahuje nejméně 0,1 IU Faktoru XIII a 0,03 až 0,1 gram fibronektinu.The biological carrier of the invention is preferably characterized in that the coagulable plasma protein concentrate contains over 90% fibrinogen and that it contains at least 0.1 IU of Factor XIII and 0.03 to 0.1 gram of fibronectin per gram of protein.
Biologický nosič podle vynálezu je dále výhodně charakterisován tím, že bílkovinný koncentrát je získán precipitací čerstvé plasmy dvěma po sobě následujícími zpracováními v 10% roztoku etanolu při teplotě 4 °C.The biological carrier according to the invention is further advantageously characterized in that the protein concentrate is obtained by precipitation of fresh plasma by two successive treatments in a 10% ethanol solution at 4 ° C.
Biologický nosič podle vynálezu je dále výhodně charakterisován lyofilisací bílkovinného koncentrátu.The biological carrier according to the invention is further preferably characterized by freeze-drying the protein concentrate.
Biologický nosič podle vynálezu je také výhodně charakterisován tím, že bílkovinný koncentrát je v suspensi s roztokem aprotininu.The biological carrier according to the invention is also advantageously characterized in that the protein concentrate is in suspension with an aprotinin solution.
Biologický nosič podle vynálezu je dále výhodně charakterisován tím, že trombin obohacený kalciem je smíšen s bílkovinným koncentrátem v poměru přibližně 10 IU/ml.The biological carrier of the invention is further preferably characterized in that the calcium-enriched thrombin is mixed with the protein concentrate in a ratio of about 10 IU / ml.
Biologický nosič podle vynálezu je dále výhodně charakterisován tím, že obsahuje jako přísadu látku stimulující množení buněk.The biological carrier according to the invention is further advantageously characterized in that it contains, as an additive, a cell-stimulating agent.
Biologický nosič podle vynálezu je dále výhodně charakteriCS 277106 B6 sován tím, že jako přísadu obsahuje antibiotikum.The biological carrier according to the invention is further preferably characterized in that it contains an antibiotic as an additive.
Biologický nosič podle vynálezu je také výhodně charakterisován tím, že obsahuje jako přísadu látku urychlující hojení ran.The biological carrier according to the invention is also advantageously characterized in that it contains a wound healing accelerator as an additive.
Předmětem vynálezu je rovněž využití biologického nosiče podle vynálezu k přípravě kultury lidských keratocytů, fetálních nebo dospělých, aby byla utvořena náhradní tkáň, kterou lze přímo isolovat, přenášet á používat jako štěp.The present invention also provides the use of a biological carrier of the invention for the preparation of a culture of human keratocytes, fetal or adult, to form surrogate tissue which can be directly isolated, transferred and used as a graft.
Využití biologického nosiče podle vynálezu je výhodně charakterisováno tím, že uvedené dvě složky biologického nosiče jsou smíšeny tak, aby v kultivační misce utvořily uniformní film, a suspense keratocytů v kultivačním médiu je pak přenesena na uvedený film.The use of a biological carrier according to the invention is advantageously characterized in that the two components of the biological carrier are mixed so as to form a uniform film in the culture dish, and the keratocyte suspension in the culture medium is then transferred to said film.
Využití biologického nosiče podle vynálezu je dále výhodně charakterisováno tím, že obě složky biologického nosiče jsou smíšeny se suspensi keratocytů tak, aby tyto buňky byly zabudovány do filmu, který bude následně utvořen.The use of the biological carrier according to the invention is further advantageously characterized in that the two components of the biological carrier are mixed with the keratocyte suspension so that these cells are incorporated into a film which will subsequently be formed.
Využití biologického nosiče podle vynálezu je dále výhodně charakterisováno tím, že suspense keratocytů je získána dispergováním čerstvé, předem utvořené vrstvy buněk.The use of a biological carrier according to the invention is further advantageously characterized in that the keratocyte suspension is obtained by dispersing a fresh, preformed cell layer.
Využití biologického nosiče podle vynálezu je dále výhodně charakterisováno tím, že suspense keratocytů je získána z buněčné banky uchovávané v tekutém dusíku.The use of a biological carrier according to the invention is further advantageously characterized in that the keratocyte suspension is obtained from a cell bank stored in liquid nitrogen.
Předmětem vynálezu je rovněž využití biologického nosiče podle vynálezu pro isolaci a přenos předem připravené kultury lidských keratocytů, fetálních nebo dospělých.The invention also relates to the use of the biological carrier of the invention for the isolation and transfer of a pre-prepared culture of human keratocytes, fetal or adult.
Využití biologického nosiče podle vynálezu je v tomto případě výhodně charakterisováno tím, že obě složky biologického nosiče jsou smíšeny přímo na předem připravené vrstvě buněk v kultivační misce.The use of a biological carrier according to the invention is in this case advantageously characterized in that the two components of the biological carrier are mixed directly on a pre-prepared cell layer in a culture dish.
Předmětem vynálezu je rovněž koncentrát bílkovin koagulovatelných trombinem charakterisovaný tím, že je balen pro přípravu biologického nosiče podle vynálezu.The present invention also provides a thrombin coagulable protein concentrate characterized in that it is packaged for the preparation of a biological carrier according to the invention.
V následující části popisu bude vynález detailněji vysvětlen:In the following, the invention will be explained in more detail:
Ke koagulaci plasmatických bílkovin v přítomnosti fibrinu dochází především díky vytvoření polymerisované fibrinové sítě, tento proces je analogií krevního srážení. Aby mohl vzniknout nosič vhodný pro přípravu buněčných kultur, probíhá koagulace v podmínkách vedouc'h ke tvorbě filmu, konkrétně v Petriho buňkách nebo v jiných buňkách vhodných pro pěstování buněčných kultur.Coagulation of plasma proteins in the presence of fibrin occurs mainly through the formation of a polymerized fibrin network, a process analogous to blood clotting. In order to produce a carrier suitable for the preparation of cell cultures, coagulation takes place under conditions leading to film formation, in particular in Petri cells or other cells suitable for cell culture.
Koncentrát plasmatických bílkovin již byl popsán v Evropské patentové přihlášce 88 401 961 3: získává se precipitací čerstvé plasmy ve dvou po sobě následujících zpracováních s užitím 10% roztoku etanolu při teplotě 4 °C. Koncentrát obsahuje přes 90 % fibrinogenu a v 1 gramu bílkoviny nejméně 0,1 IU Faktoru XIII a 0,03 až 0,1 gramu fibronektinu. Koncentrát je balen a lyofilisován a takto je přechováván do doby použití.A plasma protein concentrate has already been described in European Patent Application 88 401 961 3: it is obtained by precipitation of fresh plasma in two successive treatments using a 10% ethanol solution at 4 ° C. The concentrate contains over 90% fibrinogen and per gram of protein at least 0.1 IU of Factor XIII and 0.03 to 0.1 gram of fibronectin. The concentrate is packaged and lyophilized and is thus stored until use.
Před použitím je koncentrát rozpuštěn ve vodném roztoku solí nebo v roztoku obsahujícím polyvalentní inhibitor proteáz, nejlépe aprotinin, v koncentraci 3 000 KlU/ml (kallikrein inhibičních jednotek/ml).Prior to use, the concentrate is dissolved in an aqueous salt solution or solution containing a polyvalent protease inhibitor, preferably aprotinin, at a concentration of 3000 KIU / ml (kallikrein inhibitory units / ml).
Aby byl aktivován proces koagulace, a tím tvorba filmu sloužícího jako nosič pro buňky, je ke koncentrátu přidán trombin, který může být obohacen kalcinem. Proces koagulace zahrnuje transformaci fibrinogenu na fibrin zprostředkovanou trombinem a polymerisaci fibrin monomeru s fibrinektinem, která je zprostředkována Faktorem XIII aktivovaným Ca++ ionty.In order to activate the coagulation process and hence the formation of a cell carrier film, thrombin, which can be enriched with calcine, is added to the concentrate. The coagulation process involves the transformation of fibrinogen to thrombin-mediated fibrin and the polymerization of fibrin monomer with fibrinectin, which is mediated by Ca ++- activated Factor XIII.
Pro vytvoření nosiče podle vynálezu, který by byl zvlášť vhodný pro buněčné kultury, byla zvolena koncentrace trombinu přibližně 10 IU/ml (podstatně nižší koncentrace než jaká se užívá, požadujeme-li jinou konsistenci, např. při přípravě biologických lepidel - viz výše uvedený patent č. 88 401 961 3).A thrombin concentration of about 10 IU / ml (substantially lower than that used when a different consistency is desired, e.g. in the preparation of biological adhesives) has been chosen to create a carrier according to the invention which is particularly suitable for cell cultures. No. 88 401 961 3).
S ohledem na různé možnosti provedení vynálezu je možné začlenit do nosiče různé přísady, zvláště ty, které podporují buněčné dělení a které tak usnadňují hojení rány po transpantaci.In view of the various embodiments of the invention, it is possible to incorporate various ingredients into the carrier, particularly those which promote cell division and thus facilitate wound healing after transplantation.
Nosič tak může obsahovat přísadu stimulující dělení buněk jako například růstový faktor, nebo lépe epidermální růstový faktor (EGF, epidermal growth factor).Thus, the carrier may comprise a cell division stimulating additive such as growth factor, or more preferably epidermal growth factor (EGF).
Do nosiče může být takto začleněna látka podporující hojení nebo antibiotikum.Thus, a healing agent or antibiotic may be incorporated into the carrier.
Nosič podle vynálezu je zvláště vhodný pro přípravu kultur lidských keratocytů. Přitom lze využít bud buňky z primárních kultur získaných z kožních biopsií pacienta, které prodělaly 1 až 4 pasáže v ředění 1/15 až 1/20, nebo buňky uchovávané v buněčných bankách v tekutém dusíku.The carrier of the invention is particularly suitable for the preparation of cultures of human keratocytes. Either cells from primary cultures obtained from skin biopsies of the patient having undergone 1 to 4 passages at 1/15 to 1/20 dilution, or cells stored in liquid nitrogen in cell banks can be used.
Tyto keratocyty, pěstované v jedné splývající vrstvě, jsou před naočkováním na nosič podle vynálezu zpracovány trypsinem a suspendovány ve vhodném kultivačním médiu.These keratocytes, grown in a single confluent layer, are treated with trypsin and suspended in a suitable culture medium before being inoculated onto the carrier of the invention.
Biologický nosič podle vynálezu může být použit třemi různými způsoby:The biological carrier of the invention can be used in three different ways:
Při prvním způsobu použití je biologický nosič připraven ve formě filmu smíšením jeho dvou složek v kultivační misce, na tento film je pak naočkována suspense keratocytů ve vhodném kultivačním médiu. Jakmile se keratocytová kultura stane částečně nebo plně splývající, je vytvořena náhradní tkáň, která může být přímo isolována a oddělena pinsetou a ihned z misky přenesena na pacienta, není tedy třeba žádného dočasného nosiče jako např. gázy. To vede k významné úspoře pracovního času a ke 100% uchování vypěstované tkáně.In a first method of use, the biological carrier is prepared in the form of a film by mixing its two components in a culture dish, and then inoculating a keratocyte suspension in a suitable culture medium. Once the keratocyte culture becomes partially or fully confluent, surrogate tissue is formed which can be directly isolated and separated by a pinet and immediately transferred from the dish to the patient, thus no temporary carrier such as gauze is required. This leads to significant savings in working time and 100% retention of the grown tissue.
Při druhém způsobu užití nosiče podle vynálezu jsou jeho dvě složky smíšeny se suspensí keratocytů takovým způsobem, aby byly tyto buňky zabudovány do filmu, který bude následně utvořen. Stejně jako v prvním způsobu mohou být obě složky nosiče smíšeny s buněčnou suspensí v kultivační misce a poté použity jako štěp, rovněž je ovšem možné provést toto přímo na poraněném místě připraveném pro přijetí štěpu, konkrétně nastříkat biologický nosič i buňky na ránu s užitím nosného plynu (dusíku) pod tlakem 2 až 2,5 baru.In a second use of the carrier according to the invention, its two components are mixed with a suspension of keratocytes in such a way that these cells are incorporated into a film which will subsequently be formed. As in the first method, both carrier components can be mixed with the cell suspension in the culture dish and then used as a graft, but it is also possible to do this directly at the injured site ready for grafting, namely spraying the biological carrier and cells on the wound using carrier (nitrogen) under a pressure of 2 to 2.5 bar.
Podle třetího způsobu užití nosiče podle vynálezu jsou jeho dvě složky smíšeny na vrstvě keratocytů předem připravené v kultivační misce, buňky jsou tak pokryty utvořeným filmem a opět mohou být odděleny, přeneseny a použity jako štěp.According to a third method of use of the carrier according to the invention, its two components are mixed on a layer of keratocytes previously prepared in a culture dish, so that the cells are covered with the formed film and can again be separated, transferred and used as grafts.
Následující příklady mají ilustrovat vynález aniž by jakkoliv omezily celkový rozsah jeho použití:The following examples are intended to illustrate the invention without limiting its scope in any way:
Příklad 1: Příprava biologického nosiče buněčných kultur.Example 1: Preparation of a biological carrier for cell cultures.
Biologický nosič buněčných kultur je připraven smíšením koncentrátu koagulovatelných plasmatických bílkovin a určitého množství trombinu obohaceného kalciem nutného k aktivování koagulace.A biological carrier of cell cultures is prepared by mixing a concentrate of coagulable plasma proteins and a certain amount of calcium-enriched thrombin necessary to activate coagulation.
A. Příprava koncentrátu plasmatických bílkovin.A. Preparation of Plasma Protein Concentrate.
Příprava bílkovinného koncentrátu již byla popsána v Evropské patentové přihlášce č. 88 401 961 3. Krátce shrnuto, při přípravě je použita čerstvá (nikoliv kryoprecipitovaná) lidská plasma, tato je dvakrát po sobě precipitována 10% roztokem etanolu s pH 7,2 při teplotě 4 °C. Mezi oběma precipitacemi je zařazena procedura inaktivující viry. Precipitát je centrifugací oddělen od supernatantu, promyt v etanolu při teplotě 4 °C a opět centrifugován. Pak je precipitát suspendován v Tris/citrátovém pufru, upraven tak, aby konečná koncentrace bílkovin byla přibližně 35 g/1 a obohacen o lysin v konečné koncentraci 0,1 až 0,2 gramu na 1 gram bílkovin. Diafiltrací je pak odstraněn etanol a citrát, současně je upravena iontová síla a koncentrát je balen do baněk a lyofilisován.The preparation of the protein concentrate has already been described in European Patent Application No. 88 401 961 3. Briefly summarized, fresh (not cryoprecipitated) human plasma is used in the preparation, which is precipitated twice in succession with a 10% ethanol solution at pH 7.2 at 4 Deň: 32 ° C. A virus inactivation procedure is included between the two precipitations. The precipitate is separated from the supernatant by centrifugation, washed in ethanol at 4 ° C and centrifuged again. Then, the precipitate is suspended in Tris / citrate buffer, adjusted to a final protein concentration of about 35 g / L and enriched with lysine at a final concentration of 0.1 to 0.2 grams per gram of protein. Diafiltration then removes ethanol and citrate, at the same time adjusting the ionic strength and concentrating the flasks and lyophilizing them.
Takto připravený bílkovinný koncentrát obsahuje v 1 gramu bílkovin nejméně 0,9 gramu fibrinogenu, 0,03 až 0,06 g fibronektinu a 0,15 až 0,3 IU Faktoru XIII.The protein concentrate thus prepared contains at least 0.9 grams of fibrinogen, 0.03 to 0.06 g of fibronectin and 0.15 to 0.3 IU of Factor XIII per gram of protein.
B. Příprava nosiče buněčných kultur.B. Cell Culture Carrier Preparation.
Výše popsaný bílkovinný koncentrát je znovu uveden do suspense ve vodném roztoku, který může obsahovat aprotinin v koncentraci 3 000 KIU/ml (kalikrein inhibičních jednotek/ml).The protein concentrate described above is resuspended in an aqueous solution which may contain aprotinin at a concentration of 3000 KIU / ml (kallikrein inhibitory units / ml).
Tento roztok je smíšen se stejným objemem trombinu v koncentraci 10 IU/ml obohaceného kalciem.This solution is mixed with an equal volume of 10 IU / ml calcium enriched thrombin.
Do Petriho misky o průměru 10 cm je simultánně ze dvou stříkaček propojených směšovacím zařízením injikováno 2 ml bílkovinné suspense a 2 ml trombinu. Mícháním je směs rovnoměrně distribuována a poté se během 15 až 20 minut klidu vytvoří film pokrývající dno misky.In a 10 cm diameter petri dish, 2 ml protein suspension and 2 ml thrombin are injected simultaneously from two syringes connected by a mixer. By stirring, the mixture is evenly distributed and then a film covering the bottom of the dish is formed within 15 to 20 minutes of rest.
Použité kultivační misky jsou typu neupravené pro buněčné kultury (non treated for cell cultures), které zajistí, že nosič nebude ke dnu trvale adherovat, tím se usnadní jeho následná isolace.The culture dishes used are of the non-treated type for cell cultures, which ensure that the carrier will not adhere permanently to the bottom, thereby facilitating its subsequent isolation.
Film je posléze pokryt buněčným kultivačním médiem. Toto médium je několikrát obnoveno dokud není osmotický tlak filmu stabilisován v rozmezí slučitelném s fysiologií buněk, tj. mezi 260 a 340 miliosmoly.The film is then covered with a cell culture medium. This medium is renewed several times until the osmotic pressure of the film is stabilized in a range compatible with the physiology of the cells, i.e. between 260 and 340 milliosmoles.
Rekonstituovaný bílkovinný koncentrát může být rovněž dialysován dříve než je smíšen s trombinem.The reconstituted protein concentrate may also be dialysed before it is mixed with thrombin.
Příklad 2: Příprava kultury keratocytů na biologickém nosiči.Example 2: Preparation of a keratocyte culture on a biological carrier.
Zde se využívá primárních kultur keratocytů připravených s použitím Greenovy klasické techniky z kožních biopsií z pacientovy kůže (nebo z embryonální kůže po vytvoření banky fetálních buněk). Tyto primární kultury mohou projít 4 až 5 pasážemi v ředění 1/10·Here, primary keratocyte cultures prepared using Green's classical technique of skin biopsy from the patient's skin (or embryonic skin after creating a fetal cell bank) are utilized. These primary cultures can pass 4 to 5 passages in 1/10 dilution ·
Vrstva splývajících keratocytů je zpracována trypsinem, přenesena do kultivačního média a naočkována v ředění 1/10 na Petriho misku krytou filmem s biologickým nosičem popsaným v příkladu 1.The confluent keratocyte layer is trypsinized, transferred to culture medium and seeded at a 1/10 dilution onto a petri dish coated with the biological carrier film described in Example 1.
Po několikai hodinách buňky přilnou k nosiči a mohou se normálně dělit až se vytvoří fragment souvislé epidermis o tlouštce až 4 buněčných vrstev.After a few hours, the cells adhere to the carrier and can normally divide until a fragment of a contiguous epidermis is formed with a thickness of up to 4 cell layers.
Tento fragment rekonstituované epidermis adherující k nosiči může být pak oddělen pomocí pinsety od kultivační misky a bez dalších změn přenesen na rámu připravenou k přijetí štěpu.This fragment of the reconstituted epidermis adhering to the carrier can then be separated from the culture dish by means of a pinet and transferred to the frame ready for graft acceptance without further changes.
Jelikož buňky již adherují k biologickému nosiči, není třeba fixovat je k jinému nosiči, např. gáze napuštěné vaselinou, jak tomu je v jiných typech kultur. Tak je dosaženo významné úspory pracovního času, je možné během hodiny zpracovat 40 boxů oproti boxům při zachování konvenčního postupu.Since the cells already adhere to the biological carrier, there is no need to fix them to another carrier, e.g., vaseline impregnated gauze, as is the case in other types of cultures. In this way, a significant saving of working time is achieved, it is possible to process 40 boxes per hour compared to the boxes while maintaining a conventional procedure.
Biologický nosič navíc dobře snáší manipulaci a neretrahuje se při oddělování od kultivační misky, což umožňuje využít 100 % povrchu buněčné vrstvy kultury.In addition, the biological carrier is easy to handle and does not extract when separated from the culture dish, allowing 100% of the cell surface of the culture to be utilized.
Příklad 3: Isolace předem připravené buněčné vrstvy s užitím bilogického nosiče.Example 3: Isolation of a preformed cell layer using a biological carrier.
Keratocyty jsou podle Greenovy konvenční metody naočkovány na Petriho misku pokrytou vrstvou letálně ozářených fibroblastů.Keratocytes are inoculated according to Green's conventional method onto a petri dish coated with a layer of lethal-irradiated fibroblasts.
Jakmile keratocyty vytvoří souvislý povlak z několika vrstev buněk, kultivační médium je odstraněno a do misky je na dobu 90 min. přidán roztok EDTA, poté následuje dvojí promytí pomocí PBS. Biologický nosič je pak nanesen přímo na vrstvu buněk metodou popsanou v příkladu 2.Once keratocytes form a coherent coating of several cell layers, the culture medium is removed and placed in the dish for 90 min. EDTA solution was added followed by two washes with PBS. The biological support is then applied directly to the cell layer by the method described in Example 2.
Film, který se nad vrstvou buněk utvoří, může být opět pinsetou oddělen a použit jako štěp podobně jako v přecházejícím příkladu.The film formed above the cell layer can again be detached by a pinet and used as a graft, as in the previous example.
Příklad 4: Zabudování buněk do biologického nosiče.Example 4: Incorporation of cells into a biological carrier.
Nejprve je třeba připravit dvě stříkačky, jednu s roztokem bílkovin, druhou obsahující trombin a suspensi keratocytů. Keratocyty mohou pocházet z čerstvé kultury po zpracování trypsinem nebo z buněčné banky přechovávané v tekutém dusíku.First, two syringes should be prepared, one with a protein solution, the other containing thrombin and a keratocyte suspension. Keratocytes can be derived from fresh culture after trypsin treatment or from a cell bank stored in liquid nitrogen.
Uvedené dvě stříkačky jsou propojeny pomocí směšovacího zařízení a nosič i s buňkami je nastříkán na Petriho misku (nebo na ránu připravenou k přijetí štěpu), buňky tak zůstávají rozptýleny ve filmu během jeho koagulace. Pro potřeby nastříkání je použit nosný plyn (dusík pod tlakem 2 až 2,5 baru).The two syringes are interconnected by means of a mixing device and the carrier and the cells are sprayed onto a petri dish (or wound ready to receive the graft), leaving the cells dispersed throughout the film during its coagulation. A carrier gas (nitrogen at a pressure of 2 to 2.5 bar) is used for spraying.
Při nastřikování nedochází k denaturaci buněk, in vitro je poté možno pozorovat, jak se v kultuře znovu utváří buněčná vrstva. Lze tedy očekávat, že se buňky budou normálně, nebo prakticky normálně množit i tehdy, bude-li směs ve velmi tenké vrstvě nastříkána přímo na ránu.The cells are not denatured during the injection, and in vitro, the cell layer is re-formed in the culture. Thus, it can be expected that the cells will normally or practically normally multiply even if the mixture is sprayed directly onto the wound in a very thin layer.
Claims (14)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS902858A CS277106B6 (en) | 1990-06-08 | 1990-06-08 | Biological carrier of cellular cultures, its application for the preparation of human keratocytes and process for preparing said human keratocytes on said carrier |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS902858A CS277106B6 (en) | 1990-06-08 | 1990-06-08 | Biological carrier of cellular cultures, its application for the preparation of human keratocytes and process for preparing said human keratocytes on said carrier |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS285890A3 CS285890A3 (en) | 1992-01-15 |
| CS277106B6 true CS277106B6 (en) | 1992-11-18 |
Family
ID=5366912
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS902858A CS277106B6 (en) | 1990-06-08 | 1990-06-08 | Biological carrier of cellular cultures, its application for the preparation of human keratocytes and process for preparing said human keratocytes on said carrier |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS277106B6 (en) |
-
1990
- 1990-06-08 CS CS902858A patent/CS277106B6/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS285890A3 (en) | 1992-01-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5474770A (en) | Biological support for cell cultures constituted by plasma proteins coagulated by thrombin, its use in the preparation of keratocyte cultures, their recovery and their transport for therapeutic purposes | |
| AU732726B2 (en) | Biomaterial derived from vertebrate liver tissue | |
| RU2104039C1 (en) | Live skin substituent, method of its preparing and method of live skin lesion treatment | |
| CA2483913C (en) | Vascularization enhanced graft constructs comprising basement membrane | |
| US20060240555A1 (en) | Fibrin cell supports and method of use thereof | |
| CN102086451B (en) | Method for amplifying seed cells of skin tissue engineering | |
| JPH0223191B2 (en) | ||
| JPH0747043B2 (en) | Synthetic living skin equivalent | |
| JPH11503946A (en) | Artificial skin containing a biocompatible substance based on a hyaluronic acid derivative as a support | |
| KR100298846B1 (en) | Artificial skin using neutralized chitosan sponge or mixed chitosan / collagen mixed sponge | |
| JPH09511673A (en) | Biological material containing epithelial cells and its use as a graft | |
| CN102172337B (en) | Tissue engineering skin with sebaceous gland-like structure and preparation method thereof | |
| DE4438015A1 (en) | Bio-materials for treating skin wounds, e.g. burns, senile ulcers and diabetic wounds | |
| CN109568653A (en) | The surface of a wound recombinant human collagen protein gel dressing and preparation method thereof, application method | |
| NZ202259A (en) | Wound healing composition,preparation and uses | |
| CS277106B6 (en) | Biological carrier of cellular cultures, its application for the preparation of human keratocytes and process for preparing said human keratocytes on said carrier | |
| JP3134079B2 (en) | Biological support for keratinocyte cultures constituted by thrombin-coagulated plasma proteins, as well as preparing said keratinocyte cultures, collecting and transferring said supports in transporting for therapeutic purposes Method used | |
| PL167635B1 (en) | Method of establishing a culture of human creatocytes | |
| CA2608712A1 (en) | Endothelized artificial matrix comprising a fibrin gel, which is a superproducer of proangiogenic factors | |
| PL167291B1 (en) | Biological culture medium for cell cultures and method of culturing human keratocytes as well as proteinous concentrate | |
| RU2010028C1 (en) | Method of skin integument regeneration in critically burnt patients | |
| DD297978A5 (en) | BIOLOGICAL SUPPORTER FOR CELL CULTURES CONSISTING OF THROMBIN-CAGAGED PLASMA PROTEINS, USE IN THE PRODUCTION OF KERATOGYTH CULTURES, THEIR RECOVERY AND TRANSPORT FOR THERAPEUTIC PURPOSES |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20100608 |