CS277106B6 - Biological carrier of cellular cultures, its application for the preparation of human keratocytes and process for preparing said human keratocytes on said carrier - Google Patents

Description

Vynález se týká biologického nosiče buněčných kultur, který je tvořen koagulovanou směsí koncentrátu plasmatických bílkovin a trombinu, jeho použití při přípravě kultur keratocytů, při jejich přenosu v podobě rekonstituované epidermis a při jejich léčebném uplatnění.

V současnosti jsou široce zkoumány možnosti, jak v laboratorních podmínkách rekonstituovat z několika buněk získaných při biopsii žijící, třeba zjednodušenou, kůži, která by dokázala vykonávat fysiologické funkce normální kůže a mohla tak nahradit kůži postiženou závažným onemocněním (např. genetickým) nebo zničenou rozsáhlými popáleninami.

Kůže je komplexní orgán, který sestává za tří na sebe nesedajících tkání: z pokožky neboli epidermis, přitom 85% epidermis tvoří keratocyty představující nepropustnou rohovou vrstvu isolují tělo od okolního prostředí; ze škáry neboli dermis, která obsahuje buňky, m.j. fibrocyty, uložené v pojivové tkáni sestávající především z kolagenu; dermis pak leží na podkožní tkáni obsahující především tukové buňky. Umělá rekonstituce takto komplexního orgánu proto předpokládá vyřešení četných problémů.

První tkání, kterou se podařilo in vitro úspěšně částečně rekonstituovat, byla dermis, dosáhl toho Bellův tým (Bell et al., Proč. Nati. Acad. Sci, 76-1979-1274).

Nejprve se zdařilo kultivovat fibroblasty z kožní biopsie, zpočátku v jedné vrstvě - jako monolayer, později, po určitém pasážování, mohly být tyto buňky rozptýleny v kultivačním médiu obsahujícím kolagen (extrahovaný ze šlach krysích ocásků). Kolagen přispěl k formování kultivačního média v podobě gelu, což umožnilo trojrozměrný růst buněk. Bylo pozorováno, že fibroblasty v těchto kulturách interagují s kolagenní matrix, organisují ji a kontrahují podobně jako v normální dermis. Tato tkáň, rekonstituovaná in vitro, je známa jako ekvivalent dermis. Po několika týdnech růstu dovolují mechanické vlastnosti ekvivalentu dermis jeho přenos na pacienta nebo raněného, přitom nejsou pozorovány známky rejekce transplantátu hostitelem. Tento evivalent dermis však může sloužit pouze jako dočasné krytí, neboť nedokáže nahradit funkci kůže jako bariéry proti zevnímu prostředí.

Později vyvinul Greenův tým (H. Green et al., Proč. Nati. Acad. Sci., 76-1979-5665) metodu a kultivační médium umožňující dlouhodobý růst keratocytů. Při této metodě jsou keratocyty nejprve dispergovány pomocí trypsinu a poté inokulovány na předem připravený monolayer fibroblastů, konkrétně 3T3 buněk, letálně ozářený a složitý jako podložní a výživná vrstva. Epidermální vrstva se rychle vyvine ve tkáň o tloušťce 3 až 5 buněk, která může být transplantována pacientovi a pokračuje v diferenciaci in sítu. Bylo již prokázáno, že lze pomocí této metody zachránit těžce popálené (G. Gallico et al., New England J. Med., 311-1984-448).

Greenovou technikou lze získat z biopsie o ploše dvou čtverečních centimetrů během tří týdnů epidermis rozsahu jednoho čtverečního metru.

Velkým problémem je stále isolace rekonstituované tkáně tak, aby vytvářela vhodný štěp schopný transplantace. Nejprve je třeba enzymaticky oddělit buňky od kultivační misky, aniž by však došlo k porušení celistvosti tkáně, při této operaci byla vždy pozorována určitá retrakce buněčné vrstvy a tedy ztráta j isté části povrchu transplantátu. Po oddělení rekonstituované tkáně je třeba připevnit ji k nosiči, který umožňuje její přenášení a transplantaci pacientovi, jako nosič je obvykle užívána obvazová gáza napuštěná vazelínou. Všechny uvedené postupy jsou jemné a náročné na čas.

Významným přínosem by mohl být proto nový, biologický nosič, který by byl resorbovatelný v organismu pacienta, jemuž byl štěp transplantován, a který by zároveň zjednodušil zacházení s pěstovanými buňkami. Navíc by bylo v zájmu dobré dostupnosti vhodné, kdyby tento nosič nebo jeho součásti mohly být připravovány a baleny v průmyslovém procesu.

Podařilo se vyvinout biologický nosič buněčných kultur, který je tvořen směsí koncentrátu plasmatických bílkovin, jež mohou být koagulovány trombinem, a určitého množství trombinu s přidáním vápníku, trombin je zde nezbytný jako aktivátor koagulace.

Předmětem vynálezu je biologický nosič buněčných kultur charakterisovaný tím, že je tvořen směsí koncentrátu bílkovin koagulovatelných trombinem, získaných po zpracování krevní plasmy etanolem a obsahujících vyvážená množství funkčního fibrinogenu, Faktoru XIII a plasmatického fibronektinu, a určitého množství trombinu obohaceného kalciem, nezbytného jako aktivátoru koagulace.

Biologický nosič podle vynálezu je výhodně charakterisován tím, že koncentrát koagulovatelných plasmatických bílkovin obsahuje přes 90 % fibrinogenu a že v 1 gramu bílkovin obsahuje nejméně 0,1 IU Faktoru XIII a 0,03 až 0,1 gram fibronektinu.

Biologický nosič podle vynálezu je dále výhodně charakterisován tím, že bílkovinný koncentrát je získán precipitací čerstvé plasmy dvěma po sobě následujícími zpracováními v 10% roztoku etanolu při teplotě 4 °C.

Biologický nosič podle vynálezu je dále výhodně charakterisován lyofilisací bílkovinného koncentrátu.

Biologický nosič podle vynálezu je také výhodně charakterisován tím, že bílkovinný koncentrát je v suspensi s roztokem aprotininu.

Biologický nosič podle vynálezu je dále výhodně charakterisován tím, že trombin obohacený kalciem je smíšen s bílkovinným koncentrátem v poměru přibližně 10 IU/ml.

Biologický nosič podle vynálezu je dále výhodně charakterisován tím, že obsahuje jako přísadu látku stimulující množení buněk.

Biologický nosič podle vynálezu je dále výhodně charakteriCS 277106 B6 sován tím, že jako přísadu obsahuje antibiotikum.

Biologický nosič podle vynálezu je také výhodně charakterisován tím, že obsahuje jako přísadu látku urychlující hojení ran.

Předmětem vynálezu je rovněž využití biologického nosiče podle vynálezu k přípravě kultury lidských keratocytů, fetálních nebo dospělých, aby byla utvořena náhradní tkáň, kterou lze přímo isolovat, přenášet á používat jako štěp.

Využití biologického nosiče podle vynálezu je výhodně charakterisováno tím, že uvedené dvě složky biologického nosiče jsou smíšeny tak, aby v kultivační misce utvořily uniformní film, a suspense keratocytů v kultivačním médiu je pak přenesena na uvedený film.

Využití biologického nosiče podle vynálezu je dále výhodně charakterisováno tím, že obě složky biologického nosiče jsou smíšeny se suspensi keratocytů tak, aby tyto buňky byly zabudovány do filmu, který bude následně utvořen.

Využití biologického nosiče podle vynálezu je dále výhodně charakterisováno tím, že suspense keratocytů je získána dispergováním čerstvé, předem utvořené vrstvy buněk.

Využití biologického nosiče podle vynálezu je dále výhodně charakterisováno tím, že suspense keratocytů je získána z buněčné banky uchovávané v tekutém dusíku.

Předmětem vynálezu je rovněž využití biologického nosiče podle vynálezu pro isolaci a přenos předem připravené kultury lidských keratocytů, fetálních nebo dospělých.

Využití biologického nosiče podle vynálezu je v tomto případě výhodně charakterisováno tím, že obě složky biologického nosiče jsou smíšeny přímo na předem připravené vrstvě buněk v kultivační misce.

Předmětem vynálezu je rovněž koncentrát bílkovin koagulovatelných trombinem charakterisovaný tím, že je balen pro přípravu biologického nosiče podle vynálezu.

V následující části popisu bude vynález detailněji vysvětlen:

Ke koagulaci plasmatických bílkovin v přítomnosti fibrinu dochází především díky vytvoření polymerisované fibrinové sítě, tento proces je analogií krevního srážení. Aby mohl vzniknout nosič vhodný pro přípravu buněčných kultur, probíhá koagulace v podmínkách vedouc'h ke tvorbě filmu, konkrétně v Petriho buňkách nebo v jiných buňkách vhodných pro pěstování buněčných kultur.

Koncentrát plasmatických bílkovin již byl popsán v Evropské patentové přihlášce 88 401 961 3: získává se precipitací čerstvé plasmy ve dvou po sobě následujících zpracováních s užitím 10% roztoku etanolu při teplotě 4 °C. Koncentrát obsahuje přes 90 % fibrinogenu a v 1 gramu bílkoviny nejméně 0,1 IU Faktoru XIII a 0,03 až 0,1 gramu fibronektinu. Koncentrát je balen a lyofilisován a takto je přechováván do doby použití.

Před použitím je koncentrát rozpuštěn ve vodném roztoku solí nebo v roztoku obsahujícím polyvalentní inhibitor proteáz, nejlépe aprotinin, v koncentraci 3 000 KlU/ml (kallikrein inhibičních jednotek/ml).

Aby byl aktivován proces koagulace, a tím tvorba filmu sloužícího jako nosič pro buňky, je ke koncentrátu přidán trombin, který může být obohacen kalcinem. Proces koagulace zahrnuje transformaci fibrinogenu na fibrin zprostředkovanou trombinem a polymerisaci fibrin monomeru s fibrinektinem, která je zprostředkována Faktorem XIII aktivovaným Ca⁺⁺ ionty.

Pro vytvoření nosiče podle vynálezu, který by byl zvlášť vhodný pro buněčné kultury, byla zvolena koncentrace trombinu přibližně 10 IU/ml (podstatně nižší koncentrace než jaká se užívá, požadujeme-li jinou konsistenci, např. při přípravě biologických lepidel - viz výše uvedený patent č. 88 401 961 3).

S ohledem na různé možnosti provedení vynálezu je možné začlenit do nosiče různé přísady, zvláště ty, které podporují buněčné dělení a které tak usnadňují hojení rány po transpantaci.

Nosič tak může obsahovat přísadu stimulující dělení buněk jako například růstový faktor, nebo lépe epidermální růstový faktor (EGF, epidermal growth factor).

Do nosiče může být takto začleněna látka podporující hojení nebo antibiotikum.

Nosič podle vynálezu je zvláště vhodný pro přípravu kultur lidských keratocytů. Přitom lze využít bud buňky z primárních kultur získaných z kožních biopsií pacienta, které prodělaly 1 až 4 pasáže v ředění 1/15 až 1/20, nebo buňky uchovávané v buněčných bankách v tekutém dusíku.

Tyto keratocyty, pěstované v jedné splývající vrstvě, jsou před naočkováním na nosič podle vynálezu zpracovány trypsinem a suspendovány ve vhodném kultivačním médiu.

Biologický nosič podle vynálezu může být použit třemi různými způsoby:

Při prvním způsobu použití je biologický nosič připraven ve formě filmu smíšením jeho dvou složek v kultivační misce, na tento film je pak naočkována suspense keratocytů ve vhodném kultivačním médiu. Jakmile se keratocytová kultura stane částečně nebo plně splývající, je vytvořena náhradní tkáň, která může být přímo isolována a oddělena pinsetou a ihned z misky přenesena na pacienta, není tedy třeba žádného dočasného nosiče jako např. gázy. To vede k významné úspoře pracovního času a ke 100% uchování vypěstované tkáně.

Při druhém způsobu užití nosiče podle vynálezu jsou jeho dvě složky smíšeny se suspensí keratocytů takovým způsobem, aby byly tyto buňky zabudovány do filmu, který bude následně utvořen. Stejně jako v prvním způsobu mohou být obě složky nosiče smíšeny s buněčnou suspensí v kultivační misce a poté použity jako štěp, rovněž je ovšem možné provést toto přímo na poraněném místě připraveném pro přijetí štěpu, konkrétně nastříkat biologický nosič i buňky na ránu s užitím nosného plynu (dusíku) pod tlakem 2 až 2,5 baru.

Podle třetího způsobu užití nosiče podle vynálezu jsou jeho dvě složky smíšeny na vrstvě keratocytů předem připravené v kultivační misce, buňky jsou tak pokryty utvořeným filmem a opět mohou být odděleny, přeneseny a použity jako štěp.

Následující příklady mají ilustrovat vynález aniž by jakkoliv omezily celkový rozsah jeho použití:

Příklad 1: Příprava biologického nosiče buněčných kultur.

Biologický nosič buněčných kultur je připraven smíšením koncentrátu koagulovatelných plasmatických bílkovin a určitého množství trombinu obohaceného kalciem nutného k aktivování koagulace.

A. Příprava koncentrátu plasmatických bílkovin.

Příprava bílkovinného koncentrátu již byla popsána v Evropské patentové přihlášce č. 88 401 961 3. Krátce shrnuto, při přípravě je použita čerstvá (nikoliv kryoprecipitovaná) lidská plasma, tato je dvakrát po sobě precipitována 10% roztokem etanolu s pH 7,2 při teplotě 4 °C. Mezi oběma precipitacemi je zařazena procedura inaktivující viry. Precipitát je centrifugací oddělen od supernatantu, promyt v etanolu při teplotě 4 °C a opět centrifugován. Pak je precipitát suspendován v Tris/citrátovém pufru, upraven tak, aby konečná koncentrace bílkovin byla přibližně 35 g/1 a obohacen o lysin v konečné koncentraci 0,1 až 0,2 gramu na 1 gram bílkovin. Diafiltrací je pak odstraněn etanol a citrát, současně je upravena iontová síla a koncentrát je balen do baněk a lyofilisován.

Takto připravený bílkovinný koncentrát obsahuje v 1 gramu bílkovin nejméně 0,9 gramu fibrinogenu, 0,03 až 0,06 g fibronektinu a 0,15 až 0,3 IU Faktoru XIII.

B. Příprava nosiče buněčných kultur.

Výše popsaný bílkovinný koncentrát je znovu uveden do suspense ve vodném roztoku, který může obsahovat aprotinin v koncentraci 3 000 KIU/ml (kalikrein inhibičních jednotek/ml).

Tento roztok je smíšen se stejným objemem trombinu v koncentraci 10 IU/ml obohaceného kalciem.

Do Petriho misky o průměru 10 cm je simultánně ze dvou stříkaček propojených směšovacím zařízením injikováno 2 ml bílkovinné suspense a 2 ml trombinu. Mícháním je směs rovnoměrně distribuována a poté se během 15 až 20 minut klidu vytvoří film pokrývající dno misky.

Použité kultivační misky jsou typu neupravené pro buněčné kultury (non treated for cell cultures), které zajistí, že nosič nebude ke dnu trvale adherovat, tím se usnadní jeho následná isolace.

Film je posléze pokryt buněčným kultivačním médiem. Toto médium je několikrát obnoveno dokud není osmotický tlak filmu stabilisován v rozmezí slučitelném s fysiologií buněk, tj. mezi 260 a 340 miliosmoly.

Rekonstituovaný bílkovinný koncentrát může být rovněž dialysován dříve než je smíšen s trombinem.

Příklad 2: Příprava kultury keratocytů na biologickém nosiči.

Zde se využívá primárních kultur keratocytů připravených s použitím Greenovy klasické techniky z kožních biopsií z pacientovy kůže (nebo z embryonální kůže po vytvoření banky fetálních buněk). Tyto primární kultury mohou projít 4 až 5 pasážemi v ředění 1/10·

Vrstva splývajících keratocytů je zpracována trypsinem, přenesena do kultivačního média a naočkována v ředění 1/10 na Petriho misku krytou filmem s biologickým nosičem popsaným v příkladu 1.

Po několikai hodinách buňky přilnou k nosiči a mohou se normálně dělit až se vytvoří fragment souvislé epidermis o tlouštce až 4 buněčných vrstev.

Tento fragment rekonstituované epidermis adherující k nosiči může být pak oddělen pomocí pinsety od kultivační misky a bez dalších změn přenesen na rámu připravenou k přijetí štěpu.

Jelikož buňky již adherují k biologickému nosiči, není třeba fixovat je k jinému nosiči, např. gáze napuštěné vaselinou, jak tomu je v jiných typech kultur. Tak je dosaženo významné úspory pracovního času, je možné během hodiny zpracovat 40 boxů oproti boxům při zachování konvenčního postupu.

Biologický nosič navíc dobře snáší manipulaci a neretrahuje se při oddělování od kultivační misky, což umožňuje využít 100 % povrchu buněčné vrstvy kultury.

Příklad 3: Isolace předem připravené buněčné vrstvy s užitím bilogického nosiče.

Keratocyty jsou podle Greenovy konvenční metody naočkovány na Petriho misku pokrytou vrstvou letálně ozářených fibroblastů.

Jakmile keratocyty vytvoří souvislý povlak z několika vrstev buněk, kultivační médium je odstraněno a do misky je na dobu 90 min. přidán roztok EDTA, poté následuje dvojí promytí pomocí PBS. Biologický nosič je pak nanesen přímo na vrstvu buněk metodou popsanou v příkladu 2.

Film, který se nad vrstvou buněk utvoří, může být opět pinsetou oddělen a použit jako štěp podobně jako v přecházejícím příkladu.

Příklad 4: Zabudování buněk do biologického nosiče.

Nejprve je třeba připravit dvě stříkačky, jednu s roztokem bílkovin, druhou obsahující trombin a suspensi keratocytů. Keratocyty mohou pocházet z čerstvé kultury po zpracování trypsinem nebo z buněčné banky přechovávané v tekutém dusíku.

Uvedené dvě stříkačky jsou propojeny pomocí směšovacího zařízení a nosič i s buňkami je nastříkán na Petriho misku (nebo na ránu připravenou k přijetí štěpu), buňky tak zůstávají rozptýleny ve filmu během jeho koagulace. Pro potřeby nastříkání je použit nosný plyn (dusík pod tlakem 2 až 2,5 baru).

Při nastřikování nedochází k denaturaci buněk, in vitro je poté možno pozorovat, jak se v kultuře znovu utváří buněčná vrstva. Lze tedy očekávat, že se buňky budou normálně, nebo prakticky normálně množit i tehdy, bude-li směs ve velmi tenké vrstvě nastříkána přímo na ránu.

Claims (14)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Biologický nosič buněčných kultur, vyznačených tím, že je tvořen směsí koncentrátu bílkovin koagulovaných trombinem, získaného po zpracování krevní plasmy ethanolem a obsahujícího více než 90 % sráženíschopného fibrinogenu a 0,03 až 0,1 gramu bílkovin, a vápenatého trombinu, který je obsažen v množství nezbytném pro aktivaci koagulace bílkovin.
2. 2. Biologický nosič podle nároku 1, vyznačený tím, že bílkovinný koncentrát je získán precipitací čerstvé plasmy dvěma po sobě následujícími zpracováními v 10% roztoku ethanolu při teplotě 4 °C.
3. 3. Biologický nosič podle nároků 1 a 2, vyznačený tím, že bílkovinný koncentrát je lyofilizován.
4. 4. Biologický nosič je podle nároků 1 až 3, vyznačený tím, že bílkovinný koncentrát je v suspensi, ve které je nosnou fází roztok aprotininu.
5. 5. Biologický nosič podle nároků 1 až 4, vyznačený tím, že obsahuje vápenatý trombin v množství 10 lU/ml.
6. 6. Biologický nosič podle nároků 1 až 5, vyznačený tím, že obsahuje látku stimulující množení buněk.
7. 7. Biologický nosič podle nároků 1 až 6, vyznačený tím, že obsahuje antibiotikum.
8. 8. Biologický nosič podle nároků 1 až 7, vyznačený tím, že obsahuje látku urychlující hojení ran.
9. 9. Použití biologického nosiče podle nároků 1 až 8, pro přípravu kultury fetálních nebo dospělých lidských keratocytů za účelem vytvoření náhradní tkáně, kterou lze přímo izolovat, přenášet a používat jako štěp.
10. 10. Způsob přípravy kultury lidských keratocytů na biologickém nosiči podle nároků 1 až 8, vyznačený tím, že obě složky biologického nosiče se smísí tak, že v kultivační misce vytvoří uniformní film, načež se na tento film přenese suspense keratocytů v kultivačním médiu.
11. 11.Způsob podle nároku 10, vyznačený tím, že obě složky biologického nosiče se smísí se suspensi keratocytů tak, že tyto keratocyty budou zabudovány do filmu, který bude následně vytvořen.
12. 12. Způsob podle nároků 10 nebo 11, vyznačený tím, že suspense keratocytů se získá dispergováním čerstvé, předem utvořené vrstvy buněk.
13. 13. Způsob podle nároku 10 nebo 11, vyznačený tím, že suspense keratocytů se získá z buněčné banky uchovávané v tekutém dusíku.
14. 14. Způsob podle nároku 10, vyznačený tím, že obě složky biologického nosiče se smísí přímo na předem připravené vrstvě keratocytů v kultivační misce.

    Konec dokumentu