PL167291B1 - Nowe podłoże biologiczne dla hodowli komórkowych, zwłaszcza ludzkich keratocytów - Google Patents

Abstract

1 Nowe podłoże biologiczne dla hodowli komórkowych, zwłaszcza ludzkich keratocytów, znamienne tym, że zawiera mieszaninę koncentratu białek osocza, które mogą być wykrzepione przez trombinę, otrzymanych w znany sposób przez kolejne dwukrotne strącanie świeżego osocza 10% roztworem etanolu w temperaturze 4°C i zawierających co najmniej 90% fibrynogenu, co najmniej 0,1 IU czynnika krzepnięcia XIII na 1 g białka oraz 0,03-01,1 g fibrynoektyny, przy czym koncentrat białek osocza jest liofilizowany i zawieszony w wodnym roztworze ewentualnie zawierającym aprotyninę w stężeniu 3000 KIU/ml oraz równą objętość wzbogaconej jonami wapnia trombiny w stężeniu 10 IU/ml.

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowe podłoże biologiczne dla hodowli komórkowych, zwłaszcza ludzkich keratocytów. Podłoże to jest użyteczne do celów terapeutycznych.

Laboratoryjne odtworzenie żywej skóry podobnej do skóry ludzkiej z kilku komórek uzyskanych przez biopsję lub uproszczonej skóry zachowującej fizjologiczne funkcje normalnej skóry, bada się intensywnie w celu zastąpienia ludzkiej skóry uszkodzonej przez choroby (na przykład genetyczne) lub zniszczonej w wyniku ciężkich poparzeń.

Skóra jest organem złożonym z trzech leżących na sobie tkanek: naskórka, którego 85% jest złożone z keratocytów, które tworzą nieprzepuszczalną, rogowatą warstwę izolującą ciało od środowiska zewnętrznego, skóry właściwej z żywych komórek, w tym fibrocytów. Obie warstwy są rozdzielone tkanką łączną, złożoną głównie z kolagenu. Skóra właściwa leży na tkance podskórnej, która zawiera komórki tłuszczowe. Dokładne odtworzenie tak złożonego organu natrafia na pewne trudności.

Pierwszą tkanką, która była częściowo odtworzona in vitro, była skóra właściwa (Bell et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 76 Λ 919/, 1274).

Otrzymane w wyniku biopsji skóry fibroblasty namnażano w hodowli, początkowo w monowarstwie, następnie po kilkakrotnym pasażowaniu w zawiesinie komórek w płynnym podłożu zawierającym kolagen (wyekstrahowany ze ścięgien ogona szczura) i tworzącym po pewnym czasie żel umożliwiający trójwymiarowy wzrost kolonii. W takich hodowlach fibroblasty oddziaływują ze zrembem kolagenowym, organizując go i obkurczając jak w normalnej skórze właściwej. Ta tkanka, odtworzona in vitro, znana jest jako skóra zastępcza. Po kilkutygodniowym wzroście skóra zastępcza jest wystarczająco wytrzymała, żeby ją użyć jako przeszczep dla pacjentów lub osób zranionych i nie zdarza się żeby była odrzucona przez żywiciela. Niestety, skóra zastępcza nie spełnia funkcji bariery oddzielającej od środowiska zewnętrznego.

Green i wsp. (Proc. Natl. Acad. Sci. 76 /1979/, 5665) opracowali podłoże i metodę pozwalającą na wzrost keratocydów przez długi okres czasu. Keratocydy trypsynizuje się i zawiesza w pożywce, a następnie przesiewa na wcześniej uzyskaną monowarstwę fibroblastów, linii 3T3, napromienionych letalną dawką promieniowania i służących jako warstwa odżywcza i podłoże. Warstwa naskórka rozwija się bardzo gwałtownie i tworzy tkankę o grubości 3-5 komórek, która może być przeszczepiona pacjentowi i kontynuuje różnicowanie in situ. Udało się już uratować tą techniką pacjentów silnie poparzonych (G. Gallico et al. New England J. Med. 311 /1984/, 448).

Używając techniki Greena można otrzymać z biopsji 2 cm² skór 1 m² naskórka w ciągu 3 tygodni.

167 291

Odzyskanie odtworzonej tkanki w celu dokonania przeszczepu nastręcza ciągle pewne trudności techniczne. Niezbędne jest oddzielenie komórek od dna szalki przy użyciu enzymów, bez rozpadu tkanki na pojedyncze komórki. Podczas tej operacji zawsze obserwuje się obkurczenie warstwy komórek, a więc i stratę znacznej części powierzchni przeszczepu. Gdy odtworzona tkanka jest oddzielona, trzeba ją osadzić na podłożu umożliwiającym transport i przeszczepienie pacjentowi. Jako podłoża przeważnie używa się wazelinowanej gazy. Wszystkie te czynności są delikatne i wymagają dużo czasu.

Byłoby bardzo korzystne uzyskanie nowego podłoża, które po pewnym czasie mogłoby być wchłonięte przez organizm pacjenta i które ułatwiłoby postępowanie z komórkami. W dodatku aby zapewnić jego dostępność, podłoże to lub jego składniki powinny być przygotowane i pakowane według wymogów technologicznych.

Podłoże biologiczne według wynalazku zawiera mieszaninę koncentratu białek osocza, które mogą być wykrzepione przez trombinę, otrzymanych w znany sposób przez kolejne dwukrotne strącanie świeżego osocza 10% roztworem etanolu w temperaturze 4°C i zawierających co najmniej 90% fibrynogenu, co najmniej 0,1 IU czynnika krzepnięcia XIII na 1 g białka oraz 0,03-01,1 g fibrynoektyny, przy czym koncentrat białek osocza jest liofilizowany i zawieszony w wodnym roztworze ewentualnie zawierającym aprotyninę w stężeniu 3000 KIU/ml oraz równą objętość wzbogaconej jonami wapnia trombiny w stężeniu 10 IU/ml.

Wykrzepianie białek osocza w obecności trombiny zachodzi głównie w wyniku tworzenia się siatki spolimeryzowanej fibryny, która imituje tworzenie się skrzepu krwi. W celu otrzymania podłoża odpowiedniego dla hodowli komórkowych, wykrzepienie prowadzi się w warunkach umożliwiających powstanie błony w butelkach Petriego lub innych butelkach odpowiednich do hodowli komórkowych.

Koncentrat białek osocza był wcześniej opisany w europejskim opisie patentowym 88 4 019 613. Koncentrat pakuje się i liofilizuje w celu zakonserwowania aż do ponownego użycia

Koncentrat białek, które mogą być wykrzepione przez trombinę i zapakowane specjalnie stosuje się do przygotowania podłoża biologicznego dla hodowli komórkowych. Przed użyciem koncentrat rozpuszcza się w wodnym roztworze soli lub roztworze zawierającym wielowartościowy inhibitor proteazy, korzystnie aprotyninę, w stężeniu 3000 KIU/ml

Dla zapoczątkowania procesu wykrzepienia, a więc i formowania się błony służącej na podłoże komórek, dodaje się trombinę z dodatkiem wapnia. W procesie tym zachodzi przemiana fibrynogenu w fibrynę w wyniku działania trombiny i polimeryzacja monomerycznej fibryny z fibronektyną w wyniku działania czynnika XIII zaktywowanego przez jony Ca⁺⁺.

Czynnik krzepnięcia XIII tak jak większość czynników koagulacyjnych krwi jest syntetyzowany w wątrobie i jest obecny w krążącej krwi. Jest enzymem zwanym transglutaminazą osoczową i wytwarza wiązanie kowalencyjne pomiędzy resztami lizylowymi i glutamylowymi monomerycznych włókien fibryny w obecności wapnia. Aktywność tego enzymu wyrażona jest w IU lub i.e., co oznacza międzynarodową jednostkę aktywności enzymu stosowaną do określania aktywności wszystkich czynników koagulacyjnych i oznacza, że w jednym mililitrze krwi znajduje się jedna jednostka aktywności.

Podłoże biologiczne według wynalazku może zawierać różne dodatki przewidziane do polepszenia wzrostu komórek in vitro lub in situ i polepszenia gojenia się ran po dokonaniu przeszczepu. Podłoże może zawierać dodatki polepszające namnażanie się komórek, takie jak czynniki wzrostowe, a szczególnie EGF (naskórkowy czynnik wzrostowy). Można również dodawać czynniki poprawiające gojenie lub antybiotyki.

Dla otrzymania podłoża według wynalazku, które jest szczególnie przydatne dla hodowli komórkowych, stężenie trombiny korzystnie doprowadza się do około 10 IU/ml (stężenie dużo mniejsze, niż używane gdy wymagana jest inna konsystencja podłoża, na przykład w przypadku klejów biologicznych - europejski opis patentowy nr 88 4 019 613).

Podłoże według wynalazku jest szczególnie przydatne do otrzymywania hodowli ludzkich keratocytów. Komórki te mogą pochodzić z pierwotnej hodowli otrzymanej przez biopsję

167 291 skóry pacjenta, hodowanej przez 1 do 4 pasaży w rozcieńczeniu 1/15 do 1/20 lub z banku komórek zamrożonych w ciekłym azocie. Przed wysianiem na podłoże wytworzone sposobem według wynalazku keratocyty, które były utrzymywane jako zlewająca się warstwa, trypsynizuje się i zawiesza w odpowiedniej pożywce.

Podłoże biologiczne według wynalazku może być stosowane na trzy różne sposoby.

Zgodnie z pierwszym sposobem podłoże przygotowuje się jako błonę przez wymieszanie jego dwóch składników w szalce Petriego, a zawiesinę keratocytów w odpowiedniej pożywce wysiewa się na powstałą błonę. Gdy keratocyty zleją się częściowo lub całkowicie tworzą tkankę zastępczą, która może być bezpośrednio użyta jako przeszczep. Można ją oderwać od podłoża pincetą i przenieść z szalki na pacjenta bez jakichkolwiek dodatkowych czynności, takich jak na przykład czasowe osadzenie na gazie. Daje to oszczędność czasu i pozwala na wykorzystanie 100% otrzymanej tkanki.

Według drugiego sposobu oba składniki podłoża miesza się wraz z zawiesiną keratocytów, w ten sposób umożliwia się keratocytom ścisłe związanie z powstającą błoną. Oba składniki miesza się z zawiesiną komórek w szalce hodowlanej i następnie używa się jako przeszczep, jak opisano powyżej. Można także rozpylić podłoże i komórki bezpośrednio na przygotowaną ranę, używając jako nośnika gazu (azot) pod ciśnieniem 2-2,5 · 10⁵Pa

Według jeszcze innego sposobu oba składniki miesza się nad wcześniej otrzymaną na szalce Petriego warstwą keratocytów. W ten sposób komórki są opłaszczane przez tworzącą się błonę i mogą być oderwane i przenoszone jako przeszczep.

Poniższe przykłady stanowią ilustrację omawianego wynalazku i nie mogą być uważane za jego ograniczenie.

Przykład. Wytwarzanie podłoża biologicznego dla hodowli komórkowych.

Podłoże otrzymuje się przez zmieszanie stężonych, zdolnych do wykrzepienia białek osocza, trombiny i wapnia, niezbędnych do zapoczątkowania wykrzepiania.

A. Wytwarzanie stężonych białek osocza.

Przygotowanie stężonych białek osocza zostało wcześniej opisane w europejskim opisie patentowym nr 884019613. Używa się ludzkiego osocza, które nie było strącane przez zamrażanie i dwukrotnie strąca się je 10% roztworem etanolu w temperaturze 4°C i pH 7,2. Pomiędzy strąceniami produkt poddaje się procesowi inaktywacji wirusów. Osad oddziela się przez wirowanie, przemywa etanolem w temperaturze 4°C i powtórnie wiruje. Osad następnie zawiesza się w buforze Tris cytrynian, doprowadza do stężenia białka około 35 g/dm³ i dodaje lizynę do stężenia końcowego od 0,1 do 0,2 g/g białka. Po diafiltracji w celu usunięcia alkoholu i cytrynianu oraz ustaleniu odpowiedniej siły jonowej, koncentrat pakuje się do butelek i liofilizuje.

Koncentrat zawiera przynajmniej 0,9 g fibrynogenu, 0,03 do 0,06 g fibronektyny i 0,15 do 0,30 IU czynnika XIII w przeliczeniu na 1 g białka.

B. Wytwarzanie podłoża dla hodowli komórkowych.

Koncentrat białkowy opisany powyżej rozpuszcza się w roztworze wodnym zawierającym lub nie aprotoninę w stężeniu 3000 KlU/ml (jednostek inhibitora kalikreiny/ml). Ten roztwór miesza się z równą objętością trombiny z dodatkiem wapnia. Stężenie trombiny wynosi 10 IU/ml

Na szalki Petriego o średnicy 10 cm używa się 2 ml roztworu białek i 2 ml trombiny. Oba roztwory wstrzykuje się równocześnie przy użyciu dwóch strzykawek połączonych ze sobą złączem mieszającym. Szalkę wytrząsa się do otrzymania jednorodnego rozkładu preparatów i pozostawia na 15 do 20 minut. Tworzy się błona pokrywająca szalkę.

Szalki hodowlane są typu nietraktowane do hodowli komórkowych, co powoduje, że powstające podłoże nie przylega na stałe i ułatwia jego późniejsze oderwanie.

Następnie na błonę wysiewa się komórki w pożywce hodowlanej. Pożywkę kilkakrotnie się wymienia, aż ciśnienie osmotyczne błony ustabilizuje się w zakresie odpowiednim dla fizjologicznych właściwości komórek, to jest pomiędzy 260 i 340 mosM (miliosmoli).

Rozpuszczony koncentrat białkowy można ewentualnie dializować przed zmieszaniem z trombiną.

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.

Cena 1,00 zł.

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Nowe podłoże biologiczne dla hodowli komórkowych, zwłaszcza ludzkich keratocytów, znamienne tym, że zawiera mieszaninę koncentratu białek osocza, które mogą być wykrzepione przez trombinę, otrzymanych w znany sposób przez kolejne dwukrotne strącanie świeżego osocza 10% roztworem etanolu w temperaturze 4°C i zawierających co najmniej 90% fibrynogenu, co najmniej 0,1 IU czynnika krzepnięcia XIII na 1 g białka oraz 0,03-01,1 g fibrynoektyny, przy czym koncentrat białek osocza jest liofilizowany i zawieszony w wodnym roztworze ewentualnie zawierającym aprotyninę w stężeniu 3000 KIU/ml oraz równą objętość wzbogaconej jonami wapnia trombiny w stężeniu 10 IU/ml.
2. 2. Podłoże według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera dodatkowo czynniki polepszające namnażanie się komórek.
3. 3. Podłoże według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera dodatkowo antybiotyk.
4. 4. Podłoże według zastrz. 1, znamienne tym, że zawiera dodatkowo czynnik przyspieszający gojenie się ran.

   * * *