PL167635B1 - Sposób wytwarzania hodowli ludzkich keratocytów - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania hodowli ludzkich keratocytów płodowych lub dorosłych albo tkanki zastępczej zdolnej do odtworzenia, przeniesienia i dającej się zastosować jako przeszczep, znamienny tym, że składniki podłoża biologicznego miesza się z wytworzeniem jednolitej błony na szalce hodowlanej i na błonę tę wysiewa się zawiesinę keratocytów w pożywce hodowlanej.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania hodowli ludzkich keratocytów płodowych lub dorosłych oraz tkanki zastępczej zdolnej do odtworzenia, przeniesienia i dającej się zastosować jako przeszczep.

Laboratoryjne odtworzenie żywej skóry podobnej do skóry ludzkiej z kilku komórek uzyskanych przez biopsję, lub uproszczonej skóry zachowującej fizjologiczne funkcje normalnej skóry, bada się intensywnie w celu zastąpienia ludzkiej skóry uszkodzonej przez choroby (na przykład genetyczne) lub zniszczonej w wyniku ciężkich poparzeń.

Skóra jest organem złożonym z trzech leżących na sobie tkanek: naskórka, którego 85% jest złożone z keratocytów, które tworzą nieprzepuszczalną, rogowatą warstwę izolującą ciało od środowiska zewnętrznego, skóry właściwej z żywych komórek, w tym fibrocytów. Obie warstwy są rozdzielone tkanką łączną, złożoną głównie z kolagenu. Skóra właściwa leży na tkance podskórnej, która zawiera komórki tłuszczowe. Dokładne odtworzenie tak złożonego organu natrafia na pewne trudności.

Pierwszą tkanką, która była częściowo odtworzona in vitro, była skóra właściwa (Bell et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 76 /1979/, 1274).

Otrzymane w wyniku biopsji skóry fibroblasty namnażano w hodowli, początkowo w monowarstwie, następnie po kilkakrotnym pasażowaniu w zawiesinie komórek w płynnym podłożu zawierającym kolagen (wyekstrahowany ze ścięgien ogona szczura) i tworzącym po pewnym czasie żel umożliwiający trójwymiarowy wzrost kolonii. W takich hodowlach fibroblasty oddziaływują ze zrembem kolagenowym, organizując go i obkurczając jak w normalnej skórze właściwej. Ta tkanka, odtworzona in vitro, znana jest jako skóra zastępcza. Po kilkutygodniowym wzroście skóra zastępcza jest wystarczająco wytrzymała, żeby ją użyć jako przeszczep dla pacjentów lub osób zranionych i nie zdarza się, żeby była odrzucona przez żywiciela. Niestety, skóra zastępcza nie spełnia funkcji bariery oddzielającej od środowiska zewnętrznego.

Green i wsp. (Proc.Natl.Acad.Sci. 76/1979/, 5665) opracowali podłoże i metodę pozwalającą na wzrost keratocytów przez długi okres czasu. Keratocyty trypsynizuje się i zawiesza w pożywce, a następnie przesiewa na wcześniej uzyskaną monowarstwę fibroblastów, linii 3T3, napromienionych letalną dawką promieniowania i służących jako warstwa odżywcza i podłoże. Warstwa naskórka rozwija się bardzo gwałtownie i tworzy tkankę o grubości 3-5 komórek, która może być przeszczepiona pacjentowi i kontynuuje różnicowanie in situ. Udało się już uratować tą techniką pacjentów silnie poparzonych (G.Gallico et al. New England J.Med. 311/1984/, 448).

Używając techniki Greena można otrzymać z biopsji 2 cm² skór 1 m² naskórka w ciągu 3 tygodni.

167 635

Odzyskanie odtworzonej tkanki w celu dokonania przeszczepu nastręcza ciągle pewne trudności techniczne. Niezbędne jest oddzielenie komórek od dna szalki przy użyciu enzymów, bez rozpadu tkanki na pojedyncze komórki. Podczas tej operacji zawsze obserwuje się obkurczenie warstwy komórek, a więc i stratę znacznej części powierzchni przeszczepu. Gdy odtworzona tkanka jest oddzielona, trzeba ją osadzić na podłożu umożliwiającym transport i przeszczepienie pacjentowi. Jako podłoża przeważnie używa się wazelinowanej gazy. Wszystkie te czynności są delikatne i wymagają dużo czasu.

Byłoby bardzo korzystnie uzyskać nowe podłoże, które po pewnym czasie mogłoby być wchłonięte przez organizm pacjenta i które ułatwiłoby postępowanie z komórkami. W dodatku aby zapewnić jego dostępność, podłoże to lub jego składniki powinny być przygotowane i pakowane według wymogów technologicznych.

Podłoże biologiczne uzyskuje się przez wykrzepienie mieszaniny stężonych białek osocza, które mogą być wykrzepiane przez trombinę, przy użyciu trombiny i jonów wapnia, które są niezbędne do rozpoczęcia wykrzepiania.

Wykrzepianie białek osocza w obecności trombiny zachodzi głównie w wyniku tworzenia się siatki spolimeryzowanej fibryny, która imituje tworzenie się skrzepu krwi. W celu otrzymania podłoża odpowiedniego dla hodowli komórkowych, wykrzepianie prowadzi się w warunkach umożliwiających powstanie błony w butelkach Petriego lub innych butelkach odpowiednich do hodowli komórkowych.

Koncentrat białek osocza był wcześniej opisany w europejskim opisie patentowym 88 401 961 3. Uzyskuje się go przez dwukrotną precypitację świeżego osocza, dodając 10% roztwór etanolu w temperaturze 4°C. Koncentrat zawiera ponad 90% fibrynogenu, przynajmniej 0,1 IU czynnika XIII i od 0,03 do 0,1g fibronektyny. Koncentrat pakuje się i liofilizuje w celu zakonserwowania aż do ponownego użycia.

Koncentrat białek, które mogą być wykrzepione przez trombinę i zapakowane specjalnie stosuje się do przygotowania podłoża biologicznego dla hodowli komórkowych. Przed użyciem koncentrat rozpuszcza się w wodnym roztworze soli lub roztworze zawierającym wielowartościowy inhibitor proteazy, korzystnie aprotoninę, w stężeniu 3000 KIU/ml.

Dla zapoczątkowania procesu wykrzepiania, a więc i formowania się błony służącej na podłoże komórek, dodaje się trombiny z dodatkiem lub bez wapnia. W procesie tym zachodzi przemiana fibrynogenu w fibrynę w wyniku działania trombiny i polimeryzacja monomerycznej fibryny z fibronektyną w wyniku działania czynnika XIII zaktywowanego przez jony Ca++.

Dla otrzymania podłoża według wynalazku, które jest szczególnie przydatne dla hodowli komórkowych, stężenie trombiny korzystnie doprowadza się do około 10 IU/ml (stężenie dużo mniejsze, niż używane gdy wymagana jest inna konsystencja podłoża, na przykład w przypadku klejów biologicznych - europejski opis patentowy nr 88 401 961 3).

Podłoże biologiczne może zawierać różne dodatki przewidziane do polepszenia wzrostu komórek in vitro lub in situ i polepszenia gojenia się ran po dokonaniu przeszczepu. Podłoże może zawierać dodatki polepszające namnażanie się komórek, takie jak czynniki wzrostowe, a szczególnie EGF (naskórkowy czynnik wzrostowy). Można również dodawać czynniki poprawiające gojenie lub antybiotyki.

Podłoże o wyżej opisanym składzie jest szczególnie przydatne do otrzymywania hodowli ludzkich keratocytów. Komórki te mogą pochodzić z pierwotnej hodowli otrzymanej przez biopsję skóry pacjenta, hodowanej przez 1 do 4 pasaży w rozcieńczeniu 1/15 do 1/20 lub z banku komórek zamrożonych w ciekłym azocie. Przed wysianiem na podłoże keratocyty, które były utrzymywane jako zlewająca się warstwa, trypsynizuje się i zawiesza w odpowiedniej pożywce.

Zgodnie z wynalazkiem sposób wytwarzania hodowli ludzkich keratocytów płodowych polega na tym, że podłoże przygotowuje się jako błonę przez wymieszanie jego dwóch składników w szalce Petriego, a zawiesinę keratocytów w odpowiedniej pożywce wysiewa się na powstałą błonę. Gdy kreatocyty zleją się częściowo lub całkowicie tworzą tkankę zastępczą, która może być bezpośrednio użyta jako przeszczep. Można ją oderwać od podłoża pincetą i przenieść z szalki na pacjenta bez jakichkolwiek dodatkowych czynności, takich jak na przykład czasowe osadzenie na gazie. Daje to oszczędność czasu i pozwala na wykorzystanie 100% otrzymanej tkanki.

167 635

Według wynalazku drugi sposób wytwarzania hodowli keratocytów polega na tym, że oba składniki podłoża miesza się wraz z zawiesiną keratocytów, w ten sposób umożliwia się keratocytom ścisłe związanie z powstającą błoną. Oba składniki miesza się z zawiesiną komórek w szalce hodowlanej i następnie używa jako przeszczep, jak opisano powyżej.

Według trzeciego sposobu według wynalazku oba składniki miesza się nad wcześniej otrzymaną na szalce Petriego warstwą keratocytów. W ten sposób komórki są opłaszczane przez tworzącą się błonę i mogą być oderwane i przenoszone jako przeszczep.

Poniższe przykłady stanowią ilustrację omawianego wynalazku i nie mogą być uważane za jego ograniczenia.

Przykład I. Wytwarzanie podłoża biologicznego dla hodowli komórkowych.

Podłoże otrzymuje się przez zmieszanie stężonych, zdolnych do wykrzepiania białek osocza, trombiny i wapnia, niezbędnych do zapoczątkowania wykrzepiania.

A. Wytwarzanie stężonych białek osocza.

Przygotowanie stężonych białek osocza zostało wcześniej opisane w europejskim opisie patentowym nr 88 401 961 3. Używa się ludzkiego osocza, które nie było strącane przez zamrażanie i dwukrotnie strąca się je 10% roztworem etanolu w temperaturze 4°C i pH 7,2. Pomiędzy strąceniami produkt poddaje się procesowi inaktywacji wirusów. Osad oddziela się przez wirowanie, przemywa etanolem w temperaturze 4°C i powtórnie wiruje. Osad następnie zawiesza się w buforze Tris cytrynian, doprowadza do stężenia białka około 35 g/dm³ i dodaje lizynę do stężenia końcowego od 0,1 do 0,2 g/g białka. Po diafiltracji w celu usunięcia alkoholu i cytrynianu oraz ustalenia odpowiedniej siły jonowej, koncentrat pakuje się do butelek i liofilizuje.

Koncentrat zawiera przynajmniej 0,9g fibrynogenu, 0,03 do 0,06g fibronektyny i 0,15 do 0,30 IU czynnika XIII w przeliczeniu na 1g białka.

B. Wytwarzanie podłoża dla hodowli komórkowych.

Koncentrat białkowy opisany powyżej rozpuszcza się w roztworze wodnym zawierającym lub nie aprotoninę w stężeniu 3000 KIU/ml (jednostek inhibitora kalikreiny/ml). Ten roztwór miesza się z równą objętością trombiny z dodatkiem wapnia. Stężenie trombiny wynosi 10 IU/ml.

Na szalki Petriego o średnicy 10 cm używa się 2 ml roztworu białek i 2 ml trombiny. Oba roztwory wstrzykuje się równocześnie przy użyciu dwóch strzykawek połączonych ze sobą złączem mieszającym. Szalkę wytrząsa się do otrzymania jednorodnego rozkładu preparatów i pozostawia na 15 do 20 minut. Tworzy się błona pokrywająca szalkę.

Szalki hodowlane są typu nietraktowane do hodowli komórkowych, co powoduje, że powstające podłoże nie przylega na stałe i ułatwia jego późniejsze oderwanie.

Następnie na błonę wysiewa się komórki w pożywce hodowlanej. Pożywkę kilkakrotnie się wymienia, aż ciśnienie osmotyczne błony ustabilizuje się w zakresie odpowiednim dla fizjologicznych właściwości komórek, to jest pomiędzy 260 i 340 mosM (miliosmoli).

Rozpuszczony koncentrat białkowy można ewentualnie dializować przed zmieszaniem z trombiną.

Przykład Π. Wytworzenie hodowli keratocytów na podłożu biologicznym.

Używa się pierwotnej hodowli keratocytów, przygotowanej według klasycznej metody Greena, przez biopsję skóry otrzymanej od pacjenta (lub skóry zarodkowej z banku tkanek zarodkowych). Te pierwotne hodowle pasażuje się 4 do 5 razy rozcieńczając 1/10.

Warstwę zlanych keratocytów trypsynizuje się, zawiesza w pożywce hodowlanej i wysiewa w rozcieńczeniu 1/10 na szalki Petriego pokryte błoną podłoża biologicznego opisanego w przykładzie I. Po kilku godzinach komórki przywierają do podłoża i dzielą się normalnie, aż utworzą fragment naskórka o grubości 3 lub 4 komórek.

Ten fragment odtworzonego naskórka przylegający do podłoża można oderwać od szalki hodowlanej przy użyciu pincety i bez dodatkowej obróbki stosować jako przeszczep. Gdy komórki przywrą do podłoża, nie ma potrzeby przytwierdzania odtworzonego naskórka do innego podłoża, takiego jak wazelinowana gaza, którajest używana w innych metodach hodowli. Daje to dużą oszczędność czasu i umożliwia przeniesienie 40 pudełek na godzinę w przeciwieństwie do 4 na godzinę przy użyciu metody tradycyjnej. Ponadto podłoże jest wygodne do

167 635 manipulacji i nie kurczy się w czasie odrywania, co pozwala wykorzystać 100% wyhodowanej tkanki.

Przykład III. Odtworzenie wcześniej wysianej warstwy komórek przy użyciu podłoża biologicznego.

Keratocyty wysiewa się według klasycznej metody Greena na szalkę Petriego pokrytą warstwą letalnie napromieniowanych fibroblastów. Kiedy keratocyty zleją się i utworzą kilka warstw komórek, usuwa się pożywkę hodowlaną i dodaje roztwór EDTA na 1,5 godziny, a następnie przemywa się dwa razy PBS. Podłoże biologiczne osadza się bezpośrednio na warstwie komórek, według sposobu opisanego w przykładzie 2.

Kiedy błona utworzy się na komórkach, można ją oderwać pincetą i użyć jako przeszczep, tak jak opisano w przykładzie II.

Przykład IV. Włączanie komórek do podłoża biologicznego.

Przygotowuje się strzykawkę z roztworem białek i strzykawkę zawierającą zawiesinę keratocytów z dodatkiem trombiny. Keratocyty pobiera się ze świeżej trypsynizowanej hodowli lub z banku komórek przechowywanych w ciekłym azocie. Obie strzykawki łączy się za pomocą złącza mieszającego i podłoże zawierające komórki rozpyla się na szalkę Petriego (lub ranę). Podczas wykrzepiania powstająca błona przytrzymuje komórki. Rozpylanie można wykonać za pomocą nośnika gazowego (azot pod ciśnieniem 2-2,5.10⁵ Pa).

Takie rozpylanie nie denaturuje komórek i obserwuje się odtworzenie warstwy keratocytów in vitro. Gdy mieszaninę rozpyli się bardzo cienką warstwą bezpośrednio na ranę komórki powinny namnażać się normalnie lub prawie normalnie.

167 635

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz Cena 150 zł

Claims (4)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania hodowli ludzkich keratocytów płodowych lub dorosłych albo tkanki zastępczej zdolnej do odtworzenia, przeniesienia i dającej się zastosować jako przeszczep, znamienny tym, że składniki podłoża biologicznego miesza się z wytworzeniem jednolitej błony na szalce hodowlanej i na błonę tę wysiewa się zawiesinę keratocytów w pożywce hodowlanej.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dwa składniki podłoża biologicznego miesza się z zawiesiną keratocytów z wytworzeniem błony zawierającej w sobie komórki.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się zawiesinę keratocytów otrzymaną przez rozproszenie świeżej, wcześniej założonej warstwy komórek.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się zawiesinę keratocytów otrzymaną z banku tkanek zamrożonych w ciekłym azocie.