DD297978A5

DD297978A5 - BIOLOGICAL SUPPORTER FOR CELL CULTURES CONSISTING OF THROMBIN-CAGAGED PLASMA PROTEINS, USE IN THE PRODUCTION OF KERATOGYTH CULTURES, THEIR RECOVERY AND TRANSPORT FOR THERAPEUTIC PURPOSES

Info

Publication number: DD297978A5
Application number: DD34141790A
Authority: DD
Inventors: Herve Broly; Vincent Ronfard
Original assignee: Centre Regional De Transfusion Sanguine De Lille,Fr
Priority date: 1990-06-07
Filing date: 1990-06-07
Publication date: 1992-01-30

Abstract

Biologisches Traegermaterial fuer Zellkulturen, gebildet aus einer geronnenen Mischung eines Konzentrats aus Plasmaproteinen und Thrombin. Das Proteinkonzentrat wird durch Ausfaellung frischen Plasmas mittels Ethanol gewonnen und enthaelt Fibrinogen, Faktor XIII und Fibronektin jeweils in einem bestimmten Verhaeltnis zueinander. Die Thrombinkonzentration wird entsprechend der gewuenschten Konsistenz des in Form eines Films geronnenen Traegermaterials eingestellt. Das biologische Traegermaterial wird vorzugsweise fuer die Herstellung einer Keratozytkultur, deren Rueckgewinnung in Form eines rekonstituierten Gewebes und den Transport desselben angewendet. Das rekonstituierte Gewebe ist daher besonders fuer die Anwendung als Transplantat geeignet.{biologisches Traegermaterial; Zellkulturen; Plasmaproteine; Thrombin; Fibrinogen; Faktor XIII; Fibronektin; Keratozytkultur; rekonstituiertes Gewebe; Transplantat}Biological carrier material for cell cultures, formed from a clotted mixture of a concentrate of plasma proteins and thrombin. The protein concentrate is obtained by precipitation of fresh plasma by means of ethanol and contains fibrinogen, factor XIII and fibronectin each in a certain ratio to one another. The thrombin concentration is adjusted according to the desired consistency of the curled in the form of a film carrier material. The biological carrier material is preferably used for the production of a keratocyte culture, its recovery in the form of a reconstituted tissue and the transport thereof. The reconstituted tissue is therefore particularly suitable for use as a transplant. {Biological carrier material; Cell cultures; Plasma proteins; thrombin; fibrinogen; Factor XIII; fibronectin; Keratozytkultur; reconstituted tissue; Graft}

Description

Die Erfindung betrifft ein biologisches Trägermaterial für Zellkulturen auf der Basis einer geronnenen Mischung eines Konzentrats aus Plasmaproteinen und Thrombin, seine Anwendung bei der Herstellung von Keratozytkulturen und deren Transport in Form von rekonstituierten Epidermen sowie deren Anwendung zu therapeutischen Zwecken. Die im Labor betriebene Rekonstitution lebender, der menschlichen Haut vergleichbarer Haut auf der Grundlage einiger, durch Biopsie gewonnener Zellen, oder vereinfachter Haut, welche die physiologischen Funktionen normaler Haut gewährleistet, ist Gegenstand umfangfreicher Studien, denen die Aufgabe zugrunde liegt, infolge einer schweren Krankheit (genetisch bedingt, etc.) geschädigte oder durch großflächige Verbrennungen zerstörte Haut zu ersetzen.The invention relates to a biological support material for cell cultures on the basis of a clotted mixture of a concentrate of plasma proteins and thrombin, its application in the production of keratocytic cultures and their transport in the form of reconstituted epiderms and their use for therapeutic purposes. The laboratory-based reconstitution of living skin comparable to human skin based on biopsy-derived cells or simplified skin, which ensures the physiological functions of normal skin, is the subject of extensive studies aimed at genetically conditioned, etc.) to replace damaged or damaged by extensive burns skin.

Die Haut ist ein komplexes Organ, welches aus drei übereinander lagernden Schichten gebildet wird: der Epidermis, die zu 85% aus Kera'ozyten besteht, welche die impermeable, den Körper gegenüber der äußeren Umwelt abschirmende Hornschicht bilden; der Lederhaut, die von durch hauptsächlich aus Kollagen bestehendem Bindegewebe getrennten Zellen, einschließlich Fibrozyton, gebildet wird; die Lederhaut befindet sich über der Unterhaut, zu der auch Fett speichernde Zellen gehören. Die künstliche Rekonstitution eines derart komplexen Organs ist daher sehr problematisch.The skin is a complex organ composed of three superimposed layers: the epidermis, which consists of 85% kerateocytes, which form the impermeable horny layer shielding the body from the external environment; the dermis formed by cells consisting mainly of collagenous connective tissue, including fibrocyton; the dermis is located above the subcutaneous tissue, which also includes fat-storing cells. The artificial reconstitution of such a complex organ is therefore very problematic.

Das erste, partiell in vitro rekonstituierte Gewebe war die Lederhaut, wobei dieses Ergebnis durch Bell und seine Mitarbeiter erzielt wurde (Bell et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 76-1979 -1274).The first tissue reconstituted partially in vitro was the dermis, and this result was achieved by Bell and coworkers (Bell et al., Proc Natl Acad., Pp. 76-1979-1274).

Durch Hautbiopsien gewonnene Fibroblasten wurden erfolgreich in Kulturen dargestellt, zuerst in monozellulären Schichten und nach einer Anzahl von Passagen durch Dispersion dieser Zellen in einem kollagenhaltigen (aus Rattenschwanzsehnen gewonnenes Kollagen) Kulturmedium, wobei das Kollagen ein Gel bildet und die Darstellung dreidimensionaler Kulturen erlaubt. In einer solchen Kultur trettn die Fibroblasten mit der KoI¹ igenmatrix in Wechselwirkung, steuern diese und lassen sie wie eine normale Lederhaut kontrahieren. Bei diesem in vitro rek nstituierten Gewebe handelt es sich um ein „Lederhautäquivalent". Nach einigen Wochen des Wachstums erlauben die mechanischen Eigenschaften des Lederhautäquivalents, dieses auf einen Patienten bzw. einen Verletzten zu transplantieren. Das Transplantat wird anscheinend nicht abgestoßen. Jedoch ist dieses Lederhautäquivalsnt nur ein zeitweiser Schutz, die Schutzfunktion der Haut kann es nicht wieder herstellen.Skin biopsy-derived fibroblasts have been successfully cultured, first in monocellular layers and after a number of passages by dispersing these cells in a collagen-containing (rat tail tendon-derived collagen) culture medium, the collagen forming a gel and allowing three-dimensional cultures to be displayed. In such a culture, the fibroblasts trettn with the koi ¹ igenmatrix interact to control these and let them contract like a normal dermis. After a few weeks of growth, the mechanical properties of the dermis equivalent make it possible to transplant it to a patient or an injured person.This graft does not appear to be rejected, however, this is a sclera only a temporary protection, the protective function of the skin can not restore it.

Des weiteron haben Green und seinu Mitarbeiter (H. Green et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 76,1979,5665) ein Verfahren sowie ein entsprechendes Kulturmedium entwickelt, welches die Zucht von Keratozvten über einen längeren Zeitraum ermöglicht. Bei diesem Verfahren erfolgt eine Überimpfung der in Trypsin dispergieren Keratozyten auf eine vorgezogene, hauptsächlich aus 3T3-Zelle.i gebildete monozelluläre Fibroblastschicht, die einer letalen Strahlendosis ausgesetzt wurde und als Nährschicht und Matrix dient. Die Epidirmisschicht entwickelt sich unter Bildung eines drei bis fünf Zellen dicken Gewebes sehr schnell; dieses Gewebe kann bei einem Patienteii transplantiert werden und differenziert sich in situ weiter. Patienten mit schweren Verbrennungen konnten mit diesem Verfahren bereits nachweislich gerettet werdon (G. Gallico et al., New England J. Med., 311,Furtheron, Green and his co-workers (H.Green et al., Proc Natl Acad., 76, 7979, 565) have developed a method and a corresponding culture medium which enables the breeding of keratocytes over an extended period of time. In this method, inoculation of the trypsin-dispersed keratocytes on a preferred, mainly from 3T3-Zelle.i formed monocellular fibroblast layer, which was exposed to a lethal radiation dose and serves as a nutrient layer and matrix. The epidermis layer develops very rapidly, forming a tissue three to five cells thick; this tissue can be transplanted into a patient's egg and further differentiates in situ. Patients with severe burns have already been demonstrated to be rescued by this method (G. Gallico et al., New England J. Med., 311, p.

Mit Greens Verfahren kann aus einer Biopsie von 2cm² innerhalb von d. ei Wochen ein Quadratmeter Epidermis gewonnen werden.With Greens procedure can from a biopsy of 2cm ² within d. a square epidermis can be obtained in weeks.

Die Rückgewinnung des rekonstituierten Gewebes für die Herstellung des Transp'antat«; ist noch mit einer Reihe technischer Probleme verbunden. Es ist hierbei erforderlich, die Zellen von der Kulturschale mittols einer Enzymbehandlung zu trennen, ohne ihre Verbindung untereinar.der zu zerstören; bei dieser Operation kann stets eine Schrumpfung der Zellschicht beobachtet werden, was zum Verlust eines gewissen Prozentsatzes an Transplantatoberfläche führt. Sobald das rekonstituierte Gewebe abgetrennt worden ist, muß dieses mit einem Trägermaterial verbunden werden, das den Transport des Gewebes und dessen Transplantation auf den Patienten erlaubt. Gewöhnlich wird hierzu mit Vaseline behandelter Verbandmull genutzt. Die hier beschriebenen Operationen erfordern große Präzision und sind sehr zeitaufwendig.The recovery of the reconstituted tissue for the production of transpantate "; is still associated with a number of technical problems. It is necessary in this case to separate the cells from the culture dish by means of an enzyme treatment, without destroying their connection with each other; In this operation, shrinkage of the cell layer can always be observed, resulting in the loss of a certain percentage of graft surface. Once the reconstituted tissue has been separated, it must be joined to a backing material that allows the tissue to be transported and transplanted to the patient. Normally, gauze-treated gauze is used for this purpose. The operations described here require great precision and are very time consuming.

Es wäre daher von großem Nutzen, stünden neuartige biologische Trägermaterialien zur Verfügung, die nach Verpflanzung des Transplantats vom Patienten schnell genug resorbiert werden können und die Handhabung der Zellen vereinfachen wurden.It would therefore be of great benefit to have novel biological support materials available which, after engraftment of the graft, could be resorbed by the patient fast enough and would facilitate the handling of the cells.

Außerdem müßten diese Trägermaterialien bzw. deren Bestandteile in ausreichendem Maße verfügbar sein, damit deren industriemäßige Herstellung und Verpackung gewährleistet ist.In addition, these support materials or their components would have to be sufficiently available so that their industriemäßige production and packaging is guaranteed.

Der Anmelder hat daher ein biologisches Trägermaterial für Zellkulturen auf der Basis einer Mischung, die aus einem Plasmaproteinkonzentrat, welches mit Thrombin zum Gerinnen gebracht werden kann, und aus der für die Auslösung dos Gerinnungsprozesses notwendigen Menge Calciumthrombin besteht, entwickelt.The Applicant has therefore developed a biological support for cell cultures based on a mixture consisting of a plasma protein concentrate which can be coagulated with thrombin and the amount of calcium thrombin necessary to induce the coagulation process.

Die Gerinnung von Plasmaproteinen in Anwesenheit von Thrombin ist hauptsächlich zurückzuführen auf die Bildung eines polymerisierten Fibrinnetzes, ähnlich wie bei der Bildung eines Blutgerinnsels. Zur Bildung eines Trägermaterials, welches sich für die Herstellung von Zellkulturen eignet, findet die Gerinnung unter Bedingungen, die zur Bildung eines Films führen, statt,The clotting of plasma proteins in the presence of thrombin is mainly due to the formation of a polymerized fibrin network, similar to the formation of a blood clot. In order to form a carrier material which is suitable for the production of cell cultures, the coagulation takes place under conditions which lead to the formation of a film,

d. h. in Petrischalen oder anderen, für Zellkulturen geeigneten Schalen.d. H. in Petri dishes or other dishes suitable for cell culture.

Das Plasmaproteinkonzentrat wurde vom Anmelder bereits in der Europäischen Patentanmeldung 884019613 beschrieben.The plasma protein concentrate has already been described by the Applicant in European Patent Application 884019613.

Dieses Konzentrat wird durch Ausfällung frischen Plasmas in zwei aufeinanderfolgenden Behandlungsschritten mittels einer zehnprozentigen Ethanollösung bei einer Temperatur von 4⁰C gewonnen. Das Konzentrat enthält über 90% Fibrinogen und pro Gramm Protein mindestens 0,1 IE Faktor XIII sowie 0,03 bis 0,1 Gramm Fibronektin. Das Konzentrat wird abgepackt und gefriergetrocknet, um es bis zu seinur Anwendung zu konservieren.This concentrate is obtained by precipitation of fresh plasma, in two successive treatment steps by means of a ten percent ethanol solution at a temperature of 4 ⁰ C. The concentrate contains over 90% fibrinogen and at least 0.1 IU Factor XIII per gram of protein and 0.03 to 0.1 grams of fibronectin. The concentrate is packaged and freeze-dried to preserve it until its application.

Die Erfindung betrifft also aucn das Proteinkonzentrat, welches mit Thrombin zum Gerinnen gebracht, speziell für die Herstellung des biologischen Trägermaterials für Zellkulturen abgepackt wird.The invention thus also relates to the protein concentrate which has been coagulated with thrombin, especially for the production of the biological carrier material for cell cultures.

Soll das Konzentrat zur Anwendung kommen, dann wird es in einer wäßrigen Kochsalzlösung oder in einer einen polyvalenten Proteasenhemmstoff enthaltenden Lösung, vorzugsweise Aprotinin, bei einer Konzentration von 3000 KIE/ml wiederaufgelöst.If the concentrate is to be used, it is redissolved in an aqueous saline solution or in a solution containing a polyvalent protease inhibitor, preferably aprotinin, at a concentration of 3000 KIU / ml.

Zur Auslösung des Gerinnungsprozesses, d.h. zur Bildung des als Trägermaterial für die Zellen fungierenden Films, wird Thrombin mit oder ohne Zusatz von Calcium zugefügt. Während des Gerinnungsprozesses wird Fibrinogen unter Einwirkung von Thrombin in Fibrin umgewandelt und erfolgt die Polymerisation von monomerischem Fibrin mit Fibronektin unter Einwirkung von durch Ca⁺⁺-Ionen aktiviertem Faktor XIII.In order to initiate the coagulation process, ie to form the film which acts as a carrier material for the cells, thrombin is added with or without the addition of calcium. During the coagulation process, fibrinogen is converted into fibrin under the action of thrombin, and the polymerization of monomeric fibrin with fibronectin is effected under the action of factor XIII activated by Ca ⁺⁺ ions.

Um entsprechend der Erfindung die Trägerschicht zu bilden, ist- insbesondere bei Zellkulturen - eine Thrombinkonzentration von vorzugsweise etwa 101 E/mI (eine weitaus geringere Konzentration als die zur Erzielung einer anderen Konsistenz, wie dies bei biologischen Leimen der FaI! ist - Patent Nr. 884019613, siehe oben - einzustellen.In order to form the carrier layer according to the invention, particularly in cell cultures, a thrombin concentration of preferably about 101 U / ml (a much lower concentration than that for achieving a different consistency, as is the case with biological glues of the prior art - patent no. 884019613, see above - to be set.

Entsprechend unterschiedlichen Varianten der Erfindung ist es möglich, dem Trägermaterial verschiedene speziell für die Förderung der Zellvermehrung in vitro oder in situ gestaltete und damit die Wundheilung nach erfolgter Transplantation fördernde Substar.zen zuzusetzen.According to different variants of the invention, it is possible to add to the support material various substrates which are specially designed to promote cell proliferation in vitro or in situ and thus promote wound healing after transplantation.

Das Trägermaterial kann somit ein die Zellvermehrung förderndes Additiv wie zum Beispiel einen Wachstumsfaktor, insbesondere EGF (epidermaler Wachstumsfaktor), enthalten.The carrier material may thus contain an additive which promotes cell proliferation, such as, for example, a growth factor, in particular EGF (epidermal growth factor).

Die Heilung fördernde oder antibiotLche Präparate können auch hinzugefügt werden.The healing or antibiotic preparations can also be added.

Das entsprechend der Erfindung hergestellte Trägermaterial ist besonders für die Herstellung von menschlichen Keratozytkulturen geeignet. Bei diesen Zellen kann es sich entweder um Primärkulturen, die aus von einem Patienten entnommenen Hautbiopsin, die ein bis vier Passagen in Verdünnung Vi5 bis Vao durchlaufen haben, gewonnen wurden, oder um in flüssigem Sticks'off konservierte Zellbanken handeln.The carrier material produced according to the invention is particularly suitable for the production of human keratocytic cultures. These cells may be either primary cultures obtained from skin biopsy taken from a patient having passed one to four passages in dilution of Vi5 to Vao, or cell banks preserved in liquid Sticks'off.

Diese in einsr konfluenten Schicht hergestellten Keratozyten werden erfindungsgemäß mit Trypsin behandelt und in einem geeigneten Kulturmedium zum Zeitpunkt der Impfung auf das Trägermaterial in Suspension substituiert.These keratocytes produced in one confluent layer are treated according to the invention with trypsin and substituted in suspension in a suitable culture medium at the time of vaccination on the support material.

Die Anwendung des biologischen Trägermaterials kann entsprechend der Erfindung auf drei verschiedene Arten modifiziert werden. Entsprechend einer ersten Anwendungsart wird das biologische Trägermaterial in Form eines Films durch Mischung seiner zwei Bestandteile in einer Kulturschale hergestellt; in einem geeigneten Kulturmedium wird eine Keratozytsuspension auf diesen Film geimpft. Wenn die Keratozytkultur zusammengeflossen ist bzw. am Zusammenfließen ist, bildet diese ein Substitutionsgewebe, das als Transplantat direkt rückgewonnen und mit einer Pinzette aus der Schale entnommen und in diesem Zustand auf den Patienten transplantiert werden kann, ohne daß ein zeitweiliges Trägermaterial wie z. B. Mull notwendig wäre. Dies ermöglicht eine beträchtliche Einsparung an Arbeitszeit sowie eine lOOprozentige Ausnutzung des Transplantationsgewebes.The application of the biological carrier material can be modified according to the invention in three different ways. According to a first mode of application, the biological carrier material is produced in the form of a film by mixing its two constituents in a culture dish; in a suitable culture medium, a keratocyte suspension is seeded on this film. When the keratocyte culture is confluent, it forms a substitution tissue that can be directly recovered as a graft and removed with tweezers from the shell and transplanted to the patient in this condition without the need for a temporary support material such as tissue. B. garbage would be necessary. This allows a considerable saving in working time and a 100% utilization of the transplant tissue.

Entsprechend eines weiteren erfindungsgemäßen Verfahrens zur Anwendung des Trägermaterials werden die zwei Bestandteile des Trägermaterials mit der Keratozytsuspension dergestalt gemischt, daß die Zellen fest im sich bildenden Film verankert sind.According to a further method according to the invention for the application of the carrier material, the two constituents of the carrier material are mixed with the keratocyte suspension in such a way that the cells are firmly anchored in the forming film.

Hierbei können die zwei Bestandteile mit der Zellsuspension in einer Kulturschale gemischt und dann als Transplantat analog zum oben beschriebenen Verfahren angewendet werden; die Mischung kann auch direkt auf der zur Transplantation vorbereiteten Wunde des Patienten erfolgen, d. h. durch Aufsprühen des biologischen Trägermaterials und der Zellen mit Hilfe eines Trägergases (Stickstoff) bei einem Druck von 2 bis 2,5 bar.Here, the two components can be mixed with the cell suspension in a culture dish and then used as a graft analogous to the method described above; the mixture can also be made directly on the wound prepared for transplantation of the patient, d. H. by spraying the biological support material and the cells with the aid of a carrier gas (nitrogen) at a pressure of 2 to 2.5 bar.

Bei einem weiteren Verfahren der erfindungsgemäßen Anwendung des Trägermaterials werden die zwei Bestandteile auf einer Zellschicht aus Keratozyten, die vorher in einer Kulturschale angelegt wurde, dergestalt gemischt, daß die Zellen mit dem gebildeten Film bedeckt sind und somit abgetrennt und zur Anwendung als Transplantat transportiert werden können.In another method of using the support material according to the invention, the two components are mixed on a cell layer of keratocytes previously placed in a culture dish such that the cells are covered with the formed film and thus can be separated and transported for application as a graft ,

Die Erfindung soll nachstehend anhand folgender Beispiele, die jedoch deren Anwendungsbereich nicht begrenzen, erläutert werden.The invention will be explained below with reference to the following examples, which, however, do not limit their scope.

example 1

Herstellung des biologischen Trfigermaterlals für ZellkulturenProduction of the biological carrier material for cell cultures

Ein biologisches Trägermaterial für Zellkulturen wird durch Mischung eines Konzentrats aus gerinnungsfähigen Plasmaproteinen und der zur Auslösung des Gerinnungsprozesses notwendigen Menge Thrombin hergestellt.A biological carrier for cell cultures is prepared by mixing a concentrate of coagulatable plasma proteins and the amount of thrombin necessary to initiate the coagulation process.

A. Herstellung des PlasmaproteinkonzentratsA. Preparation of plasma protein concentrate

Die Herstellung des Proteinkonzentrats wurde vom Anmelder bereits in der Europäischen Patentanmeldur g Nr.884019613 beschrieben. Das Verfahren läßt sich wie folgt zusammenfassen: Nicht durch Kältebehandlung ausgefälltes menschliches Plasma kommt zur Anwendung; dieses Plasma wird jeweils zweimal hintereinander in zehnprozentiger Ethanollösung bei einem pH-Wert von 7,2 und einer Temperatur von 4°C ausgefällt. Zwischen zwei aufeinanderfolgenden Fällungen wird das Produkt einer Virusinaktivierungsbehandlung unterzogen. Das vom Überstand durch Zentrifugieren getrennte Fällprodukt wird bei 4°C in Ethanol gewaschen und nochmals zentrifugiert. Das Fällprodukt wird in Suspension in einem Tris(Citrat)Puffermedium bei einer Proteinkonzentration von etwa 35g/l substituiert. Lysin wird zugefügt bei einer Endkonzentration von 0,1 bis 0,2g pio Gramm Protein. Nach Diafiltration zur Abtrennung des Ethanols und des Citrats und zur Einstellung der lonenkraft wird das Konzentrat in Flaschen verpackt und gefriergetrocknet.The preparation of the protein concentrate has already been described by the Applicant in European Patent Application No. 884019613. The method can be summarized as follows: not precipitated by cold treatment human plasma is used; this plasma is precipitated twice in succession in 10% ethanol solution at pH 7.2 and 4 ° C. Between two successive precipitations, the product is subjected to a virus inactivation treatment. The separated from the supernatant by centrifugation precipitate is washed at 4 ° C in ethanol and centrifuged again. The precipitate is substituted in suspension in a tris (citrate) buffer medium at a protein concentration of about 35 g / l. Lysine is added at a final concentration of 0.1 to 0.2 g pio grams of protein. After diafiltration to separate the ethanol and citrate and to adjust the ionic force, the concentrate is packaged in bottles and freeze-dried.

Dieses Proteinkonzentrat enthält pro Gramm Protein mindestens 0,9g Fibrinogen, 0,03 bis 0,06g Fibronektin und 0,15 bis 0,30 IE Faktor XIII.This protein concentrate contains at least 0.9 g of fibrinogen, 0.03 to 0.06 g of fibronectin and 0.15 to 0.30 IU of factor XIII per gram of protein.

B. Herstellung des Trägermaterials für ZellkulturenB. Preparation of the carrier material for cell cultures

Das oben beschriebene Proteinkonzentrat wird in Suspension in wäßriger Lösung mit oder ohne Aprotinin bei einer Konzentration von 3000KIE/ml (Kallikreininhibitoreinheiten/ml) substituiert.The protein concentrate described above is substituted in suspension in aqueous solution with or without aprotinin at a concentration of 3000 KIU / ml (kallikrein inhibitor units / ml).

Diese Lösung wird mit einer gleichen Menge Calciumthrombin einer Konzentration von 10 ΙΕ/ml gemischt.This solution is mixed with an equal amount of calcium thrombin at a concentration of 10 ΙΕ / ml.

Eine Petrischale mit einem Durchmesser von 10cm wird mit 2 ml Proteinsuspension und 2 ml Thrombin gefüllt, wobei beide Lösungen gleichzeitig mittels zweier durch Mischkopplungen miteinander verbundener Spritzen injiziert werden. Die Petrischale wird geschüttelt, um eine gleichmäßige Verteilung zu erzielen, danach wird die Mixtur für 15 bis 20 Minuten ruhig gestellt. Sie bildet dann einen Film, der die Schale bedeckt.A 10 cm diameter petri dish is filled with 2 ml of protein suspension and 2 ml of thrombin, both solutions being injected simultaneously by means of two syringes interconnected by mixing couplings. The Petri dish is shaken to obtain an even distribution, then the mixture is sedated for 15 to 20 minutes. It then forms a film that covers the cup.

Bei den Kulturschalen handelt es sich um „unbehandelte, für Zellkulturen geeignete Schalen", womit gesichert wird, daß das Trägermaterial nicht permanent a jf der Schale haften bleibt, sondern sich leicht wieder ablösen läßt.The culture dishes are "untreated, suitable for cell culture dishes", thus ensuring that the carrier material does not permanently adhere to the jaws of the shell, but can easily be detached again.

Der Film wird dann mit Zellkulturmedium bedeckt. Dieses Medium wird mehrmalig erneuert, bis sich der osmotische Druck des Filmes auf ein für die Zellen physiologisch verträgliches Maß, d.h. zwischen 260 und 34OmOSM (Milliosmol), stabilisiert hat.The film is then covered with cell culture medium. This medium is renewed several times until the osmotic pressure of the film reaches a physiologically acceptable level for the cells, i. between 260 and 34OmOSM (milliosmol).

Es ist auch möglich, das rekonstituierte Proteinkonzentrat vor seiner Mischung mit Thrombin zu dialysieren.It is also possible to dialyse the reconstituted protein concentrate before mixing it with thrombin.

Example 2

Darstellung einer Keratozytkultur auf dem biologischen TrSgermaterlalPresentation of a keratocytic culture on the biological support material

Hierbei kommen nach Greens klassischem Verfahren hergestellte Keratozytprimärkulturen aus Hautbiopsien, die der Haut eines Patienten (oder eines Embryo zur Bildung fetaler Zellbanken) entnommen wurden, zur Anwendung. Diese Primärkulturen können vier bis fünf Passagen in V'io-Lösung durchlaufen.Keratocyte priming cultures from skin biopsies taken from the skin of a patient (or embryo to form fetal cell banks) are used according to Green's classical method. These primary cultures can go through four to five passages in V'io solution.

Eine Schicht konfluenter Keratozyten wird mit Trypsin behandelt, in Kulturmedium in Suspension substituiert und in Vio-Lösung auf einer mit einem Film des biologischen Trägermaterial bedeckte Petrischale geimpft, wie dies in Beispiel 1 beschrieben wurde.A layer of confluent keratocytes is treated with trypsin, suspended in culture medium in suspension, and seeded in Vio solution on a Petri dish covered with a film of the biological support material, as described in Example 1.

Nach wenigen Stunden haften die Zellen auf dem Trägermaterial, wo sie sich normal vermehren, bis sie ein Stück konfluenter, eine Schichtdicke von drei bis vier Zellen aufweisender Epidermis bilden.After a few hours, the cells adhere to the support material where they propagate normally until they form a piece of confluent epidermis having a thickness of three to four cells.

Dieses auf dem Trägermaterial haftende Fragment rekonstituierter Epidermis kann der Kulturschale mittels Pinzette entnommen und in diesem Zustand auf die zum Empfang des Transplantats vorbereitete Wunde appliziert werden.This fragment of reconstituted epidermis adhering to the carrier material can be removed from the culture dish by means of tweezers and, in this state, applied to the wound prepared for receiving the graft.

Da die Zellen auf dem Trägermaterial haften, muß die rekonstituierte Epidermis nicht auf einem anderen Trägermaterial, z. B. mit Vaseline behandeltem Mull, befestigt werden, wie das bei Zellkulturen anderer Art der Fall ist. Dies erlaubt es, Arbeitszeit in beträchtlichem Maße einzusparen, da hierbei 40 Packungen anstelle der mit konventionellen Verfahren möglichen vier Packungen pro Stunde bearbeitet werden können.Since the cells adhere to the carrier material, the reconstituted epidermis need not be on another carrier material, eg. As with vellum-treated gauze, be attached, as is the case with cell cultures of other types. This makes it possible to save a considerable amount of work time since it can process 40 packs instead of the four packs per hour possible with conventional methods.

Außerdem ist dieses Trägermaterial gut zu handhaben und zieht sich bei der Abtrennung nicht zusammen, so daß 100% der Oberfläche der Zellkulturschicht tatsächlich genutzt werden können.In addition, this support material is easy to handle and does not contract during the separation, so that 100% of the surface of the cell culture layer can actually be used.

Example 3

Rückgewinnung einer vorher angelegten Zellschicht mittels des biologischen Trägermaterials Keratozyten werden entsprechend des herkömmlichen Verfahrens nach Green in einer Petrischale mit einer Schicht Fibroblasten, die einer letalen Strahlendosis ausgesetzt wurden, geimpft.Recovering a Previously Applied Cell Layer Using the Biological Support Material Keratocytes are inoculated according to the conventional Green method in a Petri dish with a layer of fibroblasts exposed to a lethal radiation dose.

Wenn die Keratozytenlage am Zusammenfließen ist und eine Schichtdicke von mehreren Zellen erreicht hat, wird das Kulturmedium entfernt, man läßt eine EDTA-Lösung für 1 Stunde 30 Minuten einwirken, danach wird zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen. Das biologische Trägermaterial wird daraufhin direkt in die Zellschicht entsprechend dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren gegeben.When the keratocyte layer is confluent and has reached a layer thickness of several cells, the culture medium is removed, an EDTA solution is allowed to act for 1 hour 30 minutes, then washed twice with phosphate buffered saline. The biological carrier material is then added directly to the cell layer according to the method described in Example 2.

Wenn sich der Film auf den Zellen gebildet hat, kann er mittels Pinzette abgenommen und wie im vorhergehenden Beispiul als Transplantat angewendet werden.If the film has formed on the cells, it can be removed with tweezers and used as a graft as in the previous example.

Example 4

Einbau der Zellen in das biologische TrägermaterialIncorporation of the cells in the biological carrier material

Jeweils eine Spritze mit Proteinlösung und eine Spritze mit die Keratozyten in Suspension enthaltendem Thrombin werden vorbereitet. Die Keratozyten können einer frischen, mit Trypsin behandelten Kultur oder einer in flüssigem Stickstoff konservierten Zellbank entnommen werden.One syringe each with protein solution and a syringe with the keratocytes in suspension containing thrombin are prepared. The keratocytes can be taken from a fresh trypsin-treated culture or a liquid nitrogen-preserved cell bank.

Die zwei Spritzen sind durch eine Mischkopplung miteinander verbunden, das die Zellen enthaltende Trägermaterial wird auf die Petrischale gesprüht (oder auf die das Transplantat zu empfangende Wunde), dadurch verbleiben die Zellen während der Gerinnung im Film. Das Aufsprühen kann unter Verwendung eines Trägergases (Stickstoff bei einem Druck von 2 bis 2,5 bar) erfolgen.The two syringes are connected by a mixed coupling, the carrier material containing the cells is sprayed onto the petri dish (or onto the wound to be received by the graft), thereby the cells remain in the film during coagulation. The spraying can be carried out using a carrier gas (nitrogen at a pressure of 2 to 2.5 bar).

Der Sprühvorgang führt zu keiner Denaturierung der Zellen; es zeigt sich, daß sich die Zellschicht in Kultur in vitro neu bildet. Die Zellen wurden sich also normal bzw. nahezu normal vermehren, wenn die Mixtur in einer sehr dünnen Schicht direkt auf die Wunde aufgesprüht wird.The spraying process does not denature the cells; it turns out that the cell layer regenerates in culture in vitro. The cells were thus normal or almost normal propagate when the mixture is sprayed in a very thin layer directly on the wound.

Claims

A biological support for cell cultures, characterized in that it consists of a mixture of a concentrate of thrombin-clottable proteins which can be obtained by treating plasma with ethanol, and coagulable fibrinogen, factor XIII and plasma fibronectin, and the amount of thrombin necessary to induce the coagulation process each contains in certain proportions.

2. Biological carrier material according to claim 1, characterized in that the concentrate of clotable plasma proteins contains more than 90% fibrinogen and per gram of protein at least 0.1 IU factor XIII and 0.03 to 0.1 grams of fibronectin.

3. Biological carrier material according to claim 2, characterized in that the protein concentrate is obtained by precipitation of fresh plasma in two successive treatment steps with ten percent ethanol solution at 4 ° C.

4. Biological carrier material according to claim 1 to 3, characterized in that the protein concentrate is freeze-dried.

5. Biological carrier material according to claim 1 to 4, characterized in that the protein concentrate is suspended in a Aprotininlösung.

6. Biological support material according to claim 1 to 5, characterized in that calcium thrombin is mixed with the protein concentrate approximately in the ratio 10 ΙΕ / ml.

7. Biological support material according to claim 1 to 6, characterized in that it is a cell proliferation promoting substance attached.

8. Biological carrier material according to claim 1 to 7, characterized in that an antibiotic is added to it.

9. Biological support material according to claim 1 to 8, characterized in that it is added to a wound healing accelerating substance.

10. Use of the biological support material according to any of the claims described in items 1 to 9 for the production of a culture of human keratocytes of fetal or adult origin to form a replacement tissue which can be directly removed, transported and used as a transplant.

11. Application according to Pa Entanspruch 10, characterized in that the two components of the biological support material are mixed together such that forms a uniform film in a culture dish and that the keratocytes, which are suspended in the culture medium, are seeded on said film.

12. Application according to claim 10, characterized in that the two constituents of the biological support material are mixed with a Keratocytsusponsion so that the cells are assimilated by the subsequently formed film.

13. Application according to claim 11 or 12, characterized in that the keratocyte suspension is obtained after dispersion of a fresh, preferred cell layer.

14. Application according to claim 11 or 12, characterized in that the keratocyte suspension is obtained from a cell bank preserved in liquid nitrogen.

15. Application of the biological carrier according to any of the claims 1 to 9 listed above for the recovery and transport of the previously applied culture of human keratocytes of fetal or adult origin.

16. Application according to claim 15, characterized in that the two constituents of the biological carrier material are mixed together on the previously applied cell layer in the culture dish.

17. Protein concentrate, which is made to clot by means of thrombin and characterized in that it is packed according to one of the claims listed under items 1 to 9 for the production of the biological support material.