JPS61108386A

JPS61108386A - インビトロ細胞培養系

Info

Publication number: JPS61108386A
Application number: JP60203214A
Authority: JP
Inventors: ハーマン　エス．チエウング
Original assignee: M C W RES FOUND Inc
Current assignee: M C W RES FOUND Inc
Priority date: 1984-09-14
Filing date: 1985-09-13
Publication date: 1986-05-27
Also published as: CA1247542A; ATE62932T1; DE3582639D1; EP0175286A2; EP0175286A3; EP0175286B1; US4757017A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は一般的には足場依存性曙乳類細胞の生育技術に
関し、さらに特定すれば、本発Ｆ！Ａは、従来インビ）
Ｉ：Ｉ細胞培養に用＾られ友ことのないある種の基質材
料を使用すると、細胞培養にこれまで使用されてきた公
知の固体では達成し得なめ顕著な好結果が得られること
を発見し、それに基づいて完成されたものである。

従来の技術以下の記述においては、技術文献を括弧内の参照番号に
より、たとえば（１）のように示し、その引用文献は本
明細書の末尾に一覧した。

哺乳類細胞の培養は、学術的にもまた製薬工業において
も、多くの理由により重要な生物学的課題である。細胞
の構造および形態の研究は、ヒトの疾患の診断や治療の
絶えざる進歩の基盤になっている。そして、多（の細胞
産生物、たとえばホルモン、酵素、ウィルス産生物、ワ
クチン、インターフェロン、核酸等が、治療上、経済上
きわめて重量であり、その製造には大規模な細胞培養系
を必要とする。

正常な一次二倍体哨乳類細胞はインビトロで生　　　育
させ、維持することが可能であるが、足場依存性である
。すなわち、これらの細胞は生長のために固体表面ま次
は基質を要求する。固体基質は、培養すべき特定の細胞
の種類に適した栄養培地で覆うか、またはその中に浸漬
もしくはＪｌｌ！濁させる。

栄養培地と固体基質は、一般的には適当な容器中により
、これに細胞の生長と維持なテボートするため、酸素と
二酸化炭素の供給装置を装備する。

細胞培養は、培養中に酸素を必要に応じて加えるのみで
栄養素の補給を行わないバッチシステム（ｂａｔｃｈ　
５ｙｓｔ、ｅｍ　）よることもできるし、また、栄養素
、酸素の両者の濃度をモニターして必要に応じて両者を
補給する送給バッチ　システム（ｆｅｄｂａｔｃｈ　ｓ
ｙｓｔｅｍ　）、栄養素と老廃物の濃度をモニターし、
制御する潅流システム（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎｓｙｓｔｅ
ｍ　）を用いることもできる。

足場依然性哺乳類細胞は、初期には、シールされたＩラ
スピン、皿またはその他の適当な容器中で生育された。

ガラスが細胞培養に適した固体基質の役割を果たしてい
たのである。その後、プラスチック容器が、インビトロ
細胞生育により好ましい表面を与えるものとしてガラス
容器にとって代わった。価格面や、壊われに（いこと、
大部分の種類の細胞と適合性を示すことなど、多くの利
点による。回転風培養法が開発されて容器の表面対容量
比が増大し、これによって大規模な細胞培養が容易にな
った。この方法は、プラスチックまたはがラス容器を回
転させ、細胞を瓶の空気空間中の酸素と瓶内に含まれる
生長培地とに交互に暴露するものである。しかしながら
、回転瓶培養は繁雑で、操作や材料が高価につき、また
変異を起こしやすく、そのために細胞動力学のそニター
を非実際的とし、生育環境が変化する（１）。

回転瓶培養に比べてさらに表面対容量比を増大させ、大
量細胞培養を容易にするため、多重増殖機、らせん状フ
ィルム、プラスチック躾、管付旋回機、人工毛細管、管
状らせんフィルム等の他のシステムも開発された。これ
らのシステムにっ＾ては前出の文献（１）中に簡単に述
べられている。

固体マトリックス潅流システムはマツコイ（ＭＣＣＯＹ
）ほか（２）により開発されたもので、がラスビーズま
たはへリツクスを充填したがラスカラムを用い、これが
細胞培養用固体基質としてのがラスマトリツクスな形成
する。細胞がいったんがラスマトリックスに付着し次の
ちは、培地が貯蔵容器から連続的に再循環される。がラ
スビーズの代わりに固体マトリックスとして中空繊維を
用いる類似の潅流システムがアミコン（Ａ１１ｃｏｎ　
）社によって開発されている（６）。

ファン自つエツエル（Ｖａｎ　Ｗｅｚｅｌ　）は、足場
依然性哺乳類細胞の培養用固体基質として、きわめて小
さい球体（微粒子担体）が利用できることを発見した（
４）。この目的には、最初、球状イオン交換デルである
ジエチルアミノエチルセファデックス（５ｅｐｈａｄｅ
ｘ”　）　Ａ　−５０が使用された。適当な容器中で穏
やかに攪、＊して、微粒子担体を生長培地中に！濁させ
る。微粒子担体システムにおける大きな表面対容量比に
より高い細胞収率達成が可能になった。；１１１１ｍ培
養として多種類の微粒子担体が７アーマシア・ファイン
・ケミカルズ（Ｐｈａｒ−ｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌｓ　）社により、テイトデツクス（Ｃｙｔ
ｏｄｅ：ｃ　）の間係名で広（市販されていて、これに
ついては同社により出版された書籍に詳述されている（
６）。

上述の細胞培養系は現在も多かれ少なかれ実用されてい
るが、ｈずれもその効率を至適レベルより低下させる欠
点がある。微粒子担体培養系のシステムは操作および制
御が困難で、大部分は、顕微鏡検査のように培養の状態
、進行を直接検査し、評価することが難しく、グルコー
スの利用や酸素の取り込みのような培養の状態の間接的
な指標を測定する必要を生じる。微粒子担体システムは
上述のシステム中最犬の表面対容量比を有し、そ−ター
と制御が可能であることから、現時点では大量細胞培養
に最適なものと考えられている。しかしながら、微粒子
担体培養系は多（の重大な欠点を有する（文献１．１０
７〜１０８頁）。すなわち、すべての細胞系が細胞の生
存率を減少させないで微粒子担体から除去できるわけで
はないこと、小瀘微粒子担体培養が大址微粒子担体培養
の接種　　　　□に使用できず、この目的には他の培養
システムを用いなければなうな−こと、微粒子担体の価
格が高（、その費用を低減させるためには微粒子担体の
再処理を必要とすること、微粒子担体システムの酸素移
送特性がかなり劣ることなどである。

しかも、上述の細胞培養システムはすべて大きな２つの
欠点をもっている。まず第一に、上述の全シスナムでの
固体基質上において、細胞は、一層の厚さ、すなわち単
層にしか生育しないことである。そのため、固体基質の
単位表面積あたりの細胞密度がきわめて低い。第二に、
上述のシステムのすべてで生育した細胞は、現在知られ
ている限りでは、その表現をを維博しない。すなわち、
それが白米する組織での場合と、生化学的にまた代謝的
に異なるａｌ＋にとることである。インビトロ培養系で
単層に生育した細胞は、インビボにおける多細胞組織の
場合と同一ではない。本発明は、これらの欠点を除いた
細胞培養系を提供するものである。

発明の説明本発明の細胞培養系は、適当な栄養生長溶液中に含まれ
る固体基質上での足場依存性１宥乳類細胞の生育に用Ａ
られるもので、この固体基質ヲ末インビトロ培養系中で
Ｍｉ胞に非毒性のマイトジェンカルシウム化合物である
。本発明を完成させた研究、およびその結果を以下に詳
述するが、適当なカルシウム固体基質上インビトロで生
育させた鋪＠は、いくつかの新しい特性を示すことが明
らかにされた。すなわち、１、ａ胞ヲ工単層としてのみ生育するのではなく、多層
の厚さに生育する。

ト　細胞はその表現屋を維持し、これは生化学的、組織
学的性質によって確認されている。

Ｉｌ、　　！胞の生Ｗはインビトロ培養条件下に長時間
、現在までのデータからは少なくとも１１〜１６力月以
上維持される。

本発明の新規な！胞培養系のこれらの性質は以下に説明
するようにきわめて１安で、上述したような公知のイン
ビトロ細胞培養系では達成し得なかったものである。

以下の詳細な説明には、本発明の細胞培養系で達成され
る独特な結果を確認した包括的芙験データを示す。

本発明の新規な特徴は、ある櫨のカルシウム化合物がイ
ンビトロ細胞培養の固体基質として用＾２を場合、新し
＾有用な結果が得られるとい５発見にある。例１〜１２
は、数種のこれらの材料の、以下のような１１種の異な
る足場依存性哺乳類細胞の生長に対する有効性を示すも
のである。

例　１−イヌ関節軟骨細胞例　２−ウ？ギ関節軟骨細胞列　６−ヒト関節軟骨細胞同　４−マウス破？細胞および骨芽横胞例　５−ウキギ
骨芽細胞例　６−ウ？ヤ骨膜線維芽細胞ガ　７一イヌ半月線維芽細胞例　８−ヒト包ＢＬ線維芽細胞ガ　９−マウス（ＣＤＩ）皮膚線維芽細胞列１０−ウテ
ギ渭液細胞鉤１１−ヒト腎臓細胞例１２−イヌ半月線維芽則胞例にお込ては、各種のカルシウム固体基質をペトリ皿中
細胞と接種し、試験した特定の細＠く適した栄養生長培
地で覆い、ついでその特定の細胞に適した条件下に細胞
を培養した。例で用いた細胞の栄養培地および培養条件
は、従来技術における固体基質材料による公知細胞培養
法で使用されているものと同一である。本発明の細胞培
養系の利点のひとつは、実用に際し、特殊な生育条件や
生育培地を必要としないことである。すなわち、栄養生
育培地には、培養する細胞の特定の種類に適した栄養素
、塩溶液、緩衝剤、血清、−指示薬および抗生物質を加
える。大部分の細胞の場合、ＰＨは約７．２〜７．６の
範囲に保持する。

６樵のマイトジェンカルシウム固体が、以下の実施例に
おいて、インビトロ細胞培養に有用であることが示され
て＾る。これらはすべて、栄養培地にはきわめてわずか
しか溶けず、哺乳類ＩＩＩＩＩｌ胞に対し非壽性のマイ
トジェンカルシウム固体である。゛。

本発明の実施に際し、現時点でもつとも有効と考えられ
ている特異的カルシウム化合物には、リン酸カルシウム
のヒＦＱキシアパタイト（ＨＡ）　戯、Ｃａ１ｏ（ＰＯ
４）６（ＯＨ）ｚ　；リン酸カルシウムのリン酸ミカル
シウム（ＴＣＰ）　Ｗ、Ｃａ３ＣＰＯ４）２　ｍおよび
炭酸カルシウム、ＣａＣＯ３が包含される。

ヒダ０キシアパタイント（Ｉ（Ａ）およびリン酸カルシ
ウム（ＴＣＰ）はいずれも、三塩基性リン酸カルシウム
から公知方法によって製造できる。すなわち、ＴＣＰは
三塩基性すン酸カルシクムをその不安定温度８７５℃以
下に加熱し、急速に室温まで冷却することによって製造
できる。ＨＡは、三塩基性リン酸カルシウムを９００°
０から約１２５０℃までの範囲の温度に加熱することに
より製造され、７２〜９６％がＨＡ、残りがＴＣＰの材
料を生じる。

上記範囲の高い方の＠度まで加熱するほどＨＡの割合が
増加する。以下のガにおいては、バーカー・ケミカル社
（Ｔ、Ｊ、　Ｂａｋｅｒ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　
）から購入した市販三塩基性リン酸カルシウムを出発原
料とした。非多孔性ＷＨＡの製造には、三塩基性リン酸
カルシウム粉末をライクル　ゾＶス（Ｒｅｉｃｈｌｅｐ
ｒｅｓｓ　）で所定の形状に成型し、１１００°Ｃで焼
結させた。多孔性型ＨＡの製造には、三塩基性すン酸カ
ルシクム粉末を平均ティズＦＪｓｏｏミクロンのす７タ
レン粒子と混合し、ライクルゾンスで成型し、グローバ
ー（Ｇｌｏｂａｒ　）炉中４００　’Ｃに４時間加熱し
、ナフタレンを昇華させて除去して多孔性物質を製造さ
せた。この多孔性物質をっ＾で１１００℃＆Ｃ１−て８
時間焼結した。例１〜１１の多孔性および非多孔性の両
型をエネルギー分散分析によって解析し次場合、約９０
チがＨＡ、残りがＴＣＡで、カルシウム対リン酸基の平
均モル比は斗、１．６０であった。一部の例ではこれら
の材料の顆粒が用いられる。すなわち、これらの材料を
手作業で粉砕し、篩過して粒子サイズ約０．１〜０．５
Ｈの範囲に整え、顆粒とした。リン酸カルシウムを焼結
し、その多孔性剤証を装量する方法は文献に記載され公
知である（１．７．８）。

本発明の細胞培養系に適した炭酸カルシウムは、多（の
製造業者から市販されているし、公知の様様な方法で製
造されている。例１２において用ｉた炭酸カルシウムを
工、地下鉱山から採石された高カルシウム方解性石灰岩
から製造されｆｃ顆粒製品であったが、他の出発原料ｆ
）ｈら製造された炭酸カルシウムも同様に使用できる◎ 使用前に、カルシウム固体を超音波処理して洗浄し、オ
ートクレーブ中１２１℃で６０分間滅菌し、６例で使用
したそれぞれ特定の培養培地で各回５分ずつ２回洗浄し
て余分の破片を除去し＼細胞培養に使用するまで同じ培
地中に保存した。

以下の例において参照した図中では、各領域を欠の記号
で示す。

Ａ＝カルシウム化合物の固体基質Ｂ＝７ｄ胞Ｃ＝アルシアン青青色色領域＝原線維Ｎ＝核例　１硝子軟骨は特殊な結合組織で、その主たる機能はそれを
包んだ細胞外マトリックスの水利状態と構造的配置に依
存して−る。組織としては、軟骨はかなり均一なａ胞集
団として特徴づけられ、これらの細胞は、細胞表現をの
生化学的発現である構成的巨大分子（たとえば…型コラ
ーデンおよび軟骨特異性プロテオグリカン）を産生ずる
。軟骨細胞は特殊な微小環境、領域マトリックスを確立
し、他の組織における大部分の細胞とは異なり、直接的
な細胞間接触がな（存在する。各細胞は軟骨の機能単位
と考えることができ、最終的には全組織の細胞外マトリ
ックスのターンオーバーヲ決定する。

哺乳類軟骨細胞は様々の軟骨から培養のため単離されて
いる（９〜１２）。既述のように、軟骨細胞は、性質が
明確にされて（ハ）る２樵の構成的巨大分子、軟骨プロ
テオグリカンおよび…型コラーｒンを産生じ、それが軟
骨細胞の特異的分化表現塁の定義に用いられてきた。し
かしながら、鳥類や哺乳類動物種の軟骨細胞を軟骨マト
リックスから分離し、単層細ａ培養系で生長されると、
様々な状況で、これらの特徴的分子の産生を停止する　
　　　□（１６〜１９）。クローン化軟骨細胞の子孫の
コラ−２７表現型は初老期への生育中にＩＩ製からＩ型
およびＩａ）リマーコラーグンと変化することが明らか
にされている（２０）。この観察は大量培養で確証され
、コラーダンｌｆｆ１、Ｉ型トリマー、■型およびＩｎ
の複雑な脱分化表現型の記述にと発展された（２１．２
２）。

本例では、単離されたイヌ関節軟骨細胞を、本発明の細
胞培養系により、多孔性ヒドロキシアパタイト（多孔性
ＨＡ）の単離方法と培養条件に従って固体基質上で生育
させると、インビトロでもその生化学的表現型の発現が
変化することな（、組織様マトリックスを作り上げるこ
との証拠を提供するものである。以下、これらの軟骨細
胞の形態学的外貌研究について記述し、またこれらの細
胞によって合成されるコラ−ピンとそれが単離された軟
骨とを比較するための缶化学的研究結果を示す。

材料および方法：すべての培養培地、たとえば高グルコ
ースＣ４，５９７１１）のダルベツコ改良イーグル培地
（ＤＭＥＭ　）　、ウマ血清（Ｈ８）およびぺ二シリン
ーストレゾトマイシンーファンギゾン（Ｐｓｉ？）混合
物はバイオゾロダクッ（Ｍ、Ａ、　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃ
ｔｓ）社（Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　）から購
入Ｌ７ｃ。

へ、ｐ　シｙ　（Ｐ　Ｍ　１ｉｌｔ　）、コラ−１’　
ｆ−ゼ（Ｉ型）およびトリノシンは、ウアーゾントン゛
バイオケミカルズ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ　）社から、ＳＤＳ電気泳動用試薬は
バイオ−レッド・ラボラトリ−（Ｂｉｏ−Ｒｅｄ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　）から購入した。アクアゾルおよび
Ｃ２，３−３Ｈ１ｆｏリン（３０〜５０　Ｃｉ　／　ｍ
Ｍｏ１　）はアマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ＋Ａｒｌ
ｉＡｒ１１ｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ、　ＩＬＩ　）から、フ
ァｉコン（Ｆａｌｃｏｎ　）培養プレートはベクトンー
デイツカーソン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｒｓｏｎ、
　０ｘｎａｒｄ、　ＣＡ　）から人手した。

（ａ）部：例１（ａ）部では、細胞培養のための固体基
質として、多孔性ＨＡを使用した。ｆＩＩＡを乳鉢と乳
棒で顆粒状に粉砕し、篩過して均−丈イズ（約５００μ
）に整えた。

（１）細胞培養：正常イヌ軟骨を使用した。軟骨切片を
大腿関節丘表面から採取し、直ちにノ為ンクの平衡塩類
浴液（ＨＢＳＳ　）中に室温で浸漬した。軟骨細胞は軟
骨からチェラングほか（Ｃｈｅｕｎｇ　ａｎｄＲｙａｎ
　）の操作（２３）に従って酵素的に分離した。

分離した細胞を１０％（ｖ／ｖ）ウマ血清および１％（
ｖ／ｖ）ＰＳＦ補給ＤＭＦＭ−ｔＪｈらなる生育培地に
懸濁し友。約５Ｘ１０５個の祷肥を６０１＋１Ｘ１５龍
ペトリ皿中５００・ηの多孔性ＨＡ顆粒上に接種し比。

台皿に生育培地４ｄを加え、ＣＯ２インキエベーター〔
ホルマ・ティエンティフィック（ＦｏｒｍａＳｃｉｅｎ
Ｌｆｆｉｃ　）　、Ｍａｒｉｅｔｔａ　ｏａ　ｊ中、１
週間に２回培地を交換して培養を銑けた。第２週の終わ
りまでに、カルシウム顆粒は通常、ン咄胞に完全に覆わ
れた。生化学的および形態学的研究のためには、これら
の培養の一部を１６力月以上維持した。

（２）元顕微鏡および走歪鑞電子顕＠を鏡による鏡検：
サンプルは元顕微鏡および走査ｔ！ｉ電子顕微鏡による
鏡検の両者用にａ＃＃（、た。元顕微鏡用テンプルはＪ
Ｂ−４包埋剤中に埋め込み、カーバイド鋼ナイフ付きミ
クロトームで切片とした。走査型電子顕微鏡用テンプル
はＣＯ２で臨界点乾燥を行い、各標本をプントｙ　（Ｄ
ｅｎｔｏｎ　）　Ｄ　Ｖ　５２０真空室でカーボンおよ
び金−パラジウムを蒸着させた。標本は７ＡＬ／　　（
Ａｍｒａｙ）１２００走ｆ：型電子顕微鏡により１５〜
２５　ｋｖで検査した。

ため、ａｕｒａの付着しｆｃＨＡ顆粒を、馳プロリン（
５０μＣｉ　／ｒｎｌ　）　、Ｌ−アスコルビン酸（５
０μ９／ｍＡ’　）　、β−アミノグロビオニトリル（
βＡＰＮ　）（１２５μＩ／ｄ）、１０％ＥｒＳおよび
１％ＰＥ３Ｆを含有するＤＭＥＭ　Ｊ　ｄ中で標識した
。２４時間インキュベートしたのち、顆粒を培地から分
離し、７リーズミルで粉砕した。これを、４’０におい
て、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ２／　０．０５　Ｍ　）リス緩衝液
（ｐ８７．５）４ｄによって２４時間他出した。プロテ
アーゼの活性をｔｍ害する次め、フェニルメチルスルホ
ニルフルオリド（ＰＭＳＦ　）およびエタノールを加え
比。

抽出後、遠心分離して不溶性のＨＡ残渣を除去した。上
澄をはじめの培地に戻した。

培地とＨＡ抽出液に氷酢酸を加えて−３，５の酸　　□
性とし、ペプシンを最７１％潰度Ｑ、１１９／ｍＡｔに
なるように加えた。混合’［−４℃で４８時間振盪して
消化し、凍結乾燥しｋ。凍結乾燥テンプルを１ｌｌＪａ
ｌ又を含む冷０．０５　Ｍ　）リス（ｐ）１７．４）５
ｉｕに溶解してペプシンを不活性化し、４℃で２４時間
この溶液を穏やかに振盪して、コラ−２７をこの中性塩
溶液中に抽出し友。このテンプル中に酸可溶性ラット皮
膚コラ−ｒン１１ｎ９をｍ解し友。コラーゲンをつ＾で
、中性−酸基沈殿で積層した。沈殿を浴解し、０”５Ｎ
酢酸に対して大規模に透析し比。コラーダンの分類はＳ
ＤＳポリアクリルアミドデル電気泳動によって実施した
。

コラーデン■型、Ｉｆ型および旧型の同定は、さらに、
電気溶出およびシアノグンプロミド（ＣＮＢｒ）ペプチ
ド解析によって確認した。コラーダンのテンプルを５％
デル上であらかじめ分画し、切片とし、〜α１（Ｉ）お
よび〔、α−１（Ｉｆ）　Ｊ３の抽出位置が反復実嫉ｒ
ルの染色によって決定されるまで、湿つｆｃ環境中４°
Ｃに保存した。各分画のスライスからのα−鎖は′電気
溶出で溶出させ友。

α鎖のＣＩ’ＪＢｒ　９１断はミラー（Ｍｉｌｌｅｒ　
）の操作（２４）に従って行った。生成したペプチドは
ＳＤＳポリアクリルアミドデル電気泳動に付した。

の多孔性ＨＡ顆粒の走査型電子顕微鏡写真（ＩＭ。

５０Ｘ）を示す。顆粒の多孔性およびその表面のコンフ
ィギユレーションの性質がＢＡ瞭にみられる。

培養２週後、第２図（ｓＥＭ、　２００　ｘ　）および
第３図（ｓｇＭ、５００ｘ）にみられるように、軟骨細
胞Ｂは顆粒Ａの表面を完全に覆った。透過電子顕微鏡写
真（Ｔｌ１１Ｍ　）で培養２週後に鏡検すると、イヌ軟
骨細胞に典型的な細胞内グリコデン小滴０と細胞外コラ
ーデン原線維Ｆが認められる（第４図、ＴＥＭ、６ｔ２
００Ｘ）。

培養４週後に、一部のカルシウム顆粒とそれに付着した
細胞を培養皿から取り出し、横切し、染色して、元顕微
鏡で検査した。第５図はＨおよびＥ染色断面の元顕微鏡
写真（１２５Ｘ）である。

個々の細胞Ｂは暗いスポットとして写真上にみられる。

７１Ｂ＠が顆粒Ｂの表面上で増殖し、多細胞層の形に生
育していることが第３図から明らかである。顆粒Ａは暗
色の境界で囲まれた白色領域として第５図に認められる
が、これは切断時に顆粒がえぐられた穴めである。この
培養段階での他の切片を軟骨マトリックス形成ｌＣ際し
てみられる化合物、酸性プロテオグリカンに％異性のト
ルイジン青染料で染色した。第６図はトルイジン青染色
横断面の元顕微鏡写真（２００ｘ）であり、記号Ｃで指
示したような細胞内領域が暗背色ま几は震色Ｋｍ＜染色
され、これらの領域に酸性ｆロテオグリカンが形成して
＾ることを示している。

この例でｑ培養細胞は生育８力月後に再び検査した。第
７図は元顕微鏡写真（７５Ｘ）で、顆粒Ａ上の細胞層Ｂ
の厚さは顆粒自体の直径とほぼ同じ厚さで、外−は軟骨
に類似する。この組織もトルイジン實染色できわめて濃
厚に染色された。第８図は染色機Ｐ＃面の元顕微鏡写真
（１２５Ｘ）で、記号Ｃで示した領域などは眞（染色さ
れて、もとのカラー写真では暗背色な＾し紫色にみえる
。

培養細胞はさらに生育１１力月後に検査した◇第９囚は
この培養段階における元顕微鏡写真（５０Ｘ）で、細胞
Ｂはこの長期間にわたって生育および分化を続−てＡる
ことを示して＾る。第１０図は第９図の左方部分を１２
５×に拡大し次元顕微鏡写真で、基質の顆粒Ａ上に多重
層に生育した細胞Ｂがさらに明瞭に認められる。

第１１図および第１２図は生育１３力月後の培養細胞の
元顕微鏡写真である。第１１図はトルイジン背で染色し
た細胞培養の切片の１２５倍拡大写真で、軟骨のｉｉａ
ｍに特徴的なマトリックスの形成を示している。第１２
図の切片も同じ（１２５倍拡大写真であるが、この場合
は、軟骨マトリックスの主成分であるコンドロイチン硫
酸を特異的に赤色に染色する？７ランー〇赤で染色しで
ある。

第１１図の青色も同じ化合物の存在を示すが、第１２図
の赤色染色はこの化合物にさらに特異的である。第１１
図および第１２図は、本発明により生育させ几軟骨細凪
は１６力月後もその表現型を保持していることを示して
−る。細胞培養は生育１３力月目の終わりに停止し九が
、さらに長期に　　゛生育を継続できるものと思われる
。

ム（ＳＤＳ　）　ｒルミ熱泳動に付した場合の特徴を示
しｔものである。

ｅ！　１ａ）−軟骨の臓器培養で得られたコラーゲンで
、Ｆ型と同定されている像（ｂ）一本例に従い、多孔性ＨＡ上で８週間培養した
軟骨細胞によって合成されたコラーゲン酸（ＣＪ一本例
で用い九と同じ軟ｔａ胞であるが、プラスチック皿上で
２週間培養した場合に合成されたコラーゲンＲ（ａ）は天然組織からのコラーゲンの家を示してφる
。Ｌｌ！　（ｂ）は本発明に従って培養された軟骨細胞
くよって合成されたコラーゲンのものであるが、その曲
線は像（ａＪの場合とほぼ完全に一致することが明白で
ある。慮（Ｃハエ従来技術における細胞培養系によって
生育させた細胞の合成したコラーゲン酸であるが、これ
らの細胞はｌｆｆ１、Ｂ型および■型；ラーｒンの混合
物を合成したことを示し、織（ＣＪは家（ａ）とｔ工全
（類似していない。

Ｅｌ！　（ａ）と（１））のコラーゲンの同一性ｙａ−
５らにＣＮＢｒ分解で確認し、１５％ＳＤＳデル上で屏
析した。第１６図におけるこれらの２つの鑞の主ピーク
の示す鐵が第１４図である。１型コラ−ｒンのマーカー
ペゾチドであるＣＮＢｒペゾチド１ｏおよび５が本例に
よるＨＡ＠粒上で生育させたサンプルのすべてで最も顕
著なピークとして認められ〔第１４図の慮（ｂ）　３　
、これは天然組織の酸Ｃ第１４図の象（ａ）　］ときわ
めてよく類似している。一方、単層軟骨細胞からのα１
ビークは、Ｉ型およびＩｌ梨コラーデンの混合物である
。

（ｂＪ部ニガ１のこの第２部では、ＴｉＡの焼結顆粒（
前述）と直径が１００μ、５００μ、ｉ、ｏｏ。

μと異なる６ｍのナフタレン粒子とを溶融して、直径７
鴎、厚さ１０のディスクを製造した。細胞、その他のす
べての材料、および培養東件は（８７部の場合と同じと
した。６０１１Ｘ１５鳳菖のペトリ皿にそれぞれ、５０
０μのナフタレン粒子を用いて作つ友ディスク６個をと
り、この上に約５　Ｘ　１０ａ個の軟骨細胞を接種した
。このディスクの孔径は平均約６００〜５００μである
。第１５図は生育６ａ後に撮影した元顕微鏡写真（４０
Ｘ）で、デイスクの一部を示している。ａ肥Ｂ＆Ｘディ
スクの境界付近にも、またディスク表面に近い小孔中に
も多層の厚さく生育していることがわがる。第１６図は
生育１２週後のディスクの横断面の元顕微鏡写真（２０
０Ｘ）で、ディスクＡの小孔内に細胞Ｂが多層の厚さに
生育している状況を示している。１００および１，００
０μのナツタフッ粒子を用いて製造したディスクを細胞
培養の固体基質として用いｆｃ場合も同じ結果を生じた
。（ｂＪ部のディスク上での細胞の生育は、あらゆる点
で（ａ）部の顆粒上での細胞の生育と同一であったが、
ディスクの場合に比べて、顆粒の方が、基質単位重量あ
たりの細胞数が多かつ友。（ａＪ部の顆粒上での培養の
場合の基質率゛位重量あたりの細胞密度は、（ｂ）部の
ディスク上での培養の場合の約１，０００倍であった。

すなわち、（ａ）部における顆粒が大部分の例で優れて
いるものと考えられる。

ウテギ関節軟骨１ｉｉＩＪ肥を列１において用いたのと
同じＨＡ顆粒およびＨＡディスク上で培養した。

生育培地は１０％クシ胎仔血清（Ｆｅ２）および１％Ｐ
ＳＦ補給ＤルＭとり比。培養は顆粒の場合９力月、ディ
スクの場合１０週続け、元顕微鏡およびＳ＆による鏡検
を実施した。結果は欠のとおりであった。

（ａ）　　顆粒−細胞は顆粒上に多層に生育した・生化
学的研究により、細胞はＩｌ盟コラ−ｒノのみを産生じ
之ことがわかった。

（ｂＪ　　ディスク−ｍｆｆｉは増殖し、多孔性ディス
クの内部に移動し−ｚｏ　３ｙｌＬまで多層の細胞組織
が観察された。３５８０．および３Ｈ−プロリンによる
オートラジオグラフでは重い軟骨性マトリックスの形成
が示され友。この観察はＨおよびＥならびくトルイジン
！染色によって確認された。

例　　３ヒト関節軟骨細胞な例１にお匹て用Ａたのと同じＨＡ顆
粒およびＨＡディスク上で培養した。生育培地は１０％
ＦＣ８および１％ＰＳＦ補給ＤＭＥＭとした。両基質の
場合とも、培養を１５週続けた。

この？Ｍ胞は、例１および２の細胞に比べて、−ずれの
固体基質を用いた場合も生育が遅かつ次。培養１０週後
に、約６〜４層の厚さの細胞層が形成し、トルイクン背
染色したところ、横ｒｒ画は暗背色な＾し紫色に染色さ
れ、軟骨性マトリックスの形成を示した。

例　４骨組織は２種の主安部分から構成されている。

細胞性構成部と細胞外構成部である。後者は、石灰化有
機マトリックスからなり、これは容量の点で組織の大部
分を占めるが、その形成および崩壊は細胞性構成部の支
配下にある。細胞性構成部は多様の分化細胞を含み、こ
れらは起源および機能が異なるものと思われる。

骨ａ肥の別個の集団の単離および一次培養の試みは成功
しているが、これらの培養骨細胞は短期間（２週まで）
しが維持されず、その表現型の発現は失われる。

ホーは、単離マウス破骨細胞および骨芽細胞が、本発明
の細胞培養系においては少なくとも１０週まで、その生
化学的研究製の発現が変化することなくインビトロで組
織マトリックスを形成できることを証明するものである
。以下に述べる生化学的測定項目は、アルカリおよび酸
ホスファターゼ活性、副甲状腺ホルモン刺激に対する応
答、コラーダンおよびヒアルロン酸合或である。

（１）材料および方法二本例での培養培地は１０％（”
　／ｖ　）ウマ血清（ＵＳ）　＊よび１　％　（”／ｖ
　）　ヘ二シリンーストレデトマイシンー７アンヤゾン
（ｐｓＦ）補給高グルコース（４，５１１／ｌ　）アー
ルの最少必須培地（ＥＭｇｖ　）とした。これらはすべ
てバイオプロダクツ（Ｍ、Ａ、　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ　）社（Ｗａｌｋｅｒｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　）から購
入した。

ペプシン（ＰＭ級）、；ラーゼナーゼ（ＩＷ）およびト
リプシンはウアーゾントン・バイオケミカルズ（Ｗｏｒ
ｔｈｉｎｇｔｏｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）から
、ＳＤＳ電気泳動用試薬はビオーラツげ・ラボラトリ−
（８ｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）から購入し
友。アクアゾルおよびＣ２１３−３Ｈ］ゾロリン（３０
〜５０ｃｉ／ｍ　Ｍｏｔ）はマージャム（Ａｍｅｒａｈ
ａｍ、　Ａｒｌｉｎｇ−加ｎＨθｉｇｈｔｓ、　ＩＬ　
）から入手した。ファルコン培養板はベクトンーデイカ
ーンイ（Ｂｅｃｔ＋ｏｎ−Ｄｉｃｋｅｒ−ｓｏｎ、　０
ｘｎａｒｄ、　ＣＡ　）の製品である。

この列の細慮培養には、２徳の多孔性ＨＡ固体基質、ナ
なわ）（１）均一なサイズ、約５００μに篩過したＨＡ
順粒、および（２）直径約７Ｂ、厚さ１鵡のＨＡディス
クを用いた。これらは、それぞれ何１の（ａＪ部および
（ｂ）部で用いたのと同じ基質である。

使用前に基質を工超音彼処理により洗浄し、オートクレ
ーブ中１２１℃で３０分間滅菌した。

（２）細胞培養ニルーベン（Ｌｕｂｅｎ　）ほかの記載
（２５）に従い、マウス（ＣＤ−１）新生仔の頭蓋冠を
Ｍ　１１１逐欠酵素消化して、破片ｆ４［１（ＱＣ）お
よび骨芽細胞（０ｍｍ）の細胞楽団を得た。ＯＣおよび
０ｍｍ細胞は、それぞれ、消化の第２および第３期（集
団２および６）と第５および第６１４ＡＣ集団５および
６）に遊離した細胞からなる。

生育東件は、ＤＭＥＭの代わりにアールの最少必須培地
（ｇＭＥＭ　）を用い之はがは、例１において採用した
のと同じとした。

缶化＾究においては、旧来のプラスチック皿（ファルコ
ン皿）で生育させるＱＣおよびｏＢの細胞培養を同時に
行い、顆粒化ＨＡ上で生育させた場合と比較した。

一ゼの測定はウオンほか（Ｗｏｎｇ　ａｎｄ　Ｃｏｈｎ
　）によって略述された方法（２９）に従って実施し友
。ヒアルロン酸合成の試験には、ｏＣおよび０ｍｍ細胞
を３Ｈ−グルコチミン（２μＣｉ／ｍＡｉ）の存在下に
２４時間インキエベートとして標識した。精製およびヒ
アルロン酸産生の測定はシエウン（Ｃｈａｕｎｇ）ほか
の操作（２６）に従って実施した。

コラ−２７合底の測定にはＱＣおよび０８両細胞を、’
Ｈ−ｆａすｙ　（１Ｑ　４０１７ｍ　）、ｋ：”ｐミ；
／Ｃ（５０βＩ／１ｉｌｌ　）　、ＢＡＰＮ　（１００
μＪ／ゴ）、１０％ＦＣ８および１％ＰＳＦ含有Ｅ原瀉
５ｄ中で標識した。

２４時間インキエベートしたのち、細胞層を培地から分
離し、トリゾシン処理し、細胞数を血球計数器で測定し
た。細胞を超音波処理し、培地に一トリス塩酸塩（ｐＨ
７，５）をき有する浴液で２ｄＫ希択し、４℃で同一の
緩衝液に対して大規模に透析した。透析されなかったカ
ウント数を、総コラーｒンおよび非コラーゲン蛋白合成
の目安として用いた。

コラーゲンは′ｎＩ製バクテリアコラーデナーゼによっ
て消失し、可ｍ化された放射能により測定した。コラー
デナーゼ市化優に残った放射能は非コラーゲン蛋白とし
次。

（４）Ｍ果：第１表には、ノラステツクペトリ皿および
ＨＡ顆粒上で生育させたＯＣおよびｏＢ［ｊＨのアルカ
リおよび酸ホスファターゼ活性をまとめ次。ホスファタ
ーゼ活性および両ホスファターゼの間の比率は、培養１
ｍ後では両固体基質の場合とも類似している。第１表の
１列および４列の値は、他の研究者の報告している値（
２６）とよく一致する。しかしながら、培養ｉｏｉＭ後
には、ＨＡ職粒上で生育させ７ｔＭｌｔａは依然とじ【
同レベルのホスファターゼ活性な維持しく第１表３列お
よび６列参照）、なお表彰型の発現が保持されて＾るこ
とを示している。しかし一方、プラスチック皿上で同時
に培養した細胞は、３週後に死滅した。

しかも、ルーベン（Ｌｕｂｅｎ　）ほか（２５）はプラ
スチック皿で１週培養したのちには酸ホスファターゼ／
アルカリホスファターゼ比は急速に低下すると報告して
いて、換言すれば、細胞がその表現製の発現を失うこと
が知られてＡる。

第２表には、プラスチックペトリ皿およびＨＡ顆粒上で
生育させ７’ＣＯＣおよび０ｍｍ細胞によるヒアルロン
酸およびコラーダンの産生をまとめる。

第２表の列１．２．４および５に示すように、１週後で
は、培養基質に関係な（、値はほぼ同じである。しかし
ながら、ＨＡ顆粒上で生育させた細胞は第２表の列３お
よび６に示すように培養１０週後も同レベルのヒアルロ
ン酸およびコラーｒン合成を維持してｉるのに対し、ｆ
クスチック皿上で虫胃させ次細胞は２週後愕は死滅し始
めた。どの培養の場合のヒアルロン酸およびコラーｙｙ
産生レベルは文献１直（２９，３０）とよ（一致してい
た◎ １週および１０週後、セラミックス中で生育させたＯＣ
？Ｉ細胞の合成した総蛋白の約５％、０ｍｍ細胞で約１
２％がコラーダンに相当する（データは示していな−）
。この値も文献値（２８）によく一致する。

ＨＡ＠粒上でのＱＣおよび０ｍｍ細胞培養の元顕ｉ鏡に
よる鏡検では、第１７図に示すよ５に、２４週培養後、
顆粒表面上に多層の細胞の生育が認められ友。ＨＡディ
スク上でのＱＣおよび。Ｂ細胞培養でも、表面上べ多層
の＃ｌ胞が発育し、さらにディスクの小孔内への細胞の
移動および生育が一察された（第１８図、培養１２週後
の元顕微鏡写真参照）。

例　　５りｔギ破骨細胞（０ｍｍ）を列１にお＾て用いｆＣＨＡ
顆粒およびディスクの両基質上で培養した。生育培地は
、１０％（ｖ／ｖ　）　Ｆｅ２　オヨヒ１％（ｖ／ｖ）
Ｐ８Ｆ補給ｇＭＥＭとし友。細胞培養を１ｏ週続ｆｆた
〇顆粒、ディスクいずれの固体基質でも、組織の多細胞
層が観察された。解析の結果、両培養における０ｍｍ！
胞は■戯コラーｒンのみを産生じ、この細胞がその表現
型を維持していることが明らかにされた。７オン・力？
（ｙｏｎ−Ｋａｓｓａ　）染色で、多細胞組織中の石〆
社認められながった。

例６〜９は、本発明の固体基質による線維芽細胞のイン
ビ）ａ培養を例示する。例６および８では例１に用＾た
ＨＡ顆粒およびＨＡディスクの両者を用い、例７および
９では例１に用いたＨＡ顆粒のみを使用した。ガロおよ
び８での培養培地は、１０％（ｖ／ｖ）Ｆｅ２および’
ｌ　％　ＰＳＦを補充したＤｕＭとし、′例７および９
で培養培地は１０％（Ｖ／Ｖ）ウマ血清および１％（ｖ
／ｖ）　ＰＳＦを補充したＥＭ■とし友。結果を以下に
安約する０例　　６つ？ギ骨膜線維芽細胞を１０週間培養した。細胞には各
週２回、栄養素を供給した。元顕微鏡による鏡検の結果
、（ａＪ５週までに、ディスク型のＨＡ基質の小孔の内
部に細胞が充滴し、ディスク表面に多細胞層となって生
育していた、（ｂ）２週以内にＨＡ顆拉の表面上に多１
ｆａ胞層を形成して４友。

１０週の培養期間を通じて多細胞層は生育を続け、厚（
なっていった。

例　フイヌ半月線維芽細胞をＨＡ顆粒上で培養したところ、２
週以内に多細胞層を形成し、培養を続は九８週を通じて
層は生長を続け、厚（なっていった。さらに、８週の全
培養期間、細胞は培地中に半月コラーデナーゼを分泌し
続けた。これに対して、プラスチックペ）ＩＪ皿を用い
るほかは同一条件で同時に培養した同じ細胞は１週間の
培養後にこの酵素の分泌を停止した。

ｌ１８ヒト包皮線維芽細胞をディスク型のＨＡ基質を用いて１
０週間、顆粒型のＨＡ基質を用いて６力月間培養した。

細胞は両型の基質上できわめて良好に生育した。多細胞
層は第１週末までにみられ１、。

全培養期間を通じてその厚さは増加し続は比。細胞蛋白
質１１ｎ９あたりのコラーデン合成は、基質としてプラ
スチックペトリ皿を用いて同一条件で同一細胞を生育さ
せた場合に比べ、はぼ２倍に達し次。

同　　９マウス（ＣＤ−１）皮膚線維芽細胞を５週間培養したう
ｍｌ胞はＨＡ顆粒上できわめて良好な生育を示した。第
１週の末までに顆粒上に形成され次長細胞層は、全培養
期間を通じて厚さが増大し続けた。本例での培養細胞の
蛋白生成物の合成速度（ＴＣＡ沈殿分画への３Ｈ°−グ
リシンの取り込みによって測定）は同じ細胞をゾラステ
ックペトリ皿上で生育させた場合の２倍であった。

例１０および１１には、本発明の固体基質上でのその他
の種類の細胞の生育を例示する。

例１０つ？ヤ滑液細胞を例１のＨＡ頼粒およびＨＡディスクの
両者の上で培養した。生育培地は１ｏ％（ｖ　／ｖ）　
Ｆｅ２　オよび１％（ｖ／ｖ　）　Ｐ８Ｆ補給ＤＭＥＭ
とした。綱胞培ｉｔ工１０週間続け、この間、各週２回
栄養素を供給した。元顕微鏡による鏡検と組織学的検討
を行った。両型のＨＡ基質表面上に多細胞層が生育し、
層の形成は培養第２週までに明白となり、１０週の培養
期間を通じて厚さが増大し続けた。清液細胞と線維芽細
胞は最も早＾生育速度を示すように思われる。

ｆ！ｌｉｉハムスター新生仔腎臓細胞〔８匹−２１、アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ
　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、
　Ｒｏｃｋｖｉ−１１ｅ、　ＭＤ　）より購入〕を例１
のＨＡ顆粒上、１０％（ｖ／ｖ）Ｆｃｓおよび１％（Ｍ
／ｖ）　ＰＳＦ補給ｇＭＢＭ生育培地を用いて生育させ
た。培養は４週間続けた。この場合も、培養第２週の末
までに顆粒表面の周囲に多ａ胞層を形成し、４週の培養
期間を通じ、この多細胞層の厚さは増大を続けた。

例１２別の笑験で、臓器培養して生育させたイヌ手刀ＭＡ維芽
細胞が組織特異的な中性蛋白分解酵素、コラーｒナーゼ
を分泌することがわかっていた。牛刀白米の４久培養細
胞をプラスチック皿を固体基質とし″Ｃ培養する典型的
な従来技術でに、蛋白分″ｐｓｅｘコラーゲナーゼの分
泌による表現ｍ発現に１わずか２週後までしか維持され
なかった。以後、細胞の融合により、表現蛍の発現は停
止する。二次縞代ｉａＭ＆をプラスチック皿固体基質上
で培養した場合に、蛋白分解酵素、コラ産生ナーゼ１１
：意生せず、その表現型の発現は維持されていない。

本例では、インビトロ細胞培養の固体基質とし℃のＲ＠
カルシウムの有効性を示し、この基質上で生育させた細
胞は長期間にわたりその表現型発現を維持することを確
証するものである。

不例での細胞培養に用いた固体基質はオムヤ・インコー
ポレーション（Ｏｍｙａ工ｒｈａ、）ｇの炭酸カルシク
Ａｍ粒〔ブロクター（Ｐｒｏｃｔｏｒ　）　、Ｖ　’］
’０５７６５）からなる。炭酸カルシウムの化学分析か
ら、この顆粒はＲ酸カルシクム９８チ、炭酸マグネシウ
ム１チおよび他の酸不溶性成分１チからなることがわか
っている。この顆粒を蒸留水で十分洗浄し、ついで粗粒
ｔ／９５チェタノールおよびアセトンで洗浄して水を除
去した。次に顆粒をに乾し、篩遇し、粒子径０−（１５
ａｃ以上の顆粒（＆！子径の上限はｌＪｏ、ＩＱ鵡）ｋ
本例の固体基質として用いた。粗粒ｔＨ１音波処理によ
り洗浄し、オートクレーブ中１２１　’Ｑで３０分間訳
菌し、各回５分間特定のメゾクムで２回洗浄しＣ残った
破片を除去し、細胞培養に用いるまでそのメシクム中に
保存した。本例で用いた細胞に、全牛刀ｔチェクングほ
か（Ｃｈｅｕｎｇ　ａｎｄ　Ｂｙａｎ　）　Ｏ方法Ωに
従って逐次酵素消化して得られた４久および二久半月巌
維芽Ｍ胞である。本例に用いた培地は１０９ｂＨＢおよ
び１　％　Ｆ８１Ｆ補給Ｄｎ１ｍ［トＬ　タ。

６０ｍ／１５ｘｘのペトリ皿中約５００〜１，０００　
　　′９の炭酸カルシウム粗粒上に、約５Ｘ１０５個の
細胞を接種した。谷皿に生育培地４−を加え、培１１物
’ｔ−Ｇｏ２インキ為ベーター〔ホルマ・サイエンティ
フィック（］Ｆ’ｏｒｍａ　１３ｃｉｅｎｌｆｉｃ　）
　、　Ｍａｒｉｅｔ：ｔａＯＨ）中に置き、１週に２回
培地を変換した。細胞培養２週目の末までに炭酸カルシ
ウム顆粒は多１１ｍ１ｊＡ層で榎われた。培ｇ＃を１２
週間続ヴだ。この停止時まで、培養期間１２週を通じ℃
多細胞生育の継続が観察された。帛１９図は、培養１２
遍目の末に採取した本例の培髪細胞の元顧微鏡写真（７
５Ｘ）であり、炭酸カルシウム基ｌｘｈ記号ムで、多細
胞層は記号Ｂで示し℃ある。第２０図およびｍ２ｉ図は
、不例の細胞培養のＥおよびＥ染色切片Ｏ元顕微鏡写真
（１２５Ｘ＊よび１５０Ｘ　）であり、多細胞層の細胞
生育をざらに明瞭に例示するものである。

本例の／ｌａ＆＆培養は、その表現並発現の維持能、す
なわち最初に述べた蛋白分解酵素、；ラーｒす＝ゼの解
析によつ℃検査した。−久半月細胞は、その我机抛発現
を、本例の条件下での１２週間の培養期間を通じ℃維持
することが明らかにされた。

ざらに二次継代半月細胞も、−次細胞培養の場合の約４
０％のレベルに低下し℃いるものの、培養６週後の試験
では表現星の発現を維持していた。

二次細胞については６週以後の試験は行っていないが、
ひき続き表ｆＡ［’発現し℃いるものと考えられる。本
例におゆるイヌ半月臓維芽ａ胞による；ラーｒナーゼの
産生な、同じ細胞を従来技術におけるプラスチック皿固
体基貿上で生育させた場合と比軟し℃、第６表に示す。

結論以上、新しい固体基質を用いるインビ）Ｅ２Ｍｌ＆Ｌ培
養系ｔ−開示したが、こハル細胞培養系を使用する学術
分野および工業分野の両者に、きわめて有益かつ有用な
結果をもたらすものである０第３表異なる基質上で生育させたイヌ半月細胞の；ラーグナー
＋ｐ産生一次培養　プラスチック　　　２ａ　　　　０．９±０
．２ＣａＣＯ３２４ＩＩＩ定せ丁６週　　　０．６±０．３１２過　　　１．１±０．４二次培養　プラスチック　　　２遍　　　　　　０Ｃａ
ＣＯ（５２週　　　０．３±０．１６１［０，４±０．
２本発明による足場依存性曙乳類細胞のインビトロ培養用
＊＊固体基質にな、細胞に対して非毒性のマイトジェン
カルシウム化合物が包含される。

カルシウム化合物は、足場依存性細胞が培養中にその上
で生育する同体とし℃用いられ、顆粒またに固形体の形
状とすることができる。顆粒とじた場合、カルシウム化
合物の粒子径は少なくとも約０４０５０麿（約５０μ〕
とナベきであり、これは固体の最大方向くおける平均粒
子径が少なくとも約０・０５０Ｂであることを意味する
。粒子の形状は不揃いでも、均一でもよい。最少粒子径
は、足場依存性ｊ１１１胞の生育を支持するのに十分な
表面積をもつ固体基質な提供するための要求である。粒
子径が約０−０５０　ｘｘ〜０．１０　ｍｏ執粒戯力Ｊ
７７クム固体基質がとくに有用であることが明らかにさ
れ℃いる。

固形体の、形で用いる場合、カルシウム固体基質は、た
とえばガ１で用いたような任意に選択された大きざのデ
ィスク友形状とすることもできる。

しかしながら、固形体は他の多くの；７フイイレーシヨ
ンとすることも可能で、たとえは皿、７ラス；またに、
細胞を遍歯な培地とともにその中で生育させるその他の
容器の形状とし℃もよい。ま　　また、固体基質は、細
胞培養容器のライニングの形とし℃提供することもでき
る。固形体は、細胞の生育に利用できる表面積を増大さ
せるために不規則なまたは織り上げた機部を形成させ℃
もよい。

さらに、カルシウム固体基質は、多孔性またに非多孔性
形状で使用できる。現時点で好ましいカルシウム固体基
質には、リン酸カルシウムのヒドロキシアパタイトまた
はリン酸三カルシウム製の多孔性顆粒、これらのカルシ
ウム化合物の顆粒を成製して褒遺したリン酸カルシウム
の多孔性ヒドロキシアパタイトまたはリン酸三カルシウ
ム急の固形体、ならびに炭酸カルシウムの非多孔性顆粒
または固形体が包含される。

本発明のインビトロ培養系によって達成された独特の細
ｊｌｉ！主育脣性の＆Ａ樽に関する％肩な理論は現時点
では不明である。しかしながら、本発明に至る以前の研
究（３１−５８，４２）により、Ｈムの結晶（大きさが
ｏ、ｏ　ｏ　ｉ鵡、すなわち１μ以下）およびＥムの結
晶塊（大きさの範囲ｏ、ｏ　ｉ　ｏ〜０−０２０　ｘｘ
、すなわち１０〜２０μ）を、インビトロ系で単層に生
育している哺乳類細胞に添加するとマイドゾエンとじ工
作用し、；ンビテント生長因子とし℃、血小板由来の生
長因子（６１−３３Ｊとよく似た細胞の増殖刺激作用を
示すことがわかっていた。また、インビトロ系の単層に
４５ＣａＨａ結晶を加えると、それはイヌ滑液線維芽細
！ｉ＆（３４゜３５）、ヒト包皮蔵維芽細胞および単球
（３６）、ならびにネズミ骨細胞およびマクｃＩ７アー
シ（３７）によって捕食されることが知られている。ａ
胞内でのカルシウム化合物の作用に関する他の研究者の
発表では、細胞内カルシウムイオンの増加は細胞増殖に
関連し、また多分それを惹起することが示され℃いる（
３９Ｓ−４１Ｊ。本発明のカルシウム固体基質の作用に
ついて考えられる機４１１は、このカルシウム固体が結
晶の捕食ついで二択うイソゾームの酸性環境におゆる可
溶化により溶解する；可溶性の核種がライシームから細
胞のａ泡質ゾルへ拡散するかまたはポンプで輸送され、
その結果、細胞内カルシウムイオンＣａ績度が上昇しＣ
３８）　；多分、細胞増殖を起こす（３９−４１Ｊと説
明できる。

しかしながら、現時点では、これに固執するものではな
いし、またこの機構によって本発明が限定されるもので
もない。上述の過程は、以下の証拠によつ℃支持される
。すなわち（１ンリン酸４５Ｃ，は調整培地では可溶化
されないが、［ｉｌが存在すると可溶化される；　（Ｍ
）　’）ン駿カルシウム結晶集塊は、巌維芽ａ胞の添加
後１時間以内であれは、透過電子餉微競によりａ胞内良
に囲まれた液胞中に認められる（３５．４２）　；　（
ＩＩＩ）ヒドロキシアパタイトの物理的溶解率な−の低
下に伴い上昇しく２１）、培養繊維芽ｒａ＠（４３，４
４Ｊはライソゾーム内の−を細胞外メジウムの−よりも
低く床付する、Ｑｖ）２種の同ラインシーム１台イオン
、クロロキンとアンモニアにｆｄム浴屏な著しく阻害し
、またりン戚カルシウムｌｆｌ晶防発マイトジェン応答
ｙａｌ−選択に阻害する（６８）などである。単層細胞
培養への刀ルシウムイオン、ＨＡ結晶またはＨＡ結鵡塊
の、添加に圓連した文献（６１〜４４）のいずれにも、
本発明の多ａ胞層粗胞生育特注につい℃触れるもの鉱な
く、上に推騎した以外の機構が本発明のインビトｅＩＩ
ＩａＪ胞培養系の特徴に関与する可１と性も考えられる
。

例に記載したデータは本発明のマイトシエンカルシクム
固体基質が従来のｆｔｆｌ胞系に比べ℃新しいコンフイ
ギ二し−ションで細胞培養をサポートする機能をもつこ
とを確証するものである。本発明やインビトロ細胞培養
法のカルシウムＦｉＪ体基質は特異的に、厚い多くの＃
ｌ胞層として、すなわち従来技術におげろ単層の細ＪＩ
＆生育で鉱なく多細胞層としての＃ｌ胞生育を促進する
。これは、インビトＩ：Ｉ細胞培養系における最初の結
果ｙｉ！−教示するものである。

第二に、例に記載したデータは、不発明方床のマイトジ
ェンカルシウム固体基質上で生育させた細胞がその我机
ｔｍを維持し、その表現型の発現は細胞培ｇＩＭ閣を通
じて保持されることを確証するものである。これは従来
技術の固体基質上で薊胞乞生育した揚台にしばしば認め
られる状況とは著しく対照的である・従来技術のシステ
ムで鉱、細胞は一般にその表現型の発現を維持しないか
、維持したわずかな例でもざわめて短時間しか持続し　
　　゛ないからである＠第三に、例に示したデータは、本ＪＡ嘴の方法における
カルシウム固体基質を用いた？＃Ｂ施培養でに、著しく
長期にわたり、例１に示したように少なくとも１３力月
は＃ｌＪＩ＆培養を継続でさることを確証するものであ
る。これまでの研究からは、本発明の同体基質を用いて
培養すれは、さらに長期間、細胞の生育を継続できるも
のと推察される。これもｔ従来技術における基質でにａ
胞の主育可範期間がきわめて短かったことから、著しい
進歩である。大部分の従来のシステムでは細胞培養μ２
週間またはそれ以下で、融合状態に到達してしまう。

不発明方床のカルシウム固体ｈＪＸｗ用いたインビトｏ
ｌｆｄ胞培黄な、現在、学術的に貰たく工業的に用いら
れ℃いる細胞培養の目的のすべてについて）ｊｉＴ用で
ある。ヒトの択恵の研究、診断および治療の両者に必須
なＭｉ胞の構造および形態にｙｉｉ運の研究線、ａ胞が
その表現型を維持する細胞培養系が利用可能になったこ
と忙より、今後の進歩が期待される。また細胞を多？Ｉ
ａ胞層に生育させることが可能になったことは、培養細
胞をｍ織または組織様コンフイイニレーションで取扱え
る点でＸ要な因子である・さら釦、本発明の細胞培養系
において生育させた組織を、組織移植に治療的に、たと
えば例１においてＮ！警した軟骨１ｌｉｆｉ胞を関節炎
の治療に、またガ９Ｉ／ｃおいた培養した皮Ｓ嶽維芽側
胞を皮膚移植に使用できる可能性も考えられる。

本発明の細胞培撃系は細胞産生物、たとえば代謝物、ホ
ルモン、ウィルス産成物、ワクチン、インターフェロン
およびも植の細胞成分、核ａ細胞腹などの製造に；ｌ′
ＩＩ用できる。この点に関し、矛ａＩｊ＆膚への生育の
ため大蓋の細胞の培養が可能となって細胞産主物の大意
ミ産に利用でざること、また従来の典星的な諌作のよう
に、２ないし３過もしくはもつと短期間に新しく培養を
や９直す必要がなくＸＮＪＩ＆培養を長期間にわたって
維持でざるので細胞庭生物の装造コストを著しく低減で
きることが明らかである。すなわち、本発明の細胞培養
法において、表現型を維持した細胞の大量（多細胞鳥）
生育が可能なこと、および長期間培養の継続が可能なこ
とは、粗胞ｉ＠養系の研究的および工業的７！′ａ用に
真人な／Ｆ′ＩＩ点ン徒供するものである・本発明にお
けるインビトロａ胞系に用いられるカルシウム固体基質
は、市販されている任意の培養容器、たとえばペトリ皿
、７゜ラス；、回転瓶等の中で使用できる。カルシウム
固体基質は容器中、適当な培地ととも和装置させておい
てもよいし、運動させておいてもよい、現在、様々な培
養培地が市ａされているが、現在使用され℃いる任意の
栄養生育培地、すなわち、培養が所鼠の待足の表机型Ｍ
胞の庄育を支持する培養培地が、本発明のカルシウム固
体基質とともに使用できる。培地は培養容器内に静置さ
せ′Ｃおい℃もよいし、容器中を循環させ℃おい℃もよ
い。不発明のインビトロ系でのＭ胞の住胃は、培養容器
内を直接顕微鏡で鏡検し℃モニターすることもできるし
、また固体基質の一部を培養容器から取り出し、適当な
特異的染料で染色し、ついで顕微鏡で鏡検することもで
ざる。本発明のカルシウム固体基質から培養細胞を遊離
させることが、二次培養のためあるいに細胞を生化学的
に屏析するために必要な場合は、本技術分野で通常用い
られるキレート剤たとえばＣａ”　ｚ　Ｍｇ”　’ｔ’
含まない生理的緩衝−ｊ＃、塩水中０．０５チＪｉＤＴ
ム、または蛋白分解酵素たとえは０．０１％（ｗ／ｖノ
ドリプシンもしくはコラ−ゲナーゼを使用して行うこと
ができる。細胞の遊離および二次培養の操作に、現在公
知の基質を用いた二次培養における遊離に現在使用され
℃いる操作と同じである。しかしながら、本発＃！Ａｏ
細胞培養系の他の利点は、細胞が付着し℃いるカルシウ
ム固体基質の一部を堰９、こ７′Ｌを新たなカルシウム
固体基質に加えるだけで二次培養が可能なことであるＯ
この操作に、試薬な機械を必要とせず、その通程で障害
を受ける細胞も少ないという利点がある。細胞外産生物
の収穫に際しＣは、本発明のカルシウム固体基質を用い
たＭＡ胞暗培養培地を培養のある時期に＊’）出せは、
１細胞外産生物を収穫できる。

以上、本発明を特定の態様について説明した。

しかしながら、以上述べた態様には多くの改変が可能な
ことにＭ胞培養や技術分野における熟練者　　　゛・に
は自明のとおりである。これらの本発明の真の精神およ
び範囲から逸脱しない容易ＫＭ到でざる匈示的態様の改
変は、本発明の範囲に包含されるものである。

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　ト　ロ　（工ｎ’７ｉｔｒｏ　　）、　　　１　９　
　：　　２６０（４ｊ　７アン・ウエツエル（ｖａｎ　
Ｗｅｚｅｌ）　ニゲラウス・オプ・セル・ストレインズ
・アンド・プライマリ−°セル°オン・マイクロキャリ
アーズ・イン・ホモゾニアス・カルチャー（Ｇｒｏｗｔ
ｈ　ｏｆ　ｃｅｌｌｓｔｒａ工ａｓ　ａｎａ　ｐｒｉｍ
ａｒｙ　ｃｅｌｌａ・ｏｎ　ｍ工Ｃｒ０Ｃ５Ｌｒｒｉｅ
ｒ６１：ｕ　ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕａ　ｃｕｌｔｕｒｅ
　）　、ネイチャー（ＮｉＬｔｕｒす。

２１６；６４〜６５（１９６７〕（５）７アン・クエツェル（ｖａｎ　ｗｅｚｅｌ、　Ａ
、Ｌ、）　：メソズ・アンド・アプリケーションズ・オ
ブ・ティシュ−・カルチャー（Ｍｅｔｈｏｄａ　ａｎａ
　Ａｐｐｌｃａｔｉ　−ｏｎｓ　ｏｆ　Ｔｉ５ｓｕｅ　
Ｃｕユｔｕｒｅ）、７カデミ、ツク・プレス（ムａａｄ
ｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｖｒ　Ｙ
ｏｒｋ）１９７３゜（６）　　マイクロキャリアー・セル・カルチャー、プ
リンシプルズ・アンド・メンズ（Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉ
θｒＣａｌユ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　、　　Ｐｒ工ｒｈａ工
ｐｌｅａ　　ａｎｄ　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　、　　７　
ア−マシア°ファイン・ケミカルズ・ニー・ビー（Ｐｈ
ａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｓ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓム、Ｂ
、）、１９８１（７）　７パード（ｌ１ｕｂｂａｒａ、
　ｗ　）　；　１９７４　、　　フイシオロギカル・カ
ルシウム・ホスフェート・アス・オルソペデイック・バ
イオマテリアルズ（ＰｈｙａｉｏｌｏｇｉｃａＩＣａＩ
Ｃｌｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ　４ａｏｒｔｈｏｐｅ
ａｉｃ　ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌａ　）　、　−＋ｒル
ケット大学学位論文（Ｐｈ、　Ｄ、　Ｔｈｅｓｉｓ　、
　Ｍａｒｑｕｅｔｔｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）（８）
デグルー）　（ｄｅＧｒｏｏｔ　）　：バイオセラミッ
クス・オフ・カルシウム・ホス７エー）　（Ｂｉｏｃｅ
ｒａ−ｍｉｃｓ　ｏｆ　Ｃａｌｃｉｕｍ　Ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ　）　、シーアールシー・プレス°イン；−ボレ
ーション（ＣＲＣＰｒｅｓｓ工ｎＱ、、ｌ、１９８３゜（９）／ラグスｚｆ　−ン（Ｋｌａｇｓｂｕｒｎ、　Ｍ
、）：１９７９゜ラージ・スケール・プレバレージョン
・オシ・；ンドロサイツ（Ｌａｒｇｅ　５ｃａｌｅ　ｐ
ｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅａ
、、）　、メンツズーインーｘ７デイモロシー（Ｍｅｔ
ｈｏｃＬｓ　ｚｎｚ７ｍｏ１．）　、　　５５　：　５
６０〜四　ノ：ｒＩ：＋７ほか（５ｏｋｏｌｏｆｆ、　
Ｌ、Ｃ，、Ｊ、ｎａｌｅｍｕｄ６　Ｗ、Ｔ、　Ｇｒｅｅ
ｎ、　Ｉｒ−）　　：　１９７０−　　Ｔルアエート・
インコーポレーション・パイ・アーチ・イキュラー・；
ンドロサイツ・イン・モルイヤー・カルチャー（５ｕｌ
ｆａｔｅ　１ｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ　ｂｙ　ａｒｔ
ｉｃｕｌａｒｃｏｕｄｒｏｃｙｔｅｓ　ｉｎ　ｍｏｎｏ
ｌａｙｅｒ　ｃｕｌｔｕｒｅ　）　、　アースライテイ
ス°アンド・リューマドイド（ＡｒｔｈｒｉｔｉβＲｈ
ｅｕｍＪ　、　　１　３　　：　　１　１　８〜１　２
４α刀　スリパスタパほか（１３ｒｉｖａａｔａｖａ、
　Ｖ、Ｍ、Ｌ、。

Ｃ，、；Ｔ、ｎａｌｅｍｕｄ　＆　Ｌ、５ｏｋｏｌｏｆ
ｆ　）　：　１９７４．　：ＳノドΩイト・エクスプレ
ッション・パイ・レイビン・アーテイキュラー・コンド
ロサイト・イン・スピナー・カルチャー・ホローイング
・モルイヤー１グラクス（ＣｈｏｎｃＬｒｏｉｉ　ｅｘ
ｐｒｅｓｓ工ｏｎ　ｂｙ　１ａｐｉｎｅａｒｔｉａｕｌ
ａｒ　ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ　１ｎｓｐｉｎｎｅｒ
　ｃｕｌｔｕｒｅｆｏ：ＬＩＯＷｉ、ｎｇ　ｍｏｎｏｌ
ａｙｅｒ　ｇｒｏｗｔｈ　、ティッシュ−６リサーチ（
Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｒｅａ、）、　　２　：　１２７〜１３
６＠　トリツペルｔミか（Ｔｒｉｐｐｅ工、　Ｓ、Ｂ、
、　Ｍ、Ｇ、Ｋｈｒｌ工ａ。

Ｌ、Ｌｉｐｐｉｅエユｏ　　＆ｌ　　Ｈ，、Ｔ、Ｍａｎ
ｋｉｎ　　）　：１９８０．　　キャラクタリゼーショ
ン・オシ・；ンドΩサイツ・７ラム・ボパイン・アーテ
イキュラー・力・−ティレージ、工、メりポリツク・ア
ンド・モルホロジカル・エクスペリメレタル・スターデ
イズ（Ｃｈａｒａ−。

ｃｔｅｒｉｇａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔ
ｅｓ　　ｆｒｏｍ　ｂｏｖｉｎｅ　　　　　　’ａｒｔ
ｉｃｕ：ｌ、ａｒ　　ｃａｒｔ工：Ｌａｇｅ、　　工、
ＭａｔａｂＯ１ｉｃ　　ａｎｃＬ　ｍｏｒｐｈ−０１０
ｇｉＱａユｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　５ｔｕｃｋ工ａ
ｓ）、ジャーナル・オシ・ボーン・アンド・ジヨイント
・サージエリ　−　（；ｒ、　　Ｂｏｎｅ　　ＪＯｉｎ
ｔ　　Ｓｕｒｇ、）　　、　　　６　２　−　ム　：　
８１　６〜８２０峙　工）ｆ−ｒほか（Ｏｅｇｅｍａ、　Ｔ、Ｒ，Ｊｒ、
　＆　Ｒ，Ｃ，Ｔｈｏｍ−ｐｓｏｎ、　Ｖｒ、）　：　
１９８１　、キャラクタリゼーション・オシ・ア・ヒア
ルロニツク・アシズーダーマタン°フル７エート・プロ
テオグリカン・コンプレックス・７ラム°デデイ７アレ
ンシエイテツド・ヒユーマン・コンドロサイト・カルチ
ヤード（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　Ｏｆ　ａ
　ｈ７ａｌｕｒｏｎｉｏ　ａｏｉ（Ｌ　−ｄｅｒｍａｔ
ａｎ　５ｕｌｆａｔｅ　ｐｒｏｔａｏｇｌｙｃａｎ　ｃ
ｏｍｐｌｅｘ　ｆｒｏｍｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔ
ｅｄ　ｈｕｍａｎ　ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ　ｃｕｌｔ
ｕｒｅｓ）。

ジャーナル・オシ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ
、Ｂｉｏｌ、ＣｈｅｍＪ、　２５６　：　ＩＬ１１５〜
１０２２圓　オカヤマｆ、よか（Ｏｋａｙａｍａ、　Ｍ
、　、　Ｍ、　Ｐａａｉｆｉｃｉ　＆＋Ｈ，ＨＯｌｔＺ
ｅｒ　）　：　ｌ　９７６．ディ７アレンシズ・アマン
グ″丈ルアエイテッド・プロテオシリカンズ・シンセサ
イズド°イン・ノンコンドログニック・セルズ・グレサ
ンプテイブ・コンドログラスツ・アンド・コンドロブラ
スツ（Ｄｉｆｆｅｒｅｎａｅａａｍｏｎｇｓｕｌｆａｔ
ｅｄ　ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎａ　５ｙｎｔｈｅｓｉ
、ｚｅｄ　ｉｎｎｏｎｃｈｏｎｃＬｒｏｇｅｎｉｃ　　
ｃｅｌｌｓ　、　　ｐｒｅａｕｍｐｔｉｖｅ　　ｃｈｏ
ｎｄｒｏ−ｂｌａｇｔｓ、　ａｎｄ　ｃｈｏｎｄｒｏｂ
ｌａｇｔｓ　）　、プロシーデイングズ・オシ・デ・ナ
ショナル・アカデミ−・オシ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、ムｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　。

７３　：　３２２４〜３２２８（１５１７オン・デル”ｆｆ−り（ｗｏｎ　ａｅｒ　Ｍ
ａｒｋ、　ＩＣＪ：１９８０、イミュノロジカル・スタ
ーデイズ・オン・；ラーグン・タイツ−トランジション
・イン・；ンドＣ！グネーシス（工ｍｍｕｎｏｌｏｇｉ
ｃａｌ　ａｔｕｄｉｅｓｏｎ　ｃｏ↓：Ｌａｇｅｎ　ｔ
ｙｐｅ　ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ　ｉｎ　ｃｈｏｎｄｒｏ
ｇｅｎｅａ　−１ａ、）、カレント・トピックス・イン
・デペＣ！プメンタＡ／−パイオロゾー（Ｃｕｒｒ、　
Ｔｏｐ、　Ｄｅｗ、　Ｂｉｏｌ、、）。

１４：１９９〜２２５１報　ウェストほか（Ｖｅｓｔ、　Ｃ，Ｍ、、　Ｒ，Ｌ
ａｎｚａ　。

Ｊ、　Ｒｏｓｅｎｂｌｏｏｍ　、　Ｍ、　ＬＯＷ６　、
　Ｈ，Ｈｏ１ｔｚｅｒ　＆Ｎ、ムｒｄａ工ｏｖｉｃ）：
　１９７９．フィブロネクチン・オルターズ・デ・フェ
ノタイビック・プロパーティズ・オシ・カルチヤード・
チック・エンブリオ・；ンドロゾラスツ（］？’１ｂｒ
ｏｎｅｃｔｉｎ　ａユｔａｒｓ　ｔｈｅｐｈｅｎｏｔｙ
ｐｉｃ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　Ｏｆ　ｃｕｌｔｕｒｅ
ａ　ＯｋＬＩＱｋｅｍｂｒｙｏ　ｃｈｏｎｄｒｏｂｌａ
ｓｔｓ　）　、　　セル（Ｃｅ：Ｌｌ　）、　　１７：
　４９１〜５０１（１７）シ”リッツほか（５ｃｈｌｉｔｚ、　Ｊ、Ｒ，
Ｉ　Ｒ，Ｍａｙｔｔｅ、ｇａ　Ｈ，Ｈｏ１ｔｚｅｒ　）
　：　１９７３．デーシンセシス・オシ・コラ−ダン・
アンド・グリ：１？ミノグリカンズ・パイ・デデイ７ア
レンシエイテンド°コンドロプラスツ・イン・カルチャ
ー（Ｔｈｅ　ａｙｎｔｈｅ日−工ａ　ｏｆ　ｃｏｌｌａ
ｇｅｎ　ａｎｄ　ｇｌｙｃｏｅａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ
ａ　ｂｙｌｉｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔａｄ　ｃｈｏ
ｎｄｒｏｂｌａａｔｓ　ｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ　）。

セル・デ、イアアレンジニージョン（Ｃｅ１ｌ　Ｄｉｆ
ｆｅｒ−ｅｎｃｉａｔｉｏｎ　）　、　　１　：　９７
〜１０８餞　メイネほか（Ｍａｙｎｅ、　Ｒ，、Ｍ、Ｓ
、Ｖａｉｌ　＆Ｅ、Ｊ、　Ｍｉｌｌｅｒ）：　１９７５
．アナリシス・オシ・チェインゾズ・イン・コラーゲン
・バイオシンセシス・ゲット・オカーズ・クエン・チッ
ク・コンドロサイツ°アー・ブラウン・イン・５−ゾロ
モー２−デオキシウリシン（ムｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　
ｃｈａｎｇｅａｉｎ　００１工ａｇｅｎ　ｂｉｏａｙｎ
ｔｈｅａｉｓ　ｔｈａｔ　ｏｃｃｕｒｓ　ｗｈｅｎｃｈ
ｉｃｋ　ｃｈｏｕｄｒｏｃｙｔｅａ　ａｒｅ　ｇｒｏｗ
ｎ　ｉｎ　５−　ｂｒｏｍｏ　−２’　−ｄｅｏｘｙｕ
ｒｉＩｉｉｎｅ　）　、プロシーデイングズ・オシ・デ
・ナショナル・アカデミ−・オシ・サイエンシズ（Ｐｒ
ｏｃ、　Ｎａｔｌ、ムｃａａ、　ｓａｔ、）　、　　７
２　：４５１１〜４５１５１１１１　　メイネｉｔか（Ｍａｙｎｅ、　Ｒ，ｔ　Ｍ
、＋９．　Ｔａ１ｌ　。

Ｐ、Ｍ、　Ｍａ７ｎｅ　＆　ｊ［ｉ、Ｊ、　Ｍｉｌｌｅ
ｒ）：１９７６ａ−シ・エフェクト・オシ・エンブリオ
・エキストラクト・オンーデ・タイプス・オシ・コラー
ゲン・シンセサイズド°パイ・カルチヤード・チック・
；ンドロサイツ（Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｅｍｂ
ｒｙｏ　ｅｘｔｒａｃｔ　ｏｎｔｈｅ　ｔｙｐｅａ　ｏ
ｆ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ、　ｂ
ｙ　ｃｕｌｔｕｒｅｄｃｈｉｏｋ　ｃｈｏｎａｒｏｃｙ
ｔｅｓ　）　、デベロプメンタル・バイオロジー（Ｄａ
ｖ、　ＢｉｏｌＪ　、　　５４　：　２３０〜２４〇四
　メイネ＃ミか（Ｍａｙｎｅ、　ｌ（、、Ｍ、Ｓ、　Ｖ
ａｊ、：Ｌ　。

Ｐ、Ｍ、　Ｍａｙｎｅ　＆　１．Ｊ、　Ｍｉｌｌｅｒ　
）　：　１９７６ｂ、チェインシズ・イン・デ・タイプ
・オシ・コラ−ダン・シンセサイズド・アズ・クローン
ズ・オシ・チック・コンドロナイツ・グロウ・アンド・
イベンテ二アリー・ルーズ・ディビジョン・キャパシテ
ィー（Ｃｈａｎｇｅｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｔｙｐｅ　ｏｆ
　ｃｏｌｌａｇｅｎ　５）ｒｕ−ｔｈｅａｉｚｅｄ　　
ａｌｉｉ　　ｃｌｏｎｅａ　　ｏｆ　ｃｈｌｃｈ　　ｃ
ｈｏｎａｒｏｃ）ｒｔｅｓｇｒＯＷ　　ａｎｄ　　ｅｖ
ｅｎｔｕａｌｌ）ｒ　　１ｏｓｅ　　ｄｉｖｉ８１０ｎ
　　ｃａｐａｃｉｔｙ）。

プロシーデイングズ・オシ・デ°ナショナル・アカデミ
−・オシ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａ４．　Ｅｌｃｉ、）、　　７３　：　１６７４〜
１６７８　。

（２ル　　チェラングほか（Ｃｈｅｕｎｇ、　Ｈ，Ｓ、
、　Ｔｉｔ、　Ｈ，ａｒｖｅｙ。

Ｐ、Ｄ、　Ｂｅｎｙａ　＆Ｍ、Ｅ、　Ｎｉｍｎｊ、　）
　：　１９７６−　二”−・；ラーグン・マーカーズ・
オシ・１デプレツシヨン”・シンセティズド・パイ・ラ
ビット・７−チイキユラー・コンドロサイッ°イン°カ
ルチャー　（Ｎｅｗ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｍａｒｋｅｒ
ｓ　ｏｆ　”　ｄｅｐｒａａａｉｏｎ”ａｙｎｔｈｅａ
ｌｅｉ　ｂｙ　ｒａｂｂｉｔ　ａｒｔｉｃｕｌａｒ　ｃ
ｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｓ　）　、
バイオケミカル−アンド−バイオフィジカル・リサーチ
・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈ
ｙａ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、）　、　　６５　：
１６７１〜１３７８四　ベンヤはか（Ｂｅｎｙａ、　Ｐ、Ｄ、、　Ｓ、Ｒ，
Ｐａｄｉｌａ　＆ｍ、ｘ、　Ｎｉｍｎ１　）　：　１９
７７．デ・プロｒ＝−−オプ・ラビット・アーテイキニ
ラー・コンドロテイツ・シンセ丈イズ・コラーゲン・タ
イプＩ・アンド■・アンド・タイプ１トリマー・バット
・ノット・タイプ１．ベリフィケーション・パイ・シア
ノ−ダン・ブロマイド・ペプタイド“アナリシス（Ｔｈ
ｅ　ｐｒｏｇｅｎｙ　ｏｆ　ｒａｂｂｉｔ　ａｒｔｉｃ
ｕｌａｒ　ｃｈｏｎｄｒｏｃｙ−ｔｅａ　ａｙｎｔｈｅ
ａｉｅ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　ｔｙｐｅ　ｌ　ａｎｄ　ｌ
［ａｎｃＬｔｙｐｅ　ｌ　ｔｒｌｍａｒ　、　ｂｕｔ　
ｎｏｔ　ｔｙｐｅ　ｌ　、’７ｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｂｙ　ｃｙａｎｏｇｅｎ　ｂｒｏｍｉｄｅ　ｐｅｐｔｉ
ｄｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　）　、バイオケミストリー（
Ｂｉｏｃｈｅｍ工ａｔｒ７　）、　　１６　”８６５〜
８７２關　チェラングほか（Ｃｈｅｕｎｇ、　Ｈ，Ｓ、　＆　
Ｌ、Ｍ、　’Ｅｙａｎ）：１９８１、ア・メソッド・オ
シ・デイターミニング・ティーエヌエー・アンド°コン
ドロサイツ。

コンテント・オシ・７〜テイキユラー・カーテイレイシ
（ムｍｃｓｔｈｏｄ　ｏｆ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇＤ
ＮＡ　ａｎａｃｈｏｎｉｒｏｃｙｔｅｓ　ｃｏｎｔｅｎ
ｔ　ｏｆ　ａｒｔｉｃｕｌａｒ　ｃａｒｔｉｌａｇｅ）
。

アナリテイカル・バイオケミストリー（ムｎａｌ　。

ＢｉｏｃｈｅｍＪ　、　　１１６　：　９３〜９７（財
）　ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ、　ｘ、１．）　：　１９７
１　、アイソＶ　−ジョン・アント°キャラクタリゼー
シミン・オシ・シアノ−ダン・ブロマイド・ペプタイズ
・７ラム・デ・ｚ　ｔ、ｎ、＋チェイン・オシ・チック
・カ−ティレージφ；ラーグン（工５ｏｌａｔｉｏｎ　
ａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　　ｃ
ｙａｎｏｇｅｎ　ｂｒｏｍｉｃＬｅ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ
ｆ”ｒｏｒｎ　ｔｈｅ　　）（１，）ｃｈａｉｎ　　ｏ
ｆ　　ｃｈｉｃｋ　ｃａｒｔｉｌａｇｅｃｏｌｌａｇｅ
ｎ　）　、　　バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ　）　。

１０：３Ｊ３０〜３０３５四　ルピンはか（Ｌｕ１）４ｎｊ　Ｒ，ム、、　Ｇ、Ｌ
、　Ｗｏｎｇ　＆Ｄ、７゜Ｃｏｈｎ）：１９７６、バイ
オケミカル・キャラクタリゼーション°ウィズ・バラサ
イロイド・ホルモン・アンドΦカルシトニンーオグ・ア
イソレイテッド・ボーン・セルズ：プロビショナル・ア
イデンティフィケーション・オシ・オステオクラスツ・
アンド・χステオグラスツ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｃ
ｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔ４ｏｎ　ｗｉｔｈ　ｐａｒａ
ｔｈｙｒｏｌｄｈｏｒｍｏｎｅａｎｄ　ｃａｌ’ｃｉｔ
ｏｎｉｎ　ｏｆ　１ｓｏｌａｔｅｄ　−ｏｏｎｅ　ｃｅ
ｌｌｓ　：Ｐｒｏｖｉｓｉｏｎａｌ　１４ｅｎｔｉｆｉ
ｃａｔｊ、ｏｎ　ｏｆ　ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔａａｎｃ
Ｌ　ｏａｔｅｏｂｌａａｔａ　）　、　　エンドクリノ
ロシー（Ｅｎｄ−ＯＣｒｉｎＯＩＯｇ７　）　、　９９
　：　５２６〜５３４−　チェラングほか（Ｃｈｅｕｎ
ｇ＊　Ｈ，Ｓ、、　Ｎ１ｃｏｌｏｆｆ。

Ｊ、Ｔ、、　Ｍ、Ｂ、　Ｋａｍｉｅｌ、　Ｌ、　５ｐｏ
ｌｔｅｒ　＆　Ｍ、１．Ｎｉｍｎす：１９７８、ステイ
マレーション・オシ・ファイフロゾラスツ・バイオシン
セテイック・アクティビティ°パイ・シラム°オシ・ペ
イシエンッ・クイズ・プレティビアル・ミキセデマ（Ｅ
ｌｔｉｍｕｌａｔｉｏｎＯｆ　ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔａ
　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｂｙ
　Ｂａｒ−ｕｍ　ｏｆ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｊ、ｔｈ
　ｐｒｅｔｉｂｉａｌ　ｍｙｘｅｃｅｍａ　）　。

ジャーナル・オシ・インベステイｒ−テイブ・ダーマト
ロゾ−（Ｊ、工ｎｖｅｓｔ、　ＤｅｒｍａｔｏｌＪ　、
　　７　ｌ　：１２〜１７（２）チェラングほか（Ｃｈｅｕｎｇ、　Ｈ，Ｅｌ、、
　Ｋ、Ｌ、Ｌｙｎｃｈ。

Ｒ，Ｉ’、　Ｊｏｈｎａｏｎ　＆　Ｂ、Ｊ、　Ｂｒａｖ
ｅｒ　）　：　１９８０　、インビトロ・シンセシス・
オシ・ティシュ−・スペシフィック・タイプ■・；ラー
グン・パイ・ヒーリング・カーティレージ（工ｎ　Ｖｉ
ｔｒＯ８７ｎｔｈ１３ａ！、８ｏｆ　ｔｉａａｕｅ　ａ
ｐｅｃｉｆｉｃ　ｔｙｐｅ　］ｌ　ｃｏｌｌａｇｅｎ　
ｂｙ　ｈｅａｌｉｎｇｃａｒｔｉｌａｇｅ　）　、アー
スライテイス・アンド・リューマドイド（ムｒｔｈｒ工
を工ａＲｈｅｕｍ、、）、　　２３　：　２１１　　　
。

〜２１９（至）　ビータ−コアスキーｔｈか（Ｐｅｔｅｒｋｏｆ
ｓｋｙ、　Ｂ。

＆　Ｒ，Ｄｉｅｇｅｌｍａｎｎ　）　：　１９７１　、
ユース・オシ・ア・ミクスチャー・オシ・グロテネース
・フリー・；ラーｒネーシズ・フォア・デ・スペシフィ
ック・アツセー・オシ・ラジオアクティグ・；ラーダン
°イン°デ・プレゼンス°オグ７１”−・プロテインズ
（Ｕｓｅ　ｏｆ　ａ　ｍ１ｘｔｕｒｅ　ｏｆ　ｐｒｏｔ
ｅｉｎａｓｅ　−ｆｒｅｅ　ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅｓ
　ｆｏｒ　ｔｈｅ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　ａｓｓａｙ　ｏ
ｆｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ　Ｃｏ１１＆ｇｅｎ　ｉｎ　
ｔｈｌｉｌ　ｐｒｅ１１１３ｎｃｅ　ｏｆｏｔｈｅｒ　
ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈ
−ｅｍｉｓｔｒ７　）　、　１０　：　９８８〜９９４
四　クオンほか（ＷＯＩＩｇ、　Ｇ、Ｌ、　＆　Ｄ、Ｖ
、　Ｃｏｈｎ　）　：１９７８．シ・エフェクト・オグ
°パラソルモン・オン・デ・シンセシス・オシ・コラー
イナス・マトリックス“バイ°アイソレイテッド°ポー
ン°セルズ（Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐａｒａｔ
ｈｏｒｍｏｎａ　ｏｎ　ｔｈｅａｙｎｔｈｅｓｉ、ｓ　
ｏｆ　ｃｏｌｌａｇｉｏｕｓ　ｍａｔｒｉｘ　ｂｙ　１
ｓｏｌａｔｅｄｂｏｎｅ　ｃｅｌｌｓ　）　、プロシー
デイングズ、メカニズムズ・オシ・ロカライズド・ボー
ン・ロス（Ｐｒｏ−ｃｅｅｄｉｎｇｓ　、　　Ｍｅｃｈ
ａｎｉｓｍｓ　ｏｆ　ｂｏｃａｌｉｚｅａ　ＢｏｎｅＬ
ｏｓｓ　）　、　　ホートンｔヨか（Ｈｏｒｔｏｎ　、
　　Ｔａｒｐｌｅｙ　＆Ｄａｖｉｌｉｌ　）　編、　　
刀ルシフイツク°テイツシエ・アブストラクツ（Ｃａｌ
員ｆｉｃ　Ｔｉ５ａｕｅ　Ａｂｓｔｒａｃｔｓ　）　％
別増刊、４７〜５９０ＱＩ　　ｋビンｔ”ｒ、か（Ｌｕｂｉｎ、　Ｒ，Ａ、
　＆　Ｄ、Ｖ、　Ｃｏｈｎ）：１９７６、エフェクト・
オグ°パラソルモン°アンド・カルシトニン・オン・サ
イトレート・アンド・ヒアルロネート・メタボリズム・
イン・カルチヤードａｆｆ−ン（Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ
　ｐａｒａｔｈｏｒｍｏｎｅａｎａ　Ｃａ１ＱｉｔＯｎ
ｉｎ　Ｏｎ　ｃｉｔｒａｔｅａ　ａｎｄ　ｈｙａｌｕｒ
ｏｎａｔｅｍｅ　ｔａ　ｂｏユｉｓｍ　ｉｎ　ａｕｌｔ
ｕｒｅｄ　ｂｏｎｅ　）　、　　ｘンドクリノロシー（
Ｆｌｔｎｄｏｃｒｉｃｏｌｏｇ７　）　、　９８　：　
４１３〜４１９ＣＩＩＪ　　チェラング＃よか（Ｃｈｅ
ｕｎｇ、　Ｈ，Ｓ、、　Ｍ、Ｔ、　５ｔｏｎｙｓａ　Ｄ
、！、　ＭｃＣａｒｔｙ　）　：　１９８４　、マイト
ジェニック・エフエクッ・オシ・ヒドロキシアパタイト
・アンド・カルシウム・ピロホス７エート・シバイドレ
ート・クリスタルズ・オン・カルチヤード・マンマリ７
／−セルズ（Ｍ工ｔｏｇｅｎｉｃ　ｅｆｆｅｃｔａ　０
ｆｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ　ａｃｄ　ｃａｌｃｉ
ｕｍ　ｐｙｒｏｐｈｏａｐｈａｔｅｄｉｎｙｄｒａｔｅ
　ｃｒｙｓｔａｌｓ　ｏｎ　ａｕｌｔｕｒｅｄ　ｍａｍ
ｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓ　）　、アースライテメｆス・
アンド・リューマドイド（ムｒｔｈｒ工ｔｉｅ　Ｐ、ｈ
ｅｕｍ、）、　２７　：　６６８〜Ｑ　チェラング１１
か（Ｃｈｅｕｎｇ、　Ｈ，Ｂ、　＆　Ｄ、Ｉ。

ｎｃｃａｒｔｙ）：１９８４．バイオロジカル・工７エ
クッ・オブ・カルシウム・コンテイニング°クリスタル
ズ°オン・シノビオティッ（Ｂｊ、ｌｏｇｉｃａユｅｆ
ｆｅｏｔ８　０ｆ　　Ｃ２Ｌユｃｉｕｍ　　ｃｏｎｔａ
ｉｎｉｎｇ　　ｃｒｙａｔａ工ａ　　ｏｎＢ７！１ｌＯ
ＶｉＯｃ７ｔｅＢ　）　、カルシ７アイド・バイオロジ
カル・システム（Ｃａｌｃｉｕｍ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇ
ｉｃａｌＳｙｓｔｅｍ　）　、　／Ｉ／ビンハか（Ｒｕ
ｂｉｎ、　Ｒ，Ｐ、　、　Ｇ、　Ｗｅｉａｓ＆　Ｊ、Ｗ
、　Ｐｕｔｎｅｙ、　Ｉｒ　）　秦、プレナム・パブリ
ッシング・カンパニー（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕｂ工ｉｓｈ
ｉｎｇ　Ｃｏ、）。

ニューヨーク（Ｎｅｗ　Ｘｏｒｋ）ＩａＱ　　ｆ工”）７グｔ＝カ（Ｃｈｅｕｎｇ、　Ｈ，
Ｂ、　＆　Ｄ、Ｊ。

ＭｃＣａｒｔｙ）；１９８３．　　カルシウム・コンテ
イニング・クリスタルズ・キャン・サゾスティチュート
・７オア・プレイドレット・デンイタド・グラウス・フ
ァクター（ＰＤＧＥＰ　）・イン・セル・カルチャー（
Ｃａｌｃｉｉｍ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｃｒｙｓｔａｌ
ｓ　ｃａｎ　５ｕｂ−ｓｔ４ｔｕｔｅ　ｆｏｒ　ｐｌａ
ｔｅｌａｔ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔ
ｏｒ（ＰＤＧＢ’　）　ｉｎ　ｃｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒ
ｅ　）　、　　アースライティス・アンド・リューマド
イド（ムｒｔｈｒｉｔｓ　Ｒｈ６ｕｍ−ハ２６：　　Ｓ
　６０（至）　エバンスほか（Ｋｖａｎａ、　Ｒ，Ｗ、　Ｈ，
８，０Ｍｕｎｇ　ＩａＤ、Ｊ、　ＭｃＣａｒｔｙ　）　
：　１９８３−７ツプテイク・アンド・ディソリューシ
ョン・オグ・カルシウム・ホスフェート・クリスタルズ
・パイ・カルチヤード・セルズ（ｆｆｐｔａｋｅ　ａｎ
ａ　ｄ４ａｓｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃａｌｃｊ、−ｕ
ｍ　　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　　ｃｒ７＃ｔａユａ　　’
ｂｙ　　ｃｕユｔｕｒｅａ　　ｃｅｌｌｓ　）　。

アースライテイス・アンド・リューマドイド（ムｒｔｈ
ｒｉｔｉａ　Ｒｈａｕｍ、）、　　２６　：　Ｂ　６０
１５、Ｓパンスほか（Ｍｖａｎｇ、　Ｒ，’９ｒ、、　
′Ｈ，ａ、　Ｃｈｅｕｎｇ＆　Ｄ、！、　ｎｃｃａｒｔ
ｙ　）　：　１９８４−　カルチヤード・キヤナイン・
ジノＣアル°セルズ・ノリエビクイズ・４５　Ｃａ−ラ
ベルド・ヒドロキシアパタイト・クリスタルズ（Ｃｕ１
ｔｕｒａａ　ｃｏａｎｉｔｈｅ　ｇｙｎｏｖｉａｌ　ｃ
ａｌｌｓａｏｌｕｂｉｌｔｚｅ　４’Ｃａ　１ａｂｅｌ
ｅｃＬ　ｈ７（ＬｒＯＺ７５Ｌｐａｔｉｔｅ　０ｒ７Ｂ
　−ｔａｌａ〕、アースツイテイス・７ンド・リニーマ
ト　イ　ド　（ムｒｔｈｒｉ、ｔ４ｓ　　Ｒｈｅｕｍ、
）、２７：８２９〜（至）エバンスはか（、ＪＣｖａｎ
ｇ、　Ｒ，Ｗ、、　ＬＳ、　Ｃｈｅｕｎｇ＆　Ｄ、Ｊ、
　ＭｃＣａｒｔｙ　）　：カルチヤードに’　・ｋ：、
５−−７フーモノサイツ・アンド・７アイプコプラスツ
・ノリエビクイズ・カルシウム・°ホスフェート・クリ
スタルズ（ＣｕユｔｕｒｓｏＬ　ｈｕｍａｎ　ｍｏｎｏ
ｃｙｔｅａ　ａｎｄ　ｆよりｒｏｂ−１ａａｔａ　ａｏ
ｌｕ’ｂｉｌｉｚｅ　ｃａｌｃｌｕｍ　ｐｈｏｓｐｈａ
ｔｅ　ｃｒｙｓｔａｌｓＪ。

カルシ７アイド・ティシュ−・インターナショナｋ　（
Ｃａ１ｃｉｆｉｅｄ　Ｔｉ５ｓｕｅ工ｎｔｅｒｎａｔｔ
ｏｎａ：ｔ〕、＃］刷中６７）　　クオングは６ｈ　（Ｋｗｏｎｇ、　Ｃ，Ｅｌ
、　＆　Ｍｌ、　Ｃｈａｕｎｇ）：ソリュビリゼーショ
ン°オブ・ヒドロキシアパタイト・クリスタルズ・パイ
・ミューリン・ボーン・セルズ・マクロ７アーゾズ・ア
ンド・ファイブログラスツ二二ンエクト・オプ・ビーテ
イーエイチ（５ｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈ
ｙｄ、ｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ　ｃｒｙｓｔａ−１ｓ　
ｂｙ　ｍｕｒｉｎｅ　ｂｏｎｅ　ｃｅｌｌｓ　、　　ｍ
ａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　ａｎｄｆよりｒｏｂｌａｓｔｓ
　：　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ＰＴＨ）　、投稿中間　チ
ェラングほか（Ｃｈｅｕｎｇ、　Ｈ，Ｓ、　＆　Ｄ、Ｊ
。

ＭｃＣａｒｔｙ　）　：カルシウム・クリスタル・イン
デニースト・マイドシエネシス：イントラセルラー・テ
ィソリューション・イズ・エツセンシャル（Ｃａｌｃｉ
ｕｍ　ｃｒｙｓｔａｌ　１ｎａｕｃｅｄ　ｍｉｔｏｇｅ
ｎｅｓｊ、ａ　：工ｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｄｉａ
ａｏｌｕｔ４ｏｎ　Ｌａ、　ｅａａｅｎｔｉａｌ　）　
。

投稿中（３９１１”ｋヘラｌはカ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ　、　Ｒ
，＆　Ｊ。

Ｅｌｋｉｎｇｔｏｔｉ　）　：　１９７５　、インダク
シミン゛オシ・グラウス・イン・レスティン”グ・７ア
イグロゾラステイツク・セル・カルチヤード・パイ（工
ｎｃＬ−−ｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎ　
ｒｅａｌｎ５Ｈｆｉｂｒｏｂｌａａｔｊ、ｃｃａｌｌａ
ｕユｔｕｒｅｓ　ｂｙ）、プΩシーデイングズ参オデ・
デ・ナショナル・アカデミ−・オグ・サイエンンズ（Ｐ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、ムＯａｄ、　８Ｑ工、、）、７５
：１５８４〜１５８８ｍ＝り７オリアツクほか（Ｎｙｋｆｏｒｉａｋ、　Ｃ，
Ｌ。

Ｒ，Ｂ、Ｙｏｕｎｇ　＆　　Ｔ、人、Ｉ’Ｍｌｌｉ、ｐ
８　　）　：１９８Ｑ、　　チェインゾズ・イン・イン
トラセルラー・ディストリビ二−ション・デユアリング
・デ・ト２ンシション・オプ・７アイグロプラスツ・７
ラム・デ・ｆａす７エレイテイング・ツー・デ・ステイ
ショナリー・ステイト（Ｃｈａｎｇｅｓ　１ｎｉｎｔｒ
ａｃｅｌｌａｒｄｉｓｔｒｌｕｔｉｏｎ　ｄｕｒｉｎｇ
　ｔｈｅ　ｔｒａｎａｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｉｂｒｏ　
−ｂｌａａｔａ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌｉｆｅｒ
ａｔ４ｎｇ　ｔｏ　ｔｈｅ　ａｔａｔｉｏ−ｎａｚ７５
ｔａｔｅ　）　、バイオケミカル・アンド・バイオフイ
ゾクス・リサーチ・コミュニケーション（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　、Ｂｉｏｐｈｙａ、　Ｒｅｓ、　ＣｏｍｍｕｎＪ
　、　　６：　５８３〜５８７０υ　アカ−マン（ムｋｅｒｍａｎ、　Ｋ、Ｅｉ、Ｏ，
、）　：　１９８２−トランスポート・アンド・セル・
アクテイベーション（Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ　ａｎ４　ｃ
ｅｌｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　）　、メディカル・パ
イオロゾー（Ｍａｄ、　Ｂ１０１．）、　６　ＩＩＩ　
：１６８〜１８２祷　チェラングＰＣか（Ｃｈｅｕｎｇ、　Ｈ，Ｓ、、　
Ｐ、Ｂ。

Ｈａｌｖａｒａｏｎ　＆　Ｄ、Ｊ、　ＭｃＣａｒｔｙ　
）　：　ｉ　９８２．　　レリーズ・オシ・コラーグネ
ース・ニュートラル・プロチェース・アンド・ブロスタ
グ２ンジンズ・フラム・カルチヤード・マンマリアン・
シノビアル・七ルズ・パイ・ヒドロキシアパタイト°ア
ンド・カルシウム・ピロホス７エート・ゾハイトレート
ークリスタルズ（Ｒｅ１ｅａｓｅ　ｏｆ　ｃｏｌｌａｇ
ａｎａｓｅ　。

ｎｅｕｔｒａｌ　ｐｒｏｔｅａｓｅ　ａｎｄ　ｐｒｏｓ
ｔａｇｌａｎｄｉｎｓ　ｆｒｏｍｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｍ
ａｍｍａｌｉａｎ　ａ）ｒｎｏｖｉａｌ　ｃｅｌｌｓ　
ｂｙ　ｈｙｄｒｏｘ−ｙａｐａｔｉｔｅ　ａｎｄ　Ｑａ
ｌＯｊ、ｕｍ　ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ａｔｈｙ
ａｒａｔｅｃｒ７ａｔａ１ｇ　）　、アースライテイス
・アンド・リューマドイド（ムｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈ
ｅｕｍ、）　、　　２４　：　１３３８〜１３４４卿　ホｋ　７７ズはか（Ｅｆｏｌｌｅｍａｎｓ、　Ｍ、
、　Ｒ，Ｏ。

Ｊｉｌ：１ｆｅｒｉｎｋ、　Ｐ、Ｇ、、　ＤｅＧｒｏＯ
ｔ、ム、　５ｔｒｉｊｌａｎｄ　＆Ｊ、Ｍ、　Ｔａｇｅ
ｒ）：１９８１．アキュマレーション。

オシ・ウィーク・ベーシズ・イン・リレーション・ツー
・インド：）、Ｆイソゾーマル・ビーエイチ。

イン°カルチヤード・ヒユーマン・スキン・７アイゾロ
ブラスツ（ムｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｖｒｅａ
ｋ　ｂａｓｅｓｉｎ　ｒｅｌａｔ工ｏｎ　、ｔｏ　ｉｎ
ｔｒａｌｙａｏｓｏｍａｌ　ｐＨｉｎ　ｃｕｌｔｕｒｅ
ｄｈｕｍａｎ　５ｋｉｎ　ｆｉｋ＋ｒｏ’ｂｌａａｔｓ
　）　、バイオシミカー、Ｚ・バイオフィシ力・アクタ
（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｇ。

ムｅｔａ　　）　、　　　６４３　　：　　１　４０〜
１　５１（財）　オークマ＃ミか（Ｏｈｋｕｍａ、　Ｂ
、’＆　Ｂ、　Ｂｏｏｌｅ　）　：１９７８、フルオレ
ッセンス・プローブ・メシヤーメント・オシ・ゾ・イン
トララインゾーマル・　　”。

ビーエイチ・イン・リビング・セルズ・アンド・デーパ
ーターベーション・オシ・ビーエイチ・バイ・ベアリア
スーエイシェンツ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｐｒｏｂ
ｅ　ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　ｌ
ｔｒａｌｙａｏｍｏｍａｌ　ｐＨ工ｎ　　ｌｊ、ｖｉｎ
ｇ　ｃａｌｌｓ　　ａｎｄ　　ｔｈｅ　　ｐｅｒｔｕｒ
ｂａｔヱｏｎ　　ｏｆ　　ｐＨ。

ｂｙ　ｖａｒｉｏｕｓ　ａｇｅｎｔｓ）、プロシーデイ
ングズ・オシ・デ・ナショナル・アカデミ−・オシ・ブ
イエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｂ
ｃＬ、）　、　　７５二６３２７〜３６３１

【図面の簡単な説明】

Ｍ１図〜石１６図μ例１に示した実施態様に関するもの
で、第１図〜第１２図、廊１５図および第１６凶は先物
の形態を示す写真であつ℃、為１図は例１（ａ）部に用
いた粗粒固体ｉ負の走丘皺′−子顕微鏡写真（、８４Ｃ
Ｍ　、　５０Ｘ　）であり、第２図は例１−フ部におザ
る細胞培９！２週後を示すＳ胚（２［ＪＯＸＪであり、
第３図は例１（２）ノ部における細胞培養の同じく２過
俊を示す１３ＸＭ　（５ＬＩＯＸ）テアリ、Ｍ４図は例
１（ａ）部にＳげる細胞培養２過俊の透過電子顕微鏡写
真（’ｒｘＭ、　２ｃ＋、ｏｃ＋ｏＸンであり、第５図
はｆｉｔ　１（ａ）部におけるａｊ１培養４週後のＨお
よびＥ染色所間の光顕微鏡写真（１２５）Ｑであり、第
６図は例１（ａ）部におけるｌＩＩＪＪＮｇｌ培養４週
後のト培養４ン後果色断面の元顕微鏡写真（２００Ｘ）
であり、第７図は例１（ａ）部における細胞培養８週後
の凭顕微鏡写真（７５Ｘ、）、第８図はＮ　１　（ＩＬ
）部における細胞培養８週後のトルイジン實染色断面の
元顕微鏡写真（１２５Ｘハ第９図は例１（ａ）部におけ
る細胞培養１１週後の元顕微鏡写真（５０Ｘ）　、第１
０図は第９図の一部を示す元顕微鏡写Ｘ　（１２５ＸＪ
であり、第１１図は例１（ａＪ部におい℃生育１３週仮
にトルイジン青染色を行った細胞培養の断面の元顕微鏡
写真であり、帛１２図は例１（ａ）部におい″Ｃ主青１
６過俊にサフラン−０亦染色を行った細胞培養の断面で
ある・第１３図はドデシル硫酸ナトリウム電気泳動の一
連の像であって、コラーゲンの分類を例示する図であり
、（ａ）は軟骨臓器培養によつ℃、（ｂ）はガ１　（ａ
）部の多孔性ＨＡ顆粒上で８週間生育させた軟骨細胞に
よって、（Ｃ）は旧来のプラスチック皿上で２週間生育
させた軟骨細胞によって、それぞれ産主された；ラーダ
ンの５ＤＥＩ電気泳動像である。第１４凶は一連のｆ３
Ｄｓ電気泳動像であつ℃、シアノーグングロミドペプテ
ド解析によるコラーゲンの分類を例示する図面であり、
（ハ））に軟骨臓器培養から、（ｂ）は例１（ａ）部の
多孔性ＨＡ顆粒上に生育させた軟骨ｆｉｌｔＩ胞から、
それぞれ単離さ、れたα、１＠のシアノダングロミドペ
グテドの１３ＤＢ−気泳励像である。第１５凶は例１（
６）部における細胞培養６過後の元顕微続写真（４０Ｘ
、）であり、第１６図は例１（ｂ）部に３ける細胞培養
１２過後の九順＆鏡写真（，２００Ｘ）である。第１７凶〜兜２１凶は生物の形態を示す写真であって、
第１７図および富１８凶ｒｌ：しｕ４にｄご躯の夷元悪
伽に関するもので、第１７因は顆粒状固体基５ｋを用い
たガ４の細胞培養の光融微競写冥（１２５Ｘ）であり、
Ｍ２Ｓ図はディスク状固体基質を用いた例４のＪ１ｉＩ
ｌ胞培養の元顕微鏡写真（ｉ２５）Ｑである。第１９図〜第２１図区例１２に記載の冥施悪様に胸する
ものであり、ｋｌ　９図μ例１２における細胞培養１２
週後の元顕微鏡写真（７５Ｘ）であり、第２０図は例１
２におする細胞培養１２迦後にＥおよびＥ染色を行った
Ｍ面の九順微跳写真（１２５）Ｑであり、ｉ２１図は例
１２における細胞培養１２週後にＥおよびＥ染色を行っ
た断面の光撫微鏡写Ｘ　（１５０Ｘ）である。写真中に用いた記号はそれぞれ次の領域を示すものであ
る。Ａ＝カルシウム化合切の固体基質Ｂ＝Ｎｉ胞Ｃ＝アルシアン？染色領域？＝鳳嶽維Ｎ；核

Claims

【特許請求の範囲】

（１）細胞がその表面で生育可能な固体基質を適当な栄
養生長培地中に含有するタイプの足場依存性哺乳類細胞
用のインビトロ細胞培養系において、固体基質は細胞に
対して非毒性のマイトジエンカルシウム化合物を含有し
、かつ足場依存性細胞を支持するのに十分な大きさを有
するインビトロ細胞培養系
（２）カルシウム化合物は顆粒の形とし、その最大方向
における粒子径は少なくとも０．０５０ｍｍである特許
請求の範囲第１項記載のインビトロ細胞培養系
（３）カルシウム化合物顆粒の粒子径は０．０５０ｍｍ
〜１．０ｍｍの範囲内にある特許請求の範囲第２項記載
のインビトロ細胞培養系
（４）固体基質はカルシウム化合物の固形体の形とする
特許請求の範囲第１項記載のインビトロ細胞培養系
（５）固形体はカルシウム化合物の焼結多孔性顆粒であ
る特許請求の範囲第４項記載のインビトロ細胞培養系
（６）カルシウム化合物は、リン酸カルシウムのヒドロ
キシアパタイト型もしくはリン酸三カルシウム型化合物
または炭酸カルシウムである特許請求の範囲第１項から
第５項までのいずれかに記載のインビトロ細胞培養系
（７）栄養生長培地中に浸漬した固体基質表面上での足
場依存性哺乳類細胞のインビトロ培養法において、哺乳
類細胞に対して非毒性のマイトジエンカルシウム化合物
を包含し、足場依存性細胞を支持できる十分な大きさを
有する固体基質を用い、その固体基質表面に厚い多重細
胞層が生長するまで細胞を継続するインビトロ細胞培養
方法
（８）カルシウム化合物の顆粒の形で、最大方向におけ
る粒子径が少なくとも０．０５０ｍｍの固体基質を用い
る特許請求の範囲第７項記載のインビトロ細胞培養方法
（９）カルシウム化合物の顆粒の粒子径は０．０５０ｍ
ｍ〜１．０ｍｍの範囲内にある特許請求の範囲第８項記
載のインビトロ細胞培養方法
（１０）固形体の形のカルシウム化合物を固体基質とし
て用いる特許請求の範囲第７項記載のインビトロ細胞培
養方法
（１１）固形体はカルシウム化合物の焼結多孔性顆粒に
形成された特許請求の範囲第１０項記載のインビトロ細
胞培養方法
（１２）カルシウム化合物は、リン酸カルシウムのヒド
ロキシアパタイト型もしくはリン酸三カルシウム型化合
物または炭酸カルシウムである特許請求の範囲第７項か
ら第１１項までのいずれかに記載のインビトロ細胞培養
方法