JP6711424B2 - 細胞培養用ゲル組成物およびその製造方法、細胞培養方法ならびに細胞培養用基板 - Google Patents

Description

本発明は、動植物の細胞培養に用いられるゲル組成物およびその製造方法、ならびに細胞培養方法に関する。

動植物の細胞培養には、ポリスチレン製の培養プレートが広く用いられている。細胞は、プレートの表面に吸着した接着分子や細胞自身が分泌した接着分子を介してプレートに接着する。細胞表面にはこれらの接着分子と結合する受容体が存在し、この受容体を介して細胞の生存を維持し、増殖を促すシグナルが入力される。

再生医療において細胞を生体に移植する場合は、細胞の機能を生体に近い状態に向上する必要がある。しかしながら、プレート上での二次元培養では、不完全な機能を有する細胞が構築される場合が多い。プレート上で細胞を単層培養する二次元培養に対して、縦方向の厚みを持たせて細胞を培養する三次元培養技術が開発されている。三次元培養では、細胞が多方向で相互作用し、in vivoの状態をより正確に模倣するため、細胞が本来の機能を発現しやすいことが明らかとなっている。

三次元培養技術では、細胞を三次元的に培養するための足場基材（三次元スキャフォールド）が用いられる。特許文献１では、ポリスチレンやポリエチレン等のポリマー材料からなる三次元の多孔質支柱を三次元スキャフォールドとする三次元培養技術が提案されている。

三次元培養マトリックスとしてヒドロゲルを用いる技術も実用化されている。動物由来の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）をベースとするヒドロゲルが「Ｍａｔｒｉｇｅｌ」の商品名で市販されており、Ｍａｔｒｉｇｅｌを用いた三次元培養に関する多数の報告がある。特許文献２では、特定の配列を有するペプチドの自己集合により形成されるヒドロゲルを三次元培養基材として利用する技術が開示されている。

ＷＯ２００８／１０１００１号パンフレット ＷＯ２００７／０５９４９１号パンフレット

微小構造体からなる三次元スキャフォールドは、取り扱いが困難であり、大量培養に適しているとは言い難い。また、材料が生分解性を有していないため、生体への移植に適しておらず、培養後の細胞の回収も容易ではない。Ｍａｔｒｉｇｅｌ等の動物由来のＥＣＭをベースとするヒドロゲルは、ロット間にばらつきがあり、動物由来の増殖因子等が含まれている場合には、細胞の増殖に影響を及ぼす可能性がある。そのため、動物由来のＥＣＭをベースとするヒドロゲルは、品質安定性や安全性等の観点から、生体への移植を目的とした再生医療等への適用の実現性に乏しく、in vitroでの実験用に用途が限定される。

特許文献２等に開示されている合成ペプチドをベースとするヒドロゲルは、ロット間の差が少なく、動物性タンパク質による悪影響もない。このヒドロゲルは、ｐＨ、イオン強度、温度等の変化によって分解するため、ヒドロゲルを足場として培養された細胞を回収可能である。しかしながら、細胞培養時には分解せず、生体への移植時に分解するようにゲルを調製することは容易ではなく、培養細胞の回収に困難を伴う場合がある。また、ゲルが変性しやすいため、使用時まで冷蔵または冷凍で保管する必要があり、管理が煩雑である。

上記の様に、従来の三次元培養基材のほとんどは、ロット間バラツキによる不安定性、生分解性の欠如、培養細胞の回収困難、培養基材の保管の煩雑さ等の課題を抱えている。これらに鑑み、本発明は、三次元培養基材として適用可能な新規の細胞培養用ゲル組成物の提供を目的とする。

本発明者らは両親媒性ブロックポリマーをベースとするゲル組成物が、三次元培養基材として優れた特性を有していることを見出した。本発明は、親水性ブロックと疎水性ブロックとを有する両親媒性ブロックポリマーを有する細胞培養用ゲル組成物およびその製造方法、ならびにゲル組成物を用いた細胞培養方法に関する。

両親媒性ブロックポリマーとしては、例えば、親水性ブロックが２０個以上のサルコシン単位を有し、疎水性ブロック鎖が１０個以上の乳酸単位を有するポリサルコシン−ポリ乳酸ブロックポリマーが挙げられる。

本発明のゲル組成物は、実質的に分散媒を含有しないキセロゲルでもよく、分散媒として水を含むヒドロゲルでもよい。両親媒性ブロックポリマーを有機溶媒と混合することによりオルガノゲルが得られ、オルガノゲルから有機溶媒を除去することによりキセロゲルが形成される。有機溶媒としては、例えば炭素数１〜６のアルコールが用いられる。キセロゲルと水または水溶液とを混合することによりヒドロゲルが形成される。ヒドロゲルは、両親媒性ブロックポリマーを１０重量％以上含有することが好ましい。

キセロゲルに細胞培養液等の培養対象の細胞を含む水溶液を混合することにより、細胞を内包するヒドロゲルを形成してもよい。例えば、ウェルプレート等の細胞培養用基板上でオルガノゲルから有機溶媒を除去することによりキセロゲルを形成し、キセロゲルが形成された培養用基板上に細胞を含む水溶液を加えることにより、細胞を内包するヒドロゲルを形成してもよい。基板上にキセロゲルを備える細胞培養用基板は、室温での保管が可能であり、用時調製によりキセロゲル上に水または水溶液を加えることによりヒドロゲルが得られる。

ヒドロゲル中で培養後の細胞は、水または水溶液を加えることによりゲルを溶解して回収してもよく、細胞がヒドロゲルに内包された状態でそのまま生体に移植してもよい。

本発明のゲル組成物は、生分解性を有する合成ポリマーをベースとするため、品質の安定性に優れる。本発明のゲル組成物は、溶媒（分散媒）を含まないキセロゲルとして保持可能であり、常温で保管可能である。使用時に細胞培養液等を添加することにより細胞培養の足場となるヒドロゲルを用時調製できるため、取り扱いが容易である。細胞培養後は、水溶液等を加えて濃度を調整することによりゲルが分解するため、培養後の細胞の取り出しも容易である。本発明のゲル組成物は、三次元細胞培養の足場物質として有用である。

実験例１‐２の顕微鏡観察写真である。 Ｐｓａｒ−ＰＬＬＡから構成されるヒドロゲルを用いて培養した細胞のｚ方向の顕微鏡観察写真である。 実験例１‐３におけるCYP3A4遺伝子発現量の測定結果である。 実験例２の顕微鏡観察写真である。 実験例２におけるCYP3A4遺伝子発現量の測定結果である。

本発明のゲル組成物は、親水性ブロック鎖と疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックポリマーを含む。両親媒性ポリマーをアルコール等の有機溶媒と混合することによりオルガノゲルが得られ、オルガノゲルから分散媒としての有機溶媒を除去することによりキセロゲルゲルが得られる。キセロゲルを水または水溶液と混合することによりヒドロゲルが得られる。

［両親媒性ブロックポリマー］
本発明のゲル組成物は、親水性ブロック鎖と疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックポリマーを主要構成要素とする組成物である。親水性ブロック鎖のモノマー単位としては、アルキレンオキシドやサルコシン等が挙げられる。疎水性ブロック鎖のモノマー単位としては、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシイソ酪酸等のヒドロキシ酸や、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、チロシン、トリプトファン、グルタミン酸メチル、グルタミン酸ベンジル、アスパラギン酸メチル、アスパラギン酸エチル、アスパラギン酸ベンジル等の疎水性アミノ酸あるいはアミノ酸誘導体が挙げられる。

上記例示の両親媒性ブロックポリマーの中でも、親水性ブロック鎖がサルコシン単位を有し、疎水性ブロック鎖が乳酸単位を有する両親媒性ブロックポリマーは、細胞培養に適したゲルを形成しやすい。

（疎水性ブロック鎖）
疎水性ブロック鎖は、１０個以上の乳酸単位を含むことが好ましい。ポリ乳酸は、優れた生体適合性および安定性を有する。また、ポリ乳酸は、優れた生分解性を有することから、代謝が早く、生体内での集積性が低い。そのため、ポリ乳酸を構成ブロックとする両親媒性ポリマーは、生体、特に人体への応用において有用である。また、ポリ乳酸は結晶性であるため、疎水性ブロック鎖が短い場合でも、アルコール等の溶媒中で疎水性ブロック鎖が凝集し、物理ゲルが形成されやすい。

疎水性ブロック鎖中の乳酸単位の数の上限は特に制限されないが、構造を安定化させる観点からは１０００個以下が好ましい。疎水性ブロックにおける乳酸単位の数は、１０〜１０００個が好ましく、１５〜５００個がより好ましく、２０〜１００個がさらに好ましい。

疎水性ブロック鎖を構成する乳酸単位は、Ｌ‐乳酸でもＤ‐乳酸でもよい。また、Ｌ‐乳酸とＤ‐乳酸が混在していてもよい。疎水性ブロック鎖は、全ての乳酸単位が連続していてもよく、乳酸単位が非連続であってもよい。疎水性ブロック鎖に含まれる乳酸以外のモノマー単位は特に限定されないが、例えば、グリコール酸、ヒドロキシイソ酪酸等のヒドロキシ酸や、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニン、チロシン、トリプトファン、グルタミン酸メチルエステル、グルタミン酸ベンジルエステル、アスパラギン酸メチルエステル、アスパラギン酸エチルエステル、アスパラギン酸ベンジルエステル等の疎水性アミノ酸あるいはアミノ酸誘導体が挙げられる。

（親水性ブロック鎖）
親水性ブロック鎖は、２０個以上のサルコシン単位（Ｎ−メチルグリシン単位）を含むことが好ましい。サルコシンは、水溶性が高い。また、ポリサルコシンはＮ置換アミドを有することからシス−トランス異性化が可能であり、かつ、α炭素まわりの立体障害が少ないことから、高い柔軟性を有する。そのため、ポリサルコシン鎖を構成単位として用いることにより、高い親水性と柔軟性とを併せ持つ親水性ブロック鎖が形成される。

親水性ブロック鎖のサルコシン単位が２０個以上であれば、隣接して存在するブロックポリマーの親水性ブロック同士が凝集しやすいため、水やアルコール等の親水性の分散媒が取り込まれたゲルが形成されやすくなる。親水性ブロック鎖中のサルコシン単位の数の上限は特に制限されない。隣接して存在するブロックポリマーの両親媒性ポリマーの疎水性ブロック同士を凝集させてゲルの構造を安定化する観点から、親水性ブロック鎖中のサルコシン単位の数は３００個以下が好ましい。サルコシン単位の数は、２５〜２００個がより好ましく、３０〜１５０個がさらに好ましい。

親水性ブロック鎖は、全てのサルコシン単位が連続していてもよく、上記のポリサルコシンの特性を損なわない限りにおいてサルコシン単位が非連続であってもよい。親水性ブロック鎖がサルコシン以外のモノマー単位を有する場合、サルコシン以外のモノマー単位は特に限定されないが、例えば親水性アミノ酸あるいはアミノ酸誘導体が挙げられる。アミノ酸は、α−アミノ酸、β−アミノ酸、γ−アミノ酸を含み、好ましくは、α−アミノ酸である。親水性のα−アミノ酸としては、セリン、スレオニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸等が挙げられる。また、親水性ブロックは、糖鎖やポリエーテル等を有していてもよい。親水性ブロックは、末端（疎水性ブロックとのリンカー部と反対側の末端）に、水酸基等の親水性基を有することが好ましい。

（両親媒性ブロックポリマーの構造および合成方法）
両親媒性ポリマーは、親水性ブロック鎖と疎水性ブロック鎖とを結合させたものである。親水性ブロック鎖と疎水性ブロック鎖とは、リンカーを介して結合していてもよい。リンカーとしては、疎水性ブロック鎖の構成単位である乳酸モノマー（乳酸やラクチド）またはポリ乳酸鎖と結合可能な官能基（例えば、水酸基、アミノ基等）と、親水性ブロックの構成単位であるサルコシンモノマー（例えばサルコシンやＮ−カルボキシサルコシン無水物）またはポリサルコシンと結合可能な官能基（例えばアミノ基）とを有するものが好ましく用いられる。リンカーを適宜に選択することにより、親水性ブロック鎖や疎水性ブロック鎖の分枝構造を制御することができる。

両親媒性ブロックポリマーの合成法は、特に限定されず、公知のペプチド合成法、ポリエステル合成法、デプシペプチド合成法等を用いることができる。詳細には、ＷＯ２００９／１４８１２１号等を参照して、両親媒性ブロックポリマーを合成することができる。

ゲルの硬度、安定性、分解性（溶解性）等を調整するためには、疎水性ブロック鎖の鎖長（乳酸単位の数）や、疎水性ブロック鎖と親水性ブロック鎖の鎖長の比（乳酸単位の数とサルコシン単位の数の比）を調整することが好ましい。疎水性ブロック鎖の鎖長の制御を容易とするためには、両親媒性ブロックポリマーの合成の際に、一端にリンカーが導入された疎水性ブロック鎖（例えばポリ乳酸）を先に合成した後、親水性ブロック鎖（例えばポリサルコシン）を導入することが好ましい。重合反応における開始剤とモノマーとの仕込み比、反応時間、温度等の条件を調整することにより、疎水性ブロック鎖および親水性ブロック鎖の鎖長を調整できる。親水性ブロック鎖および疎水性ブロック鎖の鎖長（両親媒性ブロックポリマーの分子量）は、例えば^１Ｈ‐ＮＭＲによって確認できる。両親媒性ポリマーの生分解性を高める観点から、重量平均分子量は、１００００以下が好ましく、９０００以下がより好ましい。本発明に用いられる両親媒性ポリマーは、ゲルの形成促進や、ゲルの安定性向上等の目的で、分子間に化学架橋を形成してもよい。

［ゲル組成物の調製］
上記の両親媒性ポリマーを、溶媒と混合することによりゲルが得られる。安定性の高いゲルを形成するためには、両親媒性ポリマーと有機溶媒を混合してオルガノゲルを作製し、オルガノゲルから溶媒を除去して実質的に溶媒を含まないキセロゲルを作製することが好ましい。キセロゲルに水または水溶液を混合することにより、細胞培養に適したヒドロゲルが得られる。

オルガノゲルを形成するための有機溶媒としては、両親媒性ポリマーの親水性ブロック鎖を溶解しやすく、疎水性ブロック鎖を溶解し難い溶媒が好ましい。例えば、疎水性ブロック鎖としてポリ乳酸を含み、親水性ブロック鎖としてポリサルコシンを含む両親媒性ブロックポリマーに対しては、ポリサルコシンを溶解しポリ乳酸を溶解しない有機溶媒が好ましく用いられる。このような有機溶媒を用いることにより、両親媒性ポリマーと有機溶媒との混合下において、両親媒性ポリマーの疎水ブロック部分が凝集し、物理的に架橋したマトリクスが形成されやすくなる。また、このような有機溶媒を用いてオルガノゲルを形成すれば、有機溶媒を除去後のキセロゲルも、疎水性ブロック部分が凝集した構造を取りやすい。そのため、キセロゲルに水または水溶液を接触させた際に、親水性ブロック鎖部分に水が浸透しやすく、オルガノゲルと同様のポリマーマトリクス構造を維持したヒドロゲルが形成されやすくなると考えられる。

オルガノゲルの形成に用いられる有機溶媒としては、炭素数１〜６のアルコールが好ましい。中でも、親水性ブロック鎖の溶解性が高く、有機溶媒の除去によるキセロゲルの形成が容易であることから、炭素数１〜４のアルコールが好ましい。好ましい有機溶媒の具体的としては、メタノール、エタノール、プロパノール、２‐プロパノール、ブタノール、２‐ブタノール等が挙げられる。

有機溶媒は２種以上を混合して用いてもよい。２種以上の有機溶媒を混合することにより、疎水性ブロック鎖や親水性ブロック鎖の溶解性を調整してもよい。また、溶解性の高い有機溶媒を用いて両親媒性ポリマーを溶解させた後、疎水性ブロック鎖に対する溶解性の低い有機溶媒を加えることにより、疎水性ブロックの凝集による物理架橋を促進し、ゲルのマトリクスを形成することもできる。２種以上の有機溶媒が用いられる場合、少なくとも１種が上記のアルコールであることが好ましい。２種以上のアルコールを用いてもよい。有機溶媒が２種以上の有機溶媒の混合溶媒である場合、有機溶媒全量の５０重量％以上が上記のアルコールであることが好ましい。有機溶媒全量に対するアルコールの量は、６０重量％以上がより好ましく、７０重量％以上がさらに好ましい。

両親媒性ポリマーと有機溶媒の比は特に限定されず、両親媒性ポリマーの分子量や、有機溶媒の種類等に応じて、両親媒性ポリマーを溶解または膨潤可能な範囲で設定すればよい。隣接する両親媒性ポリマーの距離を適切に保ち、ゲルの形成を抑制する観点から、有機溶媒の量は、両親媒性ポリマー１００重量部に対して、１００〜１５００重量部が好ましく、２００〜１０００重量部がより好ましい。オルガノゲル組成物中の両親媒性ブロックポリマーの含有量は、１０重量％以上であることが好ましい。

オルガノゲルの形成においては、加熱下で、両親媒性ポリマーと有機溶媒とを共存させることにより、両親媒性ブロックポリマーを有機溶媒に溶解または膨潤させて流動性を有する粘性液体を調製することが好ましい。加熱によりポリマーの分子運動が活性化されるため、有機溶媒による両親媒性ポリマーの膨潤・溶解が促進される。加熱温度は、溶媒の沸点以下の範囲であればよく、例えば５０〜９５℃程度であり、６０〜９０℃程度が好ましい。両親媒性ブロックポリマーの溶液または膨潤物が冷却され、ゲル化点以下になると、疎水性ブロック鎖が物理架橋の形成が促進され、流動性の低い（あるいは流動性を有さない）オルガノゲルが得られる。

オルガノゲルから分散媒としての有機溶媒を除去することにより、キセロゲル（乾燥ゲル）が得られる。オルガノゲルからの有機溶媒の除去方法は特に限定されず、非溶媒との接触によりゲルを沈殿させる方法、窒素等のガスによる乾燥、真空乾燥、加熱乾燥、加熱真空乾燥、凍結乾燥、超臨界乾燥等が含まれる。有機溶媒除去の促進等の目的で、オルガノゲルを粉砕して粒子化した後、溶媒の除去を行ってもよい。また、溶媒を除去しながらゲルを粉砕してもよい。

有機溶媒の除去の程度は特に限定されないが、湿潤性を有さない固体状になるまで溶媒を除去することが好ましい。キセロゲルは実質的に分散媒を含有しないことが好ましい。キセロゲルにおける分散媒の含有量は、ゲル組成物全量に対して２０重量％以下が好ましく、１０重量％以下がより好ましく、５重量％以下がさらに好ましい。オルガノゲルからキセロゲルを形成する際に、有機溶媒を十分に除去することにより、キセロゲルから形成されるヒドロゲル中の有機溶媒の含有量を低減させ、細胞に対する毒性を低下させるとともに、生体安全性を高めることができる。

キセロゲルを水または水溶液と混合することにより、ヒドロゲルが得られる。キセロゲルを水または水溶液と混合して湿潤させる方法は、ヒドロゲルの形成が容易であり、かつ残存有機溶媒を低減できるため好ましい。また、また、オルガノゲルから溶媒を除去したキセロゲルでは、オルガノゲル形成時の物理架橋構造を維持しやすく、キセロゲルに水または水溶液を接触させて湿潤させたヒドロゲルにおいても物理架橋構造が維持されやすいため、ゲルの安定性に優れる。

キセロゲルからヒドロゲルを形成する際に用いられる水溶液としては、注射用蒸留水、生理食塩水、緩衝液等の生化学的、薬学的に許容し得る水溶液が好ましく用いられる。細胞懸濁液等の細胞を含む水溶液をキセロゲルに加えてヒドロゲルを形成してもよい。細胞を含む水溶液を用いて形成したヒドロゲルは、そのまま細胞培養に用いることができる。この場合、ゲル中に細胞を移植する必要がなく、ゲル中に細胞を分散させることができるため、作業性に優れる。

ゲル組成物中には、細胞培養に用いられる各種の物質が含まれていてもよい。細胞培養に用いられる物質としては、各種の無機塩類、炭水化物、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸、脂質、タンパク質、ペプチド等が挙げられる。また、細胞接着エピトープ、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニスト、リガンド、細胞外マトリックス成分等を、ゲル組成物中に含めてもよい。これらの機能を有する官能基で両親媒性ポリマーを修飾してもよい。ゲル組成物中には、防腐剤、可塑剤、界面活性剤、消泡剤、安定剤、緩衝剤、ｐＨ調整剤、浸透圧調整剤、等張化剤等が含まれていてもよい。

ヒドロゲルの調製において、両親媒性ポリマーと水の比は特に限定されず、両親媒性ポリマーの分子量や質量等に応じて、ゲルを湿潤可能な範囲で設定すればよい。隣接する両親媒性ブロックポリマーの分子間距離を適切に保ち、ゲルの強度を維持する観点から、ヒドロゲルにおける水の量は、両親媒性ポリマー１００重量部に対して、５０〜１５００重量部が好ましく、１００〜１０００重量部がより好ましい。ヒドロゲル組成物中の両親媒性ブロックポリマーの含有量は、１０重量％以上であることが好ましい。

ヒドロゲルを形成後に、水を除去してキセロゲルを形成してもよい。例えば、有機溶媒に不溶の物質や、有機溶媒により分解されやすい物質等をゲル組成物中に含める場合は、ヒドロゲル中にこれらの物質を混合後に、水を除去することにより、これらの物質を含有するキセロゲルが得られる。得られたキセロゲルを、再度、水または水溶液により湿潤させることによりヒドロゲルが得られる。

生体への毒性や刺激性を低減する観点から、ヒドロゲルは、有機溶媒の含有量が極力少ないことが好ましい。ヒドロゲルの分散媒全体に占める水の割合は、８０重量％以上が好ましく、９０重量％以上がより好ましく、９５重量％以上がさらに好ましく、９８重量％以上が特に好ましい。有機溶媒の含有量を低減するために、オルガノゲルからキセロゲルを形成する際の有機溶媒の除去率を高めることが好ましい。また、上述のように、オルガノゲルからキセロゲルを形成後に、ヒドロゲルの形成と分散媒の除去によるキセロゲルの形成とを繰り返し行うことによっても、有機溶媒の含有量を低減できる。

ウェルプレート等の基板上でオルガノゲルから有機溶媒を除去すれば、基板上にキセロゲルを備える細胞培養用基板が得られる。例えば、両親媒性ポリマーを有機溶媒に溶解し、流動性を有する状態でウェル上に滴下後に溶媒を除去すればよい。また、基板上でヒドロゲルから水を除去してキセロゲルを形成してもよい。基板上で溶媒を除去することにより、基板表面にキセロゲルが固着した状態となるため、培養用基板の保管および取り扱いが容易となる。キセロゲルが形成された培養用基板上に細胞を含む水溶液を加えることにより、細胞を内包するヒドロゲルを形成できる。

キセロゲルは室温でも保管が可能であり、冷蔵や冷凍による管理を必要としない。そのため、基板上にキセロゲルを備える細胞培養用基板も、室温での保管が可能である。この形態では、用時調製によりキセロゲル上に水または水溶液を加えることによりヒドロゲルが得られるため、試料の取り扱いが容易である。また、基板上のキセロゲルに細胞培養液等の培養対象の細胞を含む水溶液を添加すれば、細胞を内包するヒドロゲルが得られるため、作業性の飛躍的な向上が期待できる。

［ゲル組成物の用途］
本発明の細胞培養用ゲル組成物は、各種の細胞の培養に用いられる。本発明の細胞培養方法では、ヒドロゲル中に培養対象となる細胞を内包させた状態で細胞培養が行われる。ヒドロゲルに細胞を内包させる方法としては、ヒドロゲルに細胞懸濁液等の培養対象細胞を含む溶液を注入する方法が挙げられる。前述のように、キセロゲルと細胞懸濁液等の細胞を含む水溶液を混合して、細胞を内包するヒドロゲルを形成してもよい。この方法は、ヒドロゲル中に細胞を注入する作業を必要とせず、作業性に優れる。また、ヒドロゲル中に細胞を均一に分散させることが可能である。

細胞の種類は特に限定されず、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、幹細胞、骨芽細胞、線維芽細胞等を適用可能である。ゲル組成物を用いた細胞培養は、二次元培養および三次元培養のいずれでもよい。本発明のゲル組成物を三次元培養の足場基材として利用すれば、より生体に近い環境で細胞スフェロイドが成長し、培養細胞の高機能化を実現可能である。また、本発明のゲル組成物は生分解性の合成ポリマーをベースとしており動物由来材料を利用しないため、品質の安定性および安全性に優れ、ヒト等の生体への適用も可能であり、再生医療を含む細胞培養分野での応用が期待される。

細胞の培養条件は特に限定されず、一般的な細胞培養条件を適用できる。培養後の細胞は、ゲル組成物に内包された状態で生体へ移植してもよく、ゲルを分解して培養後の細胞を回収してもよい。上述のように、ゲル組成物のベースとなる両親媒性ブロックポリマーは生分解性を有し、生体に移植した場合でも、毒性を示し難い。本発明のゲル組成物を用いれば、三次元培養により形成された細胞スフェロイドをゲル中に内包した状態でそのまま生体に移植可能であるため、生体への細胞の生着率の向上が期待できる。

本発明のゲル組成物は、両親媒性ポリマーの濃度が低下すると、隣接するポリマー間の相互作用が弱められてゲルが分解しやすくなる。細胞を内包するゲル組成物を生体内に移植すると、生体内の水分によりゲル組成物中のポリマー濃度が低下するため、ゲルが分解し、細胞の生着の促進が期待できる。

培養後の細胞を回収する場合でも、ゲルに水または水溶液を加えて濃度を低下させることにより、ゲルが容易に分解するため、細胞の回収が容易である。例えば、ヒドロゲル内で細胞を培養後、培地等の水分をヒドロゲルに添加するか、あるいはピペッティング等によりゲルを溶解させた後、遠心分離を行うことにより、細胞を回収できる。

以下、実施例を示して本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。

［キセロゲルの作製］
ＷＯ２００９／１４８１２１号に記載の方法を参照して、サルコシン無水物およびアミノ化ポリＬ−乳酸をモノマー成分として、グリコール酸、Ｏ‐（ベンゾトリアゾル‐１‐イル）‐Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’‐テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩（ＨＡＴＵ）およびＮ，Ｎ‐ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を用いて、サルコシン単位１０８個からなる親水性ブロックとＬ‐乳酸単位３２個からなる疎水性ブロックとを有する直鎖状の両親媒性ブロックポリマー（ＰＬＡ_３２−ＰＳａｒ_１０８）を合成した。

上記で得られたポリマーに重量比で５倍量のエタノールを添加し，７０℃で加温したところ、ポリマーが溶解し、乳白色の溶液が得られた。この溶液を２４ウェルプレートの１ウェルに６００ｍｇ（ポリマー量１００ｍｇ）ずつ添加し、安全キャビネット内で一晩風乾して溶媒を除去し、乾燥ゲル（キセロゲル）を得た。

［実験例１：HePG2細胞の培養］
実験例１では、上記のゲル物質を培養基材としてHepG2細胞の培養を行い、培養細胞の観察および遺伝子発現量の定量を行った。

［実験例１‐１：HepG2培養細胞のＲＮＡの定量］
上記で得られたウェル上のキセロゲルに，１ウェルにつき２．５×１０^４個／５００μＬのHepG2細胞懸濁液を添加したところ、ゲルが吸水して半透明のヒドロゲルが得られた。比較対象として、自己組織化ペプチドを構成成分とするヒドロゲル（３Ｄマトリックス社 「PuraMatrix」）を１ウェルに２５０μＬロードし、１ウェルにつき２．５×１０^４個／５００μＬのHepG2細胞懸濁液を添加した。

これらの試料を３７℃，５％ＣＯ_２環境下で培養し、２日後に、両親媒性ブロックポリマーから得られたヒドロゲルのウェルおよびPuraMatrixのウェルのそれぞれに、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を５００μＬ添加し、ウェル上でピペッティングによる混合を行った後、１．５ｍＬのマイクロチュープに全量を移した。遠心分離を行い、沈殿物を回収し、QIAGEN RNeasy KitによりＲＮＡを回収し、蛍光測定（サーモフィッシャーサイエンティフック社「Ｑｂｉｔ」）により総ＲＮＡ濃度を測定した。培養開始から３日および７日の試料についても、同様の操作により総ＲＮＡ濃度を測定した。

両親媒性ブロックポリマー（PSar-PLLA）から得られたヒドロゲルのウェルでは、２日後、３日後および７日後のＲＮＡ濃度が、それぞれ５．０ｎｇ／μＬ、１１．６ｎｇ／μＬおよび９２．６ｎｇ／μＬであり、日数経過とともに回収ＲＮＡ量が増加していた。この結果から、本発明のゲル組成物中で細胞が増殖していることが確認された。

一方、PuraMatrixのウェルでは、２日後、３日後および７日後のいずれもＲＮＡ濃度が検出限界以下であった。本発明のゲル組成物は、ＰＢＳの添加に伴うポリマー濃度の低下によりゲルが分解（溶解）し、ゲルに内包された細胞を回収可能であったのに対して、PuraMatrixでは濃度を低下させてもペプチドの自己凝集力が保持されるためにゲルが分解し難く、ゲル中の細胞を取り出すことができなかったと考えられる。

［実験例１‐２：HepG2培養細胞の観察］
実験例１‐１と同様に、ウェル上に両親媒性ポリマーのキセロゲルを作製し、HepG2細胞懸濁液を添加した後、３７℃，５％ＣＯ_２環境下で培養し、２日後および７日後に、倒立型顕微鏡による観察を行った。比較対象として、動物由来のＥＣＭをベースとするヒドロゲル（コーニング社「Matrigel」の１０倍希釈液）を１ウェルに２５０μＬロードし、その上にHepG2細胞懸濁液を添加したもの、およびポリスチレン製の平面培養基板上にHepG2細胞懸濁液を添加したものを同条件にて培養し、倒立顕微鏡による観察を行った。

それぞれの試料の培養開始から２日後および７日後の顕微鏡観察像を図１に示す。平面培養（２Ｄ）では、平面的に細胞が増殖していく様子が観察されたのに対して、Matrigel上で培養を行った試料では、一部の細胞が塊になっている様子が観察された。両親媒性ポリマー（PSar-PLLA）のゲル上で培養を行った試料では、培養開始から２日後（Ｄａｙ２）に、複数の細胞の塊（スフェロイド）が観察され、７日後（Ｄａｙ７）では細胞の塊が大きくなっていた。倒立顕微鏡の観察位置をｚ方向に変えて７日後の試料の白矢印で示した細胞を観察したところ、図２に示すように、ゲル中で立体的に細胞が増殖していることが確認された。

［実験例１‐３：HepG2培養細胞のCYP3A4遺伝子発現量］
実験例１‐２と同様に、両親媒性ポリマー（PSar-PLLA）のゲル、Matrigelおよび平面培養基板で２日間の培養を行った後、実験例１‐１と同様にしてQIAGEN RNeasy KitによりＲＮＡを回収した。以下の手順により、回収したＲＮＡ中のＣＹＰ３Ａ４をコードするｍＲＮＡの発現量を調べた。回収したＲＮＡから５０ｎｇを採取し、cDNA Reverse Transcription Kit（サーモフィッシャーサイエンティフック社）により逆転写を行い、ｃＤＮＡを調製した。ＣＹＰ３Ａ４のｃＤＮＡを特異的に増幅するプライマーとＣＹＰ３Ａ４遺伝子に特異的に結合するプローブを用いて、TaqManPCR法によりリアルタイムＰＣＲを実施した。内部コントロールとして、GAPDHの遺伝子発現量を求め、GAPDHのmRNA発現量に対するCYP3A4のmRNA発現量の相対値を求めた。両親媒性ポリマー（PSar-PLLA）のゲル、Matrigelおよび平面培養基板のそれぞれについてN＝３での平均を求めた。結果を図３に示す。

図３に示すように、両親媒性ポリマーのゲルを用いた培養群では、平面培養群と比較してCYP3A4遺伝子の発現が約６０倍向上しており、Matrigelを用いた培養群と比較してもCYP3A4遺伝子の発現量の向上がみられた。

［実験例２：初代培養幹細胞の観察およびCYP3A4遺伝子発現量］
実験例２では、HepG2細胞に代えて、肝臓特異的機能発現モデルとしてより生体に近いヒト由来の初代培養肝細胞を培養対象として、上記の実験例１−２および１−３と同様の実験を行った。

実験例１と同様に、ウェル上に両親媒性ポリマーのキセロゲルを作製し、１ウェルにつき２×１０^５個／５００μＬの初代培養肝細胞懸濁液を添加したところ、ゲルが吸水して半透明のヒドロゲルが得られた。３７℃，５％ＣＯ_２環境下で培養し、１日後、３日後および７日後に、倒立型顕微鏡による観察を行った。また、実験例１−３と同様にして、培養開始から１日後、２日後および３日後のそれぞれの培養細胞からＲＮＡを抽出し、GAPDHのmRNA発現量に対するCYP3A4のmRNA発現量の相対値を求めた。

比較対象として、Matrigelの１０倍希釈液を１ウェルに２５０μＬロードしてその上に初代培養肝細胞懸濁液を添加したもの、市販の三次元スフェロイド形成用マイクロプレート（コーニング社 製品番号４５１５）上に初代培養肝細胞懸濁液を添加したもの、およびポリスチレン製の平面培養基板上に初代培養肝細胞懸濁液を添加したものを同条件にて培養し、倒立顕微鏡による観察および遺伝子発現量の定量を行った。

実験例２の顕微鏡観察像を図４、GAPDHのmRNA発現量に対するCYP3A4のmRNA発現量の相対値（N＝３の平均）を図５に示す。

図４に示すように、いずれの培養試料においても経日的に細胞が増殖する様子が観察された。培養開始から１日後（Ｄａｙ１）では、両親媒性ポリマー（PSar-PLLA）のゲル上で培養を行った試料は，２００μｍ以上のスフェロイドが観察されたのに対して、他の培養試料では，スフェロイドは観察されなかった。スフェロイド形成用マイクロプレート（Corning #4515）を用いた試料では培養開始から３日後（Ｄａｙ３）に１００μｍ未満のスフェロイドが観察され、７日後（Ｄａｙ７）にスフェロイドのサイズが１００μｍ以上となっていた。Matrigel上で培養を行った試料では、培養開始から７日後に、細胞がプレート底面に接着している様子が観察された。両親媒性ポリマーのゲル上で培養を行った試料は，培養開始から７日後に、スフェロイドが分断している様子が観察された。

図５において、培養開始から１日後には４つの培養群で明確な差はみられなかったが、２日後には、両親媒性ポリマーのゲルを用いた培養群のCYP3A4遺伝子の発現量が、平面培養群と比較して約５倍、Matrigelを用いた培養群と比較して約４．５倍、スフェロイド形成用マイクロプレートを用いた培養群と比較して約７倍であり、危険率５％で有意差が認められた。培養開始から３日後には、両親媒性ポリマーのゲルを用いた培養群のCYP3A4遺伝子の発現量は、Matrigelを用いた培養群とほぼ同等であった。

以上の結果から、両親媒性ブロックポリマーを構成要素とするゲルは、種々の細胞の三次元培養用基材として有用であることが分かる。両親媒性ブロックポリマーを構成要素とするゲルは、従来の三次元培養基材と比較してより短期間で三次元的に細胞がスフェロイドを形成し、生体内の細胞と同等の機能を有する高機能の培養細胞が得られることが分かる。

Claims (13)

1. 親水性ブロック鎖と疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックポリマーを含有し、
   前記両親媒性ブロックポリマーは、前記親水性ブロックが２０個以上のサルコシン単位を有し、前記疎水性ブロック鎖が１０個以上の乳酸単位を有する、細胞培養用ゲル組成物。
2. 実質的に分散媒を含有しないキセロゲルである、請求項１に記載の細胞培養用ゲル組成物。
3. 分散媒として水を含むヒドロゲルである、請求項１に記載の細胞培養用ゲル組成物。
4. 前記両親媒性ブロックポリマーを１０重量％以上含有する、請求項３に記載の細胞培養用ゲル組成物。
5. 親水性ブロック鎖と疎水性ブロック鎖とを有する両親媒性ブロックポリマーを有機溶媒と混合することによりオルガノゲルを調製し、
   前記オルガノゲルから有機溶媒を除去することによりキセロゲルを形成し、
   前記両親媒性ブロックポリマーは、前記親水性ブロックが２０個以上のサルコシン単位を有し、前記疎水性ブロック鎖が１０個以上の乳酸単位を有する、
   細胞培養用ゲル組成物の製造方法。
6. 前記有機溶媒が炭素数１〜６のアルコールを含む、請求項５に記載の細胞培養用ゲル組成物の製造方法。
7. 細胞培養用基板上で前記オルガノゲルから有機溶媒を除去することにより、細胞培養用基板上に前記キセロゲルを形成する、請求項５に記載の細胞培養用ゲル組成物の製造方法。
8. 請求項５〜７のいずれか１項に記載の方法によりキセロゲルを形成し、前記キセロゲルと水または水溶液とを混合することによりヒドロゲルを形成する、細胞培養用ゲル組成物の製造方法。
9. 前記水溶液が培養対象の細胞を含み、前記キセロゲルと前記水溶液とを混合することにより細胞を内包するヒドロゲルを形成する、請求項８に記載の細胞培養用ゲル組成物の製造方法。
10. 請求項３に記載のゲル組成物中で細胞を培養する、細胞培養方法。
11. 請求項１０に記載の方法により細胞を培養後、細胞を内包するヒドロゲルに水または水溶液を加えることによりゲルを溶解し、培養後の細胞を回収する、細胞培養方法。
12. 基板上に請求項２に記載のキセロゲルを備える細胞培養用基板。
13. 前記基板上に前記キセロゲルが固着している、請求項１２に記載の細胞培養用基板。