DE102020116108A1 - Verfahren zur Herstellung von Trägerpartikeln für die Kultivierung biologischer Zellen, Trägerpartikel und deren Anwendung - Google Patents

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Abstract

Ein Verfahren zur Herstellung von Trägerpartikeln für die Kultivierung biologischer Zellen umfasst die Schritte Bereitstellung einer wässrigen Suspension von Hydrogel-Kügelchen und Gefriertrocknung der Hydrogel-Kügelchen, so dass trockene Hydrogel-Partikel gebildet werden, wobei der Suspension mindestens eine Lyoprotektant-Substanz zugesetzt wird, die Hydrogel-Kügelchen in der Suspension mit der Lyoprotektant-Substanz beladen werden und die trockenen Hydrogel-Partikel unter der Wirkung der Lyoprotektant-Substanz eine Form erhalten, welche an eine sphärische Partikelform angenähert ist und auch nach der Rehydratisierung erhalten bleibt. Es werden auch Trägerpartikel für eine Kultivierung biologischer Zellen, die trockene Hydrogel-Partikel, vorzugsweise mit einer Proteinbeschichtung, umfassen, und Anwendungen der Trägerpartikel beschrieben.

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Trägerpartikeln für die Kultivierung biologischer Zellen, insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von getrockneten Hydrogel-Partikeln. Des Weiteren betrifft die Erfindung Trägerpartikel für eine Kultivierung biologischer Zellen, insbesondere getrocknete Hydrogel-Partikel, die mit dem genannten Verfahren hergestellt sind, und Anwendungen der Trägerpartikel. Anwendungen der Erfindung sind bei der Kultivierung biologischer Zellen, insbesondere bei der Kultivierung (Expansion) von multipotenten und pluripotenten Stammzellen oder von differenzierten Zellen, z.B. für das Tissue engineering, gegeben.
  • In der vorliegenden Beschreibung wird auf den folgenden Stand der Technik Bezug genommen, der den technischen Hintergrund der Erfindung darstellt:
    1. [1] Dissertation „Untersuchung von strukturbildenden zellulären Prozessen im Kontext des Tissue Engineerings: Alginat-basierte Gerüststrukturen“ Michael Gepp, Universität des Saarlandes, 2017;
    2. [2] EP 2 361 968 A1 ;
    3. [3] US 6 642 363 B1 ; und
    4. [4] M. Gepp et al. in „J. Appl. Phycol." (2017) 29:2451-2461.
  • Die Verwendung von Polysaccharid-Polymeren, insbesondere von Alginat-Hydrogelen (auch kurz als Alginate bezeichnet), als Träger für Zellkulturen ist allgemein bekannt (siehe [1] und darin zitierte Literatur). Alginate können schichtförmig auf zweidimensionalen Substraten oder als Zell-Carrier (kugelförmige Partikel, Kügelchen, Carrier-Beads, Micro-Carrier) in Suspensionen verwendet werden (siehe z. B. [1], [2]). In Abhängigkeit von der konkreten Kultivierungsaufgabe und den zu kultivierenden Zellen können Alginate durch Zusatzstoffe modifiziert werden. Zusatzstoffe umfassen z. B. Peptide oder Kollagen, welche die Zelladhäsion beeinflussen (siehe z. B. [3] oder [4]). Die Zellkultivierung auf Micro-Carriern in Suspensionen, z. B. in Bioreaktoren, hat Vorteile für die Bildung von dreidimensionalen Zellanordnungen (z. B. 3D-Aggregate, Sphäroide, Mikro-Carrier-Zell-Hybride) unter nahezu physiologischen Bedingungen, und sie erlaubt eine effiziente Prozessführung, da ein günstigeres Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis eingestellt werden kann.
  • Die herkömmliche Zellkultivierung unter Verwendung von Alginaten als Micro-Carrier in einem Bioreaktor umfasst beispielsweise die folgenden Schritte. Zunächst werden Alginat-Kügelchen hergestellt, indem flüssiges Alginat durch Vernetzung in Kugelform ausgefällt wird (siehe z. B. [1]). Es wird eine Suspension von Alginat-Kügelchen gebildet, die, je nach Anwendung, eine Größenverteilung mit Durchmessern im Bereich von 200 µm bis 500 µm aufweisen. Die Breite der Größenverteilung, die in Abhängigkeit von Vertropfungsbedingungen einstellbar ist, kann sich auf die nachfolgende Zellkultivierung auswirken. Nach einem Waschen der vernetzten Alginat-Kügelchen erfolgt deren Modifizierung (Aktivierung und/oder Funktionalisierung), z. B. durch Ankopplung von Tyramin oder eine Einstellung der Elastizität der Kügelchen mittels vor der Herstellung der Alginat-Kügelchen gewählter Alginatmischungen. Die fertig modifizierten Alginat-Kügelchen werden in einem Kultivierungsmedium suspendiert und in einen Bioreaktor gegeben. Die zu kultivierenden Zellen werden der Suspension im Bioreaktor zugesetzt, wo sie die Alginat-Kügelchen besiedeln und einem vorgegebenen Kultivierungsprotokoll unterzogen werden.
  • Das herkömmliche Verfahren hat die folgenden Nachteile und Beschränkungen. Die Herstellung der modifizierten Alginat-Kügelchen mit vorbestimmten Eigenschaften erfordert Spezialkenntnisse, was eine routinemäßige Bereitstellung der Alginat-Kügelchen in einem Labor zur Zellkultivierung oder für eine industrielle Anwendung erschwert. Typischerweise werden die Alginat-Kügelchen nach Vorgaben des Anwenders, z. B. mit einer bestimmten Größenverteilung, Durchmesser) und/oder Modifizierung, hergestellt, zum Anwender in Suspension geliefert und beim Anwender zunächst gelagert. Von Nachteil ist jedoch, dass der Transport und die Lagerung der Suspension beim Anwender die Alginat-Kügelchen in unerwünschter Weise verändern können.
  • Alginat-Kügelchen können aggregieren (verklumpen) oder zerfallen, was sich nachteilig auf eine genaue, reproduzierbare Dosierung durch den Anwender auswirkt. Bei der Lagerung kann die Sterilität der Alginat-Kügelchen verloren gehen. Des Weiteren können Eigenschaften der fertigen Alginat-Kügelchen vom Anwender nicht oder nur sehr beschränkt geprüft oder variiert werden. Beispielsweise lässt sich die Größenverteilung von Alginat-Kügelchen in einer Suspension nachträglich, wenn überhaupt, nur unter großem Aufwand verändern. Der Wasseranteil der Alginat-Kügelchen kann das Kultivierungsmedium im Bioreaktor verfälschen. Um dies zu vermeiden, kann die Zahl der Alginat-Kügelchen gering gehalten werden, was jedoch zu einem hohen Medienverbrauch und einer kleinen Zahl kultivierbarer Zellen führt. Im Ergebnis zeichnen sich herkömmliche Verfahren zur Zellkultivierung durch eine geringe Effektivität, hohe Prozesskosten, keine Skalierbarkeit, eine beschränkte Erfolgsquote und eine geringe Reproduzierbarkeit aus.
  • Es ist auch bekannt, Alginat-Kügelchen einer Trocknung zu unterziehen ([1]). Getrocknete Alginat-Kügelchen lassen sich besser lagern als in Suspension. Des Weiteren können getrocknete Alginat-Kügelchen mit dem Kultivierungsmedium im Bioreaktor rehydratisiert werden. Die Beschränkungen der herkömmlichen Anwendungen von Alginat-Kügelchen konnten damit in der Praxis jedoch bisher nicht überwunden werden. Auch bei der Anwendung von herkömmlich getrockneten und rehydratisierten Alginat-Kügelchen hat sich gezeigt, dass die getrockneten Alginat-Kügelchen schwer handhabbar sind und die Zuverlässigkeit einer erfolgreichen Zellkultivierung und die Reproduzierbarkeit des Kultivierungsergebnisses selbst bei Anwendung gleichbleibender Kultivierungsprotokolle beschränkt sind.
  • Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Trägerpartikeln für die Kultivierung biologischer Zellen, insbesondere ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von getrockneten Hydrogel-Partikeln, bereitzustellen, mit dem Nachteile herkömmlicher Techniken überwunden werden. Die Aufgabe der Erfindung ist es des Weiteren, verbesserte Trägerpartikel für eine Kultivierung biologischer Zellen bereitzustellen, mit denen Nachteile herkömmlicher Trägerpartikel überwunden werden. Die Erfindung soll insbesondere Trägerpartikel bereitstellen, die reproduzierbare Eigenschaften haben, eine verbesserte Lagerungsfähigkeit aufweisen, genauer dosierbar sind, einfacher modifizierbar sind und/oder für eine routinemäßige Anwendung in Bioreaktoren verschiedener Bauformen und Aufgaben geeignet sind. Erfindungsgemäß hergestellte Trägerpartikel sollen insbesondere eine Zellkultivierung mit erhöhter Effizienz, Erfolgsquote und/oder Reproduzierbarkeit erlauben.
  • Diese Aufgaben werden jeweils durch ein Verfahren zur Herstellung von Trägerpartikeln für die Kultivierung biologischer Zellen und durch Trägerpartikel gelöst, welche die Merkmale der unabhängigen Ansprüche aufweisen. Bevorzugte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
  • Gemäß einem ersten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die obige Aufgabe durch ein Verfahren zur Herstellung von Trägerpartikeln für die Kultivierung biologischer Zellen gelöst, das die folgenden Schritte umfasst. Es wird eine wässrige Suspension von sphärischen Hydrogel-Kügelchen bereitgestellt. Vorzugsweise werden die Hydrogel-Kügelchen durch Vernetzung eines Vorläuferpolymers mit einem ionischen Fällungsmittel frisch hergestellt. Die Herstellung der Hydrogel-Kügelchen kann mit an sich bekannten Verfahren erfolgen. Die Suspensionsflüssigkeit der wässrigen Suspension von Hydrogel-Kügelchen umfasst eine wässrige Lösung mit dem Fällungsmittel, in der die Herstellung der Hydrogel-Kügelchen erfolgt, und/oder eine Wasch- und/ oder Pufferlösung, mit der die Hydrogel-Kügelchen nach der Fällung optional gewaschen werden. Anschließend erfolgt eine Gefriertrocknung der Hydrogel-Kügelchen, so dass getrocknete Hydrogel-Partikel gebildet werden. Die Gefriertrocknung der Hydrogel-Kügelchen umfasst eine Beaufschlagung der Hydrogel-Kügelchen mit einer reduzierten Temperatur (Temperatur unterhalb der Raumtemperatur, vorzugsweise unter 0°C) und mit einem Unterdruck (Druck geringer als Atmosphärendruck). Die Gefriertrocknung der Hydrogel-Kügelchen erfolgt vorzugsweise im suspendierten Zustand mit der Suspensionsflüssigkeit, wobei zunächst die Suspensionsflüssigkeit entfernt und dann die Hydrogel-Kügelchen getrocknet werden. Alternativ können die Hydrogel-Kügelchen vor der Gefriertrocknung aus der Suspensionsflüssigkeit der wässrigen Suspension entnommen werden, d. h. die Suspensionsflüssigkeit wird vor der Gefriertrocknung von den Hydrogel-Kügelchen getrennt.
  • Gemäß der Erfindung wird der Suspensionsflüssigkeit mindestens eine Lyoprotektant-Substanz zugesetzt, wobei die Hydrogel-Kügelchen in der Suspension vor der Gefriertrocknung mit der Lyoprotektant-Substanz beladen werden. Die Lyoprotektant-Substanz (oder: Lyoprotektivum) ist eine Substanz, die eine Beschädigung der Hydrogel-Kügelchen, insbesondere der Makromoleküle, aus denen die Hydrogel-Kügelchen aufgebaut sind, durch Eisbildung bei der Gefriertrocknung minimiert oder die Beschädigung verhindert. Des Weiteren wird eine Lyoprotektant-Substanz verwendet, die bewirkt, dass die Hydrogel-Kügelchen nach der Gefriertrocknung, d. h. die getrockneten Hydrogel-Partikel, unter der Wirkung der Lyoprotektant-Substanz eine Form aufweisen, welche an eine sphärische Partikelform angenähert ist.
  • Die Hydrogel-Kügelchen umfassen vorzugsweise Alginat-Kügelchen (Alginat-Hydrogele). Die Umsetzung der Erfindung in der Praxis ist jedoch nicht auf Alginat-Kügelchen beschränkt, sondern entsprechend auch mit Kollagen-, Gellan- oder Pektin-Hydrogelen. Alginat hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, da es einen Formspeicher-Effekt (Memory-Effekt) aufweist und nach dem Gefriertrocknen und der Rehydratisierung wieder sphärische Alginat-Kügelchen bildet.
  • Der Begriff „annähernd sphärische Partikelform“ schließt eine Gestalt eines getrockneten Hydrogel-Partikels ein, die einen Sphäroiden (insbesondere Kugel oder Ellipsoid) repräsentiert und eine glatte oder strukturierte Oberflächentopologie mit charakteristischen Strukturdimensionen wie z. B. Stufen, Vorsprüngen oder Vertiefungen, aufweist, die kleiner als eine Querschnittsdimension, vorzugsweise kleiner als 1/10 der Querschnittsdimension, des getrockneten Hydrogel-Partikels ist.
  • Gemäß einem zweiten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die obige Aufgabe durch Trägerpartikel für eine Kultivierung biologischer Zellen, die getrocknete Hydrogel-Partikel umfassen, die eine Lyoprotektant-Substanz enthalten und eine Form aufweisen, die an eine sphärische Form angenähert ist. Die Trägerpartikel sind vorzugsweise mit dem genannten Verfahren gemäß dem ersten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung oder einer seiner Ausführungsformen hergestellt. Vorzugsweise haben die Trägerpartikel eine charakteristische Querschnittsdimension, wie z. B. einen Durchmesser, im Bereich von 50 µm bis 2 mm.
  • Gemäß einem dritten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung wird die obige Aufgabe durch Anwendungen der Trägerpartikel gemäß dem zweiten allgemeinen Gesichtspunkt der Erfindung oder ihren Ausführungsformen als Zell-Carrier für die Kultivierung biologischer Zellen gelöst. Gemäß bevorzugten Varianten kann die Anwendung der Trägerpartikel in einem Suspensions-Bioreaktor, insbesondere einem Kultivierungsgefäß, einer Mikrotiterplatte, hängenden Tropfen, einem Zellkulturbeutel, einem (Suspensions-)bioreaktor und/oder einer Schale, wie zum Beispiel einer Petrischale, vorgesehen sein. Vorzugsweise umfasst die Anwendung der Trägerpartikel die Phasen Herstellung der getrockneten Partikel, Rehydratisierung und Waschung, Zellinokulation, Zellvermehrung und Zellpassage/Ernte.
  • Die Erfinder haben festgestellt, dass durch die erfindungsgemäße Beladung der Hydrogel-Kügelchen mit der Lyoprotektant-Substanz, welche die annähernd sphärische Partikelform der Getrockneten Hydrogel-Partikel bewirkt, die Nachteile herkömmlicher suspendierter oder getrockneter Alginat-Kügelchen in Bezug auf die Lagerfähigkeit, Dosierbarkeit und Handhabbarkeit vermieden werden. Es wird eine schonende Gefriertrocknung mit einem Struktur- und Funktionserhalt der sphärische Hydrogel-Kügelchen bewirkt.
  • Die Lagerfähigkeit ist verbessert, da ein Verkleben oder Aggregieren vermieden wird, im trockenen Zustand die Sterilität besser aufrechterhalten werden kann und somit ein Verkeimen der präparierten Carrier-Beads vermieden werden kann. Diese Vorteile gelten insbesondere auch gegenüber den herkömmlichen Ansätzen einer Gefriertrocknung von Alginat-Kügelchen, z. B. gemäß [1]. So haben die Erfinder festgestellt, dass die herkömmlichen Alginat-Kügelchen im getrockneten Zustand keine sphärische, sondern eine irregulär deformierte, z. B. gefaltete und/oder durch Risse oder Ausstülpungen versehene Gestalt haben, welche die Beschaffenheit der getrockneten Alginat-Kügelchen, z. B. durch Dichteschwankungen im Schüttmaterial und irreguläre Klumpenbildung, beeinträchtigt. Erfindungsgemäß hergestellte getrocknete Hydrogel-Partikel begünstigen eine sterile Lyophilisation und Rehydratisierung.
  • Die Dosierbarkeit ist verbessert, da die getrockneten Hydrogel-Partikel ein homogenes Material bilden, das vollständig rieselfähig ist oder einen schnittfähigen Kuchen (Lyo-Kuchen, auch als getrocknete Produktmatrix bezeichnet) bildet. Die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Konzentrationseinstellung der Carrier-Beads im Bioreaktor wird verbessert. Die getrockneten Hydrogel-Partikel können z. B. durch eine Volumenmessung, eine Massemessung und/oder eine optische Messung quantifiziert werden. Da die Getrockneten Hydrogel-Partikel opak sind, kann mit der optischen Messung die Rehydratisierung im Bioreaktor geprüft werden.
  • Die getrockneten Hydrogel-Partikel können vereinfacht verarbeitet werden. Die Verarbeitung erfolgt vorzugsweise in einer Sterilbank, wobei jedoch zur Dosierung kein Pipettieren erforderlich ist. Die getrockneten Hydrogel-Partikel können vereinfacht vorportioniert werden. Im Prozess der Herstellung und Anwendung der getrockneten Hydrogel-Partikel wird ein verbessertes Qualitätsmanagement ermöglicht.
  • Die getrockneten Hydrogel-Partikel können als rieselfähiges Schüttgut oder in Tablettenform angewendet und insbesondere direkt in einen Bioreaktor (Gefäß, in dem die Zellkultivierung erfolgt und das eine Einstellung von biochemischen und physikalischen Kultivierungsbedingungen ermöglicht) eingebracht werden. Vorteilhafterweise verfälschen die getrockneten Hydrogel-Partikel nicht das Gesamtvolumen des Kultivierungsmediums im Bioreaktor.
  • Die Anwendung der rehydratisierten Hydrogel-Kügelchen erfolgt vorzugsweise, indem die getrockneten Hydrogel-Partikel direkt in das Kultivierungsmedium im Bioreaktor gegeben werden. Die zu kultivierenden Zellen können bei Zufuhr der getrockneten Hydrogel-Partikel im Kultivierungsmedium bereits suspendiert sein oder nach der Rehydratisierung der getrockneten Hydrogel-Partikel in den Bioreaktor zugeführt werden. Der Rehydratisierungsgrad der getrockneten Hydrogel-Partikel wird vorzugsweise mit einer optischen Transmissionsmessung- oder Streulichtmessung am Kultivierungsmedium ermittelt. Besonders bevorzugt erfolgt die Zufuhr der Zellen in das Kultivierungsmedium, nachdem die getrockneten Hydrogel-Partikel vollständig hydratisiert sind.
  • Die Rehydratisierung der getrockneten Hydrogel-Partikel, z. B. in Wasser, kann optional als weiterer Teilschritt des erfindungsgemäßen Verfahrens betrachtet werden. Vorteilhafterweise weisen die bei der Rehydratisierung gebildeten Hydrogel-Kügelchen (rehydratisierte Hydrogel-Kügelchen) auch nach der Rehydratisierung eine sphärische Partikelform auf. Vorzugsweise zeichnen sich die rehydratisierten Hydrogel-Kügelchen durch die Kugelform aus, wie sie vor der Gefriertrocknung gegeben ist. Damit wird in einer Inokulationsphase die Kultivierung von Zellen auf den Hydrogel-Kügelchen begünstigt. Des Weiteren zeichnen sich kugelförmige, rehydratisierte Hydrogel-Kügelchen vorteilhafterweise durch ein günstiges Schwebe-Verhalten in der Suspension und eine im Vergleich zu deformierten Hydrogel-Kügelchen verminderte Neigung zu unerwünschten Aggregationen aus.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Hydrogel-Kügelchen mit einer Proteinschicht beladen. Diese Modifizierung erfolgt vorzugsweise nach Herstellung der Hydrogel-Kügelchen und vor der Gefriertrocknung. Die Proteinschicht kann z. B. Proteine der extrazellulären Matrix umfassen, so dass vorteilhafterweise eine Adhäsion der Zellen auf rehydratisierten Hydrogel-Kügelchen begünstigt wird. Die Proteinschicht kann eine sub-Monolage, eine Monolage oder eine Multilage von Proteinmolekülen auf den Hydrogel-Kügelchen umfassen. Beispielsweise wird nach der Herstellung der Hydrogel-Kügelchen in einer Suspension der Suspensionsflüssigkeit das mindestens eine, zu koppelnde Protein zugesetzt und mit dem Hydrogel-Kügelchen inkubiert. Vorteilhafterweise erlaubt die Inkubation eine kovalente Kopplung von mindestens einem Protein oder einem Vermittlermolekül mit der gesamten Oberfläche, einschließlich eventueller Poren, der Hydrogel-Kügelchen.
  • Die Beladung mit der Proteinschicht erfolgt vorzugsweise vor der Gefriertrocknung. Bei ausgewählten Anwendungen der Erfindung kann die Beladung mit der Proteinschicht nach der Gefriertrocknung, insbesondere nach der Rehydratisierung, z. B. im Bioreaktor, erfolgen. Beispielsweise kann mindestens ein Protein aus dem Kultivierungsmedium im Bioreaktor oder von bereits im Bioreaktor vorhandenen Zellen geliefert werden.
  • Vorzugsweise werden die Hydrogel-Kügelchen mit mindestens einem Vermittlermolekül (z.B. Tyramin) und/oder mindestens einem der Proteine beladen, die Laminin (rekombinant und gewebespezifisch), Vitronektin, (rekombinant und kompatibel mit pluripotenten Stammzellen), Kollagen (gewebespezifisch, kompatibel mit multipotenten Stammzellen), Proteine aus dezellularisiertem Gewebe (sehr gewebespezifisch) und komplexe Proteinmischungen aus der Basalmatrix (z.B. Geltrex, Matrigel, denovoMatrix) umfassen.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden nach der Gefriertrocknung Rückstände der Lyoprotektant-Substanz entfernt. Wenn Rückstände der Lyoprotektant-Substanz von den getrockneten Hydrogel-Partikeln getrennt werden, ergeben sich Vorteile für die spätere Rehydratisierung und die nachfolgende Zellkultivierung. Vorteilhafterweise werden Einflüsse der Lyoprotektant-Substanz auf die Zellen vermieden oder minimiert. Die Entfernung von Rückständen der Lyoprotektant-Substanz umfasst eine vollständige Beseitigung der Lyoprotektant-Substanz aus den getrockneten Hydrogel-Partikeln oder eine Beseitigung der Lyoprotektant-Substanz von den Oberflächen der getrockneten Hydrogel-Partikel. Besonders bevorzugt sind die Oberflächen der getrockneten Hydrogel-Partikel frei von Rückständen der Lyoprotektant-Substanz.
  • Besonders bevorzugt werden die Rückstände der Lyoprotektant-Substanz, wie z. B. der „Lyo-Kuchen“, durch eine mechanische Bearbeitung des getrockneten Materials, umfassend dessen Zerkleinerung und ein Sieben, entfernt. Vorteilhafterweise werden dabei gleichzeitig mit der Trennung der Lyoprotektant-Substanz vom getrockneten Hydrogel die getrockneten Hydrogel-Partikel voneinander getrennt.
  • Alternativ oder zusätzlich können gemäß einer weiteren Variante der Erfindung Rückstände der getrockneten Lyoprotektant-Substanz nach der Rehydratisierung der getrockneten Hydrogel-Partikel und vor der Anwendung der Partikel in einer Waschlösung, insbesondere aus Natriumchlorid, entfernt werden. Vorteilhafterweise wird durch das Waschen der rehydratisierten Hydrogel-Kügelchen ein Einfluss der Lyoprotektant-Substanz auf die nachfolgende Zellkultivierung weiter unterdrückt.
  • Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass verschiedene Lyoprotektant-Substanzen für die erfindungsgemäße Modifizierung der Hydrogel-Kügelchen verfügbar sind. Die Lyoprotektant-Substanz kann insbesondere Trehalose, Dimethylsulfoxid (DMSO), Sucrose und/oder ein Poloxamer umfassen. Diese Lyoprotektiva, die einzeln oder in Kombination verwendbar sind, haben den Vorteil, dass ihre Wirkung auf biologische Zellen gut untersucht ist. Unerwünschte Auswirkungen auf die Zellkultur können damit vermieden oder minimiert werden. Trehalose und/oder Sucrose werden besonders bevorzugt als Lyoprotektant-Substanz verwendet, da bei deren Anwendung Trägerpartikel gewonnen werden, die sich nach der Rehydratisierung durch einen besonders weitgehenden Form- und Funktionserhalt und in der Zellkultur durch eine besonders gute Zellenadhäsion auszeichnen.
  • Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Konzentration der Lyoprotektant-Substanz in der Suspensionsflüssigkeit mit den ursprünglich hergestellten Hydrogel-Kügelchen im Bereich von 1 mg/ml bis 500 mg/ml gewählt. Dieser Konzentrationsbereich wird bevorzugt, da unterhalb der Konzentration von 1 mg/ml eine Annäherung an die sphärische Partikelform nur unzureichend erzielte wird und oberhalb von 500 mg/ml eine übermäßige Belastung des Kultivierungsmediums im Bioreaktor durch die Lyoprotektant-Substanz auftreten kann.
  • Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung kann eine Funktionalisierung der erfindungsgemäß hergestellten Zell-Carrier für die Kultivierung biologischer Zellen vorgesehen sein. Vorzugsweise erfolgt eine Funktionalisierung der Hydrogel-Kügelchen vor oder während deren Herstellung (Einkapselung von Wirkstoffen, magnetischen Partikeln, etc.), z. B. vor oder während einer Vertropfung zur Herstellung der Hydrogel-Kügelchen durch Ausfällen, damit die Substanzen in der Hydrogelmatrix eingeschlossen sind, oder nach deren Bereitstellung und vor der Gefriertrocknung (z. B. Funktionalisierung der Oberfläche mit Tyramin und/oder Proteinen). Die Funktionalisierung umfasst den Zusatz von Partikeln und/oder Substanzen, welche den Hydrogel-Kügelchen weitere, über die Trägerfunktion hinausgehende Eigenschaften verleihen. Gemäß bevorzugten Varianten der Erfindung werden die Hydrogel-Kügelchen mit magnetischen Partikeln und/oder biologisch wirksamen Substanzen (Wirkstoffen) beladen. Besonders bevorzugt erfolgt die Zufuhr der magnetischen Partikel und/oder der Wirkstoffe vor der Gefriertrocknung. Die Erfinder haben festgestellt, dass auch die funktionalisierten Hydrogel-Kügelchen im getrockneten Zustand Partikel mit einer annähernd sphärischen Form und rehydratisierten Zustand kugelförmige Zell-Carrier bilden.
  • Hydrogel-Kügelchen, die jeweils einen oder mehrere magnetische Partikel enthalten, bieten vorteilhafterweise die Möglichkeit einer Manipulation der Zell-Carrier im Bioreaktor mittels magnetischen Feldern. Die magnetischen Partikel können aus an sich bekannten Permanent-Magnet-Materialien bestehen.
  • Als biologisch wirksame Substanzen zur Modifizierung von Hydrogel-Kügelchen werden vorzugsweise Differenzierungsfaktoren, d. h. biologisch wirksame Substanzen, die eine Zelldifferenzierung auslösen und/oder eine Richtung der Zelldifferenzierung zu einem bestimmten Zeitpunkt beeinflussen, verwendet.
  • Wenn gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung die Dispersion der ursprünglich bereitgestellten Hydrogel-Kügelchen eine kohäsionsmindernde Substanz enthält, wird ein gegenseitiges Anhaften der getrockneten Hydrogel-Partikel unterdrückt. Vorteilhafterweise wird damit eine Schüttfähigkeit der getrockneten Hydrogel-Partikel begünstigt. Besonders bevorzugt umfasst die kohäsionsmindernde Substanz Polyethylenglykol, dessen Wirkung auf biologische Zellen vorteilhafterweise gut untersucht ist.
  • Für die Gefriertrocknung der Hydrogel-Kügelchen kann ein an sich bekanntes Gefriertrocknungs-Verfahren gewählt werden. Bevorzugt wird zur Gefriertrocknung, insbesondere von Alginat-Kügelchen, ein Protokoll mit den folgenden Phasen angewendet. Zunächst erfolgt eine Einfrierphase, in der die in Suspension bereitgestellten Hydrogel-Kügelchen gemäß einer vorbestimmten Zeit-Temperatur-Funktion mit einem Einfrierintervall von mindestens 120 min und einer End-Temperatur unterhalb von - 20°C und oberhalb von - 80°C eingefroren. Vorzugsweise werden Einfrierraten im Bereich von 50°C/min (schnelles Einfrieren), über 1 bis 1,5°C/min (moderates Einfrieren) bis 0,1 bis 1°C/min (langsames Einfrieren) eingestellt. Die Einstellung in der Zeit-Temperatur-Funktion erlaubt vorteilhafterweise ein schonendes Einfrieren der Hydrogel-Kügelchen. Anschließend ist eine Stabilisierungsphase vorgesehen, in der die Hydrogel-Kügelchen für die Dauer eines Stabilisierungsintervalls von mindestens 90 min bei der End-Temperatur gelagert werden. Danach werden die gefrorenen Hydrogel-Kügelchen in einer ersten Trocknungsphase zur Bildung der getrockneten Hydrogel-Partikel, bei der End-Temperatur mit einem ersten Unterdruck beaufschlagt, der im Bereich von 30 µbar bis 60 µbar gewählt ist. Es folgt eine zweite Trocknungsphase, in der die trockenen Hydrogel-Partikel bei einer Temperatur gleich oder größer als die End-Temperatur mit einem zweiten Unterdruck beaufschlagt werden, der geringer als der erste Unterdruck ist. Schließlich erfolgt eine Belüftungsphase, in der die getrockneten Hydrogel-Partikel gemäß einer Zeit-Druck-Funktion mit einem Druckanstiegsintervall von mindestens 0.5 min bis 1 min (1 bar/min) in einen Normaldruck langsam überführt werden. Die Belüftungsphase erfolgt in einem Gefäß unter Beaufschlagung mit einem inerten Schutzgas oder Luft.
  • Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben. Die Zeichnungen zeigen in:
    • 1: ein Flussdiagramm, das Merkmale bevorzugter Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von Trägerpartikeln zeigt;
    • 2: ein Flussdiagramm, das Merkmale bevorzugter Ausführungsformen der Anwendung erfindungsgemäß hergestellter Trägerpartikel zeigt;
    • 3: photographische Bilder von rehydratisierten Trägerpartikeln im Vergleich zu herkömmlichen Trägerpartikeln; und
    • 4: eine schematische Verfahrensdarstellung einer Beispiel-Anwendung erfindungsgemäß hergestellter Trägerpartikel.
  • Die Erfindung wird im Folgenden unter beispielhaftem Bezug auf Alginat-basierte Zell-Carrier (Trägerpartikel) beschrieben. Alginat-Kügelchen, welche erfindungsgemäß mit der Lyoprotektant-Substanz beladen und der Gefriertrocknung unterzogen werden, können beispielsweise aus kommerziell verfügbaren Alginat hergestellt werden, das typischerweise eine geringe Viskosität durch relativ geringe Kettenlängen der Polymer-Makromoleküle aufweist. Alternativ kann Alginat mit einer im Vergleich zum kommerziell verfügbaren Alginat höheren Viskosität aufgrund längerer Molekülketten verwendet werden. Die Auswahl eines konkret zu verwendenden Alginat erfolgt beispielsweise in Abhängigkeit von der gewünschten Elastizität der Zell-Carrier bei der Zellkultivierung. Die Erfindung ist nicht auf die Verwendung von Alginat beschränkt, sondern entsprechend auch mit anderen Hydrogelen, wie zum Beispiel Kollagen-, Gellan- oder Pektin realisierbar.
  • Ausführungsformen der Erfindung werden im Folgenden insbesondere unter Bezug auf Beispiele für die Beladung von Alginat mit Lyoprotektant-Substanzen, die Modifizierung von Alginat-Kügelchen, getrockneten Alginat-Partikeln und/oder rehydratisierten Alginat-Kügelchen und die Protokolle der Gefriertrocknung beschrieben. Einzelheiten der Anwendung der rehydratisierten Alginat-Kügelchen bei der Kultivierung biologischer Zellen können realisiert werden, wie es an sich von der herkömmlichen Zellkultivierung bekannt ist.
  • 1 zeigt schematisch die Hauptschritte der erfindungsgemäßen Herstellung von getrockneten Alginat-Partikeln. Bei Schritt P1 werden Alginat-Kügelchen in einer wässrigen Suspension in einem Behälter hergestellt. Die Herstellung der Alginat-Kügelchen erfolgt beispielsweise durch Erzeugung von Na-Alginat-Tröpfchen mit einer Düse und Vernetzung der Alginat-Tröpfchen in einer wässrigen Suspensionsflüssigkeit mit einem ionischem Fällungsmittel, beispielsweise wie in [1] beschrieben ist. Als Fällungsmittel wird beispielsweise eine BaCl2-Lösung verwendet. Die Größe und Größenverteilung der Alginat-Kügelchen kann durch die Dimension der Düse und Betriebsparameter der Düse eingestellt werden. Die vernetzten Alginat-Tröpfchen bilden formstabile Alginat-Kügelchen, die in der Suspensionsflüssigkeit suspendiert sind.
  • Vorzugsweise werden die Alginat-Kügelchen nach der Ausfällung durch Beschichtung mit Tyramin und/oder einem Protein, wie z. B. Matrigel, funktionalisiert. Die Beschichtung erfolgt durch Niederschlag aus der Suspensionsflüssigkeit oder direkter kovalenter Ankopplung. Die Matrigelbeschichtung bietet Vorteile für die Adhäsion von Zellen bei einer nachfolgenden Zellkultivierung.
  • Bereits während des Eintropfens der Alginat-Tröpfchen in die Suspensionsflüssigkeit oder alternativ nach der Vernetzung und Bildung der Alginat-Kügelchen wird der Suspensionsflüssigkeit eine Lyoprotektant-Substanz zugesetzt. Bei Tests der Erfinder wurde als Lyoprotektant-Substanz beispielsweise Trehalose (100 mg/ml), Poloxamer (Handelsname Pluronic F 68, 1 mg/ml), und/oder Sucrose (100 mg/ml) in einer wässrigen NaCI-Lösung (0,9%) verwendet. Die Beladung der suspendierten Alginat-Kügelchen mit der Lyoprotektant-Substanz erfolgt z. B. durch Lagerung der Alginat-Kügelchen in einer wässrigen Lösung, welche die Lyoprotektant-Substanz, z. B. für mindestens einen Tag.
  • Optional werden bei Schritt P2 die mit der Lyoprotektant-Substanz beladenen Alginat-Kügelchen aus der Suspension entnommen. Beispielsweise wird die Suspensionsflüssigkeit abgegossen, so dass im Behälter die Alginat-Kügelchen, umgeben von Restflüssigkeit, zurückbleiben. Alternativ wird zur Entnahme ein Sieb verwendet.
  • Wenn Schritt P2 nicht vorgesehen ist, erfolgt unmittelbar nach der Beladung der Alginat-Kügelchen mit der Lyoprotektant-Substanz bei Schritt P3 die Gefriertrocknung der Alginat-Kügelchen. Dabei sind die folgenden Phasen vorgesehen.
  • Zunächst werden die Alginat-Kügelchen in einer Einfrierphase über 150 min von Raumtemperatur auf eine End-Temperatur von z. B. - 45 °C abgekühlt (ca. 0,4°C/min). Während der Einfrierphase wird beispielsweise eine lineare Zeit-Temperatur-Funktion realisiert.
  • Anschließend folgt eine Stabilisierungsphase, in der die Alginat-Kügelchen für die Dauer eines Stabilisierungsintervalls von 120 min bei der End-Temperatur gelagert werden. Die Stabilisierungsphase hat den Vorteil, dass die Probe mit den eingefrorenen Alginat-Kügelchen komplett durchgefroren wird, bevor die Trocknungsphasen ausgeführt werden.
  • Eine nachfolgende erste Trocknungsphase hat die Funktion einer Antrocknungsphase, in der die Suspensionsflüssigkeit mittels Sublimation entfernt wird. Die erste Trocknungsphase wird beispielsweise in einem Lyophilisator mit einer Kühleinheit und einem Kondensator durchgeführt.
  • Während der ersten Trocknungsphase wird die End-Temperatur, zum Beispiel - 45 °C, aufrechterhalten, während der Druck einer linearen Zeit-Druck-Funktion folgend über eine Dauer von 10 min vom Atmosphärendruck auf einen ersten Unterdruck von 50 µbar abgesenkt wird. Anschließend wird in der ersten Trocknungsphase die gefrorene Probe für eine Stabilisierungsdauer von zum Beispiel 80 Stunden bei der End-Temperatur und dem ersten Unterdruck gehalten.
  • In einer nachfolgenden zweiten Trocknungsphase werden die getrockneten Alginat-Partikel mit einem zweiten Unterdruck beaufschlagt, der geringer als der erste Unterdruck ist und zum Beispiel 100 µbar beträgt. Die Absenkung auf den zweiten Unterdruck erfolgt mit einer linearen Zeit-Druck-Funktion über eine Dauer von zum Beispiel 300 min. Während der zweiten Trocknungsphase ist die Temperatur der getrockneten Alginat-Partikel gleich der End-Temperatur oder eine erhöhte Temperatur, wie zum Beispiel Raumtemperatur (20 °C). Nach der Absenkung auf den zweiten Unterdruck wird die getrocknete Probe während der zweiten Trocknungsphase für eine Stabilisierungsdauer von zum Beispiel 20 Stunden bei dem zweiten Unterdruck gehalten.
  • Anschließend ist eine Belüftungsphase vorgesehen, in der die getrockneten Alginat-Partikel gemäß einer linearen Zeit-Druck-Funktion mit einem Druckanstiegsintervall von mindestens 1 min in einen Normaldruck überführt werden. Die Belüftungsphase kann mit Luft oder einem Inertgas vorgesehen sein. Durch die Anwendung eines relativ langen Druckanstiegsintervalls wird vorteilhafterweise eine Beschädigung der getrockneten Alginat-Partikel vermieden. Bei Belüftung mit Luft erfolgt vorher das Verschließen des Lagerungsgefäßes in der Kammer, während bei Nutzung eines Inertgases das Verschließen nach der Belüftung erfolgt.
  • Als Inertgas wird vorzugsweise trockener Stickstoff oder Argon verwendet. Besonders bevorzugt werden die getrockneten Alginat-Partikel in dem Inertgas oder im Vakuum gelagert. Praktische Tests haben eine Lagerungsfähigkeit der erfindungsgemäß hergestellten getrockneten Alginat-Partikel z. B. bei 4 °C ohne Funktionalitätsverlust über mehrere Monate ergeben.
  • Das beispielhaft beschriebene Verfahren der Gefriertrocknung P3 kann in Bezug auf die eingestellten Temperaturen und Drucke und die Form der Zeit-Druck-und Zeit-Temperatur-Funktionen in Abhängigkeit von den konkreten Anwendungsbedingungen modifiziert werden. Beispielsweise kann durch Vorbereitungstests ermittelt werden, welche Zeit-und Druck-Parameter für eine konkrete Hydrogel-, insbesondere Alginat-Probe, optimale Trocknungsergebnisse liefert.
  • Im Ergebnis der Gefriertrocknung P3 liegen die getrockneten Alginat-Partikel als fertige Zell-Carrier vor. Aufgrund des erfindungsgemäßen Zusatzes der Lyoprotektant-Substanz haben die getrockneten Alginat-Partikel eine sphärische Form (siehe zum Beispiel photographische Abbildung in 4), die vorteilhafterweise auch nach der Rehydratisierung erhalten bleibt. Die getrockneten Partikel können als Kuchen zusammenhängen oder ein rieselfähiges Schüttgut aus einzelnen Teilchen bilden. Die Bildung des rieselfähigen Schüttguts wird begünstigt, wenn der Suspension der Alginat-Kügelchen zusätzlich zu der Lyoprotektant-Substanz eine kohäsionsmindernde Substanz, wie zum Beispiel Polyethylenglykol, zugeführt wird. Es wird beispielsweise Polyethylenglykol mit dem Handelsnamen PEG 600 mit einer Konzentration von 50 mg/ml verwendet, um ein Zusammenhaften der getrockneten Alginat-Partikel zu minimieren.
  • In Abhängigkeit von der Konzentration der verwendeten Lyoprotektant-Substanz kann diese nach der Gefriertrocknung P3 Reste auf der Oberfläche der getrockneten Alginat-Partikel bilden. Entsprechend kann, wie in 1 gezeigt ist, optional ein Schritt P4 zur Entfernung der Lyoprotektant-Substanz insbesondere von der Oberfläche der getrockneten Alginat-Partikel vorgesehen sein, z. B. durch Sieben oder Mahlen vorgesehen sein.
  • Eine Anwendung der getrockneten Alginat-Partikel als Zell-Carrier bei der Kultivierung biologischer Zellen ist schematisch in 2 gezeigt. Zunächst erfolgt bei Schritt K1 die Vorbereitung eines wässrigen Kultivierungsmediums in einem Bioreaktor. Die Zusammensetzung des Kultivierungsmediums wird in an sich bekannter Weise in Abhängigkeit von der konkreten Anwendung der Zellkultivierung gewählt. Dem Kultivierungsmedium werden die erfindungsgemäß hergestellten Alginat-Partikel zugesetzt. Die Dosierung der getrockneten Alginat-Partikel erfolgt beispielsweise mittels Wägung. Tests mit erfindungsgemäß hergestellten, getrockneten Alginat-Partikeln ergaben, dass Partikel ohne eine Polyethylenglykol-Beladung zunächst auf der Oberfläche des Kultivierungsmedium lagen und erst nach einem Zentrifugieren in das Kultivierungsmedium einsanken, während bei mit Polyethylenglykol modifizierten Partikeln kein Aufschwimmen auf dem Kultivierungsmedium beobachtet wurde.
  • Im wässrigen Kultivierungsmedium erfolgt bei Schritt K2 die Rehydratisierung der Alginat-Partikel. Die getrockneten Alginat-Partikel werden durch Aufnahme von Wasser aus dem Kultivierungsmedium in Alginat-Kügelchen umgewandelt, wie beispielhaft in 3 gezeigt ist. Schließlich erfolgt bei Schritt K3 die Zellkultivierung, Zellinkubation und/oder Zelllagerung von biologischen Zellen im Kultivierungsmedium mit den Alginat-Kügelchen.
  • 3 zeigt photographische, lichtmikroskopische Bilder von Alginat-Kügelchen, die gemäß bevorzugten Varianten der Erfindung mit Trehalose (A) oder Sucrose (B) beladen, gefriergetrocknet und rehydratisiert wurden, im Vergleich mit Alginat-Kügelchen, die ohne Lyoprotektant-Substanz (C) gefriergetrocknet und rehydratisiert wurden, und frisch hergestellten Alginat-Kügelchen (D) in Suspension (Durchmesser rd. 400 µm. Die erfindungsgemäß hergestellten und rehydratisierten Partikel (A, B) zeigen vorteilhafterweise deutlich die gleiche Kugelform wie die suspendierten, unbehandelten Alginat-Kügelchen (D). Die unbehandelt gefriergetrockneten und rehydratisierten Partikel (C) (z. B. gemäß [1]) weisen hingegen anders als die unbehandelten Alginat-Kügelchen eine zerklüftete, unregelmäßige Oberfläche auf.
  • Eine weitere Anwendung der getrockneten Alginat-Partikel als Zell-Carrier bei der Zellexpansion von hiPS-Zellen (humane induzierte pluripotente Stammzellen) ist schematisch in 4 gezeigt. Für eine erste Expansionsphase werden getrocknete Alginat-Partikel 1 in ein erstes Kultivierungsgefäß 2, z. B. einen Suspensionsbioreaktor mit einem Volumen von wenigen ml (z.B. 10 ml) bis mehrere Liter (z. B. 31), gegeben. Durch Rehydratisierung werden aus den Alginat-Partikeln 1 Alginat-Kügelchen 3 (beispielhaft gezeigt) gebildet. Des Weiteren werden aus einem Gefäß 4 hiPSC-Zellen in das Kultivierungsgefäß 2 gegeben. Es erfolgt dann die Zellkultivierung unter vorgegebenen Kultivierungsbedingungen, in der die Zellen zunächst auf den Micro-Carriern anhaften und adhärieren und sich dann über mehrere Tage (z. B. 7 Tage) um ein Vielfaches vermehren (z.B. um das Siebenfache). In einem letzten Schritt des Prozesses werden die Alginat-Kügelchen mit adhärierten Zellen 5 gewonnen, d.h. es liegen nach dieser Gewinnung (z.B. durch eine enzymatische Behandlung) die verbrauchten Micro-Carrier 6 und die vervielfachten hiPS-Zellen 7 vor. Anschließend können diese in einer Zellbank 10 gelagert, weiter untersucht und/oder prozessiert 9 (z.B. Differenzierung in Kardiomyozyten), und/oder zu einer direkten Anwendung 8 überführt (z.B. Bioprinting) werden.
  • Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in Kombination oder Unterkombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
  • Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
  • Zitierte Patentliteratur
    • EP 2361968 A1 [0002]
    • US 6642363 B1 [0002]
  • Zitierte Nicht-Patentliteratur
    • M. Gepp et al. in „J. Appl. Phycol.“ (2017) [0002]

Claims (18)

  1. Verfahren zur Herstellung von Trägerpartikeln für die Kultivierung biologischer Zellen, umfassend die Schritte: - Bereitstellung einer wässrigen Suspension von Hydrogel-Kügelchen, und - Gefriertrocknung der Hydrogel-Kügelchen, so dass getrocknete Hydrogel-Partikel gebildet werden, dadurch gekennzeichnet, dass - der Suspension mindestens eine Lyoprotektant-Substanz zugesetzt wird, wobei die Hydrogel-Kügelchen in der Suspension mit der Lyoprotektant-Substanz beladen werden und die getrockneten Hydrogel-Partikel unter der Wirkung der Lyoprotektant-Substanz eine Form erhalten, welche an eine sphärische Partikelform angenähert ist.
  2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem - die Hydrogel-Kügelchen mit einer Proteinschicht beladen sind.
  3. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem - nach der Gefriertrocknung Rückstände der Lyoprotektant-Substanz entfernt werden.
  4. Verfahren gemäß Anspruch 3, bei dem - die Rückstände durch eine mechanische Bearbeitung der getrockneten Partikel, umfassend eine Zerkleinerung und ein Sieben, entfernt werden.
  5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem - die Lyoprotektant-Substanz mindestens eines von Trehalose, Dimethylsulfoxid, Sucrose und einem Poloxamer umfasst.
  6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem - die Konzentration der Lyoprotektant-Substanz in der Suspension im Bereich von 1 mg/ml bis 500 mg/ml gewählt ist.
  7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem - die getrockneten Hydrogel-Partikel einer Rehydratisierung unterzogen werden, und - Rückstände der getrockneten Lyoprotektant-Substanz vor der Anwendung der Trägerpartikel in einer Waschlösung, insbesondere aus Natriumchlorid, entfernt werden.
  8. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem - die Hydrogel-Kügelchen mindestens eines von magnetischen Partikeln und biologisch wirksamen Substanzen (Wirkstoffen) enthalten, wobei die magnetischen Partikel und/oder die Wirkstoffe beim Gefriertrocknen mit den Hydrogel-Kügelchen getrocknet werden.
  9. Verfahren gemäß Anspruch 8, bei dem - die Hydrogel-Kügelchen Differenzierungsfaktoren enthalten.
  10. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem - der Suspension mindestens eine kohäsionsmindernde Substanz zugesetzt wird, die eine Schüttfähigkeit der getrockneten Hydrogel-Partikel begünstigt.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 10, bei dem - die kohäsionsmindernde Substanz, vorzugsweise Polyethylenglykol, umfasst.
  12. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Gefriertrocknung der Hydrogel-Kügelchen die folgenden Phasen umfasst: - Einfrierphase, in der die Hydrogel-Kügelchen gemäß einer Zeit-Temperatur-Funktion mit einem Einfrierintervall von mindestens 120 min und einer End-Temperatur unterhalb von - 40 °C eingefroren werden, - Stabilisierungsphase, in der die Hydrogel-Kügelchen für die Dauer eines Stabilisierungsintervalls von mindestens 90 min bei der End-Temperatur gelagert werden, - erste Trocknungsphase zur Bildung der getrockneten Hydrogel-Partikel, in der die gefrorenen Hydrogel-Kügelchen bei der End-Temperatur mit einem ersten Unterdruck beaufschlagt werden, der im Bereich von 30 µbar bis 60 µbar gewählt ist, - zweite Trocknungsphase, in der die getrockneten Hydrogel-Partikel bei einer Temperatur gleich oder größer als die End-Temperatur mit einem zweiten Unterdruck beaufschlagt werden, der geringer als der erste Unterdruck ist, und - Belüftungsphase, in der die getrockneten Hydrogel-Partikel gemäß einer Zeit-Druck-Funktion mit einem Druckanstiegsintervall von mindestens 0,5 min in einen Normaldruck überführt werden
  13. Trägerpartikel für eine Kultivierung biologischer Zellen, umfassend - getrocknete Hydrogel-Partikel mit einer Proteinbeschichtung, wobei die Hydrogel-Partikel eine Lyoprotektant-Substanz enthalten und eine Form aufweisen, die an eine sphärische Form angenähert ist.
  14. Trägerpartikel gemäß Anspruch 13, bei denen - die Proteinbeschichtung Matrigel, Kollagen, Laminin und/oder Vitronektin umfasst.
  15. Trägerpartikel gemäß Anspruch 13 oder 14, bei denen - die Oberflächen der Partikel frei von Rückständen der Lyoprotektant-Substanz sind.
  16. Trägerpartikel gemäß einem der Ansprüche 13 bis 15, die - eine charakteristische Querschnittsdimension im Bereich von 50 µm bis 2 mm aufweisen.
  17. Trägerpartikel gemäß einem der Ansprüche 13 bis 16, die mindestens eines enthalten von - magnetischen Partikeln, und - biologisch wirksamen Substanzen (Wirkstoffen).
  18. Anwendung von Trägerpartikeln gemäß einem der Ansprüche 13 bis 17, die mit einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 hergestellt sind, als Trägerpartikel für die Kultivierung biologischer Zellen.
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