KR20230027159A - 생체 세포 배양을 위한 캐리어 입자 제조 공정, 캐리어 입자 및 이들의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 하이드로겔 비드의 수성 현탁액을 제공하는 단계, 및 건조한 하이드로겔 입자가 형성되도록 하이드로겔 비드를 동결 건조하는 단계를 포함하는 생체 세포 배양용 캐리어 입자의 제조 공정에 관한 것으로, 여기서 상기 현탁액에는 하나 이상의 라이오프로텍턴트 물질이 첨가되고, 상기 하이드로겔 비드는 현탁액에서 라이오프로텍턴트 물질과 함께 로딩되고, 건조한 하이드로겔 입자는 라이오프로텍턴트의 효과 하에서 형상을 받고, 이는 구형 입자 형상에 근사하고 재수화 후에도 여전히 유지된다. 본 발명은 또한 건조한 하이드로겔 입자, 바람직하게는, 단백질 코팅을 갖는 생체 세포의 배양을 위한 캐리어 입자 및 캐리어 입자의 적용에 관한 것이다.

Description

생체 세포 배양을 위한 캐리어 입자 제조 공정, 캐리어 입자 및 이들의 용도

본 발명은 생체 세포 배양을 위한 캐리어 입자의 제조 방법, 특히 건조 하이드로겔 입자의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 생체 세포 배양을 위한 캐리어 입자, 특히 상기 방법을 사용하여 제조된 건조 하이드로겔 입자 및 캐리어 입자의 적용에 관한 것이다. 본 발명은 생체 세포의 배양, 특히 다능성 및 다능성 줄기 세포의 배양(확장) 또는 분화된 세포(예: 조직 공학)에 적용될 수 있다.

본 명세서는 본 발명의 기술적 배경을 나타내는 다음의 종래 기술을 참조할 것이다.

[1] 논문 "조직 공학의 맥락에서 구조 세포 과정의 조사: 알긴산염 기반 비계 구조" , 2017년 사르란데스(Saarlandes) 대학 미카엘 겝(Michael Gepp);

[2] EP 2 361 968 A1;

[3] US 6 642 363 B1; 및

[4] M Gepp 외. "J. Appl. Phycol." (2017) 29:2451-2461.

세포 배양을 위한 캐리어로써, 다당류 중합체, 특히 알긴산 하이드로겔 (또한 "알긴산염류(alginates)"로도 약칭됨)의 사용은 일반적으로 알려져 있다([1] 및 여기에 인용된 문헌 참조). 알긴산염류는 2차원 기판 상에 레이어 형태로 사용되거나, 현탁액(예를 들어 [1], [2] 참조)에서 셀 캐리어(구형 입자, 비드, 캐리어 비드, 마이크로 캐리어)로써 사용될 수 있다. 특정 배양 과제 및 배양할 세포에 따라, 알긴산염류는 첨가제로 변형될 수 있다. 첨가제는 세포 접착에 영향을 미치는, 예를 들어, 펩타이드 또는 콜라겐을 포함한다(예: [3] 또는 [4] 참조). 현탁액에서, 예를 들어 바이오리액터에서 마이크로캐리어 상에서의 세포 배양은 충분히 비슷한 생리학적 조건 하에서 세포 (예를 들어, 3D 집합체, 회전 타원체, 마이크로캐리어-세포 하이브리드) 의 3차원 배열의 형성에 있어서 이점을 가지며, 이는 유리한 표면 대 체적 비율을 설정하는 것을 가능하게 함으로써 프로세스의 효율적인 수행을 가능하게 한다.

바이오리액터에서 알긴산염을 마이크로캐리어로 사용하는 종래의 세포 배양은 예를 들어, 하기 단계들을 포함한다. 먼저, 알긴산염 비드는 가교결합(crosslinking)에 의해 구형의 액체 알긴산염을 침전시킴으로써 생산된다(예: [1] 참조). 현탁액의 알긴산염 비드가 형성되는데, 용도에 따라, 200 μm 에서 500 μm 까지의 범위의 직경을 갖는 크기 분포를 갖는다. 액적 형성 조건에 기초하여 설정될 수 있는 크기 분포의 폭은 이후의 세포 배양에 영향을 미칠 수 있다. 가교결합된 알긴산염 비드를 세척한 후, 예를 들어, 알긴산염 비드가 생성되기 전에 선택된 알긴산염 혼합물을 통해 알긴산염 비드의 탄성을 조정하거나 티라민(tyramine)을 결합하여 변형(활성화 및/또는 기능화)된다. 완성된 변형된 알긴산염 비드는 배양 배지에 현탁되어, 바이오리액터에 배치된다. 배양될 세포는 바이오리액터의 현탁액에 추가되며, 여기서 알긴산염 비드에 대량 서식하고 지정된 배양 프로토콜에 종속된다.

종래의 방법은 다음의 단점과 한계를 갖는다. 미리 정의된 특성을 가진 변형된 알긴산염 비드를 생산하려면 전문가의 지식이 필요하므로, 세포 배양 또는 산업용 사용을 위한 실험실에서 알긴산염 비드를 정기적으로 제공하는 것은 어렵다. 알긴산염 비드는 전형적으로 예를 들어 특정 크기 분포, 직경 및/또는 변형과 같은 사용자의 사양에 따라 생산되며, 현탁액에 담겨서 사용자에게 전달되고 처음에는 사용자의 현장에 저장된다. 하지만, 한 가지 단점은 사용자의 현장에서 현탁액의 운반 및 보관이 알긴산염 비드를 바람직하지 않게 변경할 수도 있다는 것이다.

알긴산염 비드는 응집되거나 (함께 모이거나) 분해될 수 있으며, 이는 사용자에 의한 정밀하고 재현 가능한 측정에 불리하다. 알긴산염 비드의 무균성은 저장시에 손실될 수 있다. 또한, 완성된 알긴산염 비드의 특성은 사용자에 의해 매우 제한적인 범위에서만 확인 또는 변경될 수 있거나 전혀 변경될 수 없다. 예를 들어, 현탁액내의 알긴산염 비드의 크기 분포는, 한다 하더라도, 상당한 노력으로 후속적으로 변경될 수 있다. 알긴산염 비드의 수분 함량은 바이오리액터 내의 배양 배지를 왜곡시킬 수 있다. 이를 방지하기 위하여, 알긴산염 비드의 수를 적게 유지할 수 있지만, 이는 적은 수의 배양 가능 세포와 배지의 높은 소비를 초래한다. 따라서, 세포 배양을 위한 종래의 방법들은 낮은 효율, 높은 공정 비용, 확장성의 결여, 낮은 성공률 및 낮은 재현성을 특징으로 한다.

또한 알긴산염 비드를 건조시키는 것이 알려져 있다. 건조된 알긴산염 비드는 현탁액내의 비즈보다 더 잘 보관될 수 있다. 더욱이, 건조된 알긴산염 비드는 바이오리액터 내에서 배양 배지로 재수화될 수 있다. 그럼에도 불구하고, 종래의 알긴산염 비드의 사용의 한계를 실제로 극복하는 것은 아직 가능하지 않았다. 심지어 종래 건조 및 재수화된 알긴산염 비드를 사용하는 경우에도, 건조된 알긴산염 비드는 취급이 어려운 것으로 입증되었으며, 성공적인 세포 배양의 신뢰성 및 배양 결과의 재현성은 심지어 불변의 배양 프로토콜을 사용하는 경우에도 제한적이다.

본 발명의 목적은 생체 세포 배양을 위한 캐리어 입자의 제조방법, 특히 종래 기술의 단점을 극복할 수 있는 건조 하이드로겔 입자를 제조하기 위한 개선된 방법을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 목적은 종래의 캐리어 입자의 단점을 극복할 수 있도록 개선된 생체 세포 배양용 캐리어 입자를 제공하는 것이다. 본 발명은 특히, 재현가능한 특성, 개선된 저장성을 구비하고, 정밀하게 측정될 수 있고, 수정하기 쉬우며, 및/또는 상이한 구조 및 목적의 바이오리액터에서 정례적인 적용에 적합한 캐리어 입자를 제공하기 위한 것이다. 본 발명에 따라 제조된 캐리어 입자는 특히 증가된 효율, 성공률 및/또는 재현성을 갖는 셀 배양을 가능하게 하기 위한 것이다.

이러한 목적들은 각각 생체 세포를 배양하기 위한 캐리어 입자의 제조 방법 및 독립 청구항의 특징을 구비한 캐리어 입자에 의해 달성된다. 본 발명의 바람직한 실시예 및 적용은 종속 청구항들에서 제시되어 있다.

본 발명의 제 1 일반 양태에 따라서, 상기 목적은 생체 세포 배양을 위한 캐리어 입자의 제조 방법에 의해 달성되며, 이 방법은 다음 단계들을 포함한다. 구형 하이드로겔 비드의 수성 현탁액이 제공된다. 바람직하게는, 하이드로겔 비드는 전구체 중합체를 이온성 침전제로 가교결합하여 갓 제조된다. 하이드로겔 비드는 그 자체로 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 하이드로겔 비드의 수성 현탁액의 현탁액 액체는 하이드로겔 비드가 제조된 침전제를 갖는 수용액 및/또는 침전 후 하이드로겔 비드가 선택적으로 세척되는 세척 및/또는 완충 용액을 포함한다. 그런 다음 하이드로겔 비드가 동결 건조되어서, 건조 하이드로겔 입자가 형성된다. 하이드로겔 비드의 동결 건조는 하이드로겔 비드에 감소된 온도(상온 이하, 바람직하게는 0°C 이하)와 부압(대기압보다 낮은 압력)을 인가하는 단계를 포함한다. 하이드로겔 비드의 동결 건조는 바람직하게는 현탁액 액체와 함께 현탁 상태에서 일어나고, 현탁액 액체가 먼저 제거되고나서 하이드로겔 비드가 건조된다. 대안적으로, 하이드로겔 비드는 동결 건조 전에 수성 현탁액으로부터 제거될 수 있는데, 즉, 동결 건조 전에 현탁액 액체가 하이드로겔 비드로부터 분리된다.

본 발명에 따르면, 하나 이상의 라이오프로텍턴트(lyoprotectant) 물질이 현탁액 액체에 첨가되고, 현탁액 내의 하이드로겔 비드는 동결 건조 전에 라이오프로텍턴트 물질로 로딩된다. 라이오프로텍턴트 물질 (또는 라이오프로텍턴트)은 동결 건조중에 얼음 형성에 의해, 하이드로겔 비드, 특히 하이드로겔 비드를 구성하는 고분자에 미치는 손상을 최소화하거나 방지하는 물질이다. 또한, 동결 건조 후에 하이드로겔 비드, 즉 건조 하이드로겔 입자가 라이오프로텍턴트 물질의 작용하에서 구형 입자 형상에 근사하는 형상을 갖게하는 라이오프로텍턴트 물질이 사용된다.

하이드로겔 비드는 바람직하게는 알긴산염 비드 (알긴산 하이드로겔)를 포함한다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 구현은 실제로 알긴산염 비드에 한정되지않고, 오히려 또한 그에 따라 콜라겐, 겔란 또는 펙틴 하이드로겔을 가지고 구현될 수도 있다. 알긴산염은 형상 기억 효과가 있고 동결 건조 및 재수화 후 구형 알긴산염 비드를 재형성하기 때문에 특히 유리한 것으로 입증되었다.

용어 "대략적으로 구형의 입자 형상"은 구형 (특히 구체 또는 타원체)에 해당하고, 특징적인 구조 치수, 예를 들면 단면 치수보다 작은, 바람직하게는 건조 하이드로겔 입자의 1/10 보다 작은 계단, 돌기 또는 함몰부를 갖는 매끄럽거나 구조화된 표면 위상을 갖는 건조 하이드로겔 입자의 형태를 포함한다.

본 발명의 제 2의 일반 양태에 따르면, 그 목적은 생체 세포 배양을 위한 캐리어 입자에 의해 달성되는데, 캐리어 입자는 라이오프로텍턴트 물질을 포함하고 대략적으로 구형인 건조 하이드로겔 입자를 포함한다. 캐리어 입자는 바람직하게는 본 발명의 제 1의 일반 양태 또는 그 실시예 중 하나에 따른 전술된 방법을 이용하여 생산된다. 바람직하게는, 캐리어 입자는 50μm 내지 2mm 범위의 특징적인 단면 치수, 예를 들어 직경을 갖는다.

본 발명의 제 3의 일반 양태에 따르면, 상기 목적은 본 발명의 제 2의 일반 양태에 따른 캐리어 입자 또는 이의 실시예들을 생체 세포 배양용 세포 담체로 사용함으로써 달성된다. 바람직한 변형에 따르면, 상기 캐리어 입자의 사용은 현탁액 바이오리액터, 특히, 배양 용기, 미세적정(microtitration) 플레이트, 부유 액적, 세포 배양 가방, (현탁액) 바이오리액터 및/또는 접시, 예를 들어 페트리(Petri) 접시 등에서 제공될 수 있다. 캐리어 입자의 사용은 바람직하게는 건조된 입자의 제조, 재수화 및 세척, 세포 접종, 세포 전파 및 세포 통로/수확 단계를 포함한다.

본 발명자들은, 본 발명에 따라, 건조 하이드로겔 입자의 대략적인 구형 입자 형태를 유발하는 라이오프로텍턴트 물질을 하이드로겔 비드에 로딩함으로써, 기존의 현탁 또는 건조된 알긴산염 비드가 저장성, 계량성 및 취급성 측면에서 불리한 점을 회피할 수 있음을 발견하였다. 구형 하이드로겔 비드의 구조와 기능을 유지하는 완만한 동결 건조가 달성된다.

접착이나 응집이 방지되므로, 저장성이 개선되고, 건조 상태에서 무균성을 보다 잘 유지할 수 있으며, 따라서 마련된 캐리어 비드의 오염을 방지할 수 있다. 이러한 이점들은 또한, 종래의 접근법에 대하여 특히 예를 들어, [1]에 따른 알긴산염 비드의 동결 건조에 적용된다. 따라서, 본 발명자들은 건조된 상태의 종래 알긴산염 비드들이 구형이 아니라 오히려 불규칙적으로 변형된 형태, 예를 들어, 접힌 형태 및/또는 크랙 또는 돌기가 있는 형태를 갖는다는 것을 발견했는데, 이는 건조된 알긴산염 비드의 품질을 예를 들어 벌크 재료내의 밀도 변동 및 불규칙한 덩어리 형성으로 기인하여 손상시킨다. 본 발명에 따라 제조된 건조 하이드로겔 입자는 무균의 동결건조 및 재수화를 촉진한다.

건조 하이드로겔 입자는 전체적으로 유동 가능한 또는 절단이 가능한 케이크(라이오케이크(lyocake), 건조 제품 매트릭스라고도 함)를 형성하는 균질한 재료를 형성하기 때문에. 계량성이 향상된다. 반응장치 내 캐리어 비드의 농도 설정 정확도 및 재현성이 향상된다. 건조 하이드로겔 입자는 예를 들어 부피 측정, 중량 측정 및/또는 광학 측정에 의해 정량화될 수 있다. 건조 하이드로겔 입자는 불투명하기 때문에, 광학 측정을 통해 바이오리액터 내의 재수화를 검증할 수 있다.

건조 하이드로겔 입자는 단순화된 방식으로 처리될 수 있다. 그러한 처리는 바람직하게는 무균 캐비닛에서 수행되지만, 측정을 위해 피펫팅이 요구되지는 않는다. 건조 하이드로겔 입자는 단순화된 방식으로 미리 분할될 수 있다. 건조 하이드로겔 입자를 제조하여 사용하는 과정에서 품질 관리개선이 가능하다.

건조 하이드로겔 입자는 주입 가능한 벌크 물질로 또는 펠릿 형태로 사용될 수 있으며, 특히 바이오리액터 (세포 배양이 이루어지고 생화학적, 물리적 배양 조건의 설정이 가능한 용기) 내로 직접 도입될 수 있다. 유리하게, 건조 하이드로겔 입자는 바이오리액터 내에서 배양 배지의 전체 부피를 왜곡시키지 않는다.

재수화된 하이드로겔 비드는 바람직하게는 바이오리액터 내의 배양 배지에 직접 첨가된 건조 하이드로겔 입자에 의해서 사용된다. 배양될 세포는 건조 하이드로겔 입자가 투입될 때 이미 배양 배지 내에 현탁되어 있거나, 또는 바이오리액터 내의 건조 하이드로겔 입자를 재수화한 후에 첨가될 수도 있다. 건조 하이드로겔 입자의 재수화 정도는 바람직하게는 광 투과 측정 또는 배양 배지상의 산란광 측정을 이용하여 결정된다. 건조 하이드로겔 입자가 완전히 수화된 후, 세포들은 특히 바람직하게는 배양 매체 내로 공급된다.

건조된 하이드로겔 입자의, 예를 들어 물에서의 재수화는 선택적으로 본 발명에 따른 방법의 추가적인 하위 단계로 고려될 수 있다. 유리하게, 재수화시에 형성되는 하이드로겔 비드(재수화된 하이드로겔 비드)는 재수화 후에도 구형의 입자 형상을 갖는다. 바람직하게는, 재수화된 하이드로겔 비드는 동결 건조 전에 지녔던 구형의 형상을 특징으로 한다. 이것은 접종 단계에서 하이드로겔 비드 상의 세포 배양을 촉진한다. 또한, 구형의 재수화된 하이드로겔 비드는 변형된 하이드로겔 비드에 비해 현탁액에서 유리한 부유 거동 및 바람직하지 않은 응집에 대한 경향이 감소하는 것을 유리하게 특징으로 한다.

본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 하이드로겔은 단백질 층으로 로딩된다. 이러한 변형은 바람직하게는 하이드로겔 비드의 제조 후 및 동결 건조 전에 수행된다. 단백질 층은 예를 들어 세포외 매트릭스 단백질을 포함할 수 있으며, 이에 따라 재수화된 하이드로겔 비드에 대한 세포의 접착을 유리하게 촉진할 수 있다. 단백질 층은 하이드로겔 비드 상에서 단백질 분자의 멀티레이어, 모노레이어 또는 서브모노레이어를 포함할 수 있다. 예를 들어, 현탁액에서 하이드로겔 비드를 제조한 후, 하나 이상의 결합될 단백질을 현탁액에 첨가하여 하이드로겔 비드와 함께 배양한다. 유리하게, 배양은 하이드로겔 비드의 기공을 포함하는 전체 표면에 하나 이상의 단백질 또는 매개체 분자의 공유 결합을 가능하게 한다.

단백질 층에 대한 로딩은 바람직하게는 동결 건조 전에 일어난다. 본 발명의 선택된 애플리케이션에서, 단백질 층을 포함한 로딩은 동결 건조 후, 특히 재수화 후, 예를 들어 바이오리액터에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 단백질이 바이오리액터 내의 배양 배지로부터 또는 이미 바이오리액터 내에 존재하는 세포로부터 공급될 수 있다.

하이드로겔 비드는 바람직하게는 하나 이상의 매개체 분자(예: 티라민) 및/또는 라미닌(재조합 및 조직 특이), 비트로넥틴(재조합 및 다능성 줄기 세포와 호환됨), 콜라겐(조직 특이, 다능성 줄기 세포와 호환됨), 탈세포화된 조직(고도로 조직 특이)으로부터의 단백질 및 기저 매트릭스(예: 겔트렉스, 매트리겔, 데노보매트릭스)로 부터의 컴플렉스 단백질 혼합물을 포함하는 하나 이상의 단백질로 로딩된다.

본 발명의 추가적인 바람직한 일 실시예에 따르면, 라이오프로텍턴트 물질의 잔여물은 동결 건조 후에 제거된다. 건조 하이드로겔 입자로부터 라이오프로텍턴트 물질의 잔여물을 분리하는 것은 이후에 재수화 및 후속의 세포 배양을 위해 유리한 결과를 가져온다. 유리하게는, 세포에 대한 라이오프로텍턴트 물질의 영향이 방지되거나 최소화된다. 라이오프로텍턴트 물질의 잔여물 제거는 건조 하이드로겔 입자로부터 라이오프로텍턴트 물질을 완전히 제거하는 것 또는 건조 하이드로겔 입자의 표면으로부터 라이오프로텍턴트 물질을 제거하는 것을 포함한다. 건조 하이드로겔 입자의 표면은 특히 바람직하게는 라이오프로텍턴트 물질의 잔여물이 없다.

라이오프로텍턴트 물질의 잔여물, 예를 들어, "라이오케이크(lyocake)"는 특히 바람직하게는 건조된 물질의 기계적 처리에 의해 제거되며, 이들의 분해 및 스크리닝을 포함한다. 유리하게는, 건조된 하이드로겔로부터 라이오프로텍턴트 물질이 분리됨과 동시에 건조 하이드로겔 입자들이 서로 분리된다.

대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 또 다른 변형예에 따르면, 건조 하이드로겔 입자의 재수화 이후 및 입자를 특히 염화 나트륨으로 구성된 세척 용액 내에 사용하기 전에, 건조된 라이오프로텍턴트 물질의 잔여물이 제거될 수 있다. 재수화된 하이드로겔 비드를 세척함으로써, 후속 세포 배양에 미치는 라이오프로텍턴트 물질의 영향이 유리하게 더욱 억제된다.

본 발명의 또 다른 이점은 본 발명에 따른 하이드로겔 비드의 개질을 위해 이용 가능한 상이한 라이오프로텍턴트 물질이라는 점에 있다. 라이오프로텍턴트 물질은 특히 트레할로스, 디메틸 설폭 사이드(DMSO), 수크로스 및/또는 폴록사머를 포함할 수 있다. 개별적으로 또는 조합하여 사용될 수 있는 이들 라이오프로텍턴트는 생체 세포에 미치는 효과가 철저히 조사되었다는 이점을 갖는다. 따라서 세포 배양에 대한 바람직하지 않은 효과는 회피되거나 최소화될 수 있다. 트레할로스 및/또는 수크로스가 특히 바람직하게는 라이오프로텍턴트 물질로 사용되는데, 이는 그들이 사용되는 경우에, 재수화 후 특히 포괄적인 형태 및 기능 유지 및 세포 배양에서 특히 우수한 세포 접착성을 특징으로 하는 캐리어 입자가 얻어지기 때문이다.

본 발명의 추가적인 바람직한 실시예에 따르면, 본래 제조된 하이드로겔 비드를 포함하는 현탁액 액체내의 라이오프로텍턴트 물질의 농도는 1 mg/ml 내지 500 mg/ml 범위 내에서 선택된다. 이러한 농도 범위가 바람직한데, 이는 1 mg/ml 농도 아래에서 구형 입자 형상에 다만 충분하게 근사하지않고, 500 mg/ml 위에서는 라이오프로텍턴트 물질에 의해 바이오리액터 내 배양 배지에 과도한 로딩이 발생할 수 있기 때문이다.

본 발명의 또 다른 유리한 실시예에 따르면, 생체 세포 배양을 위한 본 발명에 따라 제조된 세포 담체의 기능화가 제공될 수 있다. 바람직하게는, 하이드로겔 비드의 기능화는 그것의 제조 전 또는 제조 중에 (활성 성분, 자성 입자 등의 캡슐화), 예를 들어 침전에 의해 하이드로겔 비드를 제조하기 위한 적하 전 또는 적하 중에, 물질이 하이드로겔 매트릭스에 포함되도록 하기 위해, 또는 그것의 제공 후와 동결 건조 전(예: 티라민 및/또는 단백질을 사용한 표면 기능화) 일어난다. 기능화는 하이드로겔 비드에 캐리어 기능을 넘어서는 추가적인 특성을 제공하는 입자 및/또는 물질을 추가하는 것을 포함한다. 본 발명의 바람직한 변형예에 따르면, 하이드로겔 비드는 자성 입자 및/또는 생물학적 활성 물질(활성 성분)로 로딩된다. 자성 입자 및/또는 활성 성분은 바람직하게는 동결 건조 전에 공급된다. 본 발명자들은 건조된 상태의 기능화된 하이드로겔 비드가 또한 대략 구형 형상을 갖는 입자를 형성하고, 재수화된 상태에서 또한 구형 셀 캐리어를 형성한다고 결정했다.

각각 하나 이상의 자성 입자를 포함하는 하이드로겔 비드는 자기장을 이용하여 바이오리액터 내의 세포 담체를 조작할 수 있는 가능성을 유리하게 제공한다. 자성 입자는 그 자체로 알려진 영구 자석 물질로 구성될 수 있다.

하이드로겔 비드의 개질을 위한 생물학적 활성 물질로서, 바람직하게는 분화 인자, 즉 특정 시점에서 세포 분화를 유발하고 및/또는 세포 분화의 방향에 영향을 미치는 생물학적 활성 물질이 유용하다.

본 발명의 추가적인 바람직한 실시예에 따르면, 본래 제공된 하이드로겔 비드의 분산이 응집력 감소 물질을 포함하는 경우에, 건조 하이드로겔 입자들끼리의 접착이 억제된다. 이는 유리하게 건조 하이드로겔 입자의 주입성을 촉진한다. 응집성-감소 물질은 특히 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하고, 그것이 생체 세포에 미치는 효과가 유리하게 철저히 조사되었다.

하이드로겔 비드의 동결 건조를 위해서, 그 자체로 공지된 동결 건조 방법이 선택될 수 있다. 동결 건조를 위해서, 특히 알긴산염 비드의 동결 건조의 경우, 다음과 같은 단계들을 갖는 프로토콜이 바람직하게는 적용된다. 먼저, 현탁액에 구비된 하이드로겔 비드가 동결 간격이 120분 이상이고 종료 온도가 -20°C 미만 및 -80°C 이상인 소정의 시간-온도 함수에 따라 동결되는 동결 단계가 있다. 바람직하게는, 동결속도는 50°C/min(급속 냉동), 1 내지 1.5°C/min(중도 냉동), 0.1 내지 1°C/min(저속 냉동) 범위 내에서 설정된다. 시간-온도 함수의 설정은 유리하게는 하이드로겔 비드의 완만한 동결을 가능하게 한다. 그뒤에, 하이드로겔 비드가 최소 90분의 안정화 간격 지속 시간 동안 종료 온도에서 저장되는 안정화 단계가 제공된다. 그 후, 건조 하이드로겔 입자를 형성하기 위한 제 1 건조 단계에서, 종료 온도에서 동결된 하이드로겔 비드에 30 μbar 내지 60 μbar 범위에서 선택된 제 1 부압이 인가된다. 건조 하이드로겔 입자에 제 1 부압보다 낮은 제 2 부압이 종료 온도 이상의 온도에서 인가되는 제 2 건조 단계가 뒤따른다. 마지막으로, 건조 하이드로겔 입자가 적어도 0.5분 내지 1분(1 bar/min)의 승압 간격을 갖는 시간-압력 함수에 따라 정상압력으로 전이되는 환기 단계가 뒤따른다. 환기 단계는 불활성 가스 또는 공기를 적용하는 용기에서 일어난다.

본 발명의 추가적인 세부 사항 및 이점은 첨부된 도면을 참조하여 아래에서 설명된다.

도면들은 다음을 도시한다:
도 1: 캐리어 입자 생산을 위한 본 발명에 따른 방법의 바람직한 실시예들의 특징을 나타낸 흐름도;
도 2: 본 발명에 따라 제조된 캐리어 입자의 사용에 대한 바람직한 실시예들의 특징을 나타낸 흐름도
도 3: 기존의 캐리어 입자와 비교하여 재수화된 캐리어 입자의 사진; 및
도 4: 본 발명에 따라 생산된 캐리어 입자의 예시적인 적용 방법의 개략도.

본 발명은 알긴산염-기반의 세포 담체(캐리어 입자)를 예시적으로 참조하여 후술한다. 본 발명에 따라 라이오프로텍턴트 물질이 로딩되고 동결 건조된 알긴산염 비드는, 예를 들어, 상용화된 알긴산염으로 부터 생산될 수 있는데, 이는 중합체 고분자의 상대적으로 짧은 사슬 길이에 기인하여 전형적으로 낮은 점도를 갖는다. 대안적으로, 상용화된 알긴산염보다 더 긴 분자 사슬에 기인하여, 더 높은 점도를 갖는 알긴산염이 유용할 수 있다. 사용될 특정 알긴산염의 선택은 바람직하게는 세포 배양 중에 세포 담체의 바람직한 탄성에 기초하여 이루어진다. 본 발명은 알긴산염의 사용에 제한되지 않고, 오히려 그에 따라 다른 하이드로겔, 예를 들어, 콜라겐, 겔란 또는 펙틴을 가지고 수행될 수 있다.

본 발명의 실시예들은 특히 알긴산염에 라이오프로텍턴트 물질의 로딩, 알긴산염 비드, 건조 알긴산염 입자 및/또는 재수화 된 알긴산염 비드, 및 동결 건조를 위한 프로토콜을 참조하여 설명된다. 재수화된 알긴산염 비드가 생체 세포의 배양에 사용되는 상세한 내용은 기존의 세포 배양으로부터 그 자체로 공지된 바와 같이 수행될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 건조된 알긴산염 입자 생산의 주요 단계들을 개략적으로 나타낸다. 단계 P1에서, 알긴산염 비드는 용기 내의 수성 현탁액에서 생산된다. 알긴산염 비드는, 예를 들어, [1]에 기재된 바와 같이, 노즐을 이용하여 Na-알긴산염 액적을 생성하고, 수성 현탁액 액체 내의 알긴산염 액적과 이온성 침전제를 가교결합시킴으로써 생산된다. 예를 들어, BaCl2 용액은 침전제로 사용된다. 알긴산염 비드의 크기 및 크기 분포는 노즐의 치수와 노즐의 동작 파라미터에 의해 설정될 수 있다. 가교결합된 알긴산염 비드는 치수적으로 안정적인 알긴산염 비드를 형성하며, 이 알긴산염 비드는 현탁액 액체 내에서 현탁된다.

알긴산염 비드는 바람직하게는 침전 후 티라민 및/또는 단백질, 예를 들어, 매트리겔로 코팅하여 기능화된다. 코팅은 현탁액의 침전 또는 직접적인 공유 결합에 의해 일어난다. 매트리겔 코팅은 후속 세포 배양에서 세포의 접착을 위한 이점을 제공한다.

알긴산염 액적이 현탁액 내로 적하되는 동안, 또는 대안적으로 알긴산염 비드의 가교결합 및 형성 후에, 라이오프로텍턴트 물질은 이미 현탁액 액체에 첨가된다. 본 발명자의 시험에서는, 예를 들어 NaCl 수용액(0.9%) 중의 트레할로스(100mg/ml), 폴록사머(상표명 Pluronic F68, 1mg/ml) 및/또는 수크로스(100mg/ml)가 라이오프로텍턴트 물질로 사용되었다. 현탁된 알긴산염 비드는, 예를 들어 알긴산염 비드를 라이오프로텍턴트 물질을 포함하는 수용액에 예를 들어 적어도 하루 동안 저장함으로써, 라이오프로텍턴트 물질로 로딩된다.

선택적으로, P2 단계에서, 라이오프로텍턴트 물질로 로딩된 알긴산염 비드는 현탁액으로부터 제거된다. 예를 들어, 현탁액 액체는 용기 내에 잔여 액체로 둘러싸인 알긴산염 비드를 남기면서 디캔팅된다. 대안적으로, 스크린이 제거에 사용된다.

단계 P2가 제공되지 않는 경우, 단계 P3에서 알긴산염 비드의 동결 건조는 알긴산염 비드에 라이오프로텍턴트 물질이 로딩된 직후에 수행된다. 다음의 단계들이 이러한 목적을 위해서 제공된다.

먼저, 알긴산염 비드가 150분(약 0.4°C/min)에 걸쳐 동결 단계에서 -45°C의 종료 온도로 냉각된다. 동결 단계 중에, 예를 들어 선형 시간-온도 함수가 적용된다.

그뒤에, 안정화 단계가 이어지며, 알긴산염 비드는 120분의 안정화 간격 지속 시간 동안 종료 온도에서 저장된다. 안정화 단계는 건조 단계가 수행되기 전에 샘플은 동결된 알긴산염 비드를 통해 완전히 동결된다는 이점을 갖는다.

후속하는 제 1 건조 단계는 승화에 의해 현탁액이 제거되는 건조 단계의 기능을 갖는다. 제 1 건조 단계는 예를 들어 냉각 유닛 및 응축기를 구비한 동결건조기에서 수행된다. 제 1 건조 단계 중, 대기압으로부터 제 1 부압인 50 μbar 까지 10분 동안 선형 시간-압력 함수에 따라 압력을 낮추는 동안, 종료 온도, 예를 들어 -45°C가 유지된다. 그뒤에, 제 1 건조 단계에서, 동결된 샘플은 예를 들어 80시간의 안정화 기간 동안 종료 온도와 제 1 부압으로 유지된다.

후속하는 제 2 건조 단계에서, 제 1 부압보다 낮고, 예를 들어 100 μbar인 제 2 부압이 인가된다. 제 2 부압으로의 하강은 예를 들어 300분 동안의 지속기간에 걸쳐서 선형 시간-압력 함수로 일어난다. 제 2 건조 단계 동안, 건조된 알긴산염 입자의 온도는 종료 온도 또는 증가된 온도, 예를 들어 상온(20°C)과 동일하다. 건조된 샘플은 제 2 부압으로 하강한 후, 제 2 건조 단계 동안 제 2 부압으로 유지되며, 예를 들어 20시간의 안정화 기간 동안 유지된다.

그뒤에, 환기 단계가 제공되는데, 이 단계에서는 건조된 알긴산염 입자가 1분 이상인 압력 상승 간격을 갖는 선형 시간-압력 함수에 따라 정상압력으로 전이된다. 환기 단계는 공기 또는 불활성 가스를 사용하여 제공될 수 있다. 상대적으로 긴 승압 간격을 적용하면 유리하게는 건조된 알긴산염 입자의 손상을 방지한다. 공기로 환기하는 경우, 저장 용기는 챔버 내에서 사전에 폐쇄되는 반면, 불활성 가스를 사용하는 경우에는 환기 후에 폐쇄된다.

건식 질소 또는 아르곤이 바람직하게는 불활성 기체로 사용된다. 건조된 알긴산염 입자는 특히 바람직하게는 불활성 기체 또는 진공 내에서 저장된다. 실용적인 시험으로 수개월 동안 기능성의 손실 없이 본 발명에 따라 제조된 건조 알긴산염 입자의 , 예를 들어 4°C에서, 저장성이 부여되었다.

예시에 의해 기술된 동결 건조 방법 P3는 예를 들어, 구체적인 적용 조건에 기초하여, 설정된 온도 및 압력과 시간-압력 및 시간-온도 함수의 형태 측면에서, 변형될 수 있다. 예를 들어, 준비 테스트를 사용하여 특정 하이드로겔, 특히 알긴산염, 샘플에 대해 최적의 건조 결과를 제공하는 시간 및 압력 매개변수를 결정할 수 있다.

동결 건조 P3의 결과로서, 건조된 알긴산염 입자는 완성된 세포 담체로 존재하게 된다. 본 발명에 따르면, 라이오프로텍턴트의 첨가로 인하여, 건조된 알긴산염 입자는 구형의 형태(예를 들어, 도 4의 사진 참조)를 가지는데, 이는 유리하게 재수화 후에도 남는다. 건조된 입자는 케이크로서 함께 결합될 수 있거나, 개별 입자들로 이루어진 주입 가능한 벌크 물질을 형성할 수 있다. 라이오프로텍턴트에 더하여 응집력을 감소시키는 물질, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜이 알긴산염 비드의 현탁액에 첨가되는 경우, 주입 가능한 벌크 물질의 형성이 촉진된다. 예를 들어, 건조된 알긴산염 입자가 서로 부착되는 것을 최소화하기 위해 PEG 600이라는 상표명을 갖는 폴리에틸렌 글리콜이 유용하다.

사용되는 라이오프로텍턴트 물질의 농도에 따라, 상기 물질은 동결 건조 P3에 따라서 건조된 알긴산염 입자의 표면에 잔여물을 형성할 수도 있다. 이에, 도 1에 나타낸 바와 같이, 특히 건조된 알긴산염 입자의 표면으로부터, 예를 들어 스크리닝 또는 분쇄에 의해, 라이오프로텍턴트 물질을 제거하기 위한 선택적인 단계 P4가 제공될 수도 있다.

도 2에서는 생체 세포 배양에 있어서 세포 담체로서 건조된 알긴산염 입자의 의 적용을 도식적으로 나타낸다. 먼저, K1 단계에서, 바이오리액터에 수성 배양 배지를 준비한다. 배양 배지의 조성은 세포 배양액의 구체적인 애플리케이션에 기초하여 그 자체로 공지된 방법에서 선택된다. 본 발명에 따라 제조된 알긴산염 입자가 배양 배지에 첨가된다. 건조된 알긴산염 입자는 예를 들어 무게 측정에 의해 계량된다. 본 발명에 따라 생산된 건조된 알긴산염 입자를 사용한 시험은 폴리에틸렌 글리콜 로딩이 없는 입자가 처음에는 배양 배지의 표면에 놓여 있다가 원심분리 후 배양 배지 내로만 가라앉는 반면, 폴리에틸렌 글리콜을 가지고 변형된 입자와 함께 배양 배지 상에 부유하는 것이 관찰되지 않음을 보여준다.

단계 K2에서, 상기 수성 배양 배지에서, 알긴산염 입자의 재수화가 일어난다. 건조된 알긴산염 입자는, 도 3에 나타낸 바와 같이, 배양 배지로부터 물을 흡수하여 알긴산염 비드로 전환된다. 그뒤에, 단계 K3에서, 알긴산염 비드가 있는 배양 배지에서 생체 세포의 세포 배양, 세포 배양 및/또는 세포 저장이 이루어진다.

도 3은, 본 발명의 바람직한 변형에 따라, 트레할로스(A) 또는 수크로스(B)로 로딩되어 동결 건조 및 재수화된 알긴산염 비드의 광현미경 이미지를, 현탁액 내에 라이오프로텍턴트 물질(C), 및 갓 제조된 알긴산염 비드(D) 없이 동결 건조 및 재수화된 알긴산염 비드와 비교하여 보여준다(직경 약 400μm). 본 발명에 따라 제조된 재수화된 입자(A, B)는 유리하게는 현탁된 미처리된 알긴산염 비드(D)와 동일한 구형 형상을 명확하게 나타낸다. 반면에, 미처리 동결 건조 및 재수화된 입자(C)(예를 들어, [1]에 따른)는 미처리 알긴산염 비드와 달리 울퉁불퉁하고 불규칙한 표면을 갖는다.

건조된 알긴산염 입자를 hiPS 세포(인간 유도 만능 줄기세포)의 세포 확장내 세포 운반체로서의 추가 애플리케이션은 도 4에 도식적으로 나타낸다. 제 1 팽창 단계의 경우, 건조된 알긴산염 입자(1)가 제 1 배양 용기(2), 예를 들어, 수 밀리리터(예를 들어 10 ml) 내지 수 리터(예를 들어 3 l)의 부피를 갖는 현탁액 바이오리액터에 첨가된다. 알긴산염 비드(3)(예로 표시된)는 알긴산염 입자(1)로부터 재수화함으로써 형성된다. 또한, hiPSC 세포는 용기(4)로부터 배양 용기(2)에 추가된다. 그런 다음 세포 배양은 특정 배양 조건 하에서 일어나는데, 세포는 처음에 마이크로 캐리어에 부착 및 접착된 후 며칠(예: 7일)에 걸쳐 인자(예: 7배)를 곱한다. 공정의 마지막 단계에서, 접착된 세포(5)를 갖는 알긴산염 비드가 얻어진다; 즉, 이들이 얻어진 후(예를 들어, 효소 처리에 의해), 소모된 마이크로 캐리어(6) 및 증식된 hiPS 세포(7)가 존재한다. 이들은 그뒤에 세포 은행(10)에 저장될 수 있으며, 추가 조사 및/또는 처리(9)(예: 심근 세포 내로 분화) 및/또는 직접적인 사용(8)(예: 바이오프린팅)을 위해 이송될 수 있다.

상기 설명 및 도면 및 청구항에 개시된 발명의 특징은 다양한 구성으로 발명을 수행하기 위하여, 개별적으로, 그리고 조합 또는 부-조합 모두에서 의의가 있을 수 있다.

Claims (18)

1. 생체 세포 배양을 위한 캐리어 입자의 제조 방법에 있어서,
   - 하이드로겔 비드의 수성 현탁액을 제공하는 단계, 및
   - 건조 하이드로겔 입자가 형성되도록 하이드로겔 비드를 동결 건조하는 단계를 포함하고,
   - 상기 현탁액에는 하나 이상의 라이오프로텍턴트(lyoprotectant) 물질이 첨가되어 현탁액 내의 하이드로겔 비드에 상기 라이오프로텍턴트 물질이 로딩되고, 라이오프로텍턴트 물질의 효과 하에서 상기 건조 하이드로겔 입자는 구형 입자 형상에 근사하는 형상을 얻는 것을 특징으로 하는 생체 세포 배양을 위한 캐리어 입자의 제조 방법.
   
2. 제 1항에 있어서,
   - 상기 하이드로겔 비드에는 단백질 층이 로딩되는 것을 특징으로 하는 생체 세포 배양을 위한 캐리어 입자의 제조 방법.
   
3. 전 항들 중 어느 한 항에 있어서,
   - 라이오프로텍턴트 물질의 잔여물은 동결 건조 후에 제거되는 것을 특징으로 하는 생체 세포 배양을 위한 캐리어 입자의 제조 방법.
   
4. 제 3항에 있어서,
   - 상기 잔여물은, 해체 및 스크리닝을 포함하는, 건조된 입자의 기계적 공정에 의해 제거되는 것을 특징으로 하는 생체 세포 배양을 위한 캐리어 입자의 제조 방법.
   
5. 전 항들 중 어느 한 항에 있어서,
   - 상기 라이오프로텍턴트 물질은 트레할로스, 디메틸 설폭 사이드, 수크로스 및 폴록사머 중 적어도 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 생체 세포 배양을 위한 캐리어 입자의 제조 방법.
   
6. 전 항들 중 어느 한 항에 있어서,
   - 라이오프로텍턴트 물질의 농도는 1 mg/ml 에서 500 mg/ml 까지의 범위 내에 있는 것으로 선택되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
   
7. 전 항들 중 어느 한 항에 있어서,
   - 건조 하이드로겔 입자는 재수화되고, 및
   - 건조된 라이오프로텍턴트 물질의 잔여물은, 특히 염화 나트륨으로 구성된 세척 용액에서 캐리어 입자를 사용하기 전에 제거되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
   
8. 전 항들 중 어느 한 항에 있어서,
   - 하이드로겔 비드는 자성 입자 및 생물학적 활성 물질(활성 성분) 중 적어도 하나를 함유하며, 여기서 상기 자성 입자 및/또는 상기 활성 성분은 동결 건조 중 하이드로겔 비드로 건조되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
   
9. 제 8항에 있어서,
   - 하이드로겔 비드는 분화 인자를 함유하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
   
10. 전 항들 중 어느 한 항에 있어서,
    - 건조 하이드로겔 입자의 주입성을 촉진하는 하나 이상의 응집성-감소 물질이 현탁액에 첨가되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
    
11. 제 10항에 있어서,
    - 상기 응집성-감소 물질은 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
    
12. 전 항들 중 어느 한 항에 있어서, 하이드로겔 비드의 동결 건조는 다음 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법:
    - 냉동 간격이 120 분 이상이고 말기 온도가 -40 ° C 미만인 시간 온도 기능에 따라 하이드로겔 비드가 동결되는, 동결 단계.
    - 하이드로겔 비드가 최소 90 분의 안정화 간격 지속기간 동안 종료 온도에서 저장되는, 안정화 단계,
    - 최종 온도에서 동결된 하이드로겔 비드에 30 μbar 내지 60 μbar 범위 내에서 선택되는 제 1 부압이 인가되는, 건조 하이드로겔 입자를 형성하기 위한 제 1 건조 단계,
    - 제 1 부압보다 낮은 제 2 부압이 종료 온도 이상의 온도에서 건조 하이드로겔 입자에 인가되는 제 2 건조 단계, 및
    - 건조 하이드로겔 입자가 0.5분 이상의 승압 간격을 갖는 시간-압력 함수에 따라 정상 압력으로 전이되는 환기 단계.
    
13. 생체 세포 배양을 위한 캐리어 입자에 있어서,
    - 하이드로겔 입자는 라이오프로텍턴트 물질을 함유하고, 구형에 근사하는 형상을 갖는, 단백질 코팅을 갖는 건조 하이드로겔 입자를 포함하는 캐리어 입자.
    
14. 제 13항에 있어서,
    - 단백질 코팅은 매트리겔, 콜라겐, 라미닌 및/또는 비트로넥틴을 포함하는 캐리어 입자.
    
15. 제 13항 또는 제 14항에 있어서,
    - 입자의 표면에는 라이오프로텍턴트 물질의 잔류물이 없는 것을 특징으로 하는 캐리어 입자.
    
16. 제 13항 내지 제 15항에 있어서,
    - 캐리어 입자는 50μm 에서 2mm 까지의 범위 내의 특징적인 단면 치수를 갖는 것을 특징으로 하는 캐리어 입자.
    
17. 제 13항 내지 제 16항에 있어서, 적어도 다음 중 하나를 함유하는 캐리어 입자:
    - 자성 입자, 및
    - 생물학적 활성 물질 (활성 성분).
    
18. 제 1항 내지 제 12항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 제 13항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 따른 캐리어 입자를 생체 세포 배양용 캐리어 입자로 사용하는 것.
    
    

Images